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CN101981199A - 通过两种微生物的顺序作用将植物材料转化为燃料和化学产品的方法 - Google Patents

通过两种微生物的顺序作用将植物材料转化为燃料和化学产品的方法 Download PDF

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CN101981199A CN2009801107450A CN200980110745A CN101981199A CN 101981199 A CN101981199 A CN 101981199A CN 2009801107450 A CN2009801107450 A CN 2009801107450A CN 200980110745 A CN200980110745 A CN 200980110745A CN 101981199 A CN101981199 A CN 101981199A
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aerobic
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J·基尔贝恩
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Abstract

本发明公开了将复杂的植物多糖(包括纤维素材料)转化为燃料和其他化学产品的方法。在优选的实施方式中，该方法包括通过两种或多种微生物顺序水解植物多糖。

Description

通过两种微生物的顺序作用将植物材料转化为燃料和化学产品的方法
交叉引用
本申请要求2008年2月27日提交的美国临时申请61/032,048的优先权，本文引入该申请作为参考。
发明背景
人们对于开发由可再生和可持续的生物质资源产生可用能量的方法存在着兴趣。碳水化合物形式的能量可以在废弃生物质中和在专门的能量作物，如谷物(如玉米或小麦)或草类(如柳枝稷(switchgrass))中找到。纤维素(cellulosic)材料和木质纤维材料在许多应用中大量地生产、加工并使用。
目前的挑战是开发将碳水化合物转化成为可用能量形式的可行和经济的策略。由碳水化合物获得有用的能量的策略包括乙醇(“纤维素乙醇”)和其他醇类(如丁醇)的生产、碳水化合物转化成氢和碳水化合物通过燃料电池直接转化为电能。例如，DiPardo，Journal of Outlookfor Biomass Ethanol Production and Demand(EIA Forecasts)，2002；Sheehan，Biotechnology Progress，15：8179，1999；Martin，EnzymeMicrobes Technology，31：274，2002；Greer，BioCycle，61-65，April 2005；Lynd，Microbiology and Molecular Biology Reviews，66：3，506-577，2002；及Lynd等人，″Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass：AnUpdate，″Current Opinion in Biotechnology，16：577-583，2005中描述了生物质乙醇的策略。
虽然由谷物和糖生产乙醇是公知的，但这种方法涉及将有价值的粮食作物转用于能量生产。因此，将更经济和更丰富的植物材料(如木质纤维材料)转化为乙醇是可取的。令人遗憾的是，尽管非常需要将包含木质纤维素材料(纤维素、半纤维素和木质素)的源自植物的聚合物高效和完全地生物转化为燃料和/或化学产品，但现在仍面临挑战，因为只有木质纤维材料的纤维素和半纤维素可以通过目前已知的生物催化剂转化为燃料(如乙醇)。此外，材料的紧凑/致密的结构加上木质纤维素材料的木质素成分的难消化性(indigestibility)限制了木质纤维素材料中纤维素和半纤维素的实质部分(substantial portion)的生物利用度。并非所有的生物体可以利用这些复杂的化合物和结构。通常情况下，可以产生想要的终产物(包括可以用作燃料或其他功能化合物的化合物，优选简单糖类或其他特殊碳基质)的生物体。
