CN102088992B

CN102088992B - 肽基二酰基甘油酯

Info

Publication number: CN102088992B
Application number: CN200980124286.1A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·D·撒克
Original assignee: Therimunex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Therimunex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-04-24
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2029-04-24
Also published as: NZ589365A; WO2009132231A3; CN102088992A; WO2009132231A2; US9662370B2; EP2293809B1; JP2011518840A; CA2727973C; CA2727973A1; AU2009240516B2; RU2010147464A; KR20110015571A; US20110123611A1; WO2009132231A8; EP2293809A4; EP2293809A2; RU2545347C2; AU2009240516A1; JP5802553B2

Abstract

本文公开了可以被共价连接至脂质的肽以及使用这些肽和脂肽来预防或治疗疾病的方法。

Description

肽基二酰基甘油酯

相关申请的交叉引用：

本申请要求来自2008年4月24日提交的名为“肽基二酰基甘油酯”的美国临时申请第61/047,464号的优先权，该临时申请的公开内容通过引用并入本文。

政府利益

不适用

联合研究协议的各方：

不适用

通过引用并入在光盘上呈交的材料：

不适用

背景

二酰基甘油的生物学作用已被充分地描述在文献中。例如众所周知二酰基甘油参与脂质作为甘油三酯的运输并参与与可溶性蛋白的缔合，诸如载脂蛋白是胆固醇的运载蛋白。二酰基甘油也已知具有细胞内信号传导功能。细胞内的、膜结合的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸被酶磷脂酶C的作用切割来释放两个胞内信使分子肌醇三磷酸和膜结合的二酰基甘油(具体而言1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油)。二酰基甘油激活蛋白激酶C，蛋白激酶C激活转录因子NFκB以上调多种细胞因子和趋化因子的基因表达。肽基-2，3-二酰基甘油酯或PDAG与免疫功能有关。更具体而言，PDAG具有刺激免疫应答的作用。通过引用并入美国申请第11/459,772号(美国公开第2007/0197436号)和本文所用的阐述本发明背景或提供有关生物学机制的另外细节的其他公开文件。

发明概述

本文描述的本发明的实施方案包括可以刺激免疫应答的化合物，所述化合物包括与脂质共价连接的约5个至约25个氨基酸的免疫活性肽。在一些实施方案中，脂质可以是通式(I)的甘油酯：

其中X₁、X₂和X₃选自氢、C₂到C₂₅脂肪酸和肽，并且X₁、X₂和X₃中的至少一个是肽。实施方案的脂肪酸可以是饱和的、不饱和的或多不饱和的脂肪酸，并且该肽可以通过肽C端的酯键与脂质共价连接。

在某些实施方案中，免疫活性肽具有氨基酸序列XLYDKGYTSKEQKDCVGIX或XLYDKGYTPKEQKDCVGIX或它们的倒位物(inversion)或模拟物，其中X不存在或者是天然存在的氨基酸或其模拟物、衍生氨基酸或非氨基酸辅基。

本发明的实施方案的化合物还可以包含药学上可接受的赋形剂并且可以与有效量的该化合物一致的单位剂量形式提供，并且这些实施方案可以考虑药物组合物。

本发明的其他实施方案包括如下方法：所述方法可以包括向有此需要的受治疗者施用有效量的由共价连接至脂质的具有大约5个至大约25个氨基酸的肽组成的剂，并刺激免疫应答。本发明的实施方案的肽可以包括具有氨基酸序列XLYDKGYTSKEQKDCVGIX或XLYDKGYTPKEQKDCVGIX或其倒位物或模拟物的肽或肽片段，其中X不存在或为天然存在的氨基酸或其模拟物、衍生氨基酸或非氨基酸辅基。

本发明的实施方案的剂可以包括通式(I)的甘油酯：

其中X₁、X₂和X₃选自氢、C₂至C₂₅脂肪酸和肽，并且X₁、X₂和X₃中的至少一个是肽。实施方案的脂肪酸可以是饱和的、不饱和的或多不饱和的脂肪酸。该肽可以通过肽C端的酯键与脂质共价连接。可以施用该剂以刺激先天性免疫应答，并且可以刺激组织驻留的免疫细胞，包括但不限于：γδT细胞、单核细胞、NK细胞、嗜中性细胞、CD5+B细胞及其组合。在一些实施方案中，组织驻留的免疫细胞当被肽接触时受到刺激。

本发明的实施方案的剂可以包括通式(I)的甘油酯，其中可以施用该剂以刺激先天性免疫应答，并且可以刺激非免疫细胞，包括但不限于：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、肝细胞及其组合。在一些实施方案中，这些组织免疫细胞当被肽接触时受到刺激。

在本发明的某些实施方案中刺激的免疫应答可以包括在施用该剂后刺激免疫应答至少1-3天，并且在某些其他实施方案中，可以刺激免疫应答一周或更久。

在本发明的又其他实施方案中，该剂可以被沉积在受治疗者的脂肪组织中，并且该剂可以通过任何方法施用，包括肠、肠胃外和局部递送，乳房输注和这些方法的组合。肠胃外施用可以包括但不限于：关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、静脉内、肌内、皮下及其组合。肠施用可以包括但不限于口服(oral)、经口(peroral)、直肠及其组合，并且局部施用可以包括但不限于鼻内、呼吸道内、表皮、透皮递送及其组合。

在本发明的一些实施方案中，该剂可以在暴露于形成疾病的因素之前被施用，并且在这些实施方案中可以基本上防止疾病的发作或发展。在其他实施方案中，该剂可以在疾病之前施用。该剂还可以在暴露于形成疾病的因素以后被递送并且在这些实施方案中可以基本上阻止疾病发展。在又其他实施方案中，可以在疾病发作后将该剂递送给受治疗者以减轻疾病的严重度或扭转疾病病程。

本发明的实施方案的其他方法包括使用上文描述的本发明的剂和组合物用于治疗感染的方法、用于刺激免疫应答的方法、用于防止疾病的方法、用于防止感染的方法和这些方法的组合，诸如治疗疾病和防止继发感染的方法。

本发明的实施方案还包括针对本发明的化合物的抗体和通过施用本发明的实施方案的抗体治疗炎症的方法，所述炎症诸如但不限于全身性炎症、慢性炎症疾病以及由于脓毒症、非脓毒性损伤、外伤、手术或其组合所致炎症。可以通过本领域已知的任何方法将本发明的实施方案的抗体施用给受治疗者，所述方法包括但不限于肠、肠胃外和局部递送。

