CN102060905B - 利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法 - Google Patents
利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法，其特征是它由如下步骤组成：(1)将鲜海参加工废液减压浓缩醇沉，吸取上清液；(2)将所得上清液通过大孔吸附树脂柱，吸附饱和后冲洗并收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩得浸膏；(3)将所得浸膏拌硅胶粉，利用由甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，水组成的溶液体系进行硅胶柱层析；再利用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1为展开体系，取下层进行TLC层析，收集硅胶柱层析迁移率为0.2-0.3的组分，将该组分减压浓缩，真空干燥得白色粉末。(4)将白色粉末利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，乙腈水溶液为流动相进行纯化，收集主峰，真空干燥得海参皂苷Holotoxin A1对照品。本发明主要用于制备海参皂苷Holotoxin A1。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法。
背景技术
海参皂苷具有重要的生物学活性，如抗真菌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、提高免疫力等，1976年，日本学者Kitagawa便从刺参(stichopus japonicusshlenka)中分离出具有显著抗真菌活性的皂苷类物质，holotoxin A和B，现已经成为脚气和脚癣的治疗药物。此后，对海参皂苷的研究倍受学者们关注。
我国对于海参皂苷的研究始于上世纪80年代，已先后分离纯化出100余种不同结构的海参皂苷。海参皂苷分离纯化方法有多种，包括如下：
如2005年，第二军医大学药学院海洋药物中心在《第二军医大学学报》第26卷第6期，发表了“糙海参中三萜活性成分的研究”，分离鉴定了5个三萜皂苷化合物，分别为24-dehydroechinoside A(1)，echinosideB(2)，echinoside A(3)，holothurin B(4)和holothurin A(5)，其分离纯化的主要特点是：糙海参干燥、粉碎(7.0kg)，用70％乙醇冷浸提取(200L×3次)，回收乙醇得流浸膏，分散在水中，依次用石油醚、三氯甲烷、正丁醇萃取，得到石油醚部分、三氯甲烷部分和正丁醇部分，糙海参皂苷主要集中于正丁醇部分。正丁醇部位减压浓缩得糙海参总皂苷(75.8g)。总皂苷经大孔树脂柱层析和Sephadex LH-20葡聚糖凝胶过滤纯化，经反复的正相硅胶柱层析处理，氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1，下层)洗脱，再经反相硅胶柱层析分离(洗脱剂为62％甲醇溶液)，最后通过HPLC纯化(流动相为60％甲醇溶液，流速为1.5ml/min)。
2006年，第二军医大学药学院海洋药物中心在《中草药》第4期，发表了“黑乳海参中两个新的三萜皂苷”，其分离纯化的主要特点：新鲜黑乳海参材料洗净、切碎后，用85％乙醇冷浸提取，回收乙醇得流浸膏。将流浸膏均匀分散在水中，用二氯甲烷萃取，待二氯甲烷萃取液颜色变得极浅后，再用正丁醇萃取。回收正丁醇即可得到黑乳海参粗皂苷。取粗皂苷60mg，溶于120mL由吡啶-二氧六环等体积混合的溶剂中，120℃加热215h。反应物冷却后，回收溶剂，所得浸膏用硅胶低压柱色谱处理，氯仿∶甲醇∶水(7.5∶2.5∶1，下层)洗脱，得到的主成分再进行高效液相柱色谱纯化，色谱柱为Zobax SB C218型ODS反相柱，洗脱剂为80％甲醇，体积流量为1.5mL/min，得到2个化合物。
2006年，第二军医大学药学院海洋药物中心在《中国天然产物》第4卷，发表了“花刺参中两个新的三萜皂苷”，其分离纯化的主要特点：新鲜花刺参(约15kg)，绞碎，用70％的乙醇冷浸3次，每次7d，减压回收乙醇提取液得流浸膏。用甲醇反复多次溶解，过滤除去不溶物，甲醇组分减压回收至浸膏状。再将其分散在水中，水溶液用石油醚萃取3次，脱脂后的溶液用正丁醇萃取6次，减压回收正丁醇部分得到粗总皂苷(17.6g)。总皂苷经反复的正相和反相硅胶柱层析分离，以及Sephadex LH-20纯化，所得主成分进行制备HPLC纯化(流动相为65％甲醇)，流速为1.5mL·min-1，得到化合物Ⅰ(19.6mg)，化合物Ⅱ。