目前用于生物转化木质纤维素物质为燃料和/或化学产品的方法可以包括通过机械、热化学和生物化学过程对材料进行大量而昂贵的预处理。一般地，这种预处理过程的目标包括：(1)使得纤维素和半纤维素聚合物更易于为微生物利用，和(2)转化复杂的纤维素和半纤维素的多糖成为更简单、可发酵的糖类或其他简单化合物，其更容易通过微生物转化为燃料和其他化学产品。经常用于木质纤维素材料的预处理中的机械、热化学和生化过程构成了主要成本且不是完全有效的。此外，目前用于由木质纤维材料产生燃料和其他化学产品的微生物缺乏用于裂解复杂植物多糖成为糖类(糖化作用)和然后以有效的方式将得到的各种糖类转化成燃料及其他化工产品的必要的细胞机构(cellular machinery)。因此，为了糖化复杂的多糖和更有效地转化更广泛的可发酵糖成为燃料和其他化学产品，现在仍然需要利用更多能的微生物和/或微生物组合的优势的生物转化方法。
发明概述
本发明提供了转化复杂的植物多糖(包括纤维素材料)成为燃料和其他化学产品的方法。在优选的实施方式中，该方法包括通过一种生物体(其然后被另一种生物体用作生产希望的化合物的底物)转化植物多糖成为较短链的多糖或其他化合物。在其他优选的实施方式中，该方法包括顺序的纤维素水解性(cellulolytic)需氧微生物对植物多糖的水解和厌氧微生物对水解产物的发酵。
在第一方面，公开了一种用于产生生物燃料(如乙醇)和其他化学产品的方法。该方法包括：(1)在厌氧条件下提供生物质材料，其中，生物质没有用外部提供的化学品或酶进行处理；(2)用非遗传修饰厌氧细菌的第一培养物处理生物质，其中，非遗传修饰的厌氧细菌转化生物质的至少一部分成为单糖和二糖；和(3)用作为非专性需氧菌(obligate aerobe)的微生物的第二培养物处理生物质，其中，单糖和二糖转化为生物燃料。在某些实施方式中，该方法在封闭的容器中进行。非遗传修饰的厌氧细菌的第一培养物可以是Clostridiumphytofermentans。
在第二个方面，公开了一种根据本发明的优选实施方式的制造乙醇和其他化学产品的方法。该方法包括：(1)提供包含植物多糖的预处理的源自生物质的材料；(2)在氧的存在下，用包含纤维素水解性需氧微生物的第一培养物接种预处理的源自生物质的材料，以产生需氧培养液(aerobic broth)，其中，需氧微生物能够至少部分地水解植物多糖；(3)孵育需氧培养液，直到纤维素水解性需氧微生物消耗氧的至少一部分和水解植物多糖的至少一部分，从而将需氧培养液转化成为包含具有可发酵糖的水解产物的厌氧培养液；(4)用包含能够转化可发酵糖成为乙醇的厌氧微生物的第二培养物接种厌氧培养液；和(5)发酵接种的厌氧培养液，直到可发酵糖的一部分被转化成乙醇。
在第三个方面，公开了生产纯化的生物燃料(如乙醇)和其他化学产品的三阶段方法。该方法包括：(1)第一阶段，其中，在厌氧条件下用非遗传修饰的厌氧细菌的第一培养物处理生物质材料，其中非遗传修饰的厌氧细菌无需外源提供的化学品或酶将生物质基本上转化成为单糖和二糖；(2)第二阶段，其中，单糖和二糖用第二微生物的培养物处理，其中，单糖和二糖转化为生物燃料；和(3)第三阶段，其中，从残留的生物质和培养物分离和回收产生的生物燃料。在某些实施方式中，该方法在封闭的容器中进行。非遗传修饰的厌氧细菌的第一培养物可以是Clostridium phytofermentans。
在上述方法的某些实施方式中，从发酵的厌氧培养液回收至少一部分乙醇。
在其他的实施方式中，该方法进一步包括溶解(lyse)发酵的厌氧培养液中的需氧和厌氧微生物以产生包含剩余的可发酵糖和细胞内容物的溶解产物(lysate)的步骤。在一种变型中，溶解产物可以进行另外的物理和/或化学处理。在另一个变型中，可以用另一种能够加快剩余的可发酵糖转化为乙醇和其他化学产品的厌氧微生物接种溶解产物。
在另一方面，公开了一种根据本发明的优选实施方式的制造乙醇和其他化学产品的方法。该方法包括：(1)提供包含植物多糖的预处理的源自生物质的材料；(2)在厌氧条件下，用包含Clostridiumphytofermentans细胞的第一培养物接种源自生物质的材料以水解植物多糖的至少一部分，其中，培养物的细胞吸收水解的植物多糖的至少一部分作为细胞内化合物；(3)溶解Clostridium phytofermentans细胞以产生溶解的培养液；(4)用包含能够转化可发酵糖成为乙醇和其他化学产品的厌氧微生物的第二培养物接种溶解的培养液；和(5)发酵接种的厌氧培养液，直到可发酵糖的至少一部分被转化成乙醇和/或其他化学产品。