本发明的实施方案的抗体还可以被连接至选择性标记，诸如但不限于制备探针的荧光标记，如蛋白或量子点(quantumdot)，和使用这些探针来检测并鉴定样品中的肽的方法，所述样品诸如生物样品、细胞样品或组织样品以及与这些肽相互作用的细胞或蛋白。

附图描述

为了更完全地理解本发明的性质和优点，应该参考与附图相联系的以下详细描述，其中：

图1显示包含PDAG的血清级分(图1A)和纯化的本发明的1-肽基-2，3-二酰基甘油酯(图1B)的代表性HPLC色谱图。

图2显示来自山羊来源的PDAG的片段的ESI质谱(图2A)和证实本发明的氨基酸序列的多电荷离子种类(m/z845.45)的MS/MS质谱(图2B)。

图3显示在二羟苯甲酸基质中的纯化的PDAG的PSDMALDI-TOF质谱。

图4显示在弱酸水解后PDAG水解产物的PSDMALDI-TOF质谱。表格显示构成本发明中的整个PDAG分子的关键肽片段的主要离子分配。

图5显示在与PDAG一起孵育的成纤维细胞中的IL-6mRNA和IL-6蛋白表达的刺激。

图6显示PDAG刺激成纤维细胞中的NALP3而不是NFκB的mRNA表达。

图7显示PDAG和PDAG肽(25ng/ml和50ng/ml)诱导肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)从感染的单核细胞中清除。

图8显示PDAG抑制HepDES19细胞中的乙型肝炎病毒复制。

图9显示PDAG在用热灭活的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(FCA)接种的兔中诱导抗原特异性IgM产生的两倍提高。

图10显示PDAG的施用显著延迟用致死剂量的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)感染的小鼠中的疾病发展。

详细描述

还必须指出，如此处和在所附权利要求中所用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个所指。因此，例如，提及“细胞”是指本领域技术人员已知的一个或多个细胞及其等同物，等等。除非另外限定，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方案的实施或试验中可使用与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法、装置和材料。本文所提及的所有出版物均通过引用并入。这些出版物在此不得被解释为承认本发明无权先于因先前发明所作的此类公开。

“佐剂”是指增强抗原的免疫刺激特性或药物的药理学作用的任何物质。

如本文所用，术语“大约”表示加上或减去正与其一起使用的数字的数值的10％。因此，大约50％表示45％-55％的范围。

术语“模拟物”、“肽模拟物”和“模拟肽(peptidomimetic)”在本文可互换使用，并且一般是指模拟所选择的天然肽或蛋白功能域(例如，结合基序或活性位点)的三级结合结构或活性的肽、部分肽(partialpeptide)或非

肽分子。这些肽模拟物包括以下进一步描述的重组或化学修饰的肽以及非肽类药物，诸如小分子药物模拟物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物”是指本发明的化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前体药物，它们在正常的医学判断范围之内，适于在与患者的组织接触中使用而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的益处/风险比相称，并且对于它们的预期用途是有效的；以及在可能的地方还指本发明的化合物的两性离子形式。

如本文所用，术语“生理上耐受的”及其语法变体在它们是指组合物、载体、稀释剂和试剂时可互换使用并且代表能够对哺乳动物施用而没有或具有极小的不希望的生理作用(诸如恶心、眩晕、疹或胃不适(gastricupset))的产生的材料。在优选的实施方案中，治疗组合物在出于治疗目的施用给人类患者或其他动物时不具抗原性。

“提供”当结合治疗手段(therapeuticmeans)使用时表示将治疗剂直接施用到靶组织中或施用到靶组织上，或表示向患者施用治疗剂从而该治疗剂积极地影响其所靶向的组织。

如本文所用“受治疗者”或“患者”是指动物或哺乳动物，包括但不限于：人、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、兔、大鼠、小鼠等等。

对于本发明的目的，“疾病”可以是任何感染因子(infectiousagent)，举例来说，例如病毒粒子、细菌病原体以及类似物。关于“患病的受治疗者”使用的“患病的”可以指感染了感染因子的任何人类或动物受治疗者。“患病的受治疗者”可以表现或可以不表现感染的体征，举例来说，例如已知症状。

如本文所用“样品”包括生物学样品，这些生物学样品可以通过本发明的方法测试并且包括但不限于体液，诸如血清、血浆、全血、脑脊髓液、淋巴液、各种外部分泌物(尿、呼吸道分泌物、肠道分泌物或生殖泌尿道分泌物、泪等)等等。

如本文所用，术语“治疗剂”表示用于治疗、斗争、改善、防止或改进患者的不想要的病症或疾病的剂。本发明的实施方案涉及刺激先天免疫应答或炎症应答的调节。本文使用的方法考虑在现有病症的治疗中的预防用途以及治疗用途。

如本文所用，术语“治疗上有效的”或“有效的”可以被互换使用并且是指本发明的治疗组合物实施方案—例如一种或多种肽基二酰基甘油酯或其模拟物的量。例如，包含1-肽基-2，3-二酰基甘油酯或其模拟物的组合物的治疗上有效的量是被计算达到希望的效果即有效刺激施用该组合物的动物中的免疫应答的预定量。

术语“单位剂量”当关于本发明的治疗组合物使用时是指适于作为受治疗者的单元剂量的物理上分离的单位，每个单位包含与需要的稀释剂即赋形剂、载体或媒介物联合的被计算产生希望的治疗效果的预定数量的活性材料。

本发明的一个实施方案可能涉及1-肽基-2，3-二酰基甘油酯或PDAG。本发明的其他实施方案可能包括包含PDAG的组合物、包含PDAG的部分的组合物、包含PDAG肽的类似物的组合物以及包含PDAG的肽模拟物的组合物。

在本发明的实施方案中，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物可以被提供给受治疗者并且可以刺激治疗作用，所述治疗作用诸如但不限于诱导免疫应答，并且在某些实施方案中，免疫应答可以是如此被提供的受治疗者中的先天免疫应答。在本发明的其他实施方案中，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物可以被施用给接受疾病治疗的受治疗者、施用给健康的受治疗者或施用给健康且可能暴露于疾病、形成疾病的粒子或患病的人和/或动物的受治疗者。在本发明的实施方案中，在PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物以及包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物的治疗剂被提供给健康的受治疗者时，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物可以促进受治疗者的免疫系统的预防性激活和在某些实施方案中先天免疫的预防性激活。

