CN101993904A

CN101993904A - 5’-鸟苷酸的生产方法

Info

Publication number: CN101993904A
Application number: CN2010102505411A
Authority: CN
Inventors: 深田宽朗; 浅原贵之; 桥口贤一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2010-08-10
Publication date: 2011-03-30
Also published as: KR101669474B1; JP5636648B2; KR20110016417A; EP2295546A2; EP2295546B1; EP2295546A3; JP2011036171A; US9200304B2; US20110033898A1; CN104480169A

Abstract

本发明涉及5’-鸟苷酸的生产方法。使用微生物高效率地生产5’-鸟苷酸(GMP)。使XMP与经过修饰而使得nagD基因无法正常发挥功能、且经过修饰而增大了GMP合成酶的活性的细菌反应来得到GMP。

Description

5’-鸟苷酸的生产方法

技术领域

本发明涉及5’-鸟苷酸的生产方法以及在5’-鸟苷酸的生产中使用的新微生物。5’-鸟苷酸作为调味料、医药以及调味料、医药的原料是有用的。

背景技术

作为5’-鸟苷酸(鸟苷-5’-一磷酸，以下也称“GMP”)的工业制备方法，采用发酵法生产鸟苷，再采用酶法将所得的鸟苷磷酸化，从而得到5’-鸟苷酸的方法(专利文献1～4)。

此外，还已知下述生产方法：将增大了GMP合成酶活性的属于埃希氏菌属的微生物与下述产氨短杆菌在包含XMP和氨气或谷氨酰胺的培养基中进行培养，高效率地将XMP转化为GMP，并使培养液中生成并蓄积GMP，其中，所述产氨短杆菌的腺苷-三磷酸(ATP)生物合成(以下也称“ATP再生”)活性高，所述腺苷-三磷酸(ATP)是代谢葡萄糖来从5’-黄苷酸(XMP)合成GMP的反应所必需的(非专利文献1)。

另一方面，提出了利用发酵法来生产GMP的方法。例如，专利文献5中公开了一种GMP的生产方法，该生产方法中培养具有腺嘌呤营养缺陷性、显示德夸菌素(decoyinine)或甲硫氨酸亚砜抗性、且具有GMP生产能力的芽孢杆菌属的突变株，并收集培养基中生成蓄积的GMP。此外，专利文献6公开了一种GMP的生产方法，该生产方法中培养使具有肌苷酸(肌苷酸-5’-一磷酸，以下也称“IMP”)生产能力的埃希氏菌属细菌的2种5’-核苷酸酶基因缺失、以及IMP脱氢酶和GMP合成酶基因增强而得到的菌株，并收集培养基中生成并蓄积的GMP。但是，一般而言，GMP的直接发酵收率不充分，与前述酶法相比较未必实用。

如前述，针对5′-鸟苷酸的生产进行了各种研究，并已有数个成功的实例。但是，对于核苷酸分解酶还有许多不明之处，已经发现了数种核苷酸分解酶，已知通过使它们缺失能够提高收率(专利文献6、7)，但完全抑制其分解是困难的，这是一个大问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1特开平07-231793号公报

专利文献2特开平10-201481号公报

专利文献3国际公开第96/37603号小册子

专利文献4特开2001-245676号公报

专利文献5特公昭56-12438号公报

专利文献6特开2002-355087号公报

专利文献7国际公开第2006/078132号小册子

非专利文献

非专利文献1 Tatsuro Fujio等，Biosci.Biotech.Biochem.，1997年，第61卷，5号，840-845页

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题是创造新微生物，所述新微生物能够在使用微生物从XMP生产GMP的方法中使用、且能够高效率地将XMP转化为GMP。

解决问题的方法

本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过利用经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能、且经过修饰从而增大了GMP合成酶活性的埃希氏菌属微生物，能够高效率地将XMP转化为GMP，从而完成了本发明。

本发明的一类实施方式提供5’-鸟苷酸的生产方法，该方法中使黄苷酸作用于经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能、且还经过修饰从而增大了5’-鸟苷酸合成酶的活性的、具有将黄苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物，来生成5’-鸟苷酸，并收集5’-鸟苷酸。

本发明的其它实施方式提供前述方法，其中，所述微生物经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能、而且还经过修饰而增加了guaA基因的表达，从而增大了5’-鸟苷酸合成酶的活性。

本发明的其它实施方式提供前述方法，其中，所述guaA基因编码下述(A)或(B)的蛋白质。

(A)具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的蛋白质。

(B)下述蛋白质，所述蛋白质具有在SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有5’-鸟苷酸合成酶活性。

本发明的其它实施方式提供前述方法，其中，所述微生物还经过修饰从而使得ushA基因和aphA基因中的1种或1种以上的基因无法正常发挥功能。

本发明的其它实施方式提供前述方法，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、芽孢杆菌属细菌或棒状杆菌型细菌。

