CN102076842A

CN102076842A - 在光合生物中诱导絮凝

Info

Publication number: CN102076842A
Application number: CN2009801242452A
Authority: CN
Inventors: M·门德斯; C·贝恩克; Y·潘; P·李
Original assignee: Sapphire Energy Inc
Current assignee: Sapphire Energy Inc
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-26
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-06-26
Also published as: IL231312A0; US8969066B2; MA32491B1; CN102076842B; US20110159595A1; IL209814A0; AR072376A1; BRPI0914706A2; AU2009261966B2; PT2294179E; WO2009158658A3; IL231312A; EP2294179A2; EP2294179B1; WO2009158658A2; NZ589879A; EP2664668A1; ES2475973T3; US20150132829A1; IL209814A

Abstract

本发明提供了用于在光合生物中生产絮凝部分的组合物以及方法。将这些光合生物进行基因修饰以影响这些絮凝部分的生产、分泌、或两者。还提供了使生物絮凝的方法。

Description

在光合生物中诱导絮凝

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年6月27日提交的美国临时申请号61/076,430的权益，出于所有目的将其全部内容通过引用结合在此。

背景

藻类是单细胞生物，通过光合作用产生氧气。出于多种原因，一类(微藻)对于生物技术应用是有用的，这些原因包括它们的高生长速率以及对变化的环境条件的耐受性。在多种工业过程中用于商业上重要的产品的微藻的用途是已知的和/或已经被提出了。例如，微藻在生产营养补剂、药物、天然染料、用于鱼和甲壳动物的一种食物来源、生物防治农业害虫、在污水处理中产生氧以及去除氮、磷以及有毒物质、以及污染控制(如生物降解塑料或吸收二氧化碳)中具有用途。

微藻(像其他生物一样)含有作为膜组分、储藏产物、代谢产物以及能量来源的脂类和脂肪酸。已经发现一些藻株、硅藻、以及蓝细菌含有成比例地高水平的脂类(超过30％)。在寻找用于生产生物燃料的一种可持续原料中，具有高油或脂含量的微藻株是特别感兴趣的。

一些野生型藻类适合用于不同的工业应用中。然而，已经认识到通过修饰藻类来改进对于上述应用有用的具体特征，这些相关的方法更可能是商业上可行的。为此，可以开发具有超过野生型株的改进特征的藻株。已经通过传统的筛选和突变和选择技术完成了这样的开发。另外，已经广泛地提出了将重组DNA技术用于藻类。此类方法可以提高生产商业上有价值的产品的经济有效性。

为了生产一些感兴趣的商业产品，可以将生产这些产品的生物生长在液体环境中。从这些液体环境中去除这些生物有时是有利的。去除生物的一种方法是将这些生物絮凝或聚集以有助于去除。絮凝剂或絮凝化试剂通过引起液体中的胶体以及其他悬浮的颗粒物(例如细胞)聚集从而促进了絮凝，形成一种絮状物。将絮凝剂用于水处理过程中以提高小颗粒的沉淀。例如，可以将一种絮凝剂用于游泳池或饮用水过滤中以帮助去除微观颗粒，否则这些微观颗粒将引起水浑浊并且这些微观颗粒单独通过过滤将难以去除。

许多絮凝剂是多价阳离子，如铝、铁、钙或镁。这些带正电荷的分子与带负电荷的颗粒和分子相互作用从而减少聚集的障碍。此外，多种这些化学品在适当的pH和其他条件(如温度和盐度)下，与水反应从而形成不可溶的氢氧化物，当沉淀时这些氢氧化物连接到一起从而形成长链或网状，物理地将小颗粒俘获到该较大的絮状物中。

使用化学絮凝剂使微藻絮凝是已知的。长链聚合物絮凝剂，如修饰的聚丙烯酰胺，是由絮凝剂生产企业制造并销售的。这些可以以干的或液体的形式提供，用于该絮凝过程中。例如最常用的液体聚丙烯酰胺是作为一种具有10％-40％的活性物的乳液被提供的，并且剩余部分是一种载体流体、多种表面活性剂以及胶乳。

然而使用化学絮凝剂具有多个缺点。例如，用于水处理和其他过程中要求随后去除絮凝剂。加入和去除絮凝剂增加了商业生产一种感兴趣的产品的成本，因此降低了生产的经济可行性。

概述

本披露的一个方面提供了多种载体，这些载体包括一个对一个絮凝部分进行编码的核酸以及一个调节元件，该调节元件被连接为用于在一种光合生物的细胞核中表达该絮凝部分。在本发明中使用的这些絮凝部分可以包括碳水化合物结合蛋白、结合到莱茵衣藻、盐生杜氏藻(D.salina)、杜氏盐藻(D.tertiolecta)、或雨生血球藻的一个细胞表面抗原上的抗体、凝集素、FhuA蛋白、pb5蛋白、或形成一种牢固的蛋白-蛋白对的其他蛋白，其中该对导致微藻的絮凝。在这些载体中使用的这些调节元件可以包括一种组成型启动子、光诱导型启动子、群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、或氮饥饿响应型启动子。在此披露的这些载体还可以包含多种核酸，这些核酸能够将该絮凝部分靶向到细胞表面上并且将该絮凝部分的一部分进行锚定以使该絮凝部分的一部分被牢固地结合到该细胞表面上。使用这些载体来转化无维管的光合生物(如微藻)用于絮凝。在某些情况下，当将该絮凝部分分泌到该培养物中时，该锚定部分可以是任选的(取决于一个絮凝部分的特性)，是用于絮凝的优选的方法。

另一个方面提供了使用无维管的光合生物进行絮凝的方法。无维管的光合生物的实例是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。这些絮凝方法可以包括通过用不同的絮凝部分进行转化来产生两种明显不同的光合生物并且通过允许这两个絮凝部分彼此相互作用来引起絮凝。絮凝部分的实例包括：FhuA与pb5之间的蛋白-蛋白相互作用、交配型特异性凝集素之间的相互作用、一个抗体-抗原对、以及能够彼此识别为一对并且形成一种稳定的蛋白-蛋白复合体的其他蛋白。用于诱导无维管的光合生物絮凝的方法的实例是，改变光照条件、培养密度、培养温度、或养分有效性；在该培养物中加入凝集素、蛋白、重金属、阳离子的或化学的絮凝剂；或将上述絮凝剂附连到一种固体支持物上。

另一个方面提供了再利用来自一个液体环境的培养物液体的方法。可以将无维管的光合生物培养在具有本领域中已知的确定成分培养基的一种培养基中，如min-70、M-培养基、或TAP培养基。在絮凝后，再利用该培养物的液体部分经常是可能的并且经济上有利的。在此披露的是能够再利用包括对一个絮凝部分进行编码的生长的微生物的液体；将该生物与絮凝部分进行接触并且由此使该生物絮凝；并且从该液体环境中去除聚集的微生物的方法。

一个具体方面提供了一种用于使一种无维管的光合生物絮凝的方法，该方法包括在一种无维管的光合生物的外表面上表达一种对一个第一絮凝部分进行编码的外源核酸并且将该生物与一个第二絮凝部分进行接触。这种生物可以是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻，虽然可以使用其他属的成员。该第一絮凝部分可以是一种碳水化合物结合蛋白，如一种凝集素并且具体地一种c型凝集素。碳水化合物结合蛋白的其他非限制性实例包括：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。在其他实施方案中，该第一絮凝部分可以是一种单价的、单价态的或多价的抗体，例如一种scFv抗体，该scFv抗体结合到一种感兴趣的生物的表面上的一个抗原上。这类生物的实例包括衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的成员，如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。一些实施方案还可以包括使用一个第二絮凝部分。该第二絮凝部分可以是在一种固体支持物的表面上或在一个第二生物的表面上，该第二生物可以是或可以不是一种无维管的光合生物。当该第二絮凝部分被表达于一个第二生物的表面上时，该第二絮凝部分可以是天然发生的或可以是一种外源核苷酸序列表达的结果。在一些实施方案中，该第一和第二生物是相同的种，而在其他实施方案中，该第一和第二生物是不同的品系、不同的属或不同的界。例如，在一个实施方案中，该第一和第二生物两者都是藻类，而在另一个实施方案中，一个生物是一种藻类而另一个是一种细菌或酵母。当该第二絮凝部分是在一个第二生物或固体支持物的表面上时，该方法进一步包括将该第一生物与该第二生物、与该固体支持物或两者结合。

另一个方面提供了一种无维管的光合生物，该光合生物包括在该生物的外部细胞表面(如一个细胞膜或细胞壁)上的一种外源蛋白；该外源蛋白包括一个结合对的一个成员。该外源蛋白可以是一种抗体，如一种单链可变区片段(scFv)抗体，或一种碳水化合物结合蛋白，如一种凝集素(例如一种c型凝集素)。在其他实施方案中，该外源蛋白是一种抗原，该抗原是一种抗体的目标，并且在一个实施方案中，一种抗体对于那种抗原是特异的。在一些实施方案中，该外源蛋白是一种融合或嵌合蛋白，其中部分的该蛋白发挥作用将该蛋白锚定到该细胞表面上。该无维管的光合生物可以是一种藻类，例如一种绿藻，更具体地衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，并且更具体地莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻中的一种。在一个实施方案中，该无维管的光合生物是一种适盐生物，如盐生杜氏藻或杜氏盐藻。在又其他实施方案中，该碳水化合物结合蛋白是以下各项中的至少一个：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、或半乳凝素类。

又另一个方面提供了一种絮凝方法，该方法包括用一种对一个第一絮凝部分进行编码的核酸转化一个第一无维管性光合生物，用一种对一个第二絮凝部分或一种用于生产一个第二絮凝部分所必要的蛋白(该第二絮凝部分与该第一絮凝部分相互作用)进行编码的核酸转化一个第二生物，该第二生物可以是或可以不是一种无维管的光合生物，表达该第一和第二絮凝部分并且使这两部分进行接触从而使得絮凝发生。这两个生物可以是相同的或不同的属、相同的或不同的种或相同的或不同的界。例如，这些生物可以是相同种的藻类、不同种的藻类、或一种藻类和一种细菌或酵母。该第一生物、该第二生物或两者可以是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的成员，从而这些生物中的一个或两者可以是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。该第一或第二絮凝部分可以是抗体、碳水化合物结合蛋白或交配型特异性凝集素。

又另一个方面提供了一种载体，该载体包括：一个对一个絮凝部分进行编码的分离的核酸、一个用于在该光合生物中(例如在细胞核中)表达该絮凝部分的调节元件、以及一个允许该絮凝部分导向到该生物的表面上或被该生物分泌的靶向元件。该絮凝部分可以是一种抗体或在此所述的碳水化合物结合蛋白的任何一种。絮凝部分的具体实例包括抗体、凝集素、FhuA蛋白以及pb5蛋白。当该核酸编码一种抗体时，它可以是对于衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻的表面的抗原的。在某些实施方案中，该载体进一步包括一种对一个锚定元件进行编码的核酸，该锚定元件将该絮凝部分锚定到该生物的表面上。

又另一个方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括这些前述载体中的任何一个。该宿主细胞可以是或可以不是一种无维管的光合生物。在一些实施方案中，该宿主细胞是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。在另一个实施方案中，该宿主细胞是一种细菌或一种酵母。

又另一个方法提供了一种用于再利用液体(如水或一种基于水的生长培养基)的方法，该方法包括使一种无维管的光合生物生长在一个液体环境中(该无维管的光合生物包括一种对一个絮凝部分进行编码的外源核酸)，将该生物与一个第二絮凝部分进行接触(该第二絮凝部分直接地或间接地结合到该第一絮凝部分上，导致该生物的絮凝)，并且将该液体环境中至少一部分液体与该生物分离。该第一和第二絮凝部分可以是在此所述的多个部分中的任何一种，包括但不限于，抗体、碳水化合物结合蛋白、碳水化合物、重金属絮凝剂、化学絮凝剂、阳离子絮凝剂、以及交配型凝集素。该第二絮凝部分可以被附连到一个第二生物的表面上，该第二生物可以是或可以不是一种无维管的光合生物，或可以被附连到一种固体支持物上。

又另一个方面提供了一种使一种无维管的光合生物絮凝的方法，包括将该无维管的光合生物与一个第二生物进行接触，该第二生物包括一种对一种抗体进行编码的外源核酸，该抗体结合到该无维管的光合生物的表面上的一个抗原上，由此引起絮凝。在一个实施方案中，该抗体被表达在该第二生物的表面上。在另一个实施方案中，该抗体是一种单链可变区片段(scFv)抗体。在又另一个实施方案中，该外源核酸编码了一种融合或嵌合蛋白，该融合或嵌合蛋白包括该抗体以及一个锚定组分，该锚定组分将该抗体锚定到该第二生物的细胞膜或细胞壁的外表面上。在一个实施方案中，该第二生物是一种细菌，而在另一个实施方案中，该第二生物是一种酵母。该无维管的光合生物可以是一种绿藻，例如衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，并且更具体地莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。

另一个方面提供了一种将一种无维管的光合生物絮凝的方法，该方法包括将该无维管的光合生物与一个第二生物进行接触，该第二生物包括一种对一个絮凝部分进行编码的外源核酸，该絮凝部分结合到该无维管的光合生物的一个表面组分上，由此引起该无维管的光合生物的絮凝。该絮凝部分可以被该第二生物分泌、被表达在该第二生物的表面上、或两者。该第二生物可以是一种酵母、一种细菌、一种非光合藻类或一种光合藻类。在一些实施方案中，该第二生物是大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。该碳水化合物部分可以是下组中的多个成员中的至少一个成员，该组选自：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。在具体实施方案中，该碳水化合物结合蛋白是一种凝集素，例如一种c型凝集素。

在在此说明的实施方案中的任何一个中，一种对一个絮凝部分(如一种抗体或一种碳水化合物结合蛋白)进行编码的外源核酸可以进一步包括一个或多个调节元件(如一个启动子)。启动子可以是组成型的或诱导型的。诱导型启动子包括但不限于，光诱导型启动子、群体敏感型启动子、温度敏感型启动子或氮敏感型启动子。

应当理解的是，除非另外说明，当提及一个絮凝部分在一种生物或固体支持物的表面上表达或存在时，这种提及是指该生物或固体支持物的外表面，即该表面面对该有待絮凝的生物存在其中的环境。

通过引用进行结合

在本说明书中提到的所有公开物、专利、以及专利申请都通过引用以相同程度结合在此，如同各个单独的公开物、专利或专利申请都专门地并且个别地表明要通过引用进行结合。

附图简要说明

在所附权利要求中具体提出了本发明的新颖的特征。通过参考以下详细描述以及以下附图将获得对本发明特征和优点的更好的理解，这些详细描述提出了说明性实施方案(在这些说明性实施方案中使用了本发明的原理)：

图1展示了本披露中使用的多个构建体

图2是一个通过凝集素进行絮凝的流程图。执行Q.C.；执行大规模生长的质量控制，包括生长速率、培养基pH，以及对于菌株污染进行筛选。N；对于条件令人不满意来前进到下一个步骤的替代的工作流程。

图3是一个由一种抗-Fus1抗体诱导的絮凝的流程图。

图4是一个由FhuA和pb5的表达诱导的絮凝的流程图。

图5是一个在基因修饰的莱茵衣藻中由基因诱导的絮凝的流程图，这些基因是由氮饥饿来调节的。

图6显示了在大肠杆菌中生产的重组凝集素的活性。A-D是莱茵衣藻，其中A和C是阴性对照并且B和D是对应地存在来自盖罩大蜗牛(H.pomatia)和滑北螈(T.vulgaris)的FITC-结合的凝集素。E-H是二形栅藻，其中E和G是阴性对照并且F和H是对应地存在来自盖罩大蜗牛(H.pomatia)和滑北螈(T.vulgaris)的FITC-结合的凝集素。