不希望受理论束缚，在本发明的实施方案中PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物当被提供给受治疗者时可以激活该受治疗者中的组织驻留的免疫细胞。在一些实施方案中，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物可以启动免疫应答并且在其他实施方案中，该免疫应答可以是先天免疫应答。

本发明的实施方案还可以包括施用PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物以及包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物的治疗剂的方法，诸如但不限于肠胃外、肠内或局部施用。

本发明的其他实施方案包括具有对PDAG的特异性的抗体和在消耗受治疗者中PDAG的全身浓度或局部浓度中使用这些抗体的方法。在某些实施方案中，被提供对PDAG特异的抗体的受治疗者可能表现免疫疾病的症状，所述免疫疾病诸如但不限于：全身炎症、慢性炎症疾病、动脉粥样硬化疾病、类风湿性疾病、自身免疫疾病以及类似疾病。

本发明的又其他的实施方案包括荧光标记的PDAG、PDAG的类似物和荧光标记的具有对PDAG的特异性的抗体或抗体片段，以及用于产生这些荧光标记的PDAG、PDAG的类似物和抗体的方法。荧光标记的PDAG、PDAG的类似物和抗体可以在本发明的实施方案中用作体外和体内评价免疫系统以及免疫病理学的各方面的诊断工具，并且在一些实施方案中，受治疗者可以包括但不限于表现出符合慢性炎症疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化疾病、糖尿病以及类似疾病的症状的受治疗者。

在本发明的各实施方案中描述的PDAG可以包括具有与脂质部分共价相连的至少一个肽部分的肽基二酰基甘油酯并且具有通式1-肽基-2，3-二酰基甘油酯。在某些实施方案中，脂质部分是1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油。

在本发明的实施方案中描述的PDAG可以具有通式(I)：

其中X₁、X₂和X₃可以是氢、肽、肽模拟物、或肽类似物，或是具有大约1个至大约20个碳原子的饱和的、不饱和的或多不饱和的脂肪酸。在本发明的一些实施方案中，X₁、X₂和X₃中的至少一个可以是肽、肽模拟物、或肽类似物，并且在其他实施方案中，X₁、X₂和X₃中多于一个可以是肽、肽模拟物、肽类似物。

本发明的实施方案的肽部分可以由大约5个到大约25个之间的氨基酸组成并且可以包括一个或多个天然存在的、非天然存在的和化学修饰的氨基酸。这些肽部分可以重大约1000amu至大约3000amu。本发明所包括的肽或其模拟物可以包括赋予希望的激活免疫作用的任何氨基酸序列。肽部分可以在与脂质部分连接之前被制备和/或分离，并且由天然来源(举例来说例如人、动物、细菌来源以及类似来源)合成和分离，或者可以通过任何本领域已知的方法合成。这样合成和分离的肽、肽模拟物和肽类似物可以通过本领域普通技术人员已知的方法纯化或浓缩，举例来说，例如通过过滤、色谱法以及类似方法。可以通过在肽的羧基末端的羧酸处酯化将该肽部分共价结合至脂质部分，并且在一些实施方案中，可以通过在肽的羧基末端的羧酸处的磷酸酯将该肽部分结合至脂质部分。

PDAG的肽部分的序列可能在各实施方案中不同。例如，在一个实施方案中，肽序列可以是XLYDKGYTSKEQKDCVGIX或XLYDKGYTPKDCVGIX或它们的合成的等同物、肽类似物或模拟肽。在这些实施方案中，X可以不存在或者是任何天然存在的氨基酸或其模拟物、衍生氨基酸或非氨基酸辅基，并且在具体实施方案中，最N端的氨基酸可以是N-乙酰基丙氨酸(acA)。不希望受理论束缚，本文以上呈现的肽序列可以代表当单独施用或与脂质部分结合(例如作为PDAG)施用时可能引发哺乳动物且特别是人的免疫应答的较大类别的肽。因此，从几乎任何来源分离的执行这种功能的任何肽可以被本发明的实施方案涵盖，所述肽包括例如，从诸如但不限于以下来源分离的与PDAG相关联的肽：动物、哺乳动物、人、灵长类动物、牛、马、猪、鸟、爬行动物、昆虫、微生物、细菌等等。

与脂质部分共价结合以组成PDAG的肽、肽模拟物或肽类似物可以被考虑并且此后将被称作“PDAG脂肽”。

例如，可以如下合成PDAG。可以使用固相合成方法制备PDAG肽或PDAG肽模拟物，举例来说，例如具有延伸的HBTU/HOBt偶联循环和预装Wang树脂的FMOC合成方案。在合成后，可以切割肽侧链保护基，并且可以用试剂-K从树脂中释放肽。然后可以使用例如乙醚提取和冷冻干燥从合成缓冲液中提取肽。可以使用反相C-18纯化来进一步纯化得到的粗肽并且随后可以进行MALDI-TOF表征来证实氨基酸序列。

可以使用两步法将PDAG肽或肽模拟物与PDAG的脂质部分共价连接，其中，首先如以上所述合成PDAG肽，但是没有脱保护步骤。然后用例如二环己基碳二亚胺激活C端羧酸，并且可以在存在二酰基甘油和催化剂诸如二甲基氨基吡啶(DMAP)的情况下孵育肽。酯化可以发生在允许肽基二酰基甘油酯形成的孵育步骤过程中。然后可以用试剂K切割肽侧链保护基，并且可以通过色谱法分离并纯化肽基二酰基甘油酯产物。然后可以使用MALDI-TOF或ESI-MSⁿ表征来证实纯化产物的结构。

本发明的实施方案的PDAG的肽部分可以举例来说例如通过用非天然存在的侧链替代20种遗传编码氨基酸(或D氨基酸)的一个或多个天然存在的侧链来修饰，以及用4、5、6至7元杂环修饰以产生肽模拟物，非天然存在的侧链的实例包括但不限于：烷基(alkyl)、低级烷基、4、5、6至7元烷芳基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基及其低级酯衍生物。例如，可以制备其中脯氨酸残基的环大小从5元到4、6或7元改变的脯氨酸类似物。环基团可以是饱和的或不饱和的，并且如果不饱和，可以为芳香族或非芳香族的。杂环基团可以包含一个或多个杂原子，举例来说，例如氮、氧和/或硫以及类似原子，并且可以形成包括但不限于以下的基团：呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如硫吗啉代)、以及三唑基。这些杂环基团可以是取代的或未取代的。取代的杂环基团可以包含诸如但不限于以下的取代基：烷基、烷氧基、卤素、氧或取代或未取代的苯基。PDAG肽的模拟肽还可以具有已通过例如磷酸化、磺化、生物素化以及诸如此类被化学修饰的氨基酸残基。