本发明的其它实施方式提供前述方法，其中，所述微生物是埃希氏菌属细菌。

本发明的其它实施方式提供前述方法，其中，所述微生物是大肠杆菌。

本发明的其它实施方式提供经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能、而且还经过修饰而增加了guaA基因的表达从而增大了5’-鸟苷酸合成酶的活性的、具有将黄苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物(但是，不包括除了经过了上述修饰以外，还经过修饰从而通过增加guaB基因的表达增大了肌苷酸脱氢酶活性的微生物)。

本发明的其它实施方式提供前述微生物，该微生物还经过修饰从而使得选自ushA基因和aphA基因中的1种或1种以上的基因无法正常发挥功能。

本发明的其它实施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、芽孢杆菌属细菌或棒状杆菌型细菌。

本发明的其它实施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是埃希氏菌属细菌。

本发明的其它实施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是大肠杆菌。

附图说明

图1：(A)显示使JM109/pSTV29-Ptac-guaA株与XMP反应时的XMP和GMP的浓度变化的图表；(B)显示使JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株与XMP反应时的XMP和GMP的浓度变化的图表。

图2：(A)显示使JM 109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA株与XMP反应时的XMP和GMP的浓度变化的图表；(B)显示JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株与XMP反应时的XMP和GMP的浓度变化的图表。

图3：(A)显示使JM 109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA株与XMP反应时的XMP和GMP的浓度变化的图表；(B)显示使JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株与XMP反应时的XMP和GMP的浓度变化的图表。

发明的具体实施方式

以下，对本发明进行具体说明。

<I>本发明的方法中使用的微生物

本发明的方法中使用的微生物是经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能且还经过修饰从而增大了GMP合成酶活性的、具有将XMP转化为GMP的能力的微生物。

作为微生物，可以列举出属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌型细菌(Coryneform bacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌等。

作为属于肠杆菌科的细菌，可以列举出：埃希氏菌属(Escherichia)细菌、泛菌属(Pantoea)细菌、肠杆菌属(Enterobacter)细菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌、沙雷氏菌属(Serratia)细菌、欧文氏菌属(Erwinia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、摩根氏菌属(Morganella)细菌等。

对于埃希氏菌属细菌没有特殊限制，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属的细菌即可，具体地可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt，FR.C.et al.，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)中列举的埃希氏菌属细菌。

此外，作为肠杆菌属细菌，可以列举出成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等；作为泛菌属细菌，可以列举出Pantoea ananatis等。

作为棒状杆菌型细菌，可以列举出：按照微生物领域的本领域技术人员已知的分类方法分类为棒状杆菌型细菌的细菌；传统上被分类为短杆菌属，而现在被重新分类为棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))；以及属于与棒杆菌属亲缘关系非常近的短杆菌属的细菌等。这样的棒状杆菌型细菌的例子可以列举如下。

嗜乙酰乙酸棒杆菌

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)

白色棒杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

作为芽孢杆菌属细菌，可以使用按照微生物领域的本领域技术人员已知的分类方法分类在芽孢杆菌属的细菌，具体地，可以列举出枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，但不限于此。

对在诸如上述的微生物中增大GMP合成酶的活性的方法进行说明。

在本发明中，“经过修饰从而增大了GMP合成酶的活性”是指：与埃希氏菌属细菌等微生物的非修饰株例如野生株相比，GMP合成酶的活性高。

GMP合成酶是指催化下述反应的酶(EC 6.3.4.1)，“GMP合成酶的酶活性”是指催化从XMP生成GMP的反应的活性。

ATP+XMP+NH₃→AMP+焦磷酸+GMP

GMP合成酶活性可以例如采用Spector的方法(Spector，T.，Methods Enzymol.，1978，51，p219)，通过考察NADH的减少速度来测定。

为了增大GMP合成酶的活性，优选提高编码该酶的guaA基因的表达量。作为提高表达量的方法，可以列举出提高编码GMP合成酶的DNA在细菌细胞内的拷贝数的方法。为了提高细胞内的拷贝数，只要将编码GMP合成酶的DNA片段与能够在埃希氏菌属细菌等微生物中发挥功能的载体连接来制作重组DNA、并将其导入宿主中来进行转化即可。转化株细胞内的编码GMP合成酶的基因(guaA基因)的拷贝数提高的结果是GMP合成酶的活性增大。

细胞内拷贝数的提高可以通过使GMP合成酶基因在上述宿主的染色体DNA上以多拷贝存在来实现。为了在属于埃希氏菌属的细菌的染色体DNA上以多拷贝导入GMP合成酶基因，可以利用染色体上多拷贝存在的序列作为靶标通过同源重组来进行。作为染色体DNA上多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA或存在于转移因子端部的反向重复序列等。或者，也可以如特开平2-109985号公报所公开的那样，将目的基因搭载在转座子上并使之转移来多拷贝导入到染色体DNA上。采用任何方法提高转化株内的GMP合成酶基因拷贝数的结果均是GMP合成酶的活性增大。