2008年，第二军医大学药学院海洋药物中心在《中国海洋药物杂志》第27卷，发表了“丑海参的化学成分研究”，分离鉴定了3个海参皂苷：HolothurinA1(Ⅰ)，Holothurin A(Ⅱ)和Pervicoside C(Ⅲ)，其分离纯化的主要特点是：丑海参干品3.8kg粉碎，用70％乙醇加热回流提取4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，分散水中，进行大孔树脂柱分离，依次用水、70％乙醇和95％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱液浓缩得总皂苷(83g)。总皂苷进行快速硅胶柱色谱分离，用CHCl3∶MeOH∶H2O梯度洗脱(8∶2∶1，7∶3∶1，6.5∶3.5∶1)，分为A～J 10个组分，TLC检测表明海参皂苷主要在J组分中(7.03g)。取J组分1.0g，进行MPLC(ODS反相硅胶)分离，以70％MeOH洗脱，得到J 1，J 2和J 33个组分：J 1经HPLC制备，以50％MEOH洗脱，得到化合物Ⅰ(13mg)；J 2经HPLC制备，以54％MEOH洗脱，得到化合物Ⅱ(220mg)；J 3经HPLC制备，以54％MEOH洗脱，得到化合物Ⅲ(24mg)。C组分(940mg)进行硅胶柱和SephadexLH-20柱分离，得化合物Ⅳ(64mg)。
以上对海参皂苷单体的分离纯化均从鲜海参或干参中获得。
2006年，中国海洋大学以海参废液为原材料提取制备了水溶性海参皂苷，在《中国海洋大学学报》第36卷，发表了“仿刺参水溶性海参皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究”，其主要特点是：海参废弃液用1mol/L NaOH调节pH＝10，离心(8000r/min，30min)收集上清液，上样于预处理的AB-8型大孔吸附树脂柱，用去离子水冲洗后，分别用20％和70％的乙醇溶液进行洗脱，收集70％乙醇的洗脱组分，减压浓缩至浸膏状，加入少量蒸馏水重新溶解，离心(8000r/min，40min)收集上清液，经石油醚萃取脱脂后，将水层再利用水饱和的正丁醇萃取3次，合并所得正丁醇层，减压浓缩至浸膏状后进行真空冷冻干燥，即得到水溶性海参皂苷冻干品。文中从海参废液中分离制备了海参皂苷，但对于Holotoxin A1纯品的制备还没有报道。
发明内容
本发明提出一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法。
本发明的技术方案包括如下内容：(本发明所述百分数均为浓度百分比)
一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法，其特征是它由如下步骤组成：(1)将鲜海参加工废液减压浓缩后加入乙醇，静置，待固液分层后，吸取上清液；(2)将所得上清液通过大孔吸附树脂柱，吸附饱和后，分别利用水，20％乙醇溶液冲洗；然后再利用70％乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂柱并收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩得浸膏；(3)将所得浸膏拌样硅胶粉，利用由甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，水组成的溶液体系进行硅胶柱层析；再利用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1，取下层为展开剂进行TLC层析；收集硅胶柱层析迁移率为0.2-0.3的组分，将该组分减压浓缩，真空干燥得白色粉末。(4)将白色粉末利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，乙腈水溶液为流动相进行纯化，收集主峰，真空干燥得海参皂苷Holotoxin A1对照品。TLC是指硅胶板层析。
本方案的具体特点还有所述鲜海参为新鲜刺参。将新鲜刺参煮制后的加工废液减压浓缩后利用乙醇沉淀得到混合液，使乙醇在混合液中的浓度为15-25％，静置分层后，取上清液。所述乙腈水溶液为45-55％乙腈水溶液。所述鲜海参加工废液是指将新鲜刺参放入沸腾的海水或自来水中煮10-40min，捞出海参后所得到的溶液。所述硅胶柱层析中的层析液为甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1，取下层。
海参皂苷Holotoxin A1结构式如下：
本发明充分利用新鲜刺参加工煮制过程中所产生的废液，利用上述工艺方法，能够有效的分离纯化出98％以上的海参皂苷Holotoxin A1对照品。本发明最显著的特点包括如下三个方面：(1)利用新鲜刺参加工废液，从中提取纯度高于98％以上的海参皂苷Holotoxin A1；(2)工艺方法仅采用醇沉取上清液、大孔树脂层析、硅胶柱层析、HPLC层析四步先后组合就可获得98％以上纯度的海参皂苷对照品，工艺简单；(3)HPLC层析，采用203nm紫外光吸收，45-55％乙腈水溶液为流动相进行纯化，不同于文献中报道的分离其它海参皂苷单体(纯品)的方法，如利用60％甲醇溶液为流动相。本发明对于利用新鲜刺参加工废液分离纯化制备海参皂苷Holotoxin A1对照品具有极高的利用价值。
具体实施方式
实施例1
(1)收集新鲜刺参加工废液2000L，65℃第一次减压浓缩，浓缩至体积200L，固形物含量为16％，然后加入95％的乙醇45L，静置后取上清液。