图7显示将一种LppOmpA-凝集素融合蛋白插入大肠杆菌的细胞膜中。

图8显示了β-自转运蛋白扁豆(L.culinaris)凝集素融合蛋白对二形栅藻的沉淀的影响。

图9显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹显示了将一种LppOmpA-scFv5融合物正确地插入大肠杆菌的质膜中。

图10显示了在巴斯德毕赤酵母中分泌的凝集素的蛋白质印迹。标记1(盖罩大蜗牛凝集素)和2(扁豆凝集素)的代表性实例显示了蛋白分泌到该生长培养基中。

图11显示了在巴斯德毕赤酵母中表达这些支架凝集素融合蛋白：(1)Pir1b-盖罩大蜗牛凝集素，(2)Pir1b-扁豆凝集素，以及(3)Pir1a-滑北螈凝集素。

图12显示了将一种Pir1a-凝集素融合蛋白插入巴斯德毕赤酵母的膜中。

图13显示了Fas1-凝集素融合物的表达。条带1：Fas1-扁豆凝集素；条带2：Fas1-截短的扁豆凝集素；条带3：Fas1-鸡冠刺桐(E.cristagalli)凝集素。

图14显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹描述了Fas1-凝集素融合蛋白的亚细胞定位。WT：21gr；对照：细胞质酶；1：Fas1-扁豆凝集素融合物；2：Fas1-截短的扁豆凝集素融合物；3：Fas1-T.鸡冠刺桐凝集素融合物。

图15显示了Fas1-滑北螈凝集素融合蛋白构建体的存在对沉降的影响。

图16显示了在莱茵衣藻中全细胞表达GP1-凝集素蛋白。1：GP1-盖罩大蜗牛凝集素融合物；2：GP1-截短的扁豆凝集素融合物。

图17显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹显示了GP1-凝集素融合蛋白的亚细胞定位。WT：21gr；对照：细胞质酶；GP1-盖罩大蜗牛凝集素。

图18显示了GP1-盖罩大蜗牛凝集素构建体的存在对沉降的影响。

图19显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹显示了在莱茵衣藻中表达一种scFv5-Fas1融合蛋白。1：该融合蛋白在此显示。较高的条带是残留的与争光霉素蛋白的完整融合物。

图20显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹描述了Fas1融合蛋白的亚细胞定位。WT：21gr；对照：细胞质酶；scFv5-Fas1融合物。存在定位于该膜部分上的scFv5-Fas1蛋白。(箭头)。

图21显示了在莱茵衣藻中NO₃ ^-诱导表达盖罩大蜗牛凝集素。泳道1：时间0，TAP；泳道2：时间12小时，TAP；泳道3：时间24小时，TAP；泳道4：时间12小时，TAP-NH₄Cl+7.4mM KNO₃；泳道5：时间24小时，TAP-NH₄Cl+7.4mM KNO₃泳道6：对照。

图22显示了在氮缺乏后两个莱茵衣藻株的絮凝。

图23显示了在将氮减少到最小后两个莱茵衣藻株的絮凝。

详细说明

本披露在此提供了在光合生物中并且具体地在无维管的光合生物(NVPO)中引发絮凝的新颖的方法。出于工业或农业的目的，光合生物、具体地单细胞的生物如微藻或蓝细菌的生长经常涉及从液体环境中收获这些生物的细胞。当前，许多这种收获是通过离心、压带机处理、向液体环境中加入化学絮凝剂、或多种方法的一些组合来完成的。传统的絮凝方法可能导致额外的成本(例如，絮凝剂的成本、从该液体和/或生物中去除絮凝剂的成本、等)以及其他问题(例如，污染，产品纯化、等)。本披露提供了用于使光合生物絮凝的新颖的组合物、宿主细胞以及方法，这些新颖的组合物、宿主细胞以及方法能够克服传统的絮凝方法的缺点。

本披露利用了不同分子之间的强的分子相互作用(例如，抗体与抗原、蛋白和碳水化合物、蛋白-蛋白结合对、等)。可以使用絮凝对(两个组分的复合体)或絮凝复合体(多于两个组分的复合体)。在一些实例中，一个絮凝对或复合体的一个成员将被自然地表达在将被絮凝的一个生物上，但是生产的水平可以从基因方面被提高。在其他实例中，一个絮凝对或复合体的一个成员将被重组地表达于有待絮凝的一个生物上。然后将该生物与该第二(和/或随后的)絮凝部分进行接触以诱导絮凝。附带地可以将该第二或随后的絮凝部分加入(例如，到一种固相如一种珠粒或筛上)，在一个分离的生物上进行表达(该生物与该第一生物可以是相同的或不同的种)然后将该分离的生物与该第一生物进行接触、或在相同的生物上进行表达(例如，在一个可诱导型调节元件的控制下)。

所使用的一种方法涉及基因操作一种光合生物(例如一种NVPO)以表达一个或多个絮凝部分。基因操作可以涉及用一种对一个絮凝部分进行编码的核酸瞬时地或整合地转化一种光合生物(例如，莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、雨生血球藻)或一种非光合生物(例如大肠杆菌)。在一些实例中，该絮凝部分是一种能够结合到另一种蛋白、一种碳水化合物或另一种感兴趣的分子上的蛋白。例如，可以用一个对融合到一个抗体上的一个莱茵衣藻细胞表面蛋白进行编码的基因转化莱茵衣藻，从而在该细胞的表面上抗体的表达将引起这些转化的细胞的或任何其他目标生物的絮凝。已经在莱茵衣藻的叶绿体中生产了抗体，但是这样的表达没有在该细胞的表面上产生抗体。参见，例如Mayfield et al.，PNAS 100(2)：438-42(2003)。可替代地，该抗体可以被表达于一种非光合生物的表面上。在一个实施方案中，该非光合生物是一种原核生物如一种细菌。在另一个实施方案中，该非光合生物是一种真核生物，例如一种真菌，并且更具体地一种酵母。然后该非光合生物的表面上的细胞表面抗体结合到多个光合生物上，导致了絮凝。

宿主细胞

本披露还考虑了用在此所述的一个或多个核酸转化的一种宿主细胞。在某些实施方案中，该宿主细胞是光合的。在一些情况下，该宿主细胞是光合的并且无维管的。在其他情况下，该宿主细胞是光合的并且有维管的。在又其他情况下，该宿主细胞是非光合的。该宿主细胞可以是真核的或原核的。可以用对一个或多个絮凝部分进行编码的多个基因转化一些宿主细胞。例如，一个单个的转化的细胞可以包含对一个、两个、三个或更多个蛋白或其亚基进行编码的外源核酸。例如，可以用对一种抗体进行编码的一个基因转化一种藻类如莱茵衣藻、一种细菌如大肠杆菌或一种蓝细菌、或一种酵母如巴斯德毕赤酵母，该抗体识别该有待絮凝的生物的一种细胞表面蛋白，其中将该抗体作为一种融合蛋白或以两个或更多个内部组装的亚基进行生产。该有待絮凝的生物可以是与表达该表面蛋白的生物相同或不同。这些构建体可以包含相同基因的多个拷贝、和/或对相同蛋白进行编码的多个基因、和/或在该编码序列的一个或多个部分中具有突变的多个基因。

可以用一种在此所述的载体(例如包括一个或多个絮凝部分编码基因的一种载体)转化该宿主细胞。该载体可以包含用于转化该宿主细胞的细胞核或一个叶绿体或其他质体的一个质体启动子或一个核启动子。该载体还可以编码一种融合蛋白或试剂，该融合蛋白或试剂选择性地将该载体产物靶向到细胞核或该叶绿体或其他质体中。使用本领域中已知的任何方法，可以发生一种宿主细胞的转化。

一个宿主生物是包括一种宿主细胞的一个生物。在某些实施方案中，该宿主生物是光合的。一种光合生物是一种生物，该生物是自然地光合的(具有一种质体)或该生物是被基因设计为或另外地被修饰为是光合的。在一些实例中，可以用一种构建体转化一种光合生物，该构建体使得该光合装置的全部或部分不可操作。在一些实例中，它是无维管的并且光合的。该宿主细胞可以是原核的。本发明的一些光合原核生物的实例包括但不限于蓝细菌(例如蓝藻、集胞藻、节旋藻(Athrospira))。该宿主生物可以是单细胞的或多细胞的。在几个实施方案中，该宿主生物是真核的(例如绿藻)。在此考虑的生物的实例包括但不限于，红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰藻门、chlorarachniophytes、裸藻、定鞭藻门、隐藻、腰鞭毛类、以及浮游植物。在其他实施方案中，该宿主生物是非光合的。非光合宿主生物包括细菌和酵母。适合的细菌宿主生物的实例可以在变形菌门中找到，并且包括但不限于大肠杆菌。适合的酵母生物的实例可以在子囊菌门中找到，并且包括但不限于巴斯德毕赤酵母以及酿酒酵母。

一个宿主生物可以在允许光合作用的条件下进行生长，然而，这不是一个必要条件(例如，一个宿主生物可以在无光下进行生长)。在一些实例中，该宿主生物可以以这样一种方式被基因修饰，即减少和/或破坏光合作用的能力。在生长条件下当一个宿主生物不能光合作用时(例如由于无光和/或基因修饰)，典型地，将向该生物提供必需的营养物以支持在无光合作用下的生长。例如，可以用任何需要的营养物补充一个生物在其中(或其上)生长的一种培养基，这些营养物包括一种有机碳源、氮源、磷源、维生素、金属、脂类、核酸、微量营养物、或一种生物特异的需要物。有机碳源包括该宿主生物能够代谢的任何碳源，包括但不限于，乙酸盐、简单的碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖)、复杂的碳水化合物(例如淀粉、糖原)、蛋白、以及脂类。本领域的普通技术人员应当认识到不是所有的生物都将能够充分地代谢一种特定的营养物并且应当意识到营养物混合物可能需要从一种生物到另一种生物进行修饰，从而提供适当的营养物混合物。

可以将一个宿主生物生长在陆地上，例如在池塘、水渠、垃圾中，或生长在封闭的或部分封闭的生物反应器系统中。也可以将这些宿主生物直接生长在水中(例如洋、海、湖、河、水库、等)。在藻类被大量培养的实施方案中，可以将该藻类生长在高密度光生物反应器中。大量培养藻类的方法在本领域中是已知的。例如可以将藻类生长在高密度光生物反应器中(参见，例如Lee et al，Biotech.Bioengineering 44：1161-1167，1994)以及其他生物反应器(例如用于污水和废水处理的那些)中(例如Sawayama et al，Appl.Micro.Biotech.，41：729-731，1994)。此外，可以将藻类大量培养以去除重金属(例如Wilkinson，Biotech.Letters，11：861-864，1989)、氢(例如美国专利申请公开号20030162273)、以及药物化合物。

一个示例性的组的生物是绿藻。一个实例，衣藻属，是单细胞绿藻的一个属(绿藻门)。这些藻类被发现于土壤、淡水、海洋、以及甚至在山顶上的雪中。在这个属中的藻类具有一个细胞壁、一个叶绿体、以及两个允许在液体环境中移动的前面的鞭毛。已经描述了超过500个不同的种的衣藻。

最广泛使用的实验室种是莱茵衣藻。这个种的细胞是单倍体，并且可以在一个无机盐的简单的培养基上生长，利用光合作用来提供能量。如果提供乙酸盐作为一种碳源，它们也可以在全黑暗中生长。当缺乏氮时，莱茵衣藻细胞可以分化成同形配子。存在两个不同的交配型，指定为mt+和mt-。这些进行两性之间地融合，由此产生了一个厚壁的合子，该合子形成一个坚硬的外壁，该外壁保护它免受不同的环境条件。可以使用受控制地表达交配型凝集素以帮助絮凝。当在光和水存在下恢复到氮培养基中时，该二倍体接合孢子经历了减数分裂并且释放四个单倍体细胞，这四个单倍体细胞重新开始植物性的生命周期。在有丝分裂生长中，这些细胞以每八个小时进行快速加倍。莱茵衣藻细胞可以在一个广泛排列的条件下生长。虽然一个专用的、温度控制的空间可以导致最佳的生长，莱茵衣藻在室温下在标准荧光下可以容易地生长。通过将这些细胞放在一个光亮-黑暗循环上并且剥夺它们的乙酸盐，可以使这些细胞同步。

莱茵衣藻的核遗传学已被良好地建立。存在已经被表征的大量的变异体并且莱茵衣藻中心(www.chlamy.org)保存了广泛集合的变异体、连同衣藻属种的注释的基因组序列。已经在莱茵衣藻中开发了大量的叶绿体变异体以及几个线粒体变异体。

术语“植物”在此广泛地被使用，是指含有质体、具体地叶绿体的一种真核生物，并且包括处于发育的任何阶段的任何这样的生物，或是指一个植物的一个部分，包括一个植物插条、一个植物细胞、一个植物细胞培养物、一个植物器官、一个植物种子、以及一个小植株。一个植物细胞是该植物的结构和生理的单位，包括一个原生质体和一个细胞壁。一个植物细胞可以是处于一种分离的单细胞或一种培养的细胞的形式、或可以是更高的组织化的单位的一部分(例如，一个植物组织、植物器官、或植物)。因此，一个植物细胞可以是一个原生质体、一个产生配子的细胞、或可以再生成一个整株植物的一个细胞或多个细胞的集合。这样，出于本披露的目的，包括多个植物细胞并且能够再生成一个整株植物的一个种子被认为是植物细胞。一个植物组织或植物器官可以是一个种子、原生质体、愈伤组织、或被组织成一个结构和功能单位的任何其他组的植物细胞。一个植物的特别有用的部分包括可收获的部分以及对于繁殖子代植物有用的部分。一个植物的一个可收获的部分可以是一个植物的任何有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根、等。对于繁殖有用的一个植物的一个部分包括例如，种子、果实、插条、幼苗、块茎、根茎、等。

载体

在此所述的载体可以能够稳定转化多种光合生物，包括但不限于，光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyt、灰藻门、chlorarachniophytes、裸藻门、裸藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐藻、甲藻门、腰鞭毛类、金黄藻门(pyrmnesiophyta)、硅藻门、黄藻门、黄绿藻(eustigmatophyta)、绿胞藻(raphidophyta)、褐藻门、以及浮游植物。其他载体能够稳定转化莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。仍然有其他载体能够稳定转化非光合生物如酵母和细菌。用于稳定转化细菌和酵母的载体在本领域中是熟知的并且可以从商业经销商处得到。表达载体可以被设计以生产异源的和/或同源的一个或多个感兴趣的蛋白(例如，抗体、交配型凝集素、等)。此类载体对于重组地生产感兴趣的蛋白是有用的。此类载体对于修饰宿主细胞的天然表现型(例如表达一个絮凝部分)也是有用的。

可以将一个表达盒构建在一个适当的载体中。在一些实例中，该盒被设计以便在一个宿主细胞中表达一个或多个编码蛋白的序列。可以使用本领域中已知的标准技术构建此类载体。在一个典型的表达盒中，该启动子或调节元件被放置在一个编码序列的5’或上游侧，该编码序列的表达是所希望的。在其他盒中，可以将多个序列放置在一个编码序列的侧翼，当这些序列插入一个目标基因组(例如核或质体)中时，这些序列允许表达。例如，可以将一个对一个絮凝部分进行编码的核酸插入一个宿主细胞的一个核基因组中，从而由一个天然发生的调节元件控制该絮凝部分的表达。在本披露中，可以使用任何调节元件，这些调节元件在适当条件下提供表达，从而mRNA或蛋白产物被表达到一个水平，该水平足以产生被转化的NVPO的絮凝。