在另一方面，公开了一种生产生物燃料(如乙醇)和其他化学产品的方法。该方法包括在中温条件(mesophilic condition)下，在Clostridium phytofermentans和选自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyliticum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和食纤维梭菌(Clostridium cellovorans)的第二种梭菌属细菌的共培养的存在下，使包括含纤维素和半纤维素的植物材料的生物质进行发酵，所述培养的比例为使得纤维素：乙醇和半纤维素：乙醇的转化率大于通过使用单独Clostridium phytofermentans或第二种梭菌属细菌获得的转化率的量。
在另一方面，公开了一种生产生物燃料(如乙醇)和其他化学产品的方法。该方法包括在中温条件下，在Clostridium phytofermentans和运动发酵单胞菌(Zymonomas mobilis)的共培养存在下，使包括含纤维素和半纤维素的植物材料的生物质进行发酵，所述培养的比例为使得纤维素：乙醇和半纤维素：乙醇的转化率大于通过使用单独的Clostridium phytofermentans或运动发酵单胞菌获得的转化率的量。
在另一方面，公开了一种同时糖化和发酵来自生物质的纤维素固体物质成为生物燃料(如乙醇)和其他化学产品的方法。该方法包括在一定条件下，用Clostridium phytofermentans细菌处理封闭的容器中的生物质，其中，Clostridium phytofermentans细菌产生足以基本上转化生物质为单糖和二糖的糖分解(saccharolytic)酶，和引入第二微生物的培养物，其中，第二微生物能够基本上转化单糖和二糖为生物燃料。
在另一方面，公开了一种由含木质素的生物质生产生物燃料的方法。该方法包括：(1)将含木质素的生物质与具有足以水解含木质素的生物质的至少一部分的浓度的碱性水溶液接触；(2)中和处理的生物质至7-8的pH；(3)在一定条件下，用Clostridium phytofermentans细菌处理封闭的容器中的生物质，其中，Clostridium phytofermentans细菌产生足以基本上转化处理过的生物质为单糖和二糖的糖分解酶；和(4)引入第二微生物的培养物，其中，第二微生物能够基本上转化单糖和二糖为生物燃料。
在另一方面，公开了一种由生物质生产生物燃料和营养发酵残留物的方法。该方法包括：(1)用包含Clostridium phytofermentans的培养物处理生物质，该包含Clostridium phytofermentans的培养物在发酵反应中产生醇和包含选自氨基酸、辅因子(cofactor)、激素、蛋白质、维生素和脂类的营养物的发酵残留物；(2)在适于产生生物燃料的条件下和适于产生营养物的条件下发酵培养物；(3)从培养分离生物燃料；和(4)回收包含营养物的发酵残留物。
在另一方面，公开了一种由纤维素基质生产乙醇的方法。该方法包括：(1)在反应容器中提供包含施予了厌氧糖分解酶的纤维素基质、Clostridium phytofermentans细菌和任选的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)细菌的浆料形式的反应混合物；(2)搅拌反应混合物持续第一选定的时间段，其中，反应混合物在足以引发并保持发酵反应的条件下反应；(3)停止反应混合物的搅拌足够的时间以允许反应混合物的不溶性基质在第二选定的时间段中沉淀，从而形成基本上不含悬浮固体的含乙醇流出层和残留固体层；(4)在第二选定的时间段结束时和在进行任何进一步的搅拌之前，从反应容器除去含乙醇的流出物；(5)向含有残留固体的反应容器中添加包含步骤(1)的反应混合物的成分的第二反应混合物；和(6)重复步骤(2)至(5)，以保持连续的发酵反应。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含：在基本上不存在外源提供的酶、空气和添加的营养物的情况下，包含有运动发酵单胞菌的第一培养物和不抑制发酵单胞菌属(Zymomonas)生长和发酵的量的Clostridium phytofermentans的第二培养物的发酵生物质。