多种技术可用于构建具有与对应的天然肽相同或相似的希望生物活性但具有更好的溶解性、稳定性和/或对水解或蛋白酶解的易感性的肽模拟物。因此，由于模拟肽化合物可能具有增加的细胞渗透性、对细胞受体更大的亲和力和/或亲合力以及延长的生物半衰期，所以模拟肽化合物的这些特点鼓励它们在治疗应用中使用。某些模拟肽化合物是基于本发明的肽的氨基酸序列。通常，模拟肽化合物是具有以所选肽的三维结构为基础的三维结构(即“肽基序”)的合成化合物。这些肽基序提供具有希望的生物学活性即增强或刺激免疫应答的模拟肽化合物，其中模拟化合物的结合活性基本上没有被降低，并且通常与模拟物模仿的天然肽的活性相同或比其大。

模拟肽设计策略是本领域中容易获得的。一类模拟肽包含如下骨架：部分或完全为非肽，但原子对原子地模拟肽骨架并包含同样模拟天然氨基酸残基的侧基官能度的侧基。几种类型化学键，诸如酯键、硫代酸酯键、硫代酰胺键、逆酰胺键、还原羰基键、二亚甲基键和酮亚甲基键已知在本领域中一般是耐蛋白酶的模拟肽的构建中有用的肽键代用品。另一类模拟肽是小的非肽分子，所述小的非肽分子结合另外的肽或蛋白但其不必是天然肽的结构模拟物。还有另一类模拟肽是由于组合化学和大量化学文库的产生而得到的。这些一般是新颖的模板，尽管在结构上与天然肽不相关，但它们拥有安放在非肽支架上来充当原始肽的“地形”模拟物的必需的官能团。

不希望受理论束缚，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物可以在产生激活的PDAG(“PDAG”)的靶组织内被激活。然后“PDAG”部分可以与之前指出的免疫细胞和/或非免疫细胞中或其上的特定受体分子结合并启动细胞因子的释放，所述细胞因子诸如但不限于：IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β、INF-γ、TNF-α、粒酶以及招募并激活巨噬细胞、吞噬性NK细胞或中性粒细胞并刺激其他刺激性细胞因子和肽的释放的RANTES。细胞因子的释放还可以刺激CD5⁺B细胞(也称作组织驻留的B1细胞)以产生免疫球蛋白(IgM，一种有力的调理免疫球蛋白)和其他B细胞来源的免疫球蛋白诸如IgA或IgG、细胞因子和趋化因子。因此，本发明的实施方案包括PDAG肽、PDAG肽的部分、PDAG肽的类似物或PDAG肽的肽模拟物，它们在施用给受治疗者时可以以无活性形式(即与脂质部分共价相连)存在于靶组织中并且经时间被脂蛋白脂肪酶的作用激活，由此允许保持提高的PDAG肽浓度和经时间在受治疗者的靶组织中的免疫激活。活性PDAG肽的持续释放可能允许持续的先天免疫系统激活，由此给予预防性处理的受治疗者当经时间免疫激发时增强的抗病能力或给予治疗性处理的受治疗者PDAG的长效制剂。

在本发明的其他实施方案中，多于一种PDAG肽可以被共价结合至脂质部分。不希望受理论束缚，PDAG肽或肽模拟物的有效释放的持续时间可能直接与结合至脂质部分的PDAG肽或肽模拟物的数目相关。因此，具有结合至单个脂质部分的三个PDAG肽部分的PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物的施用可能经过比类似施用的只具有结合至脂质部分的一个PDAG部分的PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物更长的时间释放PDAG肽。

在一些实施方案中，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物可以被直接递送至受治疗者，并且在其他实施方案中，可以将PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物与药学上可接受的载体联合以制备可被递送或提供给受治疗者的药物组合物。

各种施用途径在本发明的实施方案中是可用的。所选择的具体方式将取决于所选的具体的化学治疗药物、治疗的病症的严重度和治疗疗效所需的剂量。本发明的方法一般说来可以使用任何医学上可接受的施用方式来实施，所述医学上可接受的施用方式表示产生有效的活性化合物水平而不引起临床上不可接受的副作用的任何方式。这样的施用方式包括但不限于：口服、直肠、局部、鼻、皮内、吸入、腹膜内或肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内或输注。静脉内、皮下或肌内途径特别适合于本发明的目的。

本发明的实施方案的药物组合物可以包括缓冲剂，举例来说，例如，乙酸的盐(aceticacidinasalt)、柠檬酸的盐(citricacidinasalt)、硼酸的盐(boricacidinasalt)、磷酸的盐(phosphoricacidinasalt)以及类似物，并且任选地包括防腐剂，诸如：苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞以及类似物。

药物组合物可以便利地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。所有方法可以包括使活性剂与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。一般而言，组合物可以通过如下方式制备：均匀地且紧密地使活性化合物与液体载体、细分的固体载体结合或二者结合，然后如果必要的话，将产物塑形。

多种其他载体材料还可以以适当的数量有利地存在于鼻喷雾剂中。可以通过在含水介质中溶解少量氯化钠将该溶液制备成低浓度盐水。盐浓度可以在大约0.1-2.0％的范围内并且优选地将为大约0.65％左右。其他材料诸如表面活性剂、维生素和维生素衍生物、抗组胺药、湿润剂、防腐剂、保湿剂、乳化剂、增味剂以及类似材料也可以以常规浓度存在。适合材料的许多公开连同在含水介质中的有效浓度的描述可见于文献。本领域熟练技术人员将不难确定已知其功能的适合材料和浓度。喷雾剂至鼻腔的递送可以凭借任何常规的喷雾技术或装置。

本发明的实施方案还提供适于肠胃外施用的组合物，其中PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物的无菌含水制品优选地与受者的血液等渗。这种含水制品可以根据已知方法使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌注射制品还可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为1，3-丁二醇中的溶液。水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液是在可以采用的可接受的媒介物或溶剂中。此外，常规采用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯和甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可以用在注射剂的制备中。适合于口服、皮下、静脉内、肌内施用以及类似施用的载体制剂可见于Remington′sPharmaceuticalSciences(雷明顿氏制药科学)，MackPublishingCo.，Easton，PA，通过引用将其整体并入本文。