可以将一个或多个另外的编码蛋白的序列可操作地融合到一个启动子的下游或3′上。可以使用对于单个蛋白的编码序列、以及对于两个或更多个蛋白的融合物的编码序列。编码序列还可以包含另外的元件，这些元件将允许这些被表达的蛋白被靶向到该细胞表面上并且或者被锚定到该细胞表面上或者被分泌到环境中。在设计该载体中还使用了一个选择性标记用于有效地选择被该载体转化的绿藻。可以将一个选择性标记和另一个人们希望引入的序列两者都引入，融合到一个单个的启动子上或其下游处。可替代地，可以引入两个编码蛋白的序列，各自在一个启动子的控制下。

如在此使用的术语，一个调节元件，广泛地是指一个核苷酸序列，该核苷酸调节了一个多核苷酸的转录或翻译或将一个多肽定位到它被可操作地连接处。一个调节元件对于对该多肽进行编码的核苷酸序列可以是天然的或外来的。此类元件包括但不限于，一个核糖体结合位点(RBS)、一个前导序列、一个聚腺苷酸化序列、一个前肽序列、一个启动子、一个信号肽序列、以及一个转录终止子、一个增强子、一个引发(起始)密码子、一个用于内含子切除和保持一个正确的阅读框的剪接信号、一个STOP密码子、一个琥珀或赭石密码子、和/或一个内部的核糖体进入位点(IRES)。典型地，一个调节元件包括一个启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入特异性限制酶切位点的目的，可以将接头提供给这些元件，该特异性限制酶切位点的引入有助于将对一个多肽进行编码的核苷酸序列的编码区与这些控制序列进行连接。在一些实例中，这类载体包括启动子。此外，一个细胞区室化信号(即将一个多肽靶向到细胞质、细胞核、叶绿体膜或细胞膜上的一个序列)。此类信号在本领域中是熟知的并且已经被广泛报道(参见例如美国专利号5,776,689)。对于本发明有用的启动子可以来自任何来源(例如，病毒的、细菌的、真菌的、原生生物的、动物的)。在此考虑的启动子可以是对于光合生物、无维管的光合生物、有维管的光合生物(例如藻类、有花植物)、酵母以及细菌特异性的。如在此使用的，术语“无维管的光合生物”是指任何宏观的或微观的生物，包括但不限于，藻类、蓝细菌以及光合作用细菌，它们不具有一个如在高等植物中所发现的维管系统。在一些实例中，将上述的核酸插入一个载体中，该载体包括一个光合生物(如藻类)的一个启动子。该启动子可以是一个用于在该细胞核中或在一个叶绿体和/或其他质体中的表达的启动子。所考虑的用在此的多个核酸中的任何一个插入该叶绿体中的启动子的实例包括披露于美国申请号2004/0014174中的那些。适合用于细菌中的启动子包括但不限于，来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)，如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、以及劳氏肉瘤病毒(RSV)。该启动子可以是一个组成型启动子或一个诱导型启动子。典型地一个启动子包括靠近转录起始位点(例如一个TATA元件)的必需的核酸序列。

为了构建该载体，可以将在一个适合的启动子的控制下表达的一个基因的上游DNA序列绘制限制性酶切图谱并且将对于该蛋白的表达重要的区域进行表征。确定该基因的起始密码子的精确位置，并且使用该信息和该限制性酶切图谱，可以设计一个载体用于通过去除负责编码该基因的蛋白的区域并且留下被发现含有负责控制基因的表达的遗传物质的上游区域来表达一种异源蛋白。一个合成的寡聚核苷酸优选地被插入该蛋白序列曾经位于其中的位置中，从而通过使用限制性内切核酸酶位点可以将任何另外的基因克隆到该合成的寡聚核苷酸(即一个多克隆位点)中。然后在这个位点处被插入的一个不相关的基因(或编码序列)将处于一个现存的起始密码子和上游调节区的控制下，该起始密码子和上游调节区将驱动被这个基因编码的外来(即不是正常地存在的)蛋白的表达。一旦将对于该外来蛋白的基因放到一个克隆载体中，可以使用几种方法中的任何一种将它引入该宿主生物中，这些方法中的一些对于该宿主生物可能是特定的。这些方法的变体被描述于一般性文献中。操作多个条件以优化对于一个特定宿主的转化是在本领域的技能之内的。

对于用于插入不同的DNA表达盒的质粒的类型，可以使用任何常规的质粒。这些质粒或载体可以包括这样的载体如pUC或其衍生物、pBR322、pBluescript、或pGEM。其他载体包括从Invitrogen(Carlsbad，CA USA)可获得的pPIC3.5K、pPIC9K以及pAO815。基于这些标志物的本性、方便的限制酶切位点的有效性、拷贝数目等选择一种特定的质粒。对该感兴趣的多肽进行编码的DNA序列可以是合成的、天然衍生的、或它们的任何组合。取决于该感兴趣的DNA序列的本性，使用NVPO中优选的密码子来合成该序列可能是令人希望的。对该感兴趣的多肽进行编码的DNA序列可以是一个结构基因或它的一部分，该部分提供了一种所希望的表达产物。该基因可以是任何基因，不论对于该宿主是天然的、天然的变异体、或外来的。术语外来的旨在表示对于该宿主细胞一个基因不是内源的，但是可以包括固有的序列，如与NVPO自然地结合的病毒序列和细菌序列。

一个所使用的载体还可以包含一个或多个另外的核苷酸序列，这些另外的核苷酸序列为该载体提供了令人希望的特征，这些序列包括例如，如有助于操作该载体的克隆位点的多个序列、指导该载体的复制或其中包含的核苷酸序列的转录的多个调节元件、编码一种选择性标记的多个多个序列、等。这样，该载体可以包含例如一个或多个克隆位点例如可以，但不需要，将一个多克隆位点定位，从而可以将一个异源的多核苷酸插入该载体中并且可操作地连接到一个所希望的元件上。该载体还可以包含一个原核生物的复制起点(ori)，例如一个大肠杆菌ori或一个粘粒ori，因此根据需要允许将该载体传递到一个原核生物宿主细胞中以及一个植物叶绿体中。这样一些特征与适当的选择性标记进行组合允许该载体在目标宿主细胞与该细菌和/或酵母细胞之间被“穿梭”。能够将一个穿梭载体传递到一个第二宿主中可以允许更方便地操作该载体的这些特征。例如，可以使用常规方法将包含该载体以及假定插入的感兴趣的多核苷酸的一个反应混合物转化到原核生物宿主细胞如大肠杆菌中、进行扩增并且收集，并且进行检查以鉴定含有一个感兴趣的插入物或构建体的载体。如果希望，例如通过进行被插入的多核苷酸的位点定向诱变、然后再次扩增并选择具有感兴趣的一个突变的多核苷酸的载体，可以将该载体进一步操作。然后可以将一个穿梭载体引入植物细胞叶绿体中，其中可以表达并且分离(如果希望)一个感兴趣的多肽。

一个载体或其他重组核酸分子可以包括一个对一个报告多肽或其他选择性标记进行编码的核苷酸序列。术语“选择性标记”是指提供一个可检出的表现型的一个多核苷酸(或编码的多肽)。一个报告基因通常编码一个可检出的多肽，例如一个绿色荧光蛋白或一种酶(如萤虫素酶)，当与一种适当的试剂(对应地一个特定波长的光或荧光素)接触时它们产生了一个信号，该信号可以通过目测或使用适当的仪器被检测到(Giacomin，Plant Sci.116：59-72，1996；Scikantha，J.Bacteriol.178：121，1996；Gerdes，FEBSLett.389：44-47，1996；还参见Jefferson，EMBO J.6：3901-3907，1997，fl-glucuronidase)。一个选择性标记通常是一种分子，当在一个细胞中存在或表达时，该分子为含有该标记的细胞提供了一个选择性的优点(或缺点)，例如能够在一种试剂的存在下生长，否则该试剂将杀死该细胞。

一个选择性标记可以提供一种获得表达该标记的原核生物细胞或植物细胞或两者的方法并且因此作为一个载体的一个组分可以是有用的(参见例如Bock，上述，2001)。选择性标记的实例包括但不限于提供抗代谢物耐受性的那些，例如二氢叶酸还原酶，它提供了对甲氨蝶呤的耐受性(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13：143-149，1994)；新霉素磷酸转移酶，它提供了对氨基糖甙新霉素、卡那霉素以及巴龙霉素的耐受性(Herrera-Estrella，EMBO J.2：987-995，1983)，Hygro，它提供了对潮霉素的耐受性(Marsh，Gene 32：481-485，1984)、trpB，它允许细胞使用吲哚代替色氨酸；hisD，它允许细胞使用组氨醇代替组氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85：8047，1988)；甘露糖-6-磷酸异构酶，它允许细胞使用甘露糖(WO 94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，它提供对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸的耐受性(DFMO；McConlogue，1987，In：Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring HarborLaboratory ed.)；以及来自土曲霉的脱氨酶，它提供了对杀稻瘟菌素S的耐受性(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59：2336-2338，1995)。另外的选择性标记包括提供除草剂耐受性的那些，例如草胺膦乙酰转移酶基因，它提供了对草胺膦的耐受性(White et al.，Nucl.Acids Res.18：1062，1990；Spencer et al.，Theor.Appl.Genet.79：625-631，1990)，一种突变的EPSPV-合酶，它提供了草甘膦耐受性(Hinchee et al.，BioTechnology 91：915-922，1998)，一种突变的乙酰乳酸合酶，它提供了咪唑啉酮或磺酰脲耐受性(Lee et al.，EMBO J.7：1241-1248，1988)，一种突变的psbA，它提供了对莠去津的耐受性(Smeda etal.，Plant Physiol.103：911-917，1993)，或一种突变的原卟啉原氧化酶(参见美国专利号5,767,373)，或提供对除草剂如草丁膦耐受性的其他标记。选择性标记包括多个多核苷酸，这些多核苷酸为真核细胞提供了二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素耐受性以及为原核生物如大肠杆菌提供了四环素、氨苄西林耐受性；以及为植物中提供了争光霉素、庆大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、腐草霉素、草丁膦、大观霉素、链霉素、氨苯磺胺以及磺酰脲耐受性(参见例如Maliga et al.，Methods in Plant Molecular Biology，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1995，page 39)。

一个编码多核苷酸的一个或多个密码子可以被偏爱以反映该宿主细胞或它的一个细胞器(例如叶绿体)中的优选的密码子使用。大多数氨基酸是由两个或更多个不同的(简并的)密码子来编码的，并且已经充分地认识到不同生物优选于其他的密码子使用某些密码子。与在细菌和酵母中具有密码子偏爱一样(参见例如Gene 18：199-209(1982)；FEBS Lett.，285：165-169(1991)；J.Biol.Chem.，257：3026-3031(1982))，已经报道了莱茵衣藻的密码子偏爱(参见美国申请2004/0014174)。

当用于提及一个密码子时术语“偏爱”是指一个多核苷酸中的一个密码子的序列已经被改变，从而该密码子是一个密码子，该密码子被优选地用于该偏爱所针对的目标中，例如藻类细胞、叶绿体、细菌或酵母。一个偏爱一个特定的密码子使用的多核苷酸可以被从头合成的，或可以使用常规的重组DNA技术(例如通过一种定点诱变方法)被基因修饰的以改变一个或多个密码子，从而使它们偏爱叶绿体密码子使用。密码子偏爱在不同植物中可以被不同地倾斜，包括例如与烟草相比在藻类中。通常，所选择的密码子偏爱反映了正在用本发明的核酸转化的植物(或其中的细胞器)的密码子使用。例如，当莱茵衣藻是宿主时，叶绿体密码子使用可以被偏爱以反映核或叶绿体的密码子使用(例如对于靶向叶绿体的序列在第三个密码子位置处大约74.6％AT的偏爱)。可替代地，当细菌或酵母被用作宿主生物时，可以将密码子使用偏爱那些生物。

在此披露了在不同的絮凝方法中所使用的载体。这些载体或质粒可以包括被所使用的宿主生物的基因转录机器识别的多个调节元件，包括用于核或质体的基因、可操作地连接到这些调节元件上的编码序列、允许选择被该载体转化的宿主细胞的选择性标记、以及允许将该载体稳定地整合到一个宿主生物的核或质体基因组中的其他元件。调节元件的实例包括但不限于，组成型启动子、光诱导型启动子、群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、或氮饥饿响应型启动子。光诱导型启动子的一个实例被描述于美国专利号6858429中。可以被在本披露中使用的多核苷酸编码的絮凝部分的实例包括但不限于FhuA、pb5、衣藻属雄性配子凝集素(mt+)、衣藻属雌性配子凝集素(mt-)、凝集素、碳水化合物结合蛋白、抗体(例如抗碳水化合物抗体、抗鞭毛抗体、抗-Fus1抗体、抗-细胞表面蛋白抗体)。选择性标记的实例可以包括但不限于卡那霉素、腐草霉素、争光霉素、潮霉素、或博莱霉素。

转化宿主细胞

通过将同源的和/或异源的DNA引入一群目标细胞中并且选择已经吸收了该DNA的细胞生产转化的细胞。例如，可以将包含具有一个选择性标记(该选择性标记提供了对卡那霉素的耐受性)的外源DNA的转化体在含有卡那霉素的环境中进行生长。

用于在光合生物中转化和表达的基本技术与通常使用的用于大肠杆菌、酿酒酵母以及其他种的那些技术类似并且包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺、原生质体融合、脂质体、直接显微注射到细胞核中、划痕负载、以及电穿孔。对于一种NVPO(例如一株藻类的叶绿体)的专门的转化方法在本领域中是已知的。这些方法已经被描述于用于标准的分子生物学操作的多个文本中(参见Packer&Glaser，1988，“Cyanobacteria”，Meth.Enzymol.，Vol.167；Weissbach&Weissbach，1988，“Methods for plant molecular biology，”AcademicPress，New York，Sambrook，Fritsch&Maniatis，1989，“Molecular Cloning：Alaboratory manual，”2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；以及Clark M S，1997，Plant Molecular Biology，Springer，N.Y.)。这些方法包括例如生物弹装置(参见例如Sanford，Trends In Biotech.(1988)6：299-302，美国专利号4,945,050；电穿孔(Fromm et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)(1985)82：5824-5828)；使用一个激光束、电穿孔、显微注射或能够将DNA引入一个宿主细胞(例如一个NVPO)中的任何其他方法。

质体转化是用于将一个多核苷酸引入一个植物细胞叶绿体中的常规的并且熟知的方法(参见美国专利号5,451,513、5,545,817、以及5,545,818；WO95/16783；McBride et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91：7301-7305，1994)。在一些实施方案中，叶绿体转化涉及将侧翼的一个所希望的核苷酸序列引入叶绿体DNA的多个区域中、允许该外源DNA同源重组到该目标叶绿体基因组中。在一些实例中，可以使用叶绿体基因组DNA的一到1.5kb的侧翼核苷酸序列。使用这种方法，在叶绿体16S rRNA和rps12基因中的点突变(它提供了对大观霉素和链霉素的耐受性)可以被使用作为选择性标记用于转化(Svab et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 87：8526-8530，1990)，并且可以导致稳定的同质的转化体(以大约百分之一轰击目标叶的频率)。