作为用于导入上述基因的载体，可以列举出pSTV29、pMW218、pUC19等质粒载体，λ1059、λBF101、M13mp9等噬菌体载体。此外，作为转座子，可以列举出Mu、Tn10、Tn5。

在编码GMP合成酶的DNA方面，其碱基序列是公知的，因而可以基于该序列来合成引物，通过以埃希氏菌属细菌等微生物的染色体DNA作为模板采用PCR法进行扩增来获取。例如，作为大肠杆菌的guaA基因，可以列举出具有SEQ ID NO：1的碱基序列的基因。该基因也可以通过基于该碱基序列制备探针、从埃希氏菌属细菌的染色体DNA文库中通过杂交选择目的DNA片段来获得。或者，编码GMP合成酶的DNA片段可以基于已知的碱基序列来化学合成。而且，大肠杆菌的guaA基因可以使用SEQ ID NO：9和10的引物来进行克隆。

此外，从埃希氏菌属细菌以外的微生物也可以基于上述碱基序列获取编码具有与GMP合成酶等同的功能的蛋白质的基因。

作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的GMP合成酶基因(guaA)，可以列举出具有SEQ ID NO：3的碱基序列的基因。该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。作为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的GMP合成酶基因(guaA)，可以列举出具有SEQ ID NO：5的碱基序列的基因。该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

作为产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)的GMP合成酶基因(guaA)，可以列举出具有SEQ ID NO：7的碱基序列的基因。该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

如上述，因微生物所属的属、种或菌株不同，guaA基因的碱基序列中有时会存在差异，因此guaA基因可以是上述基因的变体。

guaA基因编码的蛋白质只要具有GMP合成酶活性即可，可以是相对于SEQ ID NO：2、4、6或8的整个氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％、特别优选98％以上的同一性的蛋白质。氨基酸序列和碱基序列的同一性可以使用例如Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或Pearson的FASTA(MethodsEnzymol.，183，63(1990))来确定。基于该算法BLAST，已经开发出称为BLASTN或BLASTX的程序(参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

此外，本发明中使用的guaA基因并非仅限于野生型基因，在不损害所编码的蛋白质的功能即GMP合成酶活性的前提下，也可以是突变体或人工修饰体，所述突变体或人工修饰体编码具有在SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列中包含在1个或者多个位置上的1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列的蛋白质。这里，所谓“数个”，虽然因氨基酸残基的种类或其在蛋白质立体结构中的位置而异，但具体地是指2～20个、更优选2～10个、更优选2～5个。上述取代优选为保守取代。作为保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gln、Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。作为保守取代，具体地可以列举出：从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到Gln、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp到Asn、Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带guaA基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。

此外，guaA基因也可以是下述DNA，所述DNA与SEQ ID NO：1、3、5或7的碱基序列的互补碱基序列或能够由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有GMP合成酶活性的蛋白质。这里，“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。将该条件明确地数值化是困难的，举一实例，有这样的条件：在该条件下，具有高同一性的DNA，例如具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，特别优选具有98％以上同一性的DNA之间相互杂交，而同一性较之为低的DNA之间则不互相杂交；或者是这样的条件：在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃，1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃，0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度和温度下，洗涤一次，更优选两次至三次的条件。

上述的关于基因的变体的描述对于后述的nagD基因、ushA基因、aphA基因以及其它基因也同样适用。

将DNA导入微生物可以通过C.T.chung的方法(C.T.chung et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2172-2175(1989))、D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology，68，326(1979))、或者用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))等来进行。

提高GMP合成酶基因的表达量，除了利用上述的基因扩增以外，还可以通过将染色体DNA上或质粒上的GMP合成酶基因的启动子等表达调节序列更换成强力的启动子等表达调节序列来实现。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子等是已知的强力启动子。此外，如国际公开W000/18935所披露的，也可以在基因的启动子区域导入数个碱基的碱基取代，将其修饰得更为强力。通过所述启动子取代或修饰，GMP合成酶基因的表达得到强化，蛋白质的活性增大。

guaA基因的表达量的增大可以采用Northern法、RT-PCR法等来检测。

对在诸如上述的微生物中进行修饰而使得nagD基因无法正常发挥功能的方法进行说明。

在本发明中，“进行修饰而使得nagD基因无法正常发挥功能”是指：nagD基因所编码的蛋白质的活性降低或消失，或者所述基因的转录降低或消失，或者所述基因的翻译效率降低。