本发明的实施方案的递送系统可被设计成延时释放(time-released)、延迟释放或持续释放的递送系统。PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物也可以与另外的免疫刺激剂或免疫增强剂结合使用。使用这样的系统，可以避免PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物的重复施用，从而提高对受治疗者的便利性，并且可能特别适合于本发明的某些组合物。

PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物和包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的以及PDAG的模拟物的药物组合物可以以增强或刺激免疫应答的有效量施用，并且在某些实施方案中，以刺激先天免疫应答的有效量施用。

一般而言，在临床试验中的例行实验可用来确定每种剂或药物组合物的最适效果的具体范围以及施用方案。根据受治疗者的病症和对最初施用的反应性，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物和包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物以及PDAG的模拟物的药物组合物向具体受治疗者的施用可以被调整在有效且安全的范围之内。然而，最终的施用方案可以根据参与的临床医生考虑诸如以下因素的判断来调节：受治疗者的年龄、状况和尺寸，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物和包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物以及PDAG的模拟物的药物组合物的效力，治疗的持续时间和治疗的疾病的严重度。

在本发明的实施方案中，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物和包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物以及PDAG的模拟物的药物组合物的给药方案可以通过鼻喷雾剂或吸入器(inhaler)来施用。对于鼻喷雾剂或吸入器制剂，用于有效溶解或分散PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物和包含PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物以及PDAG的模拟物的药物组合物的基础粒度(groundparticlesize)可以是在大约0.1至大约20微米、大约0.2至大约10微米以及在某些实施方案中大约0.2至大约5微米的数量级。将PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物加入到含水载体中可以通过首先将PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物分散在溶液中来辅助，举例来说，例如，在内酯溶液中的4％浓度。一旦被彻底地混合、分散和/或溶解，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物可以以大约0.001％至大约2.0％、大约0.01％至大约0.35％以及在某些实施方案中大约0.10％的浓度存在。(除非另外指出，否则本文的所有百分比是按重量计的。)

在其他实施方案中，PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物或PDAG的模拟物可以被口服施用以便在两个至四个分剂量中达到以下范围内的血液总水平：大约25μg/天至大约2000μg/天、大约25μg/天至大约500μg/天、或在某些实施方案中大约50μg/天至大约250μg/天。在一些实施方案中，可以使用间歇式治疗(例如，三周中的一周或四周中的三周)。

在应用初始剂量受治疗者的应答不足的情况下，可以采用更高剂量(或通过不同的、更为集中的递送途径有效地提高的剂量)至患者耐受性允许的程度。可以使用每天多剂量来达到化合物的适当的全身水平。一般而言，可以使用最大剂量。最大剂量可以被认为是根据合理的医学判断的最高的安全剂量。然而，本领域的普通技术人员将理解受治疗者可以出于医学理由、心理学理由或出于几乎任何其他理由坚持较低剂量或可耐受的剂量。

在本发明的其他实施方案中，至少一种PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物或PDAG肽可以与抗原肽共价相连，或者在向受治疗者施用抗原肽或疫苗之前简单地与抗原肽或疫苗混合。不希望受理论束缚，在施用抗原肽或疫苗时，PDAG或PDAG肽的添加可以通过刺激先天免疫系统来增强抗原肽或疫苗的免疫原性。具有共价连接一种或多种PDAG或PDAG肽的合成抗原或PDAG或PDAG肽的抗原或疫苗混合物可以被施用至受治疗者以诱导该受治疗者中的长期适应性免疫应答。

在本发明的其他实施方案中，可以针对天然存在的PDAG或PDAG肽产生抗体，并且在又其他实施方案中，这样产生的抗体可以被施用给受治疗者以消耗针对其产生抗体的PDAG的浓度。不希望受理论束缚，PDAG和/或PDAG肽消耗抗体的施用可能是对于表现出失控的全身炎症的受治疗者的有益治疗策略，所述失控的全身炎症举例来说例如：脓毒症、动脉粥样硬化、类风湿性疾病、自身免疫疾病、炎性肠病、I型糖尿病以及类似疾病。在类似的实施方案中，PDAG和PDAG肽消耗的抗体可以用于治疗非脓毒性损伤，举例来说，例如外伤、由大量手术程序所致炎症以及类似损伤。

本发明实施方案的针对PDAG和PDAG肽的抗体可以在兔、小鼠、山羊、马或其他物种中通过本领域熟练技术人员公知的方法产生。例如，针对PDAG或PDAG肽的单克隆抗体可以利用杂交瘤融合技术产生，并且所选的杂交瘤可以被保持在细胞培养物中或生物反应器中以连续产生单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体的PDAG肽特异性结合区可以通过整个抗体的特定化学切割或本领域已知的重组方法被选择性产生。在其他实施方案中，特异性PDAG结合区可以被结合至人抗体的Fc区以产生人源化嵌合体以用于向人类受治疗者施用PDAG消耗的抗体。嵌合抗体是本领域公知的并且可以使用合成的、半合成的或重组的方法产生。因为可能基本上在人类受治疗者中不引起二次抗体反应，人源化PDAG嵌合抗体可能对于在人类受治疗者中使用是有利的。

在本发明的又其他实施方案中，可以制备荧光标记的PDAG、PDAG肽或PDAG抗体。在这样的实施方案中，荧光染料诸如但不限于藻红蛋白(PE)、红色荧光染料以及绿色荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)可以被激活结合至PDAG的肽基部分的N端、PDAG肽中的游离硫氢基或氨基或羧基、或PDAG抗体的游离氨基。

用于制备此类结合物的方法是本领域公知的，例如PDAG或PDAG肽可以通过其N端与荧光染料结合，这是通过如下实现的：通过附加反式4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(LC-SMCC)的硫醇反应性延长链类似物激活该肽，并且通过尺寸排阻色谱将衍生的PDAG肽与未反应的LC-SMCC分离。可以通过在三-(2-羧乙基)膦(TCEP)中孵育R-PE或FITC持续10至15分钟来激活R-PE或FITC的针对游离硫醇的吡啶二硫化物衍生物。然后可以将纯化的LC-SMCC-PDAG肽衍生物与激活的R-PE或FITC合并，并在4℃混合过夜。可以通过添加为任何剩余的硫醇基团加帽的N-乙基马来酰亚胺(NEM)停止该反应。R-PE或FITC-PDAG结合物可以通过尺寸排阻色谱纯化并且被冻干以产生最终产物。