在另一方面，本发明提供了一种用于乙醇生产的封闭系统方法。该系统包括：(1)在能够由生物质产生糖的Clostridium phytofermentans的细菌存在下和能够需氧和厌氧地发酵糖并在厌氧发酵中产生乙醇的兼性厌氧菌的存在下，在至少大约35℃的温度下，在发酵容器中进行产生乙醇的厌氧发酵，(2)从厌氧发酵物连续抽取发酵培养基的一部分；(3)从抽取的发酵培养基分离细菌，并将分离的细菌返回到厌氧发酵物中；和(4)从发酵培养基的抽取部分除去乙醇。
引用引入
本文通过引用引入本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请，好像各个单独的出版物、专利或专利申请具体和单独地表明通过引用引入本文中。
附图简述
在所附的权利要求中详细地提出本发明的新特征。通过参考提出利用本发明原理的说明性实施方式的下面的详细说明他附图，可以获得对于本发明的特点和优势的更好的理解，附图中：
图1描述示意性地显示本发明的一种实施方式的方法的框图。
图2显示C.phytofermentans原液(0.3％CB.MB)的生长。
发明详述
定义
除非另有定义，本文所用的科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的意义。为了本发明的目的，下列用语的定义如下。
“生物燃料”、“燃料和/或其他化学产品”和“其他产物”可以交替使用，并且在本文中用来包括适合作为液体燃料、气体燃料、试剂、化工原料、化学添加剂、处理助剂、食品添加剂和可以添加化学产品的其他用途的化合物，且包括但不限于：碳氢化合物、氢气、甲烷、羟基化合物(如醇类，如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇等)、羰基化合物(如醛类和酮类(如丙酮、甲醛、1-丙醛等))、有机酸、有机酸衍生物(如酯类(如蜡酯、甘油酯等))和其他功能化合物(包括但不限于1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸)、酶(如纤维素酶、多糖酶(polysaccharase)、脂肪酶、蛋白酶、木质素酶(ligninase)和半纤维素酶)，且可作为纯的化合物、混合物或不纯或稀释的形式而存在。
本文所用的“生物催化剂”包括酶和微生物，包括酶和微生物的溶液、悬浮液和混合物。在某些情况中，这个词指酶或微生物任一发挥某种特定功能的可能用途，在其他情况中，这个词指酶和微生物二者的结合用途，而在其他情况中，这个词指酶和微生物二者中的仅一个。这一用语的上下文表明本领域的技术人员理解的含义。
本文所用的“植物多糖”指在植物物质中存在的糖和糖衍生物的聚合物，以及糖聚合物的衍生物。示例性的植物多糖包括木质素、纤维素、淀粉和半纤维素。一般来说，多糖可以具有两个或多个糖单元或糖单元的衍生物。糖单元和/或糖单元的衍生物可以以规则方式或以其他方式重复。糖单元可以是己糖单元或戊糖单元，或这些的组合。糖单元的衍生物可以是糖醇、糖酸、氨基糖等。
本文所用的“生物质”包括可以转化为生物燃料、化学产品或其他产物的生物材料。一种示例性的生物质的来源是植物物质。植物物质可以是，例如，木本植物物质、非木本植物物质、纤维素材料、木质纤维素材料、半纤维素材料、碳水化合物、果胶、淀粉、菊粉(inulin)、果聚糖(fructan)、葡聚糖、玉米、甘蔗、草、柳枝稷、竹子和由这些物质衍生的材料。可以通过提及存在的化学物质种类(如蛋白质、多糖和油)进一步描述植物物质。多糖包括各种单糖和单糖衍生物(包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖等)的聚合物。植物物质还包括农业废弃的副产物或副产品流(side stream)，如果渣、玉米浆、玉米浆干粉(corn steep solids)、酒糟(distillers grain)、果皮、核、发酵废弃物、秸秆、木材、污水、垃圾和剩余食物。这些材料可以来自农场、林业、工业来源、家庭等。生物质的另一非限制的例子是动物物质，包括例如牛奶、肉类、脂肪、动物加工废弃物和动物粪便。“原料”经常用来指用于加工的生物质，如本文所述的那些。
本文所用的“可发酵糖”指可以用作微生物的碳源的糖和/或糖衍生物，包括这些化合物(包括这些化合物中的两种或多种)的单体、二聚体和聚合物。在某些情况下，生物体可以在吸收裂解的材料之前，通过例如水解来裂解这些聚合物。示例性的可发酵糖包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和果糖。