微弹介导的转化还可以被用于将一个多核苷酸引入一个植物细胞中(Kleinet al.，Nature 327：70-73，1987)。这种方法使用微弹(如金或钨)，通过用氯化钙、亚精胺或聚乙二醇进行沉淀用所希望的多核苷酸对这些微弹进行包被。使用一个装置如BIOLISTIC PD-1000基因枪(BioRad；Hercules Calif.USA)，将这些微弹颗粒进行加速以高速度进入一个植物组织中。使用生物弹方法用于转化的方法在本领域中是已知的(参见例如；Christou，Trends in Plant Science1：423-431，1996)。例如已经使用了微弹介导的转化来产生多种转基因植物种，包括棉花、烟草、玉米、杂交白杨以及番木瓜。已经使用微弹介导的递送还转化了多种重要的谷类作物如小麦、燕麦、大麦、高粱以及稻(Duan et al.，NatureBiotech.14：494-498，1996；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.5：158-162，1994)。用以上所述的方法转化大多数双子叶植物是可能的。单子叶植物的转化也可以使用例如如以上所述的生物弹方法、原生质体转化、电穿孔部分渗透的细胞、使用玻璃纤维引入DNA、玻璃珠搅拌方法等进行转化。通过用一个显性的选择性标记(包括但不限于细菌aadA基因)替换隐性rRNA或r-蛋白抗生素耐受性基因可以增加转化频率(Svab and Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90：913-917，1993)。

絮凝部分

为了从本发明的一种宿主细胞(例如一种NVPO)中收获一种感兴趣的产物，从宿主细胞生长于其中的液体中有效地分离该宿主细胞经常是有用的。过去已经使用了从液体中分离生物的多种方法。例如离心已经被成功地用于在小规模培养中从液体培养基中分离细胞。然而，对于通常涉及在大量的水(例如一个池塘、一个湖泊、一个生物反应器、等)中生长一种生物的大规模应用，离心可能是耗时间的和/或成本高不可及的。絮凝是用于大规模和小规模应用的分离细胞的一种替代的方法。某些化学絮凝剂(如重金属)提出一个挑战，因为该金属可能需要从该絮凝的生物中被去除用于下游过程(例如酶纯化、营养物生产、甘油三酯的酯交换反应、等)。另一方面，被设计为用于表达絮凝部分的多株生物(例如NVPOs)没有出现从这些生物和/或该液体环境中去除一种危险的、花费高的、或污染的絮凝剂的问题。因此，本披露的一个新颖的方面是生产一种被设计为用于产生一个或多个絮凝部分的生物。

可以通过用载体(如在此描述的那些)进行转化将该絮凝部分合并入一个生物(或者光合的或者非光合的)中。在这样一些过程中涉及的技术包括但不限于，开发适合的表达盒、将该表达盒插入(即转化)一个宿主细胞中、并且筛选表达该所希望的絮凝部分的宿主细胞。取决于载体的设计，该絮凝部分可以是组成型表达的(例如一直地)或可以是诱导型表达的(例如温度诱导型、群体诱导型、等)。可以使用所设计的能够表达一个或多个絮凝部分的光合生物用于在添加或不添加其他化合物下絮凝。例如，可以转化一种非光合生物(如大肠杆菌)从而生产一种碳水化合物结合蛋白(例如一种凝集素)或一种融合到一个细胞表面蛋白上的抗体(例如LppOmpA、β-自转运蛋白、等)，从而当表达时，该融合蛋白出现在该细胞表面上并且结合到感兴趣的多个生物(如一种绿藻)上从而引起絮凝。可替代地，可以转化一种绿藻(如莱茵衣藻)以生产一种碳水化合物结合蛋白(例如一种凝集素)或一种融合到一个细胞表面蛋白上的抗体(例如GP1)，从而将该融合蛋白表达在该细胞表面上并且结合到感兴趣的多个生物(如绿藻)上从而引起絮凝。

可替代地，可以转化一个宿主生物(例如莱茵衣藻)从而生产来自大肠杆菌的FhuA蛋白，并且可以转化一个第二宿主生物(与该第一生物相同或不同的种)从而生产T5噬菌体尾部蛋白(pb5)。FhuA与pb5形成一种非常稳定的1∶1化学计量的复合体，因此通过在一个所希望的时间结合这两个转化的宿主细胞、或通过控制在不同株中表达这两个絮凝部分从而在一个所希望的时间仅表达这些絮凝部分，通过这两个部分的相互作用这两个部分之间的结合将引起絮凝。

典型地一个絮凝部分将被表达从而它存在于该宿主细胞的外表面上(例如细胞壁和/或细胞膜)。在一些实例中，一个絮凝部分被该宿主细胞分泌到周围环境中。标准的分子生物学技术允许将一个重组表达的蛋白靶向到一个宿主细胞的不同亚细胞区室中。这类亚细胞区室的实例包括高尔基体、溶酶体、分泌系统、细胞壁或质膜。因此，在一些实例中，在本披露中有用的载体将包含对一个或多个专门的多肽(例如信号肽)进行编码的DNA序列，如果该信号肽被可操作地连接到该重组蛋白上，这些专门的多肽能够将重组蛋白导向亚细胞区室中。

可以从多种生物(包括真核生物、原核生物、或病毒)得到用于表达絮凝部分的基因的候选者。在一些实例中，一个絮凝部分是一个蛋白结合对的一个成员。形成强的蛋白-蛋白复合体的蛋白对作为絮凝部分是有用的。自聚集蛋白(能够形成多亚基复合体的蛋白)作为絮凝剂也是有用的。糖蛋白的碳水化合物部分(例如阿拉伯糖基、半乳糖基、甘露糖基、以及鼠李糖基残基)、膜和/或细胞壁碳水化合物(例如海藻酸、木糖胶、甘露聚糖、琼脂糖、角叉菜聚糖、金属卟吩、红藻胶、等)、增加某些碳水化合物或糖脂类的产量的蛋白也可以用于诱导絮凝，因为某些种类的碳水化合物是蛋白复合体结构的已知的组分。

还可以将絮凝部分重组地表达于宿主细胞中并且纯化到一个有用的水平(例如均匀性的)。可以将这些纯化的絮凝剂加入到一个目标细胞培养物中以引起絮凝。典型地此类絮凝剂将不会提出与使用重金属絮凝剂相同的挑战。例如，一个重组凝集素可以由一种宿主细胞来生产(例如分泌或生产到表面上)、收集、并且引入到有待絮凝的一种生物的一个培养物中。

本领域的普通技术人员应当认识到在本方法的实践中可以使用多种类型的分子。在此披露了不同的示例性蛋白、碳水化合物、抗体、以及当或者被一种微生物表达时或是通过结合到液体培养基中被表达时可以被用作一个絮凝部分的其他部分。这些实例旨在提供可以被使用的分子的类型的说明并且不旨在进行限制。

已知蛋白(作为一个类别)与其他大分子和化合物进行结合/或复合。这样，可以使用蛋白作为絮凝部分。例如碳水化合物结合蛋白(例如凝集素)是对于一个絮凝部分有用的一个类别的蛋白。碳水化合物结合蛋白识别并且结合到多种细胞表面碳水化合物、碳水化合物部分、糖蛋白的多糖侧链、糖基化蛋白、糖肽、和/或细胞表面蛋白上。因此，在一个实施方案中，c型凝集素被表达在莱茵衣藻的细胞壁上，它通过结合到莱茵衣藻细胞的表面上的一种糖蛋白上诱导了絮凝。这些絮凝部分的实例包括但不限于，溶血磷脂酸、c型凝集素、Gal/GalNAc、O-连接的糖类、O-连接的多糖类、GlcNAc、磷脂酶A2、GalNAc-SO₄、唾液酸、糖鞘脂类、葡萄糖单霉菌酸酯、脂阿拉伯甘露聚糖、磷脂酰肌醇类、己糖基-1-磷酸类异戊二烯类、甘露糖基-磷酸多萜醇类、α-半乳糖基神经酰胺、或末端半乳糖苷。碳水化合物结合蛋白的实例包括但不限于：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选凝素、L-选凝素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、或半乳凝素类。

可以作为絮凝部分被使用的另一个类别的蛋白是抗体。例如，可以使用在一个生物上表达的抗已知细胞表面抗原的抗体。此类抗体的表达可以导致抗原-抗体复合体形成，该复合体形成随后可以导致表达该抗体的一个生物的絮凝，其中该抗体特异地结合到该被转化的株、或一个不同的株或生物上的一个细胞表面抗原上。例如，可以将莱茵衣藻进行转化以可诱导地表达一个抗体的一个单链可变区片段(scFv)，该片段检测了一个生物的外表面上的一个抗原。该表面抗原可以是天然地发生在莱茵衣藻或另一种生物的表面上的或可以是转化该生物以产生细胞表面抗原的结果。所使用的抗体可以是单价的、多价的、或多价态的。抗不同糖蛋白的其他抗体在本领域中是已知的(参见例如Matsudaet.al.，J.Plant.Res.，100：373-384，1987；Musgrave et al.，Planta，170：328-335，1987)。可以通过产生一种融合蛋白将这些抗体锚定在细胞表面上，该融合蛋白包括一种在该细胞表面上(例如细胞膜或细胞壁上)表达的蛋白。可替代地，可以设计该抗体以便被该宿主细胞分泌到周围环境中以引起絮凝。可以将识别细胞壁组分的抗体或被设计的该宿主细胞的抗体加入到该培养基或其他生长环境中以诱导絮凝。可以使用已知用于与特异性表位形成稳定的复合体的抗体作为絮凝部分。在一些实例中，可以使用靶向一个天然发生的表位的抗体。

可以将表达此类抗体的一个第一生物与表达相应的表位的另一个生物进行配对从而当进行组合时诱导絮凝。该相应的表位可以是天然发生的或可以是被基因上设计的。可替代地，当希望絮凝时，可以将该相应的表位加入到该培养基或其他生长环境中。可以将表位偶联到固态支持物如珠粒、网格、筛，等之上以有助于絮凝。对于本发明有用的抗体的实例包括但不限于，抗-HA标记抗体、抗-His标记抗体、抗-Myc标记抗体、抗-AU1标记抗体、抗-GST标记抗体、抗-KT3标记抗体、抗-MAT标记抗体、抗-MBP标记抗体、抗-S标记抗体、抗-S 1标记抗体、抗-SNAP标记抗体、抗-SRT标记抗体、抗-V5标记抗体、抗-VSV-G标记抗体、抗-TAP标记抗体、以及抗-Trx抗体。本领域的普通技术人员应当认识到一个单个的宿主细胞可以表达来自一个或多个类别的多于一个絮凝部分。例如，可以将一个生物进行转化以表达两种不同的抗体或一种抗体和一种碳水化合物结合蛋白。

在一些实施方案中，一个絮凝部分是对于一个感兴趣的细胞的一个细胞表面表位的一个抗体。在一个细胞表面蛋白上可以存在特定的细胞表面表位。这样一些蛋白的实例包括但不限于HRP-2、PHC21、ISG-C1、LMR3、VSP(1，2，3，4)、HRP3、GP1、FAS 1、FAS2、FAS3、E GWH.1280.7.1、GAS30、MMP14、ZAP2-2、MIN1、或来自莱茵衣藻的GOX1和来自盐生杜氏藻的p150。生产对于一种给定蛋白的抗体的方法在本领域中是熟知的并且可以包括培养一种光合生物；分级该微生物的膜和/或细胞壁部分；将该部分注射到一个适当的宿主动物中用于免疫；从被免疫的动物体内抽取血清；并且筛选、选择并纯化与该部分进行反应的一种或多种抗体。同样，例如当该被免疫的动物是一只小鼠时，可以使生产感兴趣的抗体的免疫细胞经受常规的杂交瘤形成以及培养技术以生产感兴趣的单克隆抗体。在另一个实施方案中，从该膜部分中进一步纯化蛋白并且将这些蛋白用在高通量筛选系统中作为噬菌体展示技术的一个目标，由此鉴定表达该抗体多肽的一部分的DNA序列与该目标相互作用。噬菌体展示技术在本领域中是已知的。参见例如美国专利号5,855,885；McCafferty et al.，Nature，348：552-54，1990。

可以作为絮凝部分被使用的另一个类别的蛋白包括形成一个结合对的蛋白。除其他事项之外，这个类别包括，形成多亚基复合体的蛋白以及与另一类蛋白形成一种复合体的蛋白。例如，大肠杆菌蛋白FhuA是一种具有一个单个的跨膜结构域的单体铁转运蛋白通道，该跨膜结构域可以被过量表达；pb5是一种T5噬菌体尾部蛋白，该尾部蛋白使用FhuA作为该噬菌体的受体。这两种蛋白之间的相互作用是非常稳定的。可以使用这样的蛋白对作为絮凝部分。例如，在一个实施方案中，FhuA被表达于盐生杜氏藻的一个株中并且pb5被表达于盐生杜氏藻的一个第二株中。当组合这两个株时，由于这两种蛋白的相互作用絮凝发生。本领域的普通技术人员应当认识到许多其他的蛋白结合对存在并且可以被使用。为了允许一些蛋白之间的相互作用，对这些蛋白进行设计从而将它们插入到细胞膜和/或细胞壁之中可能是必要的。

控制絮凝的时间

在控制絮凝的一些实例中对絮凝的时间进行控制可以是有利的。例如，通过控制絮凝的时间，一个目标培养系统的一个操作子可以确保有效地使用营养物、收获的时间、收获的生物的数量、和/或最大的产品产量。本领域的普通技术人员应当认识到最佳条件可以根据多个因素改变，但是这样的确定培养基制品是常规性的。对于通过由一个给定的宿主生物表达的絮凝部分，可以通过将一个或多个调节元件(例如启动子)结合到一个表达盒的设计中来控制絮凝的时间。这样一种方法可以允许仅在希望的时间表达一个絮凝部分。如从本披露中是清楚的，可获得多个路径来控制絮凝的时间。虽然多种示例性方法用于控制絮凝的时间，本讨论不意欲将这些方法限制于在此提到的这些具体的方法中。

为了表达一些絮凝部分，可以使用导致组成型表达的调节元件。因此，在这类调节元件的控制下的絮凝部分被预期贯穿该宿主细胞的一生被生产。这些调节元件的实例是花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S或19S区、TMV的外壳启动子、土壤杆菌的胭脂碱合酶、甘露碱合酶、或者章鱼碱合酶的启动子、细胞启动子、查耳酮合酶启动子、肌动蛋白启动子、adhI启动子、泛素启动子或者马铃薯块茎储藏蛋白启动子。为了诱导絮凝，当希望絮凝的时候可以将构成地表达一个絮凝对的一部分(例如抗体-抗原，蛋白结合对，等)的两个分离的株进行结合。在这类实例中，在一个株上的絮凝部分可以是天然发生的(例如该第一株生产一个重组凝集素，该重组凝集素识别该第二株上的一种糖蛋白)。可替代地，当希望絮凝时，可以通过将一个絮凝对的第二部分加入该株的培养物或环境中来诱导一个单个的株的絮凝。在又另一种方法中，可以将包含一个被构成地表达的絮凝对的一部分的宿主细胞与另一个株组合进行生长，该另一个株在可诱导的条件下表达该絮凝对的第二部分。在这类实例中，在该第二株中诱导表达该絮凝对的第二部分将导致絮凝。