在本发明的其他实施方案中，荧光标记的PDAG或PDAG肽可用于分析组织样品。例如，可以将荧光标记的PDAG或PDAG肽与受治疗者的样品离体混合以检测并定量占用荧光标记的PDAG或PDAG肽的免疫细胞。在又其他实施方案中，荧光标记的针对PDAG或PDAG肽的抗体可用来使用诸如荧光显微镜法、ELISA等方法检测并定量在来自受治疗者的离体样品中的PDAG或PDAG肽的水平。这些分析方法是本领域技术人员公知的。

实施例1

此实施例描述了在本发明中PDAG的分离和结构分析。通过对蒸馏水透析通过7-10kDa分子量的截留透析盒(Slide-A-Lyzer，PierceBiotechnology，Inc.)并通过透析液的真空蒸发浓缩以及冻干，可以将PDAG以研究规模的数量从凝固的血液的血清级分中常规分离。

通过经尺寸排阻树脂或过滤器的尺寸排阻色谱或过滤进一步纯化该粗血清级分以除去盐和其他低分子量污染物。通过有机溶剂萃取和反相HPLC完成最终纯化。该程序在纯化后提供了足以进行生物学活性研究并开始生物活性组分的化学表征的材料。LC/MS分析将PDAG组分表征为2-3kDa脂肽。基于总质量丰度的定量分析表明PDAG纯度在HPLC后大于98％。HPLC/ESI串联质谱可以用来证实该肽的氨基酸序列并鉴定本发明中的PDAG的脂质部分。图1中描绘了纯化的非灵长类PDAG的代表性HPLC概况。在Ultimate3000HPLC(Dionex，Sunnyvale，CA)上进行HPLC色谱。柱子是ZorbaxC81×150mm(Agilent，SantaClara，CA)。将水中的200ul样品注入到200ul环中。梯度是5-65％的溶剂A比溶剂B经60分钟，接着用90％溶剂B洗涤5分钟。溶剂A为5％乙腈+0.1％TFA并且溶剂B为90％乙腈+0.1％TFA流速为50ul/min。检测是在214nm和280nm。

提取山羊血清(2L)以产生约100μg纯化的PDAG。图1A是甲醇：氯仿可溶级分(技术级PDAG)的代表性色谱图。在标定的10.4分钟洗脱的峰被确定为是母体PDAG并且在标定的9.4分钟和4.8分钟之间洗脱的峰是母体PDAG的水解产物。在2.9分钟洗脱的峰被表征为主要包含寡糖(数据未显示)。通过制备型反相色谱收集纯化的PDAG(10.4分钟峰)并且在真空中移除溶剂。这些结果被描绘在图1A和图1B中。

实施例2

这个实施例描述了天然PDAG的结构解析。纯化的PDAG的埃德曼降解序列分析鉴定了推定的PDAG肽的氨基酸序列(X₁)LYDKGYTSKEQKDCVGI(X₂)和计算出的1883.57amu分子量。X₁和X₂是未鉴定的衍生氨基酸或非氨基酸辅基。利用液体色谱/串联质谱(LC/MSⁿ)来分析纯化的PDAG以便(a)鉴定N端和C端辅基和(b)证实该肽的氨基酸序列。PDAG母峰(10.4分钟)的ESI-MS揭示3种主要的离子片段。最丰富的(片段A)被确定为与PDAG作为PDAG-色氨酸加合物共洗脱的色氨酸(m/z205)。

第二丰富离子即片段B(MW1688.8)的质谱具有两种多电荷离子。在m/z564.00的离子为[M+3H]³⁺并且在845.45的离子为[M+2H]²⁺。m/z845.5离子的MS/MS产物离子质谱具有氨基酸序列acALYDKGYTSKEQKD(m/z1688.8)。该序列与来自埃德曼降解序列分析的头13个氨基酸一致，其中X₁为N-乙酰基丙氨酸(acA)。在图2A和图2B中呈现了片段B的质谱。

作为指定为PDAG的结构的进一步实验证据，进行了一系列MALDI-TOF质谱实验。因为PDAG作为色氨酸：PDAG加合物(估计为200∶1)而分离，所以通过有或没有添加的基质的MALDI-TOFMS分析PDAG。没有观察到对应于完整PDAG分子的分子离子，然而，在没有添加的基质(色氨酸充当基质)的阳离子谱中检测到构成整个PDAG分子的四个主要离子片段。高质量片段(m/z1282.71)由中性NH₃从N端片段离子[acALYDKGYTSKE]⁺中丧失而产生。低质量片段(m/z1133.30)与包含C端二酰基甘油(“DAG”)的y-离子[DCVGI-(DAG)]⁺一致。基峰(m/z1208.47)与内部z离子片段的色氨酸加合物[KEQKDCVGI]W⁺一致。在m/z1223.61观察到对应的y-离子(+15amu)。在m/z1207.53的y-离子是C端片段[TSKEQKDCVGI]⁺。

色氨酸：PDAG加合物与二羟基苯甲酸(DHB)的共结晶和通过MALDI-TOF质谱再分析给出也构成PDAG的整个结构的扩展系列的离子片段(图3)。

血清来源的PDAG产物在酸性条件下特别易于水解，并且这可能是在ESI或MALDI电离条件下难以获得分子离子的原因。在图1A中在4.83分钟至9.36分钟之间洗脱的峰是在10.42分钟洗脱的母体PDAG峰的水解产物(数据未显示)。因此，对纯化的PDAG进行弱酸水解，原位N端磺化，接着是对构成整个PDAG结构的水解产物的分析。对在PDAG的弱酸水解后产生的N端磺化的肽片段的PSDMALDI-TOF分析显示与之前观察的肽片段一致并构成PDAG完整结构的多个y-离子(图4)。因此，推定的PDAG结构acALYDKGYTSKEQKDCVGI-DAG与对天然产物的埃德曼降解序列分析、ESI-MS/MS序列分析和PSDMALDI-TOFMS分析一致。

鉴于PDAG中肽的推定序列，使用NCBIBLAST搜索工具BLASTP(Altshul，1997)搜索非冗余序列数据库中的同源序列。PDAG肽对瞬时受体电位通道相关蛋白1(TPRC1)中的558-574位的氨基酸的内部序列具有相同的序列同源性。没有记录到与其他已知蛋白或肽的显著同源性。来自牛、小鼠和人TRPC1的557-574位的氨基酸序列与推定的PDAG肽序列的比较揭示氨基酸序列相同，例外是在牛PDAG中的9-丝氨酸被脯氨酸替代。