已知大肠杆菌(E.coli)的nagD基因存在于参与N-乙酰葡糖胺的同化的nagBACD操纵子内，且该nagBACD操纵子基因的表达可以通过在培养基中添加N-乙酰葡糖胺(一种构成细菌细胞壁的主成分的糖)来诱导(Plumbridge JA.，Mol.Micobiol.(1989)3.505-515)。E.coli的nagD所编码的NagD蛋白质从保守结构上的特征来看可知其属于卤酸脱卤酶(HAD)家族，有报告称其在试管内实验中具有针对GMP和5’-尿苷酸(尿苷-5’-一磷酸，以下也称“UMP”)的核苷酸酶活性(Tremblay LW.，Biochemistry，(2006)45.1183-1193)。但是，E.coli的基因组上存在23种HAD家族蛋白质，它们的底物特异性范围非常广泛(Kuznetsova et al.，J.Biol.Chem.，(2006)281.，36149-36161)，因此并不清楚NagD蛋白质在细胞内的生理作用。

进行修饰而使得nagD基因无法正常发挥功能，可以采用诸如以下的方法来实现。例如，可以通过采用利用基因重组法的同源重组法(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory press(1972)；Matsuyama，S.and Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))将染色体上的nagD基因替换成无法正常发挥功能的nagD基因(以下也称为“破坏型nagD基因”)来进行。在同源重组方面，如果将携带与染色体上的序列具有同源性的序列的质粒等导入菌体内，则以某种频率在具有同源性的序列的位置上引发重组，导入的质粒整体整合到染色体上。然后，如果再于染色体上的具有同源性的序列的位置引发重组，则质粒会再次脱落，此时有些情况下，通过引发重组的位置，被破坏的基因在染色体上固定下来，而原来的正常基因与质粒一起从染色体上脱落。通过选择这样的菌株，可以获得染色体上的正常nagD基因被破坏型nagD基因取代的菌株。

这样的利用同源重组的基因取代包括：组合使用称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645)与λ噬菌体来源的切出系统(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3.)的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645，美国专利第6303383号，或特开平05-007491号公报)。

此外，基于诸如上述的利用了同源重组的基因取代的定点突变导入，也可以使用在宿主中不具有复制能力的质粒来进行。此外，通过使用下述质粒也可以进行nagD基因的破坏，所述质粒包含内部插入有药物抗性等标记基因的nagD基因，且不能在目的微生物内复制。即，用所述质粒转化后获得了药物抗性的转化体在染色体DNA中导入了标记基因。该标记基因有很高的可能性是通过其两端的nagD基因序列与染色体上的所述基因之间的同源重组而导入的，因此能够有效地选择基因破坏株。

用于基因破坏的破坏型nagD基因具体地可以这样获取：利用限制酶消化和再连接使nagD基因的一定区域缺失，或者在所述基因中插入其它DNA片段(标记基因等)，或者利用定点突变法(Kramer，W.and Frits，H.J.，Methods in Enzymology，154，350(1987))或利用次氯酸钠、羟胺等化学药物进行处理(Shortle，D.and Nathans，D.，Proc.，Natl.，Acad.，Sci.，U.S.A.，75，270(1978))，来在nagD基因的编码区域或启动子区域等的碱基序列中引发1个或多个碱基取代、缺失、插入、添加或倒位，从而使所编码的NagD蛋白质的活性降低或消失，或者使nagD基因的转录降低或消失。

nagD基因的序列本身是公知的，基于这些序列，能够容易地通过PCR法或杂交法等获得nagD基因。例如，作为大肠杆菌的nagD基因，可以列举出编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列的基因。nagD基因例如可以从大肠杆菌的染色体DNA通过使用SEQ ID NO：13和14所示的引物进行PCR来获得。

其它微生物的nagD基因也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的nagD基因之间的序列同源性来获取，并用于微生物的修饰。

nagD基因只要与进行修饰的微生物的染色体上的nagD基因之间具有能够引发同源重组程度的同一性即可，例如编码与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、特别优选95％以上的同一性的氨基酸序列即可。

目的基因被破坏的事实可以通过采用Southern印迹、PCR法对染色体上的基因进行解析来确认。

此外，对微生物进行紫外线照射或者使用N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等常规突变处理中使用的突变剂进行处理，也可以获得不产生有活性的NagD蛋白质的突变株。

本发明的方法所使用的细菌中，优选还经过修饰而使得ushA基因和/或aphA基因无法正常发挥功能。所述基因的突变株或基因重组株可以通过进行修饰而使得所述基因编码的5’-核苷酸酶的活性降低或消失，或者使得所述基因的转录降低或消失来进行。这样的突变株或基因重组株可以采用与前述的nagD基因无法正常发挥功能的突变株或基因重组株相同的方法来获得。

ushA基因的序列自身是公知的，可以容易地基于这些序列采用PCR法或杂交法等获得ushA基因。例如，作为大肠杆菌的ushA基因，可以列举出编码SEQ ID NO：16的氨基酸序列的基因。其它微生物的ushA基因也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的ushA基因之间的序列同源性来获取，并用于修饰。