可以使用可诱导型调节元件来控制一个絮凝部分的表达。在这类实施方案中，可以将该生物，例如一个无维管的光合生物，保持培养不表达该絮凝部分，直到希望絮凝时为止。可以通过引入一个外部因素(例如当一个光诱导型启动子控制该絮凝部分的表达时，暴露于光，)或通过出现一个对于表达必需的因素(例如当一个群体敏感型启动子控制一个絮凝部分的表达时，达到一个特定的细胞密度)来进行诱导表达。可以被用于诱导表达一个絮凝部分的外部因素包括但不限于：化学品、光、培养密度、温度、激素或营养物。对于可以用于本发明的细胞外部因素进行响应的诱导型启动子的非限制性实例包括：大豆Gmhsp17.3-B热休克启动子(Prandl et al.，Plant Mol.Physiol.31：157-62，2004)；化学诱导型启动子(例如IPTG/lac启动子)；磷酸盐/磷酸盐饥饿诱导型启动子(例如美国专利号6,175,060)；L-阿拉伯糖/ara B启动子；3-β-吲哚丙烯酸/Tip启动子，水杨酸/PR-1启动子(例如美国专利号5,689,044)；半乳糖诱导型启动子，例如GAL1、GAL7、GAL10(美国专利号5,972,664)；金属/金属硫蛋白启动子；FUS1启动子，该启动子可被一个外激素诱导(例如美国专利号5,063,154)；光诱导型启动子(例如核酮糖二磷酸羧化酶启动子的亚基，也参见美国专利号6,858,429)；群体敏感型启动子，该启动子感知一个液体环境中的细胞密度并且当该培养物达到某一密度时可以被用于自动地诱导絮凝(例如Whiteley et al.，Journal of Bacteriology，183：529-5534，2001)；也已经描述了使用P_L启动子的一个温度敏感型启动子系统(参见例如美国专利号4,711,845)。本领域的普通技术人员应当认识到可以通过例如将一个内源的启动子包括在一个表达盒中或将一个对一个絮凝部分进行编码的核酸插入一个目标基因组中从而它将被一个天然的调节元件控制(例如同源重组)，使用一个或多个内源的调节元件来控制一个絮凝部分的表达。

另一个类型的启动子包括氮饥饿诱导型启动子。氮饥饿导致在某些NVPO(例如莱茵衣藻)中形成配子。通过抽出氮或者通过限制可获得氮的量，通过使用氮饥饿响应型启动子来控制一个絮凝部分的表达，可以诱导絮凝，。可以使用交配型凝集素(这些交配型凝集素在氮饥饿的条件下由一些NVPO天然地表达)，虽然不是在正常地大培养中将产生絮凝的水平。因此，在一个实施方案中，增加生产(例如通过转化一个宿主株)一种或多种凝集素可以产生絮凝。

培养条件；开放的池塘和封闭生物反应器

对于很多生物，包括无维管的光合生物(NVPOs)，在室温下，在1.5％琼脂上，或者在平板上或者在试管中可以发生常规生长，同时在液体培养中典型地完成活性生长。最佳生长通常在20℃-25℃之间，虽然这些细胞暴露于35℃下可以生存，并且在更低的温度下可以生长。在摇动或混合下，细胞密度为1-5×10⁶个细胞/ml在液体中是正常的，而且一个典型的生长速率可以产生每天十倍的细胞增长(取决于生长条件)。通过将它们划到平板上、用PARAFILM^TM将这些平板密封并且将它们置于10℃-15℃下在暗光中可以实现细胞的长期储存。可替代地，可以将细胞划线或刺入琼脂试管中，加盖并且如以上进行生长。两种方法都允许储存几个月。为了更长时间的储存，可以将这些细胞在液体培养中生长到对数晚期并且然后用无菌DMSO制成浓度7％，并且在-80℃下贮藏。在存在甲醇下将该容器冷冻在液氮中也被推荐用于长期储存，。

NVPO典型地可以被生长在一个简单的确定成分的培养基上，用光作为唯一能源。在大多数情况下，处于距离为1-2英尺的荧光灯泡足以提供用于生长的能量。用空气或5％CO₂鼓泡可以提高生长速率。如果这些灯以规则的间隔(或者12:12小时或者是14:10小时的明：暗)进行开和关，一些NVPO的细胞可以被同步。

因为光合生物例如藻类需要阳光、CO₂和水用于生长，可以将它们在开放的池塘和湖中进行培养。因为这些是开放的系统的这个事实，它们相当地更容易被污染。使用开放的系统的一个挑战是感兴趣的NVPO可能不必然地是繁殖最快的。这产生了一个问题，其中其他的种移居到该液体环境中。此外，在开放的系统中，对水温、CO₂浓度和光照条件存在相对更少的控制。这些意味着该生长期主要地依赖于地点，并且除了热带地区以外，它限于较温暖的月份。虽然以上是“开放的系统”的缺点，这个类型的系统的一些益处是它典型地具有较低的生产成本。

另一个方法是使用一个半封闭系统，例如用一个温室覆盖该池塘或水池。虽然这通常生成一个较小的系统，它解决了许多与开放系统相关的问题。它允许更多的物种生长，它允许正在被生长的这些物种保持优势，它延长了生长期，并且如果将温室加热，可以整年连续生产。在这些半封闭的系统中增加CO₂的量也是可能的，因此再次增加了藻类的生长速率。

该池塘系统的一个变化是一个人工池塘，例如是一个管道池塘。在这些池塘中，该藻类、水和营养物围绕一个“跑道”循环。通过提供水的运动，例如通过使用明轮，可以将藻类保持悬浮在水中，并且以规则的频率循环回到表面。管道池塘通常保持浅的，因为需要将藻类暴露于阳光，而且阳光只能穿透池塘水至有限的深度。然而，深度可以根据一个生物所使用的一个或多个波长进行改变。这些池塘可以以一个连续的方式进行操作，其中CO₂和营养物被不断地进料到这些池塘中，而含有藻类的水在另一端处被取出。

可替代地，可以将藻类生长在封闭的结构(例如光生物反应器)中，其中该环境处于比开放的池塘中更严格的控制之下。虽然建造和操作一个光生物反应器的成本将高于用于开放的池塘的成本，来自这些光生物反应器的效率和更高的产量也可能是显著地更高的，因此在中期和长期运行中抵消了初建成本的缺点。

光生物反应器是一种结合一些类型的光源的生物反应器。一个用温室覆盖的池塘也可以被认为是一个光生物反应器。因为这些系统是封闭的，藻类生长需要的一切(二氧化碳、水和光)都需要被引入该系统中。

可以建造光生物反应器以连续地收获(多数的较大的培养系统)，或者通过一次一批地进行收获(像聚乙烯袋培养)。用营养物和藻类种子装备一批光生物反应器，而且允许生长至该批被收获。一个连续的光生物反应器或者连续地，如每天地，或者更频繁地被收获。一些类型的光生物反应器包括玻璃、塑料试管、水槽、塑料套或袋子。、可以用来提供维持光合作用所必需的光能的一些来源包括荧光灯泡、发光二极管、或者自然的阳光。

可以用于实践本发明的一些生物是适盐的。例如，盐生杜氏藻可以生长在海水和盐湖(盐度从千分之30到千分之300)和高盐度培养基(例如人造海水培养基、海水营养琼脂、半咸水培养基、海水培养基，等)中。在一些实施方案中，可以将一个包括在此描述的一个载体的宿主细胞生长在一个液体环境中，该液体环境是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3摩尔或更高浓度的的氯化钠。本领域的普通技术人员应当认识到其他盐类(钠盐、钙盐、钾盐，等)也可以存在于这些液体环境中。

当使用适盐生物时，可以用在此描述的这些载体中的任何一种转化该适盐生物。例如可以用一个载体转化盐生杜氏藻，该载体能够插入核基因组中并且该载体含有编码一个絮凝部分(例如，一个抗细胞表面蛋白抗体、一个碳水化合物结合蛋白，等)的核酸。然后可以将转化的适盐生物生长在高盐环境(例如盐湖、盐池塘、高盐培养基，等)中，以生产感兴趣的产物(例如异戊二烯类、脂肪酸类、生物质降解酶类，等)。在一些实例中，该絮凝部分在高盐度条件下可以是非功能性的。在这类实施方案中，通过在此描述的多种方法中的任何一种和/或通过降低盐度(例如通过稀释该液体环境)可以诱导絮凝。可替代地，在高盐度条件下该絮凝部分可以是功能性的，并且可以通过在此描述的多种方法中的任何一种控制絮凝。在高盐度条件下可以发生这些生物的絮凝，或者可以将该液体环境稀释到较低的盐度以允许结合。分离由该生物生产的感兴趣的任何产物可以涉及在从该生物中提取该产物之前从一个高盐环境中去除转化的生物。在其中该产物被分泌到周围环境中的实例中，在任何进一步处理产物之前将该液体环境脱盐可能是必要的。

絮凝的方法

在此提供了用于使一个宿主生物絮凝的方法。如在此所讨论的，絮凝部分对于一个宿主生物可以是或者外源的或者内源的。外源的絮凝部分可以包括重组表达的和纯化的蛋白、碳水化合物，或者其他能够结合一个NVPO的细胞表面的生物分子。内源絮凝部分可以包括天然发生的或被设计为在该转化的NVPO中进行表达的重组的蛋白，其他生物物质，例如天然发生的碳水化合物、脂质，或者在天然水平上生产的糖脂或者是由于基因修饰该转化物以增加的量生产的那些。因此，可以使用允许使一个絮凝对的至少两个成员相互作用的任何方法。

例如，可以通过加入一个结合到一个内源的絮凝部分(例如一个凝集素结合到一个细胞壁糖蛋白上)上的絮凝对的一部分诱导絮凝。图2提供了一个使用一种凝集素的这样一种方法的说明。为了简化某些步骤没有示于该说明上。为了开始该培养，从培养物原种中获得一株NVPO，例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻或者雨生红球藻。培养物原种可以是一个活性的液体培养物，或者来自一个冷冻的储存物。一旦将该培养物原种引入培养基中，该培养物在小规模实验室装备中进行扩展。在这时，可以对该培养物进行监测，监测它的生长特征、健康、污染或者典型地用于确保正确维持NVPO所执行的其他测量。在这时，也可以进行株的表现型和/或基因型测定以确定该株的身份。小规模培养被用作大规模培养的种子培养。可以在一个光生物反应器、多个半封闭的池塘、多个开放的池塘或多个湖(在图2中未示出)中进行大规模培养。可以将多批次的小规模培养物接种入一个大规模培养容器中。在接种时根据参数例如该一个或多个小规模培养物的光密度和生长速率可以确定接种体积与接收体积的比率。在制备用于大规模培养的培养基中，可以进行高压灭菌，向再利用的培养基中加入营养物，对再利用的培养基的条件进行评估，并且测量该培养基的pH、盐、和电导率。在大规模培养期间，进行质量控制。质量控制指标可以包括对于污染、株的趋异、生长动力学、氧水平、氮水平、该液体盐度、该液体培养基的pH进行取样和筛选，对于油含量测量、干重/湿重比率，以及该培养物的光密度进行生长的细胞的取样。在一个示例性的实施方案中，当絮凝被认为是适当的时候，将凝集素加入。凝集素可以被购买，或者被内部制备。生产重组凝集素在本领域中是已知的。例如，在美国专利号4,870,015中已经描述了在微生物中生产凝集素的方法以及组合物。重组表达的凝集素可以被纯化为均一性的，并且然后被加入到NVPO培养物中以促进絮凝。在一些实例中，培养中的该NVPO可以表达一种凝集素结合其上的天然发生的絮凝部分，或者可以被基因修饰以生产增加水平的天然发生的絮凝部分，或者可以被基因修饰以生产一种外源的絮凝部分。也可以将除凝集素以外的絮凝剂(图2中未示出)作为一种单独的絮凝剂或与凝集素结合进行使用。在絮凝后，收获该NVPO的絮凝的细胞团块。可以使用本领域中已知的多种收获方法中的任何一种，范围从用一个过滤器进行筛选到一个尖端的机器人系统，来收集、挤压、并且压紧该絮凝的NVPO团块。

一种替代的方法示于图3中。为了简化某些步骤没有示于该说明上。所提出的过程涉及使用一个基因修饰的生物(例如一种NVPO)，该生物表达一个或多个絮凝部分。在图3中，该絮凝部分是一个抗体，例如一个单链可变区片段(scFv)抗体。可以将除scFv抗体之外的抗体用于图3中展示的絮凝的方法中。同样没有示出但是可用于图3的这些展示的步骤的是可以被聚合的絮凝部分。例如，一个肌动蛋白单体可以形成一个肌动蛋白聚合物。构建一个对一种抗体进行编码的表达盒，并且将其结合到一个适合用于核基因组靶向的靶向载体中。该表达盒包含一个调节元件，该调节元件允许表达该抗体。该调节元件可以是一个组成型活性元件，该元件允许在该细胞中不断地进行该抗体的转录。该调节元件可以是一个可诱导型元件，该可诱导型元件要求一个外源信号来起始该抗体的转录。使用适当的步骤转化该生物。通过本领域中已知的分子生物学技术(例如聚合酶链式反应或在一个选择性抗生素培养基上进行筛选)选择被正确靶向的细胞。将一部分选择的细胞进行冷冻保存，同时将剩余部分用于开始小规模液体培养，例如如图2中所述。当絮凝被认为是适当的时候，通过提供该外源诱导信号诱导表达絮凝部分。取决于该外源诱导信号的量或强度，絮凝可以是增量的。如果组成型活性元件被用于表达该絮凝部分，絮凝的程度可以与细胞密度相关联。絮凝后，收获NVPO的絮凝的团块。可以使用在本领域中已知的多种收获方法中的任何一种，范围从使用一个过滤器的简单的筛选技术到一个尖端的机器人系统，用于收集、挤压，并且压紧该凝絮的NVPO团块。

在其他实例中，该絮凝对的一部分可以由一个基因修饰的主细胞进行分泌并且当结合到存在于该细胞或另一个细胞上的该絮凝对的第二部分上时，诱导絮凝。在又另外的实例中，可以将一个絮凝对的一个成员附连到一个固相(例如一个珠粒、一个网格、一个筛)上，以诱导表达该絮凝对的另一个成员的宿主株的絮凝。

可以通过将分别地生长的培养物以范围从1∶1到1∶10的任何比率进行结合来诱导絮凝，其中这些不同的培养物各自表达一个絮凝对(两部分结合的复合物)或者絮凝复合物(三个或更多个部分结合的复合物)的一部分。一种一般化的方法示于图4中。为了简化某些步骤没有示出。在图4中，该絮凝对是在分别地生长的株上表达的FhuA和pb5，并且通过将这些株进行结合来诱导絮凝。在这个方案中，这些絮凝部分不能自识别或自聚合。如所展示的，为了絮凝，这些絮凝部分要求彼此的存在。形成一个对或者一个复合物的其他絮凝部分也可以用于图4中展示的方案中。在上面描述了构建表达盒、引入调节元件、结合到一个适合的载体中、转化、选择、小规模到大规模培养的步骤或者其他创造性的步骤。

通过诱导地调节一个絮凝对的一个成员的表达可以诱导絮凝，例如通过：1)将一个培养物暴露于从黑暗到光亮，其中通过一个诱导型调节元件控制一个絮凝部分；2)将培养温度提高到大约26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃、39℃、40℃、41℃、42℃、或43℃，持续范围从几秒到几分钟到几个小时的一个短期的时间；3)将该培养物密度提高到大约5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰、9×10¹⁰或更多个细胞/ml；4)将氮，例如以硝酸盐的形式，加入培养物中持续大约15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、135分钟、150分钟、165分钟、180分钟、195分钟、210分钟、225分钟、240分钟、255分钟、270分钟、285分钟、300分钟、315分钟、330分钟、345分钟、360分钟、375分钟、390分钟、405分钟、420分钟、435分钟、450分钟、465分钟、480分钟、495分钟、510分钟、525分钟、540分钟、555分钟、570分钟、585分钟、600分钟、12小时、18小时、24小时、36小时、24小时或更长时间；和/或5)从该培养基中剥夺氮，持续大约15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、135分钟、150分钟、165分钟、180分钟、195分钟、210分钟、225分钟、240分钟、255分钟、270分钟、285分钟、300分钟、315分钟、330分钟、345分钟、360分钟、375分钟、390分钟、405分钟、420分钟、435分钟、450分钟、465分钟、480分钟、495分钟、510分钟、525分钟、540分钟、555分钟、570分钟、585分钟、600分钟、12小时、18小时、24小时、36小时、24小时或更长时间。