实施例3

使用AAPPTEC348Sigma(AdvancedAutomatedPeptideProteinTechnologies，Inc.，Louisville，KY)肽合成仪通过具有H-异亮氨酸-2-氯三苯甲基树脂上的延伸的HBTU偶联的标准固相合成方案合成PDAG肽。结合至树脂的完全受保护的肽序列[Ala-Leu-Tyr(But)-Asp(OBut)-Lys(Boc)-Gly-Tyr(But)-Thr(But)-Ser(But)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asp(OBut)-Cys(Trt)-Val-Gly-Ile-树脂]在用二氯甲烷洗涤后被回收。通过添加在N，N-二异丙基乙胺(20％)和N，N-二甲基乙酰胺(70％)中的10％乙酸酐，结合肽的树脂在肽的N端丙氨酸处被乙酰化。在室温两小时后，将树脂过滤，相继用N，N-二甲基乙酰胺和二氯甲烷洗涤，并冻干。使用20ml在二氯甲烷中的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇的1∶4溶液将该乙酰化的且完全受保护的肽从树脂上切割。在室温两小时后，过滤树脂并用2ml的切割溶液洗涤。使用旋转蒸发器在真空中蒸发滤液。通过质谱分析样品以证实在m/z3286的预期质量(数据未显示)。

使用二环己基碳二亚胺/二甲基氨基吡啶(DCC/DMAP)偶联反应将1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油(SigmaAldrich)结合至完全受保护的乙酰化肽的C端异亮氨酸的羧基。将1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油(5mg)溶解在2ml的二氯甲烷中并且与溶解在2ml二氯甲烷中的2当量完全受保护的乙酰化肽和同样溶解在2ml二氯甲烷中的1当量DMAP相混合。使该反应在室温下过夜进行。使反应混合物在真空中干燥并通过添加8ml的脱保护溶液(2.5％1，2-乙二醇，94％三氟乙酸，0.1％三异丙基硅烷和2.5％水)在原位除去保护基。在存在脱保护溶液的情况下室温两小时孵育时间后，将反应混合物过滤并且将滤液在旋转蒸发器上在真空中蒸发。

通过反相制备级HPLC完成粗产物的纯化，并在220nm连续监测流出液，所述反相制备级HPLC使用JupiterProteo(Phenomenex，Inc.，Torrance，CA)柱和由5％到95％溶剂B经20分钟(每分钟4.5％)形成的二元流动相梯度(溶剂A：于水中的0.1％TFA，溶剂B：于乙腈中的0.1％TFA)，流速为1ml/分钟。在这些条件下在22.9分钟洗脱PDAG产物。将粗产物(63mg)溶解在4ml乙腈和2ml水中，并将其装载到制备级柱上。在22.9分钟洗脱的峰被收集在22.5ml的流动相(95％乙腈/0.1％TFA)中。在真空中蒸发流出液并且测量PDAG肽的最终质量为2.5mg(4％产率)，具有的纯度如由HPLC分析所确定的为98.9％。

实施例4

用合成的PDAG刺激成纤维细胞24小时。从成纤维细胞中提取RNA并通过实时PCR测量IL-6转录物以及通过ELISA测量培养基中的IL-6蛋白。我们发现，100pg/ml的PDAG刺激成纤维细胞与对照(未处理的细胞)相比提高了mRNA水平，P＝0.001。同样在PDAG处理的成纤维细胞中测量到约2倍多的IL-6蛋白(P＝0.0001)。这些结果被呈现在图5中。

实施例5

从与100pg/ml合成PDAG一起过夜孵育的原代人成纤维细胞中提取mRNA。测量了NALP3和NFκB的转录物。发现NALP3转录物提高了1.75倍(P＝0.007)，而NFκB转录物没有(P＝0.4)。这些结果被呈现在图6中。

实施例6

将THP-1单核细胞(5×10⁴个细胞/孔)培养在24孔微板内的具有10％FBS的汉克斯缓冲盐水1中。用2.5×10⁴AR39肺炎衣原体(CPn)细菌细胞感染细胞以给出MOI＝1，并且将受感染的细胞在感染后每日更换培养基保持72小时。在感染前24小时或感染后24小时用PDAG媒介物(在DMSO中的0.01％吐温-20)或PDAG(25ng/ml和50ng/ml)处理细胞。在72小时孵育时间后，收获细胞并用Cytoffx/Cytoperm(BDPharmingen)透化细胞，并加入小鼠α-CPn单克隆IgG(克隆61C75)且孵育透化的细胞1小时。在孵育后洗涤细胞并添加FITC标记的α-小鼠IgG，并孵育1小时。再次收获细胞并洗涤。通过流式细胞术测量感染的细胞的定量。通过台盼蓝排除法确定细胞的生存力。这些结果被呈现在图7中。

实施例7

将四环素可诱导的HBV稳定细胞系HepDES19细胞(Guo，2007)保持在具有青霉素和链霉素(Invitrogen)、10％FBS、500μg/mlG418(Invitrogen)以及1(g/ml四环素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的DMEM/F-12培养基中。为了启动HepDES19细胞中的HBV复制，从培养基中撤走四环素，并在病毒DNA分析之前将细胞培养4-5天。为了用PDAG处理细胞，将该肽添加在不含四环素的培养基中并且每天对该细胞培养物提供。在每次处理中将溶剂DMSO的浓度调整到0.01％。

如之前所述(Guo，2009)从PDAG处理的HepDES19细胞中提取HBV核心DNA。简言之，将来自一个35mm皿的细胞用0.5ml裂解缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，10mMEDTA，1％NP40和2％蔗糖)在37℃裂解10分钟。通过离心除去细胞碎片和细胞核，并将上清液与包含1.5MNaCl的130l的35％聚乙二醇(PEG-8000)混合。在冰中孵育1小时后，通过以10,000rpm在4℃离心5分钟沉淀病毒核衣壳，接着在200μl消化缓冲液[0.5mg/ml链霉蛋白酶(Calbiochem)，0.5％SDS，150mMNaCl，25mMTris-HClpH8.0和10mMEDTA]中在37℃消化1小时。消化混合物用苯酚提萃取两次，并且用乙醇沉淀DNA并将其溶解在TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)中。通过在1.5％琼脂糖凝胶中电泳分辨DNA样品。然后在室温下使凝胶在0.2NHCl中脱嘌呤10分钟，然后在包含0.5MNaOH和1.5MNaCl的溶液中变性1小时，接着在包含1MTris-HCl(pH7.4)和1.5MNaCl的缓冲液内中和1小时。然后将DNA吸印到20×SSC缓冲液中的Hybond-XL膜(GEHealthcare)上。用α-³²P-UTP(800Ci/mmol，PerkinElmer)标记的HBV负链特异性全长核糖核酸探针探测膜。在5mlEKONO杂交缓冲液(Genotech)中进行杂交，其中在65℃预杂交1小时，并且在65℃杂交过夜，接着用0.1×SSC和0.1％SDS在65℃洗涤1小时。将该膜暴露于磷光显像仪(phosphorimager)屏，并用QuantityOne软件(Bio-Rad)显示和定量杂交信号。