而且，ushA基因只要与进行修饰的微生物的染色体上的ushA基因之间具有能够引发同源重组程度的同一性即可，例如编码与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、特别优选95％以上的同一性的氨基酸序列即可。

aphA基因的序列自身是公知的，可以容易地基于这些序列采用PCR法或杂交法等获得aphA基因。例如，作为大肠杆菌的aphA基因，可以列举出编码SEQ ID NO：18的氨基酸序列的基因。其它微生物的aphA基因也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的aphA基因之间的序列同源性来获取，并用于修饰。

aphA基因只要与进行修饰的微生物的染色体上的aphA基因之间具有能够引发同源重组程度的同一性即可，例如编码与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、特别优选95％以上的同一性的氨基酸序列即可。

本发明提供经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能、而且还经过修饰而增加了guaA基因的表达从而增大了鸟苷酸合成酶的活性的、具有将黄苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物(但是，除了经过了上述修饰以外，还经过修饰从而通过增加guaB基因的表达增大了肌苷酸脱氢酶活性的微生物除外)，作为新的微生物。在该微生物中，优选还经过修饰从而使得选自ushA基因、aphA基因中的1种或1种以上的基因无法正常发挥功能。

<II>GMP的生产方法

使XMP与上述的经过修饰从而使得nagD基因无法正常发挥功能、且经过修饰而增大了GMP合成酶活性的微生物反应，将XMP转化为GMP，从而能够得到GMP。

作为进行该微生物的培养时的碳源，只要是上述微生物能够同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、废糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物，乙醇、甘油、山梨糖醇等醇类，丙酮酸、乳酸、醋酸等有机酸，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作为氮源，可以使用氨气、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、碳酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机以及有机铵盐，尿素、各种氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化物等。作为无机物，可以使用磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、硫酸镁、磷酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、碳酸钙等。当所使用的微生物的生长繁育需要氨基酸、核酸、维生素等特定营养物质时，可以在培养基中适量添加所述物质。

培养可以在pH5.0～8.5、15℃～45℃的适宜范围内在需氧条件下进行5小时～72小时左右。而且，pH调整可以使用无机或有机的酸性或者碱性物质，还可以使用氨气等。

直接将该微生物的培养液接种于含XMP的反应液中，或者离心后仅将菌体接种于含XMP的反应液中，或者将菌体悬浮于适当的溶液中再接种于含XMP的反应液中，可以进行从XMP到GMP的转化。作为基质的XMP的浓度只要是能够获得充分量的GMP的浓度即可，对其没有特殊限制，但优选1～200mM的范围。

而且，在本发明的GMP的生产方法中，还可以使用上述微生物的菌体处理物。作为菌体的处理物，可以列举出例如将菌体用丙烯酰胺、角叉藻聚糖等固定化而得到的固定化菌体等。

作为反应液的碳源，只要是上述微生物能够同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、废糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物，乙醇、甘油、山梨糖醇等醇类，丙酮酸、乳酸、醋酸等有机酸，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作为氮源，可以使用氨气、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、碳酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机以及有机铵盐，尿素、各种氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化物等。作为无机物，可以使用磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、硫酸镁、磷酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、碳酸钙等。当所使用的微生物的生长繁育需要氨基酸、核酸、维生素等特定营养物质时，可以在培养基中适量添加所述物质。

而且，反应液中优选加入有机溶剂来激活核苷酸的细胞透过性。

作为核苷酸的膜透过性激活剂的有机溶剂优选利用二甲苯、甲苯、苯、脂肪酸醇、乙酸乙酯等，并通常优选以0.1～30ml/L的浓度使用。

反应可以在pH5.0～8.5、15℃～45℃的适宜范围以需氧条件或厌氧条件进行1小时～7天左右。而且，pH调整可以使用无机或有机的酸性或碱性物质，还可以使用氨气等。

而且，原料XMP可以使用化学合成品、市售品和通过发酵法生产的XMP等。

从反应液收集GMP，通常通过组合离子交换树脂法、沉淀法、其它公知方法来实施。

[实施例]以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。

实施例1

<1-1>JM109株来源nagD基因破坏株的构建

以作为常规DNA克隆用宿主使用的大肠杆菌JM109株作为亲本株，首先进行了NagD蛋白质非产生株的构建。NagD蛋白质由nagD基因(GenBank登录号X14135SEQ ID NO：11)编码。

nagD基因的缺失通过Datsenko和Wanner最先开发的称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645)以及λ噬菌体来源的切出系统(J.Bacteriol.2002Sep；184(18)：5200-3.Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex.Cho EH，Gumport RI，GardnerJF.)来进行。根据“Red驱动整合”方法，使用将目的基因的一部分设计在合成寡核苷酸的5′侧、将抗生素抗性基因的一部分设计在3′侧而得到的合成寡核苷酸作为引物来获得PCR产物，使用该PCR产物能够一步式地构建基因破坏株。而且，通过组合使用λ噬菌体来源的切出系统，能够将整合入基因破坏株的抗生素抗性基因除去。