本文所用的“培养液”指任何生长阶段(包括刚接种后的时刻和任一或所有细胞活动已停止后的时期)的接种培养基，且可以包括发酵后处理后的材料。如果合适的话，它包括可溶性和不溶性物质的组合、悬浮物质、细胞和培养基的全部内容物。
本文所用的“糖化”指植物多糖向低分子量物质的转化，所述低分子量物质可以被附近的生物体利用。对于某些生物体，这包，向单糖、二糖、三糖和高达大约7个单体单元的寡糖以及糖衍生物的类似链大小的糖衍生物及糖和糖衍生物的组合的转化。对于某些生物体，允许的链节可以更长，和对于某些生物体，允许的链节可以较短。
本文所用的“预处理”或“预处理的”指无论以组合的步骤进行的或顺序进行的任何机械、化学、热、生化过程或这些过程的组合，其达到去除或破坏木质素的目的以使得植物生物质中的纤维素和半纤维素聚合物更容易为纤维素酶和/或微生物利用。在一些实施方式中，预处理可以包括去除或破坏木质素以使得植物生物质中的纤维素和半纤维素聚合物更容易为纤维素酶和/或微生物利用。在一些实施方式中，预处理可以包括使用一种类型的微生物使得植物多糖更容易为另一类型的微生物利用。在一些实施方式中，预处理也可以包括纤维素/或半纤维素材料的破坏和/或膨胀。蒸汽爆发(steam explosion)和氨纤维膨胀(或爆发)是公知的热/化学技术。可以使用水解，包括利用酸和/或酶的方法。也可以使用其他的热、化学、生化、酶学技术。
描述
下面的描述和实施例详细说明本发明的某些优选实施方式。本领域技术人员会认识到，存在本发明范围涵盖的许多的变化和修改。因此，优选的实施方式的描述不应被视为限制本发明的范围。
本发明的各种实施方式提供涉及以下方面的益处：1)以渐进的方式在整个过程中，而不是依赖于单一的初步预处理步骤的效果，使得木质纤维素材料的纤维素和半纤维素聚合物具有生物可利用性，无论是使聚合物更容易接近、水解它们、衍生化或以这些或其他使它们可以由附近的生物利用的方式作用于它们；2)利用多种生物催化剂，以达到植物聚合物的更完整的糖化、源自植物的糖向燃料和/或化学产品的更完全的转化、源自植物的糖向燃料和/或化学产品的更迅速的转化；3)利用需氧微生物以从进程中除去氧，从而使得能够随后使用厌氧微生物，或在后续使用厌氧微生物或需氧微生物前利用厌氧微生物；4)循环利用过程中的营养物，以尽量减少培养基的成本；和5)提供在过程中同时制造两种或多种产物的方法。本发明的某些实施方式可能显示所有这些益处，而其他实施方式可能显示较少的益处，但仍保持在本发明的范围之内。
在一个优选的实施方式中，预处理或没有预处理的原料(如农作物、作物残渣、树木、木屑、锯末、纸张、纸板以及含有纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的其他材料(统称为“原料”))接触能够转化原料中的一种或多种植物多糖成为低分子量物质的厌氧生物体，所述低分子量物质可以用作第二微生物生产燃料和/或其他化学产品的碳源。这些低分子量物质可以保持作为细胞外化合物，可以摄取作为细胞内化合物，或同时作为细胞内和细胞外的化合物存在。生物体也可以至少部分地聚合或以某种其他方式结合这些化合物。
在一种这样的实施方式中，使用Clostridium phytofermentans。Clostridium phytofermentans包括美国典型培养物保藏700394T号，且在一些实施方式中可以根据培养菌株ISDgT(Warnick等人，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，52：1155-60，2002)的表型和基因型特征定义。本发明的方面一般包括用于生产燃料(如乙醇)和/或其他有用的有机产品的系统、方法和组合物，其涉及例如，菌株ISDgT和/或任何其他Clostridium phytofermentans种类的菌株，包括那些可以由源自菌株ISDgT的或单独分离的菌株。某些示例性的物种可以使用标准分类学规则来定义(Stackebrandt和Goebel，International Journal of Systematic Bacteriology，44：846-9，1994)：与典型菌株(ISDgT)相比具有97％和更高的16S rRNA序列同源性值的菌株和具有至少大约70％的DNA重组值(re-association value)的菌株可以是值得考虑的Clostridium phytofermentans。存在相当多的证据表明具有70％或更高的DNA重组值的许多微生物也具有至少96％的DNA序列一致性，并共有定义物种的表型性状。Clostridiumphytofermentans菌株ISDgT的基因组序列分析表明大量很可能参与植物多糖发酵机制和途径的基因和遗传基因座的存在，导致可以在这种微生物的Clostridium phytofermentans种的所有或几乎所有菌株中发现异常的发酵性能。Clostridium phytofermentans菌株可以是天然的分离物或遗传修饰的菌株。