实施例8

用有(n＝3)或没有(n＝3)天然PDAG的FCA接种雌性新西兰白兔。在接种前一天抽取血液样品(背景)，并且在接种后第3、5、7、10、12、14和17天再次抽取。通过ELISA一式三份分析血清的结核分枝杆菌IgM的产生。使用第1天滴度对接种后每天的抗体滴度进行背景扣除。到接种后第5天，在用FCA+PDAG接种的兔中的IgM滴度显著大于只接受FCA的兔中的滴度(P＝0.0004)。这些结果被描绘在图9中。

实施例9

用致死剂量的、5×10³cfu/小鼠的鼠伤寒沙门氏菌攻击SwissWebster小鼠。这些小鼠中的十五只在致死接种前24小时用5μg/mlPDAG处理。饲养小鼠并每天监测持续10天。在第4天在对照组中观察到死亡，但在PDAG处理组中直至第7天才观察到死亡。到第10天，在PDAG处理组中的12只小鼠仍存活，而在未处理组中全部死亡，P＜0.0001。这些结果被描绘在图10中。

尽管已经参考具体实施方案对本发明进行了描述，但本领域的熟练工作人员将认识到可以例如在本文所述的具体实验情况中自本发明作出许多改变，并且应理解和了解依据本发明的公开内容仅显示了本发明的一些优选的实施方案和目的以及优点而不背离本发明的较宽的范围和精神。应理解和了解依据本发明的这些发现只是示范可由本领域普通技术人员设想的化合物的许多另外的潜在应用，并因此并非旨在以任何方式限制本发明。据此，从详细的说明书以及权利要求，本发明的其他目的和优点将对本领域熟练技术人员是明显的。

Claims

1.一种由氨基酸序列XLYDKGYTSKEQKDCVGIX组成的肽，其中X来自由天然存在的氨基酸、不存在、衍生氨基酸、非氨基酸辅基及其组合所组成的组，并且其中所述肽与二酰基甘油连接。

2.如权利要求1所述的肽，还包括所述肽的倒位物、模拟物或合成的等同物。

3.如权利要求1所述的肽，其中N端X是Q。

4.如权利要求1所述的肽，其中N端X是N-乙酰基丙氨酸。

5.一种包含权利要求1所述的肽的化合物，其中脂质与所述肽结合。

6.一种具有通式(I)的化合物：

其中X₁、X₂和X₃选自由氢、C₂到C₂₅脂肪酸及其组合组成的组，并且其中X₁、X₂和X₃中的至少一个是由权利要求1中所列的氨基酸序列组成的肽。

7.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效剂量的权利要求1所述的肽。

8.如权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物具有药学上可接受的缓冲剂或生理学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述药物组合物，其中所述缓冲剂来自由以下组成的组：乙酸的盐、柠檬酸的盐、硼酸的盐、磷酸的盐及其组合。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述载体制剂来自适合于以下的组：胃肠外、内部系统地、和局部途径，及其组合。

11.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述载体制剂来自适合于以下的组：口服、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、口腔或眼睛途径、经直肠和阴道内途径，及其组合。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述口服途径是作为口或鼻喷雾剂。

13.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物是以下形式：丸剂、片剂、锭剂、颗粒、胶囊、水溶液、醇溶液、油性溶液、糖浆、乳剂、悬浮液、栓剂、注射用溶液、软膏、酊剂、乳膏、洗剂、粉剂、喷雾剂、透皮治疗系统、气溶胶混合物、植入剂、棒或贴膏。

14.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物是以下形式：包衣片剂、软锭剂、硬胶囊或软胶囊、微胶囊或鼻喷雾剂。

15.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述肠胃外制剂包含湿润剂、悬浮剂、稀释剂、溶剂或其组合。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述稀释剂是1,3-丁二醇。

17.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述溶剂来自由以下组成的组：水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和无菌固定油。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述固定油是温和的固定油。

19.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述注射用溶液包含脂肪酸。

20.如权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物具有防腐剂。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述防腐剂来自包括苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞及其组合的组。

22.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述载体提供在所述鼻喷雾剂中的低浓度盐溶液。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述盐溶液为0.1％至2.0％。

24.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述盐溶液为0.65％。

25.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述喷雾剂的制剂具有用于有效分散所述化合物的基础粒度。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述粒度为0.1微米至20微米。

27.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述粒度为0.2微米至10微米。

28.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述粒度为0.2微米至5微米。

29.如权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物包含来自由以下组成的组的添加剂：表面活性剂、维生素、维生素衍生物、抗组胺药、湿润剂、防腐剂、保湿剂、乳化剂、增味剂及其组合。

30.一种药物递送系统，所述药物递送系统包括：

a.权利要求7所述的药物组合物；和

b.来自由以下组成的组的释放装置：延时释放、延迟释放、持续释放及其组合。

31.一种用于制备权利要求7所述的药物组合物的方法，所述方法包括：

a.获得所述化合物；和

b.把所述化合物与载体均匀地混合，

其中所述载体包含一种或多种辅助成分，所述载体是液体或固体。

32.如权利要求31所述的方法，其中通过在4％内酯溶液中分散所述化合物来辅助所述混合。

33.如权利要求7所述的药物组合物在制备用于增强抗原肽的免疫原性的药物中的用途。

34.一种用于合成PDAG的方法，所述方法包括：

a.通过固相法合成由权利要求1中所列的氨基酸序列组成的肽，其中所述合成不具有脱保护步骤；

b.激活C端羧酸；

c.与DAG和催化剂一起孵育，其中所述孵育产生PDAG；和

d.用试剂K切割肽侧链保护基。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述激活是用二环己基碳二亚胺。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述催化剂是用二甲基氨基吡啶。

37.如权利要求34所述的方法，其中通过色谱法纯化PDAG。

38.包含权利要求1所述的肽的化合物在制备用于治疗感染的药物中的用途。