作为PCR的模板，使用了质粒pMW118-attL-Cm-attR。pMW118-attL-Cm-attR(WO2006078039)是在pMW118(宝生物公司制造)中插入作为λ噬菌体附着位点的attL和attR基因、以及作为抗生素抗性基因的cat基因而得到的质粒，其中按attL-cat-attR的顺序插入。

使用SEQ ID NO：19和20所示的合成寡核苷酸引物进行了PCR，其中，引物的3′末端具有与attL和attR的两端对应的序列，引物的5′末端具有与作为目的基因的nagD基因的一部分对应的序列。

将扩增得到的PCR产物用琼脂糖凝胶进行纯化，通过电穿孔将其导入包含具有温度敏感型的复制能力的质粒pKD46的大肠杆菌JM109株中。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645)包含λ噬菌体的总计2154个碱基的DNA片段(GenBank/EMBL登录号J02459、第31088位～33241位)，该DNA片段中包含受阿拉伯糖诱导型P_araB启动子调控的编码λRed同源重组系统的Red重组酶的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于将PCR产物整合到JM109株的染色体上是必要的。

电穿孔用感受态细胞如下述地制备。即，将在含100mg/L氨苄西林的LB培养基中30℃培养过夜的大肠杆菌JM109株用含氨苄西林(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL的SOB培养基(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Sambrook，J等，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年))稀释100倍。使所得稀释物于30℃通气条件下生长繁育至OD600约0.6后，浓缩100倍，再用10％甘油洗涤3次，从而使得其能够在电穿孔中使用。电穿孔使用70μL的感受态细胞和约100ng的PCR产物来进行。在电穿孔后的杯子中加入1mL的SOC培养基(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Sambrook，J.等，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年))，37℃培养2.5小时后，于37℃在包含Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养，选择出Cm抗性重组体。然后，为了除去pKD46质粒，在含Cm的L-琼脂培养基上于42℃传代2次，测试所得菌落的氨苄西林抗性，获得了pKD46脱落的氨苄西林敏感型株。

采用PCR确认了通过氯霉素抗性基因甄别出的突变体的nagD基因的缺失。将所得nagD缺损株命名为JM109ΔnagD::att-cat株。

然后，为了除去导入nagD基因内的att-cat基因，使用了辅助质粒即上述的pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts携带编码λ噬菌体的整合酶(Int)的基因、编码切除酶(Xis)的基因，是具有温度敏感型的复制能力的质粒。通过导入pMW-intxis-ts，识别染色体上的attL或attR并引发重组，从而将attL与attR之间的基因切出，染色体上形成仅残留attL或attR序列的结构。

按照常规方法制作了上述所得的JM109ΔnagD::att-cat株的感受态细胞，用辅助质粒pMW-intxis-ts进行转化，于30℃在含50mg/L氨苄西林的L-琼脂培养基上进行平板培养，选择出氨苄西林抗性株。

然后，为了除去pMW-intxis-ts质粒，在L-琼脂培养基上于42℃传代2次，测试所得菌落的氨苄西林抗性以及氯霉素抗性，获得了att-cat和pMW-intxis-ts脱落的nagD破坏株即氯霉素、氨苄西林敏感型株。将该株命名为JM109ΔnagD。

<1-2>GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA的构建以及将该质粒导入JM109株和JM109ΔnagD株

如下地进行了GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA的构建。对于guaA基因，使用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物进行PCR，扩增了大肠杆菌的guaA基因。纯化扩增片段后，将两端形成的限制酶位点用EcoRI和PstI切割。将切割片段与同样用EcoRI和PstI切割的pKK223-3(GenBank登录号M77749)相连接，选择出在紧随tac启动子之后的位置引入guaA基因而得到的质粒pKK223-guaA。将所得质粒用BamHI和HindIII切割，使得切割片段包含tac启动子。将切割片段与同样用BamHI和HindIII切割的pSTV29相连接，选择出在紧随tac启动子之后的位置引入guaA基因而得到的质粒pSTV29-Ptac-guaA。将其导入JM109株和所述JM109ΔnagD株，分别得到了JM109/pSTV29-Ptac-guaA株和JM 109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株。

<1-3>利用JM109/pSTV29-Ptac-guaA株和JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株菌体进行从XMP到GMP的转化反应