在相同的培养中生长两个株的一个实例(其中一个絮凝对的两个部分都被可诱导地控制)示于图5中。为了简化某些步骤没有示于该说明上。在图5中，该絮凝对包括这些交配型凝集素两者。在这个图中，将两株莱茵衣藻进行基因修饰以表达增加水平的交配型凝集素(例如每一株产生该絮凝对的一个成员)，但是在该天然发生的氮饥饿响应元件的控制之下。在转化的NVPO中，表达的凝集素被靶向到细胞体的更宽广的区域而不是鞭毛以促进有效的絮凝。通过将对靶向细胞壁的信号肽进行编码的DNA序列插入该表达盒中实现凝集素的靶向。随着这些培养物生长通过耗尽培养基中的氮促进凝集素的诱导。通过增加或减少氮的量可以改变絮凝的最佳时间。当达到氮饥饿时，这两个株将开始增加它们各自的絮凝部分的产量，并且将发生絮凝。

培养基的再利用

如在此披露的，使用设计的和/或天然表达的絮凝部分的一个优点是再利用该液体环境。培养基(例如实验室培养基、池塘水、湖水、生物反应器的内容物，等)的再利用是经济上有利的，尤其在大规模操作中。例如，在一个控制的循环池塘系统中，该液体环境可以通过允许该液体的连续流动被再利用，同时连续地加入营养物。在另一个实施方案中，在一个封闭的光生物反应器系统中，培养基再利用可以包括舀出絮凝的NVPO团块；测量该培养基的pH；测量该液体中各营养物的水平；将营养物调节到最佳水平；通过高压灭菌将该液体灭菌；和/或将该培养基返回用于新的培养。

应当理解的是在此使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案的目的并且不旨在进行限制。除非另外定义，在此使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及的领域中普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然与在此描述的那些相似的或等效的任何方法和材料可以被用于实践用于测试本发明，在此描述了适当的材料和方法的具体的实例。

如在这个说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”应当被解释为涵盖单数和复数指示物两者，除非该内容或上下文另外清楚地说明。因此，例如，提及“多肽”包括两个或更多个这样的多肽。术语“包括”、“具有”、“包括了”以及“包含”应当被解释为开放性术语(即含义是“包括但不限于”)，除非另外指明。

在此列举的数值的范围仅仅旨在用作个别地指每个单独的数值落在该范围内的一种速记的方法，除非在此另有说明，并且每个单独的数值被合并到该说明书中就像它在此处被个别地列举一样。在此描述的所有方法都可以以任何适合的顺序来完成，除非在此另有说明，或另外地与上下文明显地矛盾。使用在此提供的任何和所有的实例，或者示例性的语言(例如“例如”)仅仅旨在更好地说明本发明并且不对本发明的范围加以限制，除非另有要求。在本说明书中没有语言应该被解释为表明任何未要求的元件对于本发明的实践是必要的。在本发明的说明书中提供的标题仅仅为了方便被包括并且不旨在在限于在本披露的范围内。

通常地，在此使用的术语表和下面描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学以及蛋白质化学中的实验室步骤、是已熟知的并且被本领域的那些普通技术人员常规使用的那些。与本发明一致，普通的重组DNA技术、分子生物学技术、分子遗传学以及微生物学技术可以被本领域的普通技术人员使用。例如，如在Sambrook、Goeddel、supra以及CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，F.M.Ausubel et al、eds、Current Protocols、a j ointventure between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.(1994，supplemented through 1999)(在下文中“Ausubel”)、DNA CLONING：APRACTICAL APPROACH，Vols.I-II(Glover ed.1985)；Animal Cell Culture(Freshney ed.1986)中描述的那些技术可以被用于重组核酸的方法、核酸合成、克隆方法、细胞培养方法、转染和转化以及转基因结合(例如电穿孔、注射、基因枪、穿过皮肤压入以及脂质体转染)。通常地，根据说明书执行寡聚核苷酸的合成和纯化步骤。通常地根据本领域中常规的方法以及贯穿这个文件所提供的多个一般性的参考执行这些技术和步骤。其中的这些步骤被认为对于本领域的那些普通技术人员是熟知的，并且为了读者的方便被提供。

当某些实施方案已经被显示并且描述在此时，这样的实施方案仅通过实例的方式进行提供，这对于本领域的那些普通技术人员应当是清楚的。对于本领域的那些普通技术人员在不离开本发明下现在将发生众多的变更、改变和替换。应该理解的是在此描述的这些实施方案的多个替代方案可以被用于实践本发明中。所预期的是随附的权利要求定义本发明的范围和这些权利要求的范围内的方法和结构以及由此涵盖的它们的等效物。

实例

实例1.在大肠杆菌中生产重组凝集素

将对凝集素进行编码的核酸引入大肠杆菌中。在图1A中图解地显示了转化DNA。在这个实例中，标记“转基因1”的片段是对来自盖罩大蜗牛(SEQ IDNO：1)、扁豆、滑北螈(SEQ ID NO：2)或者矮生刀豆的凝集素进行编码的基因。标记“5’UTR”的片段是T7启动子，并且标记“3’UTR”的片段是T7终止子。将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及一个Flag表位设计在该基因的3’端上，以有助于表征和可视化研究。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

根据生产厂家的说明书将该转化DNA引入BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Invitrogen)中。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解，并使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。将克隆在5mL存在50μg/mL卡那霉素的Luria Broth(LB)中进行培养。将处于O.D.₆₀₀＝1下的100μL的培养基进行离心并且弃去上清液。通过将这些细胞再悬浮在50μl含有还原剂的1x SDS样品缓冲剂(BioRad)中将这些球粒进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(ThermoScientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma公司)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。

为了确定该重组凝集素的活性，每株生长了4L并且通过在5000x g下离心15分钟进行收获。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于35mL 1x Tris缓冲盐水(TBS)中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环30秒。然后在30,000xg下离心该溶液30分钟以去除未溶解的细胞。将上清液转移并且应用1mLNi-NTA树脂(Qiagen)持续1小时。收集该树脂，用30倍柱体积的1x Tris缓冲盐水(TBS)进行洗涤并且用5mLTBS和400mM咪唑的pH7.5进行洗脱。然后使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore)将该洗出液浓缩到终浓度为5mg/mL。然后根据生产厂家的说明书使用一个FITC标记试剂盒(ThermoScientific)将纯化的蛋白结合到FITC(荧光素异硫氰酸酯)上。然后将莱茵衣藻和二形栅藻细胞与该FITC标记的蛋白进行混合以显示活性。来自几个代表性的凝集素的结果示于图6中。

实例2.在大肠杆菌中生产支架-凝集素融合物

将对来自盖罩大蜗牛和扁豆的凝集素进行编码的核酸融合到支架蛋白脂蛋白-外膜蛋白A杂合物(Lpp-OmpA)或来自淋病奈瑟菌的β-自转运蛋白(SEQID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5)上，并且引入大肠杆菌中。转化DNA图解地示于图1B中。在这个实例中，标记“转基因1”的片段是对来自盖罩大蜗牛的凝集素进行编码的基因。标记“转基因2”的片段是对来自扁豆的凝集素进行编码的基因。标记“5’UTR”的片段是T7启动子，标记“3’UTR”该片段是T7终止子，标记“支架1”该片段是Lpp-OmpA，并且标记“支架2”的片段是该β-自转运蛋白。将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及一个Flag表位设计在该转基因和该支架之间。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

根据生产厂家的说明书将该转化DNA引入BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Invitrogen)中。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。将克隆在5mL存在50μg/mL卡那霉素的Luria Broth(LB)中进行培养。将处于O.D.₆₀₀＝1下的100μL的培养物离心并且弃去上清液。通过将细胞再悬浮于50μl含有还原剂的1×SDS样品缓冲剂(BioRad)中将这些球粒进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(ThermoScientific)将膜封闭，并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影，并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。

为了确定该凝集素-支架融合物是否被正确地插入到该质膜中，进行了膜分离。将处于O.D.₆₀₀＝1下的多个25mL的培养物在5000x g下离心10分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于3mL 1x Tris缓冲盐水(TBS)中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环10秒。然后将该溶液在30,000x g下离心30分钟以去除未溶解的细胞。将1mL该上清液(膜和细胞质蛋白的混合物)小心地移去并且在一台TLA100.3转子(Beckman)中在540,000x g下离心20分钟以从可溶物(细胞质蛋白)中分离不溶物(膜)。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印记半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。结果示于图8中。

为了表征该细胞表面展示的糖结合蛋白的活性，使用了多个沉淀实验。将转化为用于生产一个包括来自扁豆的凝集素和该支架蛋白β-自转运蛋白的融合蛋白的大肠杆菌生长到O.D.₆₀₀＝1.6。将该培养物离心并且用TAP培养基将该球粒再悬浮至O.D.₆₀₀＝30。将不同量的培养物(相应于终O.D.₆₀₀＝0、0.02、0.04、0.08、0.160、0.400、1.00、2.00的0uL、5uL、10uL、20uL、40uL、100uL，、250uL以及500uL)加入7mL在TAP培养基中生长的二形栅藻中。将500uL的BL21(DE3)加入到7mL的二形栅藻中作为一个阴性对照。在沉降前，将这些混合物温和地摇动30分钟。在时间点0和90分钟处进行拍照(图8)以看见该活性。

实例3.在大肠杆菌中生产支架-scFv融合物

将一个抗藻类表面抗原的单链可变区片段(scFv)抗体融合到支架蛋白脂蛋白-外膜蛋白A杂合物(Lpp-OmpA)上引入大肠杆菌中(SEQ ID NO.16)。转化DNA图解地示于图1C中。在这个实例中，标记“转基因1”的片段是对scFv5进行编码的基因。标记“5’UTR”的片段是T7启动子，标记“3’UTR”的片段是T7终止子，标记“支架1”的片段是Lpp-OmpA。将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及一个Flag表位设计在该支架和该转基因之间。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

根据生产厂家的说明书将该转化DNA引入BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Invitrogen)中。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。将克隆在5mL存在50μg/mL卡那霉素的Luria Broth((LB)中进行培养。将处于O.D.₆₀₀＝1下100μL的培养物进行离心并且弃去上清液。通过将细胞再悬浮于50μl含有还原剂的1x SDS样品缓冲剂(BioRad)中将这些球粒进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(ThermoScientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。

为了确定该LppOmpA-scFv融合物是否被正确地插入该质膜中，进行了膜分离。将处于O.D.₆₀₀＝1下的多个25mL的培养物在5000x g下离心10分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于3mL 1x Tris缓冲盐水(TBS)中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环10秒。然后将该溶液在30,000x g下离心30分钟以去除未溶解的细胞。将1mL的该上清液(膜和细胞质蛋白的混合物)小心地移去并且在一个TLA100.3转子(Beckman)中在540,000x g下离心20分钟以从可溶物(细胞质蛋白)中分离不溶物(膜)。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。来自一个代表性的融合构建体LppOmpA-scFv5的结果示于图9中。

实例4.在巴斯德毕赤酵母中生产分泌的重组凝集素

可以将对凝集素(例如来自盖罩大蜗牛、扁豆、滑北螈和矮生刀豆的那些凝集素)进行编码的核酸引入巴斯德毕赤酵母中。转化DNA图解地示于图1A中。在这个实例中，标记“转基因1”的片段是对来自盖罩大蜗牛(SEQ ID NO1)、或扁豆(SEQ ID NO2)的凝集素进行编码的基因。标记“5’UTR”的片段是AOX1启动子并且标记“3’UTR”的片段是AOX1终止子。将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及一个Flag表位设计在该基因的3’端上以有助于表征和可视化研究。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

将该转化DNA克隆到pPIC9K载体(Invitrogen)中，由此在该5’端处引入该α因子信号肽以有助于分泌，并且根据生产厂家的说明书将该转化DNA引入GS115感受态细胞(Invitrogen)中。为了确定这些重组凝集素是否被表达，每株生长1L在5000x g下离心15分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将1mL Ni-NTA树脂(Qiagen)应用到该用过的培养基中持续1小时。收集该树脂，用30倍柱体积的1x Tris缓冲盐水(TBS)进行洗涤并且用5mLTBS和400mM咪唑pH7.5进行洗脱。然后使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore)将该洗出液浓缩至终浓度为5mg/mL。将由巴斯德毕赤酵母分泌的多种代表性的凝集素进行标记并且示于图10中。

实例5在巴斯德毕赤酵母中生产支架-凝集素融合物

将对来自盖罩大蜗牛、扁豆和滑北螈的凝集素进行编码的核酸融合到支架蛋白例如酿酒酵母的Pir1a(SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7)和Pir1b(SEQ ID NO：8)、絮凝蛋白Flo1p以及凝集素蛋白Aga1p上。所有融合物，除了与Flo1p融合的那些，都是一个N端融合物(将该凝集素置于该支架的5’端)。将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及一个Flag表位设计在这两个基因之间的接头中以有助于表征和可视化研究。转化DNA图解地示于图1B中。在这个实例中，标记“转基因1”的片段是对来自盖罩大蜗牛的凝集素进行编码的基因。标记“转基因2”的片段是对来自扁豆的凝集素进行编码的基因。标记“5’UTR”的片段是AOX1启动子，标记“3’UTR”的片段是AOX1终止子，标记“支架1”的片段是Pir1a、Pir1b或Aga1p，并且标记“支架2”的片段是Flo1p。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

将该转化DNA克隆到pPIC9K载体(Invitrogen)中，由此在该5’端处引入该α因子信号肽以有助于分泌，并且根据生产厂家的说明书将该该转化DNA引入GS115感受态细胞(Invitrogen)中。根据生产厂家的说明书筛选克隆用于表达。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一个转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。显示来自表达研究的Pir1b-盖罩大蜗牛凝集素(1)、Pir1b-扁豆凝集素(2)以及Pir1a-滑北螈凝集素(3)的代表性的数据示于图11中。

为了确定该凝集素-支架融合物是否被正确地插入该质膜中，进行了膜分离。将处于O.D.₆₀₀＝1下的多个25mL的培养物在5000x g下离心10分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于3mL 1x Tris缓冲盐水(TBS)中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环10秒。然后将该溶液在30,000x g下离心30分钟以去除未溶解的细胞。将1mL的该上清液(膜和细胞质蛋白的混合物)小心地移去并且在一个TLA100.3转子(Beckman)中在540,000x g下离心20分钟以从可溶物(细胞质蛋白)中分离不溶物(膜)。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一个转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。来自一个代表性的融合构建体，Pir1a-滑北螈凝集素融合物，的结果示于图12中。

实例6.用一个对一个融合的抗性标志物进行编码的核酸和对一个凝集素-Fas1 融合蛋白进行编码的基因核转化莱茵衣藻

将一个融合到来自莱茵衣藻的Fas1上的对来自扁豆、截短的扁豆以及鸡冠刺桐的凝集素进行编码的核酸引入莱茵衣藻中(SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11)。转化DNA图解地示于图1D中。标记“转基因”的片段是凝集素-Fas1编码基因，标记“5’UTR”的片段是具有内含子的莱茵衣藻HSP70/rbcS25’UTR，标记“选择标记”的片段是一个争光霉素耐受性基因，标记CM(切割部分)的片段是口蹄疫病毒(FMDV)的2A病毒蛋白酶，标记“靶向信号”的片段是将该蛋白靶向细胞表面展示的一个信号肽，标记“锚定域”的片段是用于将该凝集素-Fas1蛋白共价连接到该细胞表面上的一个糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-锚定域，并且标记3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。该争光霉素耐受性基因，2A和凝集素-Fas1编码区被物理地连接在框内，生成一个嵌合的单个的ORF。使用标准技术，将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及FLAG表位设计在该凝集素与Fas1之间的接点之中。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