Clostridium phytofermentans提供了生物质转化为乙醇和其他产品的有用的优势。Clostridium phytofermentans的一个优势在于它产生能够水解多糖和高级糖(higher saccharide)成为较低分子量的糖、寡糖、二糖和单糖的酶的能力。在一些实施方式中，生物体可用于水解存在于生物质中的各种高级糖成为低级糖，如在用于发酵以产生乙醇、氢或如有机酸(包括甲酸、乙酸和乳酸)的其他化学品的制备中。Clostridium phytofermentans的另一个优势是其水解含有己糖糖单元、含有戊糖糖单元和含有这两种糖单元的多糖和高级糖成为低级糖，和在某些情况下水解成为单糖的能力。这些酶和/或水解产物可用于发酵中以生产各种产品(包括燃料和其他化学产品)。Clostridiumphytofermentans的另一个优势是由低级糖(如单糖)生产乙醇、氢和其他燃料或化合物(如包括乙酸、甲酸和乳酸的有机酸)的能力。Clostridium phytofermentans的另一个优势是进行水解含有糖和/或高级糖或多糖的高分子量生物质成为低级的糖及发酵这些低级糖成需要的产品包括乙醇、氢气和其他化合物(如包括乙酸、甲酸和乳酸的有机酸)的组合步骤的能力。
Clostridium phytofermentans的另一个优势是在包括升高的乙醇浓度、高糖浓度、低糖浓度、利用不溶性碳源和/或厌氧条件下运行的条件下生长的能力。这些特征可以以不同的组合实现具有长发酵周期的运行，且可用于结合批次发酵、进料批次发酵(fed batch fermentation)、自种(self-seeding)/部分收获发酵和从作为接种体的最终发酵物回收细胞。
在一些实施方式中，Clostridium phytofermentans接触预处理或未预处理的含有纤维素，半纤维素和/或木质纤维素材料的原料。可以存在另外的营养物，包括含氮化合物(如氨基酸、蛋白质、水解蛋白质、氨、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆、大豆衍生物、酪蛋白、酪蛋白衍生物、奶粉、奶制品(milk derivative)、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶解的酵母、玉米浆、玉米浆干粉、谷氨酸一钠和/或其他发酵氮源)、维生素和/或矿物质补充剂。在一些实施方式中，一种或多种其他低分子量的碳源可以被添加或存在，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米糖浆、乳酸等。这些低分子量的碳源可以发挥多种功能，包括在发酵期开始时提供初始碳源、帮助建立细胞计数、控制碳/氮比例、除去过量的氮或一些其他功能。
与C.phytofermentans接触一般包括至少一段具有足够低的溶解氧的时期，以使生物体繁殖和/或产生纤维素酶和/或在细胞内储存糖/多糖/寡糖物质和/或产生燃料和/或其他化学产品。可以通过任何适当的方法实现适当低溶解氧的条件，包括加热培养基、用低氧气体吹洗培养基、培养液或发酵罐、加入厌氧生物体、在培养基制备过程中排除空气等。
在一些实施方式中，在无氧环境下培养Clostridium phytofermentans细胞，所述无氧环境可以通过经具有浸没于培养基表面下的气体出口的起泡器鼓入基本上不含氧的气体来实现和/或维持。过量气体和由培养基中的反应产生的流出物填充顶部空间，并最终通过容器壁中形成的出气口排出。可以用来维持厌氧条件的气体包括N2、N2/CO2(80∶20)、N2/CO2/H2(83∶10∶7)和隋性气体(如氦和氩)。在2007年1月26日提交的题为“Systems and Methods for Producing Biofuels and RelatedMaterials”的美国申请11/698,722中描述了实现厌氧条件的方法，本文通过引用完整引入该文献。