对于上述菌株，实施了从XMP到GMP的转化反应评价。用于进行从XMP到GMP的转化反应评价的菌体制备方法、反应方法、反应溶液组成、分析方法如下所示。

[菌体的制备方法]

在LB培养基平板上均匀涂布JM109/pSTV29-Ptac-guaA株和JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株，37℃培养过夜。第二天，将1/32平板量的菌体接菌在装有LB培养基120ml的500ml容量坂口烧瓶中，37℃培养过夜。将LB 600ml量的培养液经离心后而得的菌体用于60ml的反应溶液。

[反应方法]

用药匙刮取前述的LB 600ml量的培养后菌体，将其接种于后述的反应液60ml中，开始反应。反应于42℃在添加氨水维持pH为7.2的条件下实施。

[反应溶液组成]

25mM XMP

50g/L 葡萄糖

9.2g/L 六偏磷酸钠

5g/L MgSO₄·7H₂O

10g/L KH₂PO₄

3ml/L 二甲苯

[分析方法]

随时间取样反应液500μl，用KOH稀释来终止反应。将反应终止液用滤器过滤，将其中的10μl用于HPLC分析。分析条件如下。

柱：Asahipak GS-220HQ(直径7.6mm，30cm)

洗脱液：0.2M NaH₂PO₄(pH 3.98)

温度：55℃

流速：0.6ml/分

检测：紫外线(254nm)吸收

结果如图1所示。应该认为使用JM109/pSTV29-Ptac-guaA株会生成GMP，但实际上分解活性高，完全没有GMP蓄积(GMP＜0.06g/L)。另一方面，显示使用JM109ΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株进行2小时反应，反应液中蓄积了最大约1.7g/L的GMP。

实施例2

<2-1>JM109株和JM109ΔnagD株来源的ushA基因破坏株的构建

以JM109株和实施例1<1-1>中所得的JM109ΔnagD株作为亲本株，进行了UshA非产生株的构建。UshA由ushA基因(GenBank登录号X03895SEQ ID NO：14)编码。按照前述的nagD基因破坏方法，使用SEQ ID NO：21、22的引物作为ushA破坏用引物进行了ushA基因破坏。由此，得到了JM109ΔushA和JM109ΔushAΔnagD。

<2-2>将GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA导入JM109ΔushA株和JM 109ΔushAΔnagD株

将实施例1所述的GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA导入所述JM109ΔushA株和JM109ΔushAΔnagD株，分别得到了JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA株和JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株。

<2-3>利用JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA株和JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株菌体进行从XMP到GMP的转化反应

对于上述菌株，实施了从XMP到GMP的转化反应评价。评价按与实施例1<1-3>相同的方式进行。

结果如图2所示。显示：使用JM109ΔushA/pSTV29-Ptac-guaA株在反应的第2小时反应液中蓄积了最大约9.7g/L的GMP；使用JM109ΔushAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株在反应的第2小时反应液中蓄积了了最大约10.3g/L的GMP。

实施例3

<3-1>JM109ΔushA株和JM109ΔushAΔnagD株来源的aphA基因破坏株的构建

以JM109ΔushA株和实施例2<2-1>中所得的JM109ΔushAΔnagD株作为亲本株，进行了AphA非产生株的构建。AphA由aphA基因(GenBank登录号X86971SEQ ID NO：17)编码。按照前述的nagD基因破坏方法，使用SEQ ID NO：23、24的引物作为aphA破坏用引物，进行了aphA基因破坏。由此，得到了JM109ΔushAΔaphA和JM109ΔushAΔaphAΔnagD。

<3-2>将GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA导入JM109ΔushAΔaphA株和JM109ΔushAΔaphAΔnagD株

将实施例1所述的GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA导入所述JM109ΔushAΔaphA株和JM109ΔushAΔaphAΔnagD株，分别得到了JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA株和JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株。

<3-3>利用JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA株和JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株菌体进行从XMP到GMP的转化反应

对于上述菌株，实施了从XMP到GMP的转化反应评价。评价按与实施例1<1-3>相同的方式进行。但，反应液中的XMP浓度为50mM。

结果如图3所示。显示：使用JM109ΔushAΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA株在反应的第5小时反应液中蓄积了最大约23.3g/L的GMP；使用JM109ΔushAΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株在反应的第4小时反应液中蓄积了最大约26.9g/L的GMP。

实施例4

<4-1>JM109株和JM109ΔnagD株来源的aphA基因破坏株的构建

以JM109株和实施例1<1-1>所得的JM109ΔnagD株作为亲本株，进行了AphA非产生株的构建。使用SEQ ID NO：23、24的引物作为aphA破坏用引物，像实施例3那样地进行了aphA基因破坏。由此，得到了JM109ΔaphA和JM 109ΔaphAΔnagD。