对于这些实验，在莱茵衣藻株21gr上实现所有的转化。将细胞进行生长并通过电穿孔进行转化。将细胞生长到对数中期(约2-6×10⁶个细胞/mL)。在收获前将Tween-20加入细胞培养物中至浓度为0.05％以防止细胞粘到离心管上。将细胞温和地旋下(在2000与5000x g之间)持续5分钟。将上清液弃去并且将细胞再悬浮于TAP+40mM蔗糖培养基中。在冰上将1到2μg的转化DNA与约1×10⁸个细胞进行混合并且转移到电击杯中。在电容设定为25μF、电压为800V以递送2000的V/cm并且时间常数持续10-14ms下执行电穿孔。电穿孔后，将该电击杯返回到室温下持续5-20分钟。将细胞转移到10mLTAP+40mM蔗糖中并且允许在连续摇动下在室温下恢复12-16小时。然后通过在2000x g与5000x g之间下离心收获细胞并且将细胞再悬浮于0.5mL TAP+40mM蔗糖培养基中。将0.25mL的细胞铺于TAP+20ug/ml争光霉素上所有转化都是在争光霉素选择(20μg/mL)下完成的，其中通过由图1D中标记“选择标记”的片段编码的基因提供耐受性。在存在争光霉素下维持多个转化的株以防止丢失该外源DNA。

通过斑点印迹筛选在存在争光霉素下生长的克隆。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。在暴露于这些蛋白后，在室温条件下用150μl含有0.05％Tween-20(TBST)的1x Tris缓冲盐水将这些珠粒洗涤三次。用150μl20μM EDTA，25mM Tris-HCl、pH 7.0，400mM NaCI从珠粒中释放蛋白，并且将该150μl洗出液斑点印迹到硝酸纤维素膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(AlphaInnotech)进行成像。然后通过蛋白质印迹对在该斑点印迹分析中显示阳性结果的克隆进行筛选。

通过将细胞再悬浮于50μl含有还原剂的1x SDS样品缓冲剂(BioRad)中将在TAP琼脂平板上生长的多片藻类细胞进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(ThermoScientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。来自三个株的结果示于图13中。

为了确定该凝集素-Fas1融合物是否被正确地以一个方向(其中该凝集素位于外部)插入该质膜中，进行了膜分离。将最小量的1×10⁷个细胞/mL的100mL的培养物在5000x g下离心10分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于3mL1x Tris缓冲盐水(TBS)中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环10秒。然后将该溶液在30,000x g下离心30分钟以去除未溶解的细胞。将1mL该上清液(膜和细胞质蛋白的混合物)小心地移去并且在一个TLA100.3转子(Beckman)中在540,000x g下离心20分钟以从该可溶物(细胞质蛋白)中分离不溶物(膜)。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(ThermoScientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。来自几个融合构建体的结果示于图14中。与从膜锚定的模式中所预期的相同，在该细胞质/可溶部分中仍然存在显著量的蛋白。然而，在该膜部分中也存在蛋白。在图15中可以看到Fas1-鸡冠刺桐凝集素融合蛋白构建体的存在对沉降的影响。

实例7.用一个对一个融合的抗性标志物进行编码的核酸和对一个GP1-凝集素融合蛋白进行编码的基因核转化莱茵衣藻

将一个融合到来自莱茵衣藻的GP1上的对来自盖罩大蜗牛和扁豆的凝集素进行编码的核酸引入莱茵衣藻中(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13)。转化DNA图解地示于图1E中。标记“转基因”的片段是凝集素-GP1编码基因，标记“启动子/5’UTR”的片段是具有内含子的莱茵衣藻HSP70/rbcS25’UTR，标记“选择性标记”的片段是一个争光霉素耐受性基因，标记CM(切割部分)的片段是口蹄疫病毒(FMDV)的2A病毒蛋白酶，标记“靶向信号”的片段是将该蛋白靶向到细胞表面展示的一个信号肽，并且标记3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。该争光霉素耐受性基因、2A和GP1-凝集素编码区被物理地连接在框内，生成一个嵌合的单个的ORF。使用标准技术，将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及FLAG表位设计在该凝集素与GP1之间的接点之中。将另一个Flag表位编码在该转基因的3’端处。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

对于这些实验，在莱茵衣藻株21gr上实现所有的转化。将细胞进行生长并且通过电穿孔进行转化。将细胞生长到对数中期(约2-6×10⁶个细胞/mL)。在收获前将Tween-20加入细胞培养物中至浓度为0.05％以防止细胞粘到离心管上。将细胞温和地旋下(在2000x g与5000x g之间)持续5分钟。将上清液弃去并且将细胞再悬浮于TAP+40mM蔗糖培养基中。在冰上将1到2μg的转化DNA与约1×10⁸个细胞进行混合并且转移到电击杯中。在电容设定为25μF、电压为800V以递送2000的V/cm、并且时间常数持续10-14ms下执行电穿孔。电穿孔后，将该电击杯返回到室温持续5-20分钟。将细胞转移到10mL TAP+40mM蔗糖中并且允许在连续摇动下在室温下恢复12-16小时。然后通过在2000g与5000g之间下离心来收获细胞并且将细胞再悬浮于0.5mLTAP+40mM蔗糖培养基中。将0.25mL的细胞铺于TAP+20ug/ml争光霉素上所有转化都是在争光霉素选择(20μg/mL)下完成的，其中通过由图1E中标记“选择标记”的片段编码的基因提供抗性。在存在争光霉素下维持多个转化的株以防止丢失该外源DNA。

通过斑点印迹筛选在存在争光霉素下生长的克隆。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。在暴露于这些蛋白后，在室温条件下用150μl含有0.05％Tween-20(TBST)的1x Tris缓冲盐水将这些珠粒洗涤三次。用150μl10μM EDTA，25mM Tris-HCl、pH 7.0，400mM NaCl从珠粒中释放蛋白，并且将该150μl洗出液斑点印迹到硝酸纤维素膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭，并用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(AlphaInnotech)进行成像。然后通过蛋白质印迹对在该斑点印迹分析中显示阳性结果的克隆进行筛选。

通过将细胞再悬浮于50μl含有还原剂的1x SDS样品缓冲剂(BioRad)中将在TAP琼脂平板上生长的多片藻类细胞进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。这些细胞翻译了小量的完整的融合物(争光霉素耐受性标志物融合到GP1-1凝集素上)；因为该耐受性标志物形成了一个二聚物，这些产物以更高的分子量进行迁移。图16表明在莱茵衣藻中生产了包括来自盖罩大蜗牛和扁豆的凝集素的GP1-凝集素融合物。

为了确定该凝集素-GP1融合物是否被正确地地以一个方向(其中该凝集素位于外部)插入该质膜中，进行了膜分离。将最小量的1×10⁷个细胞/mL的100mL的培养物在5000x g下离心10分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于3mL1x Tris缓冲盐水(TBS)2M脲中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环10秒。然后将该溶液在30,000x g下离心30分钟以去除未溶解的细胞。将1mL该上清液(膜和细胞质蛋白的混合物)小心地移去并且在一个TLA100.3转子(Beckman)中在540,000x g下离心20分钟以从可溶物(细胞质蛋白)中分离不溶物(膜)。然后将样品煮沸并且在存在2M脲下在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(ThermoScientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。图17中显示的结果证明在该膜部分中存在GP1-盖罩大蜗牛凝集素。在图18中可以看到GP1-盖罩大蜗牛凝集素构建体的存在对沉降的影响。

实例8.用一个对一个融合的耐受性标志物进行编码的核酸和对一个Fas1-scFv 融合蛋白进行编码的基因核转化莱茵衣藻

将一个融合到Fas1上的对一个抗体/单链可变区片段(scFv5)进行编码的核酸引入莱茵衣藻(SEQ ID NO：14)中。转化DNA图解地示于图1D中。标记“转基因”的片段是scFv5-Fas1编码基因，标记“启动子/5’UTR”的片段是具有内含子的莱茵衣藻HSP70/rbcS25’UTR，标记“选择性标记”的片段是一个争光霉素耐受性基因，标记CM(切割部分)的片段是口蹄疫病毒(FMDV)的2A病毒蛋白酶，标记“靶向信号”的片段是将该蛋白靶向细胞表面展示的一个信号肽，标记“锚定域”的片段是用于将该scFv5-Fas1蛋白共价连接到细胞表面上的一个糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-锚定域，并且标记3’UTR的片段是来自莱茵衣藻rbcS2的3’UTR。该争光霉素耐受性基因、，2A和凝集素-Fas1编码区被物理地连接在框内，生成一个嵌合的单个的ORF。使用标准技术，将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及一个FLAG表位标记设计在该scFv5与Fas1之间的接点之中。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

对于这些实验，在莱茵衣藻株21gr上实现所有的转化。将细胞进行生长并且通过电穿孔进行转化。将细胞生长到对数中期(约2-6×10⁶个细胞/mL)。在收获前将Tween-20加入细胞培养物中至浓度为0.05％以防止细胞粘到离心管上。将细胞温和地旋下(在2000x g与5000x g之间)持续5分钟。将上清液弃去并且将细胞再悬浮于TAP+40mM蔗糖培养基中。在冰上将1到2μg的转化DNA与约1×10⁸个细胞进行混合并且转移到电击杯中。在电容设定为25μF、电压为800V以递送2000的V/cm、并且时间常数持续10-14ms下执行电穿孔。电穿孔后，将该电击杯返回到室温持续5-20分钟。将细胞转移到10mL TAP+40mM蔗糖中并且允许在连续摇动下在室温下恢复12-16小时。然后通过在2000g与5000g之间下离心来收获细胞并且将细胞再悬浮于0.5mL

TAP+40mM蔗糖培养基中。将0.25mL的细胞铺于TAP+20ug/ml争光霉素上。所有转化都是在争光霉素选择(20μg/mL)下完成的，其中通过由图1D中标记“选择标记”的片段编码的基因提供耐受性。在存在争光霉素下维持多个转化的株以防止丢失该外源DNA。

通过斑点印迹对在存在争光霉素下生长的克隆进行筛选，。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。在暴露于这些蛋白后，在室温条件下用150μl含有0.05％Tween-20(TBST)的1x Tris缓冲盐水将这些珠粒洗涤三次。用150μl10μM EDTA，25mM Tris-HCl、pH 7.0，400mM NaCl从珠粒中释放蛋白，并且将该150μl洗出液斑点印迹到硝酸纤维素膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal WestDura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(AlphaInnotech)进行成像。然后通过蛋白质印迹对在该斑点印迹分析中显示阳性结果的克隆进行筛选。

通过将细胞再悬浮于50μl含有还原剂的1x SDS样品缓冲剂(BioRad)中将在TAP琼脂平板上生长的多片藻类细胞进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。来自1菌落(和野生型对照)的结果示于图19中。这些细胞翻译了小量的完整的融合物(争光霉素耐受性标志物融合到scFv5-Fas1上)；因为该耐受性标志物形成了一个二聚物，这些产物以更高的分子量进行迁移。这些结果表明scFv-Fas1融合蛋白是由这些株生产的。

为了确定该scFv5-Fas1融合物是否被正确地以一个方向(其中它位于外部)插入该质膜中，进行了膜分离。将最小量1×10⁷个细胞/mL的100mL培养基在5000x g下离心10分钟。所有随后的操作都是在4℃下并且在存在蛋白酶抑制剂下完成的。将该球粒再悬浮于3mL 1x Tris缓冲盐水(TBS)中并且使用一台microtip仪在30％功率下超声处理3个循环，每个循环10秒。然后将该溶液在30,000x g下离心30分钟以去除未溶解的细胞。将1mL上清液(膜和细胞质蛋白的混合物)小心地移去并且在一个TLA100.3中在540,000xg下离心20分钟以从可溶物(细胞质蛋白)中分离不溶物(膜)。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(AlphaInnotech)进行成像。来自一个scFv5-Fas1膜分离的结果示于图20中。

实例9.在莱茵衣藻中硝酸盐诱导表达一个絮凝部分

在这个实例中，将一个对来自盖罩大蜗牛的凝集素进行编码的核酸引入莱茵衣藻(SEQ ID NO.15)中。转化DNA图解地示于图1F中。标记“转基因”的片段是编码凝集素的基因，标记“5’UTR”的片段是莱茵衣藻硝酸盐还原酶5’UTR，标记“选择性标记”的片段是硝酸盐还原酶基因，标记CM(切割部分)的片段是口蹄疫病毒(FMDV)的2A病毒蛋白酶，并且标记3’UTR的片段是来自莱茵衣藻硝酸盐还原酶的3’UTR。硝酸盐还原酶、2A和盖罩大蜗牛凝集素编码区被物理地连接在框内，生成一个嵌合的单个的ORF。使用标准技术，将一个金属亲和标签(MAT)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点以及FLAG表位设计在该凝集素的3’端处。在构建这个转化DNA中执行的所有DNA操作基本上都如S ambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989)以及Cohen et al.，Meth.Enzymol.297，192-208，1998所描述。

对于这些实验，在莱茵衣藻株Nitl-305(硝酸盐还原酶功能缺陷，来自衣藻中心)上实现所有转化。将细胞进行生长并且通过电穿孔进行转化。将细胞生长到对数中期(约2-6×10⁶个细胞/mL)。在收获前将Tween-20加入细胞培养物中至浓度为0.05％以防止细胞粘到离心管上。将细胞温和地旋下(在2000x g)与5000x g)之间)持续5分钟。将上清液弃去并且将细胞再悬浮于TAP+40mM蔗糖培养基中。在冰上将1到2μg转化DNA与约1×10⁸个细胞进行混合并且转移到电击杯中。在电容设定为25μF、电压为800V以递送2000的V/cm、并且时间常数持续10-14ms下执行电穿孔。电穿孔后，将该电击杯返回到室温持续5-20分钟。将细胞转移到10mL TAP+40mM蔗糖中并且允许在连续摇动下在室温下恢复12-16小时。然后通过在2000g与5000g之间下离心来收获细胞并且将细胞再悬浮于0.5mL TAP+40mM蔗糖培养基中。将0.25mL细胞铺于TAP-NH₄Cl，+7.4mM KNO₃上所有转化都是在存在7.4mM KNO₃下完成的，其中通过硝酸盐还原酶提供了利用NO₃作为唯一氮源的能力。在存在KNO₃下维持多个转化的株以防止丢失该外源DNA。

通过斑点印迹对在TAP-NH₄Cl，+7.4mM KNO₃中生长的克隆进行筛选。简言之，根据生产厂家的说明书，通过BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)将克隆溶解并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。在暴露于这些蛋白后，在室温条件下用150μl含有0.05％Tween-20(TBST)的1x Tris缓冲盐水将这些珠粒洗涤三次。用150μl20μM EDTA，25mM Tris-HCl、pH 7.0，400mM NaCl从珠粒中释放蛋白，并且将该150μl洗出液斑点印迹到硝酸纤维素膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。然后通过蛋白质印迹对在该斑点印迹分析中显示阳性结果的克隆进行筛选。

通过将细胞再悬浮于50μl含有还原剂的1x SDS样品缓冲剂(BioRad)中将在TAP琼脂平板上生长的多片藻类细胞进行溶解。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂商的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(Thermo Scientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。