在某些实施方式中，C.phytofermentans可以降低原料中的一种或多种多糖的分子量，并在细胞内吸入低分子量的化合物的至少一部分。吸收这些化合物后，细胞被溶解并接触用于生产燃料和/或其他化学产品的另一种生物体。溶解发生在用第二生物体接种之前、期间或之后。溶解和第二接种的相对时间选择可以取决于以下事件：所使用的溶解方法、第二生物体的健壮性(robustness)和C.phytofermentans的健壮性。在某些情况下，可以在用C.phytofermentans接种的同时或之前，用第二生物体接种培养液。适合用作第二生物体的生物体包括那些能够产生乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、氢、甲烷、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、甲醛、丙酮或可作为燃料和/或其他化学产品的其他化合物的生物体。优选的生物体包括酵母(如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、梭菌属的种(如热纤梭菌(C.thermocellum)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)和食纤维梭菌(C.cellovorans))和产生乙醇的细菌(如运动发酵单胞菌)。
合适的溶解方法包括单独或组合地添加酶(如溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、多糖酶)、添加螯合剂(如磷酸盐、EDTA、碳酸盐、离子交换树脂等)、高剪切混合、超声处理、压降浆(pressure-drophomogenization)、添加酸或碱、添加氧化或还原剂或其他适当的手段。
根据产生的具体物质和所需的纯度，可以通过适当的加工方法回收产生的燃料和/或其他化合物。例如，当生产乙醇时，可以将反应物的全部内容物转移到蒸馏装置(distillation unit)，且可以蒸馏和收集96体积％的乙醇/4体积％的水。可以通过96％乙醇的共沸蒸馏(例如，通过加入苯，然后再蒸馏该混合物)，或将96％乙醇通过分子筛以除去水而获得燃料级乙醇(99-100％乙醇)。
一方面，本发明使用顺序的需氧或厌氧循环将纤维素/木质纤维材料生物转化为燃料和化学产品。
一些实施方式使用需氧/厌氧循环将纤维素/木质纤维材料生物转化为燃料和化学产品。在一些实施方式中，厌氧微生物可以直接发酵生物质而无需预处理。在某些实施方式中，原料接触能够裂解源自植物的聚合材料为低分子量产物的生物催化剂，所述产物可以随后由生物催化剂转化为燃料和/或其他需要的化学产品。
根据一种实施方式的处理步骤可以包括：1)将原料与需氧的纤维素水解性微生物接触，2)将产生的经处理的原料与厌氧的纤维素水解性微生物接触，该微生物也能够发酵糖成为燃料和/或化学产品，3)从液体部分(包括燃料和/或其他化学产品的至少一部分)分离固体部分(包括微生物细胞、残留原料和部分代谢的原料的至少一部分)，4)通过机械、热和/或化学技术处理固体，以实现残留原料材料中的植物聚合物的至少部分裂解，并产生可用的碳水化合物(如单糖、二糖、寡糖、多糖、糖醇和其他的糖衍生物)和与由前述处理步骤产生的微生物细胞相关的其他营养物，和5)将处理的固体与能够转化存在的至少一些碳水化合物为燃料和/或其他化学产品的微生物接触。
在一些实施方式中，可以预处理原料，如通过热、机械和/或化学手段预处理。这种预处理可以至少部分地水解存在的碳水化合物或蛋白质，破坏细胞结构，增加表面积，或使碳水化合物更容易为微生物或酶利用。
在一些实施方式中，处理步骤包括：1)在有氧条件下将预处理的生物质材料接触需氧细菌的第一培养物，其中，需氧细菌能够至少部分地水解预处理的生物质，3)孵育需氧培养液直到纤维素水解性需氧微生物消耗氧的至少一部分并水解生物质的至少一部分，从而转化需氧培养液成为包括含可发酵糖的水解产物的厌氧培养液，和2)用包含能够转化可发酵糖成为生物燃料的厌氧微生物的微生物第二培养物处理。
一些实施方式使用厌氧/需氧循环用于纤维素/木质纤维素材料向燃料和化学产品的生物转化。其他实施方式使用厌氧/厌氧循环用于纤维素/木质纤维素材料向燃料和化学产品的生物转化。在一些实施方式中，厌氧微生物可以直接发酵生物质而无需预处理。