<4-2>将GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA导入JM109ΔaphA株和JM109ΔaphAΔnagD株

将实施例1所述的GMP合成酶表达强化质粒pSTV29-Ptac-guaA导入所述JM109ΔaphA株和JM109ΔaphAΔnagD株，分别得到了JM109ΔaphA/pSTV29-Ptac-guaA株和JM 109ΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA株。

通过像实施例1～3那样，对这些菌株进行从XMP到GMP的转化反应评价，能够确认NagD非生产性株中GMP蓄积量的增加。

工业实用性

根据本发明，能够高效率地生产作为调味料、医药及其原料而有用的GMP。

〔序列表说明〕

SEQ ID NO：1大肠杆菌GMP合成酶(GMPS)基因(guaA)碱基序列

SEQ ID NO：2大肠杆菌GMPS氨基酸序列

SEQ ID NO：3枯草芽孢杆菌GMPS基因(guaA)碱基序列

SEQ ID NO：4枯草芽孢杆菌GMPS氨基酸序列

SEQ ID NO：5谷氨酸棒杆菌GMPS基因(guaA)碱基序列

SEQ ID NO：6谷氨酸棒杆菌GMPS氨基酸序列

SEQ ID NO：7产氨棒杆菌GMPS基因(guaA)碱基序列

SEQ ID NO：8产氨棒杆菌GMPS氨基酸序列

SEQ ID NO：9大肠杆菌guaA基因克隆用引物序列

SEQ ID NO：10大肠杆菌guaA基因克隆用引物序列

SEQ ID NO：11大肠杆菌nagD基因碱基序列

SEQ ID NO：12大肠杆菌NagD氨基酸序列

SEQ ID NO：13大肠杆菌nagD基因克隆用引物序列

SEQ ID NO：14大肠杆菌nagD基因克隆用引物序列

SEQ ID NO：15大肠杆菌ushA基因碱基序列

SEQ ID NO：16大肠杆菌UshA氨基酸序列

SEQ ID NO：17大肠杆菌aphA基因碱基序列

SEQ ID NO：18大肠杆菌AphA氨基酸序列

SEQ ID NO：19：大肠杆菌nagD基因破坏用引物序列

SEQ ID NO：20：大肠杆菌nagD基因破坏用引物序列

SEQ ID NO：21：大肠杆菌ushA基因破坏用引物序列

SEQ ID NO：22：大肠杆菌ushA基因破坏用引物序列

SEQ ID NO：23：大肠杆菌aphA基因破坏用引物序列

SEQ ID NO：24：大肠杆菌aphA基因破坏用引物序列

Claims

1.一种生产5’-鸟苷酸的方法，该方法中使黄苷酸作用于下述微生物来生成5’-鸟苷酸，并收集5’-鸟苷酸，所述微生物具有将黄苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力，且经过修饰从而使得nagD基因不能正常地发挥功能，而且还经过修饰从而增大了5’-鸟苷酸合成酶的活性。

2.根据权利要求1所述的生产5’-鸟苷酸的方法，其中，所述微生物经过修饰而增加了guaA基因的表达，从而增大了5’-鸟苷酸合成酶的活性。

3.根据权利要求2所述的生产5’-鸟苷酸的方法，其中，所述guaA基因编码下述(A)或(B)的蛋白质：

(A)具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有在SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有5’-鸟苷酸合成酶活性的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的生产5’-鸟苷酸的方法，其中，

所述微生物还经过修饰从而使得选自ushA基因和aphA基因中的1种以上的基因不能正常发挥功能。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的生产5’-鸟苷酸的方法，其中，

所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、芽孢杆菌属细菌或棒状杆菌型细菌。

6.权利要求5所述的生产5’-鸟苷酸的方法，其中，

所述微生物是埃希氏菌属细菌。

7.根据权利要求6所述的生产5’-鸟苷酸的方法，其中，

所述微生物是大肠杆菌。

8.一种微生物，所述微生物具有将黄苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力，且经过修饰而增加了guaA基因的表达，从而增大了5’-鸟苷酸合成酶的活性，而且还经过修饰从而使得nagD基因不能正常发挥功能；但上述微生物中不包括除了经过上述修饰以外，还经过修饰而增加了guaB基因的表达，从而增大了肌苷酸脱氢酶活性的微生物。

9.根据权利要求8所述的微生物，所述微生物还经过修饰从而使得选自ushA基因和aphA基因中的1种以上的基因不能正常发挥功能。

10.根据权利要求8或9所述的微生物，其中，该微生物是属于肠杆菌科的细菌、芽孢杆菌属细菌或棒状杆菌型细菌。

11.根据权利要求10所述的微生物，其中，该微生物是埃希氏菌属细菌。

12.根据权利要求11所述的微生物，其中，该微生物是大肠杆菌。