(2)上清液以2倍柱体积的流速通过AB-8型大孔吸附树脂柱，过柱完毕后，利用50L的纯净水冲洗，20L20％的乙醇溶液冲洗；再用30L70％的乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂柱并收集本次冲洗的洗脱液，将洗脱液60℃浓缩得浸膏。
(3)浸膏拌样硅胶粉，采用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1，取下层进行硅胶柱层析，再利用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1为展开体系，取下层进行TLC层析，收集硅胶柱层析迁移率为0.2-0.3的组分，收集组分50℃浓缩，真空干燥。
(4)干燥组分利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，45％的乙腈流动相层析，收集主峰，真空干燥得海参皂苷Holotoxin A1对照品。
通过上述步骤所得海参皂苷Holotoxin A1纯度达98％以上。
实施例2：
(1)收集新鲜刺参加工废液2000L，65℃第一次减压浓缩，浓缩至体积200L，固形物含量为13％，然后加入95％的乙醇70L，静置后取上清液。
(2)上清液以2倍柱体积的流速通过AB-8型大孔吸附树脂柱，过柱完毕后，利用50L的纯净水冲洗和20L20％的乙醇溶液冲洗；再用30L70％的乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂柱并收集本次冲洗的洗脱液，将洗脱液50℃浓缩得浸膏。
(3)浸膏拌样硅胶粉，采用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1取下层进行硅胶柱层析，再利用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1为展开体系，取下层进行TLC层析，收集硅胶柱层析迁移率为0.2-0.3的组分，收集组分60℃浓缩，真空干燥。
(4)干燥组分利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，50％的乙腈流动相层析，收集主峰，真空干燥得海参皂苷对照品Holotoxin A1。
通过上述步骤所得海参皂苷Holotoxin A1纯度达98％以上。
Claims (6)
1.一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法，其特征是它由如下步骤组成：
(1)将鲜海参加工废液减压浓缩后加入乙醇，静置，待固液分层后，吸取上清液；
(2)将所得上清液通过大孔吸附树脂柱，吸附饱和后，分别利用水，20％乙醇溶液冲洗；然后再利用70％乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂柱并收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩得浸膏；
(3)将所得浸膏拌样硅胶粉，利用由甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，水组成的溶液体系进行硅胶柱层析；再利用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1为展开体系，取下层进行TLC层析，收集硅胶柱层析迁移率为0.2-0.3的组分，将该组分减压浓缩，真空干燥得白色粉末；
(4)将白色粉末利用乙腈水溶液溶解，利用HPLC，203nm紫外光吸收，乙腈水溶液为流动相进行纯化，收集主峰，真空干燥得海参皂苷Holotoxin A1对照品。
2.根据权利要求1所述的利用鲜海参加工废液提取海参皂苷HolotoxinA1对照品的工艺方法，其特征是所述鲜海参为新鲜刺参。
3.根据权利要求2所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法，其特征是所述鲜海参加工废液是指将新鲜刺参放入沸腾的海水或自来水中煮10-40min，捞出海参后所得到的溶液。
4.根据权利要求3所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷HolotoxinA1对照品的工艺方法，其特征是将新鲜刺参煮制后得到的鲜海参加工废液减压浓缩后利用乙醇沉淀得到混合液，使乙醇在混合液中的浓度为15-25％，静置分层后，取上清液。
5.根据权利要求1所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法，其特征是所述乙腈水溶液为45-55％乙腈水溶液。
6.根据权利要求1所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法，其特征是所述硅胶柱层析中的层析液为甲醇∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶4∶1，取下层。
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