为了表征表达的诱导性，在光照下将50mL的Nit-2A-盖罩大蜗牛凝集素株生长在TAP培养基中。一旦细胞培养物的密度达到1×10⁶个细胞/mL，将该培养物分成两个25mL的样品。每个样品在5000x g下离心10分钟。将上清液弃去并且将一个样品再悬浮于25mLTAP中。将另一个样品再悬浮于25mLTAP-NH4Cl+7.4mM KNO3中。将20×10⁶个细胞进行离心并且在时间点0、12小时和24小时处进行冷冻。根据生产厂家的说明书，将这些样品进行处理并且使用MagneHis Ni-颗粒(Promega)将MAT标记的蛋白分离。在暴露于这些蛋白后，在室温条件下用150μl含有0.05％Tween-20(TBST)的1x Tris缓冲盐水将这些珠粒洗涤三次。用150μl20μM EDTA，25mM Tris-HCl、pH 7.0，400mM NaCl从珠粒中释放蛋白。将50μl含有还原剂的4×SDS样品缓冲剂(BioRad)加入。然后将样品煮沸并且在一个10％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上跑胶并且根据生产厂家的说明书使用一台转印迹半干印迹仪(BioRad)转移到PVDF膜上。通过起始封闭(TBS)封闭缓冲剂(ThermoScientific)将膜封闭并且用在起始封闭缓冲剂中1∶3000稀释的小鼠抗FLAG抗体-辣根过氧化物酶结合物(Sigma)探测一小时。探测后，用TBST将膜洗涤四次，然后用Supersignal West Dura化学发光底物(Thermo Scientific)进行显影并且使用一台CCD相机(Alpha Innotech)进行成像。如图21中所示，诱导盖罩大蜗牛凝集素表达是非常显著的。

实例10.氮缺乏诱导的交配表现型介导的莱茵衣藻的絮凝

在这个实例中，将对应地代表两种交配型正(MT+)和负(MT-)的两个莱茵衣藻株21gr和6145c生长在Tris-乙酸盐-磷酸盐(TAP)培养基中至5×10⁶个细胞/mL。将1L的每个培养物在5000x g下离心10分钟。将上清液弃去并且将该球粒再悬浮于无分别氯化铵的1L TAP培养基(TAP-NH₄Cl)中。再次将该培养物在5000x g下离心10分钟以洗去残余的氯化铵。将上清液弃去并且将该球粒再悬浮于1L TAP-NH₄Cl中。再次将该培养物在5000x g下离心10分钟。将该球粒再悬浮于1L TAP-NH₄Cl中并且允许在光照下摇动12-16小时。将这些培养物以1∶1的比率进行结合并且允许在观察沉淀之前在光照下摇动12小时。随着时间的过去在13×100mm硼硅酸盐一次性培养管中观察到7.5

mL该培养物的沉淀或沉降。结果示于图22中。

该方法的一个变体涉及将该培养基中氮的量最小化，从而当该培养物接近饱和时该培养物将自然开始饥饿。将株21gr和6145c在TAP中进行生长直到约2-6×10⁶个细胞/mL。将约1×10⁸个细胞进行离心并且再悬浮于1mL TAP-NH₄Cl中。将这些在TAP-NH₄Cl+5mM NaNO₃中稀释10,000倍。在光照下生长3天后达到饱和。随着时间的过去在13×100mm硼硅酸盐一次性培养管中观察到7.5mL该培养物的沉淀。结果示于图23中。

表1.序列数据

Claims

1.一种使一种无维管的光合生物絮凝的方法，包括：

a.表达一种外源核酸，该外源核酸编码作为一个第一无维管的光合生物的一个细胞表面组分的一个第一絮凝部分；并且

b.将所述生物与一个第二絮凝部分进行接触，由此使得所述生物絮凝。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述无维管的光合生物是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述无维管的光合生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一絮凝部分是一种碳水化合物结合蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述碳水化合物结合蛋白是一种凝集素。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述凝集素是一种c型凝集素。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述碳水化合物结合蛋白选自下组中的至少一项，该组的组成为：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一絮凝部分是一种抗体。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体是单价的、多价的或多价态的抗体。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体特异地结合到来自衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员的一个细胞表面抗原上。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体特异地结合到来自莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻的一个细胞表面抗原上。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸进一步包括一种组成型启动子。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述第二絮凝部分与所述第一絮凝部分相互作用并且是一种凝集素、碳水化合物、蛋白、重金属、阳离子的或化学的絮凝剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述第二絮凝部分选自下组，该组的组成为：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、半乳凝素类、溶血磷脂酸、c型凝集素、Gal/GalNAc、O-连接的糖类、O-连接的多糖类、GlcNAc、磷脂酶A2、GalNAc-SO₄、唾液酸、糖鞘脂类、葡萄糖单霉菌酸酯、脂阿拉伯甘露聚糖、磷脂酰肌醇类、己糖基-1-磷酸类异戊二烯类、甘露糖基-磷酸多萜醇类、α-半乳糖基神经酰胺、以及末端半乳糖苷类中的至少一种。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述表达步骤包括当将所述生物暴露于一种诱导剂时诱导所述絮凝部分的转录。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述诱导剂是光、温度、氮浓度、盐、或细胞密度。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸进一步包括一个调节元件，所述元件包括一种光诱导型启动子、一种群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、一种盐敏感型启动子或一种氮浓度响应型启动子。

18.如权利要求1、13或14中任何一项所述的方法，其中所述第二絮凝部分被附连到一个固体支持物上。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述第二絮凝部分作为一个第二无维管的光合生物的一种细胞表面组分存在。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述第二生物是与所述第一生物相同的属。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述第二生物是与所述第一生物不同的属。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述第二生物是与所述第一生物相同的种。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述第二生物是与所述第一生物不同的种。

24.如权利要求19所述的方法，进一步包括将所述第一生物与所述第二生物进行混合。

25.一种无维管的光合生物，在所述生物的外部细胞表面上该无维管的光合生物包括一种外源蛋白，所述外源蛋白包括一个结合对中的一个成员。

26.如权利要求25所述的生物，其中所述外源蛋白是一种抗体。

27.如权利要求26所述的生物，其中所述抗体是一种单链可变区片段(scFv)抗体。

28.如权利要求25所述的生物，其中所述外源蛋白是一种碳水化合物结合蛋白。

29.如权利要求28所述的生物，其中所述外源蛋白是一种凝集素。

30.如权利要求29所述的生物，其中所述凝集素是一种c型凝集素。

31.如权利要求25所述的生物，其中所述外源蛋白是一种抗原。

32.如权利要求25至31中任何一项所述的生物，其中所述蛋白是一种融合蛋白或一种嵌合蛋白。

33.如权利要求25所述的生物，其中所述外部细胞表面是一个细胞膜或一个细胞壁。

34.如权利要求25至33中任何一项所述的生物，其中所述生物是一种藻类。

35.如权利要求34所述的生物，其中所述藻类是一种绿藻。

36.如权利要求35所述的生物，其中所述藻类是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员。

37.如权利要求36所述的生物，其中所述藻类是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。

38.如权利要求25所述的生物，其中所述生物是一种适盐生物。

39.如权利要求38所述的生物，其中所述生物是盐生杜氏藻、杜氏盐藻或绿色杜氏藻。

40.如权利要求28所述的生物，其中所述碳水化合物蛋白是下组中的至少一项，该组的组成为：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。

41.一种絮凝方法，包括：

a.用一个核酸转化一个第一无维管的光合生物，该核酸编码一个第一絮凝部分；

b.用一个核酸转化一个第二生物，该核酸编码一个第二絮凝部分；

c.表达所述第一和第二絮凝部分；并且

d.将所述第一部分与所述第二部分进行接触，由此使得所述生物絮凝。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述第二生物是一种无维管的光合生物。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二生物是相同的属。

44.如权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二生物是不同的属。

45.如权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二生物是相同的种。

46.如权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二生物是不同的种。

47.如权利要求41所述的方法，其中所述第一生物、所述第二生物、或两者是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的成员。

48.如权利要求41所述的方法，其中所述第一生物、所述第二生物、或两者是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。

49.如权利要求41所述的方法，其中所述第一或所述第二絮凝部分是一种碳水化合物结合蛋白。

50.如权利要求41所述的方法，其中所述第一或所述第二絮凝部分是一种抗体。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述抗体特异地结合到所述第一或第二生物其中一个上的一个细胞表面抗原上。

52.如权利要求49所述的方法，其中所述第一或第二絮凝部分包括一种凝集素。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述凝集素是一种c型凝集素。

54.如权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二絮凝部分包括交配型特异性凝集素。

55.如权利要求41所述的方法，其中所述第一絮凝部分是FhuA蛋白并且所述第二絮凝部分是pb5蛋白。

56.如权利要求41所述的方法，其中所述表达步骤包括当将所述生物暴露于一种诱导剂时，诱导所述絮凝部分的转录。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述诱导剂是光、温度、氮浓度、盐、或细胞密度。

58.如权利要求41所述的方法，其中所述核酸进一步包括一个调节元件，所述调节元件包括一种光诱导型启动子、一种群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、盐敏感型启动子或一种氮浓度响应型启动子。

59.如权利要求41所述的方法，其中所述核酸进一步包括一个靶向元件，该靶向元件允许将所述第一絮凝部分、所述第二絮凝部分、或两者导向到所述生物的一个外部细胞表面上。

60.如权利要求41所述的方法，其中所述核酸进一步包括一个序列，该序列编码一个锚定元件，该锚定元件允许将所述第一絮凝部分、所述第二絮凝部分、或两者锚定在所述第一生物、所述第二生物或两者的外表面上。

61.一种载体，包括：

a.一个分离的核酸，该核酸编码一个絮凝部分；

b.一个调节元件，该调节元件用于在一个光合生物的细胞核中表达所述絮凝部分；以及

c.一个核酸，该核酸包括一个靶向元件，该靶向元件允许将所述絮凝部分导向到所述生物的一个外部细胞表面上或被所述生物分泌。

62.如权利要求61所述的载体，其中所述絮凝部分是一种碳水化合物结合蛋白。

63.如权利要求61所述的载体，其中所述絮凝部分是一种抗体。

64.如权利要求63所述的载体，其中所述抗体结合到衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员的一个细胞表面抗原上。

65.如权利要求64所述的载体，其中所述抗体结合到来自莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻的一个细胞表面抗原上。

66.如权利要求61所述的载体，其中所述絮凝部分是一种凝集素、FhuA蛋白、或pb5蛋白。

67.如权利要求66所述的载体，其中所述凝集素是一种c型凝集素。

68.如权利要求61所述的载体，其中所述絮凝部分选自下组中的至少一项，该组的组成为：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。

69.如权利要求61所述的载体，其中所述调节元件包括一个启动子。

70.如权利要求69所述的载体，其中所述启动子是一种组成型启动子、一种光诱导型启动子、一种群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、或一种氮浓度响应型启动子。

71.如权利要求61所述的载体，进一步包括一个核酸，该核酸编码一个锚定元件，该锚定元件允许将所述絮凝部分锚定在所述生物的外表面上。

72.一种宿主细胞，包括如权利要求60至71中任何一项所述的载体。

73.如权利要求72所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种无维管的光合生物。

74.如权利要求73所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员。

75.如权利要求74所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。

76.如权利要求72所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达一个外源的絮凝部分。

77.一种再利用来自一个液体环境的一种液体的方法，包括：

a.使一种无维管的光合生物生长在所述液体环境中，其中所述生物包括一种对一个第一絮凝部分进行编码的外源核酸；

b.将所述生物与一个第二絮凝部分进行接触，该第二絮凝部分直接地或间接地结合到所述第一絮凝部分上，由此使所述生物絮凝；并且

c.从含有所述无维管的光合生物的所述液体环境中分离至少一部分的所述液体。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述生物是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。

80.如权利要求77所述的方法，其中所述第一絮凝部分是一种碳水化合物结合蛋白。

81.如权利要求77所述的方法，其中所述第一絮凝部分选自下组，该组的组成为：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。

82.如权利要求77所述的方法，其中所述第一絮凝部分是一种凝集素。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述凝集素是一种c型凝集素。

84.如权利要求77所述的方法，其中所述第一絮凝部分是一种抗体。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述抗体结合来自衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员的一个细胞表面抗原。

86.如权利要求84所述的方法，其中所述抗体结合来自莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻的一个细胞表面抗原。

87.如权利要求77所述的方法，其中所述核酸进一步包括一种组成型启动子。

88.如权利要求77所述的方法，其中所述第二絮凝部分是一种凝集素、蛋白、重金属、阳离子的或化学的絮凝剂。

89.如权利要求77所述的方法，其中所述第二絮凝部分选自下组中的至少一个成员，该组的组成为：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、半乳凝素类、溶血磷脂酸、c型凝集素、Gal/GalNAc、O-连接的糖类、O-连接的多糖类、GlcNAc、磷脂酶A2、GalNAc-SO₄、唾液酸、糖鞘脂类、葡萄糖单霉菌酸酯、脂阿拉伯甘露聚糖、磷脂酰肌醇类、己糖基-1-磷酸类异戊二烯类、甘露糖基-磷酸多萜醇类、α-半乳糖基神经酰胺、以及末端半乳糖苷类。

90.如权利要求77所述的方法，其中所述核酸进一步包括一个调节元件并且其中所述元件包括一种光诱导型启动子、一种群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、或一种氮浓度响应型启动子。

91.如权利要求77所述的方法，其中所述第二絮凝部分被附连到一个固体支持物上。

92.如权利要求77所述的方法，其中所述第二絮凝部分存在于一个第二生物的细胞表面上。

93.一种使一种无维管的光合生物絮凝的方法，包括将所述无维管的光合生物与一个第二生物进行接触，所述第二生物包括一个对一种抗体进行编码的外源核酸，该抗体结合到所述无维管的光合生物上的一个表面抗原上，由此引起了所述无维管的光合生物的絮凝。

94.如权利要求93所述的方法，其中该抗体被表达在所述第二生物的一个外部细胞表面上。

95.如权利要求93所述的方法，其中所述第二生物是一种细菌或一种酵母。

96.如权利要求93所述的方法，其中所述外源核酸编码了一种融合或嵌合蛋白，该融合或嵌合蛋白包括一个锚定组分，该锚定组分将所述抗体锚定到所述第二生物的一个外部细胞表面上。

97.如权利要求93所述的方法，其中所述抗体是一种单链可变区片段抗体。

98.如权利要求93所述的方法，其中所述无维管的光合生物是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员。

99.如权利要求98所述的方法，其中所述无维管的光合生物是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻或雨生血球藻。

100.一种使一种无维管的光合生物絮凝的方法，包括将所述无维管的光合生物与一个第二生物进行接触，所述第二生物包括一个对一个絮凝部分进行编码的外源核酸，该絮凝部分结合到所述无维管的光合生物的一个表面组分上，由此引起了所述无维管的光合生物的絮凝。

101.如权利要求100所述的方法，其中所述絮凝部分是由所述第二生物分泌的。

102.如权利要求100所述的方法，其中将所述絮凝部分表达为所述第二生物的一种细胞表面组分。

103.如权利要求101或102中所述的方法，其中所述第二生物是一种酵母、一种细菌、一种非光合藻类或一种光合藻类。

104.如权利要求103所述的方法，其中所述第二生物是一种大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。

105.如权利要求101或102中所述的方法，其中所述第二生物是一种无维管的光合生物。

106.如权利要求101或102中所述的方法，其中所述絮凝部分是一种碳水化合物结合蛋白。

107.如权利要求106所述的方法，其中所述碳水化合物结合蛋白是一种凝集素。

108.如权利要求107所述的方法，其中所述凝集素是一种c型凝集素。

109.如权利要求106所述的方法，其中所述碳水化合物结合蛋白是下组中的至少一项，该组选自：CD-SIGN、Dectin-1、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。