在一些实施方式中，处理步骤包括：1)在厌氧条件下将生物质材料接触非遗传修饰的厌氧细菌的第一培养物，其中，生物质没有经外源提供的化学品或酶处理，且其中，非遗传修饰的厌氧细菌转化生物质的至少一部分成为单糖和二糖，和2)用非专性需氧菌的微生物的第二培养物处理生物质，其中，单糖和二糖转化为生物燃料。该过程可在封闭的容器中进行。在一些实施方式中，厌氧细菌是C.phytofermentans。在一些实施方式中，第二培养物是酿酒酵母、梭菌属的种(如热纤梭菌、丙酮丁醇梭菌和食纤维梭菌)或运动发酵单胞菌。在一些实施方式中，处理步骤也可以包括：3)分离和回收所产生的生物燃料、残留的生物质和培养物。
在一些实施方式中，本发明包括产生生物燃料的方法，包括在中温条件下，在Clostridium phytofermentans和运动发酵单胞菌的共培养的存在下，使包括含纤维素和半纤维素的植物材料的生物质进行发酵，所述培养的比例为使得纤维素：乙醇和半纤维素：乙醇的转化率高于通过使用单独的Clostridium phytofermentans或运动发酵单胞菌获得的转化率的量。在一些实施方式中，用Clostridium phytofermentans和运动发酵单胞菌的共培养获得的转化率高于通过使用单独的Clostridiumphytofermentans或运动发酵单胞菌获得的转化率的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。中温条件优选保持在大约28°至约35°。
在一些实施方式中，本发明提供了产生生物燃料的方法，包括在中温条件下，在Clostridium phytofermentans和选自丙酮丁醇梭菌、热纤梭菌和食纤维梭菌的第二种梭菌属细菌的共培养的存在下，使包括含纤维素和半纤维素的植物材料的生物质进行发酵，所述培养的比例为使得纤维素：乙醇和半纤维素：乙醇的转化率高于通过使用单独的Clostridium phytofermentans或第二种梭菌属细菌获得的转化率的量。在一些实施方式中，用Clostridium phytofermentans和第二种梭菌属细菌的共培养获得的转化率为高于通过使用单独的Clostridiumphytofermentans或第二种梭菌属细菌获得的转化率的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施方式中，本发明提供了一种同时糖化和发酵来自生物质的纤维素固体成为生物燃料的方法。该方法包括在一定条件下，用Clostridium phytofermentans细菌处理封闭的容器中的生物质，其中，Clostridium phytofermentans细菌产生足够基本上转化生物质为单糖和二糖的糖分解酶。该培养物然后接触第二微生物的培养物，其中，第二生物体能够基本上转化单糖和二糖为生物燃料。第二培养物的例子包括但不限于酿酒酵母、梭菌属的种(如热纤梭菌、丙酮丁醇梭菌和食纤维梭菌)和运动发酵单胞菌。
在一些实施方式中，本发明提供了一种由含木质素的生物质生产生物燃料的方法。该方法包括：1)将含木质素的生物质与具有足以水解含木质素的生物质的至少一部分的浓度的碱性水溶液接触；2)中和处理过的生物质至7-8的pH；3)在一定条件下，用Clostridiumphytofermentans细菌处理封闭容器中的生物质，其中，Clostridiumphytofermentans细菌产生足够基本上转化处理过的生物质为单糖和二糖的糖分解酶；和4)引进第二微生物的培养，其中，第二生物体能够基本上转化单糖和二糖为生物燃料。
在一些实施方式中，本发明提供了一种由生物质生产生物燃料和营养发酵残留物的方法。该方法包括：1)用包含Clostridiumphytofermentans的培养物处理生物质，Clostridium phytofermentans在发酵反应中产生醇和包含选自氨基酸、辅因子、激素、蛋白质、维生素和脂类的营养物的发酵残留物；2)在适于产生生物燃料的条件下和适于生产营养物的条件下发酵培养物；3)从培养物分离生物燃料；和4)回收包含营养物的发酵残留物。
本发明的一个实施方式由图1示意性地显示。经处理或未经处理的原料11输送到需氧生物反应器1中，在其中它受到一种或多种需氧微生物作用。步骤1是任选的需氧预处理步骤。需氧培养的原料12然后输送到厌氧生物反应器2中，在其中它由一种或多种厌氧微生物作用，以产生一种或多种用作燃料或其它用途的化合物，并任选地分解存在的糖。在另一实施方式中，需氧培养1和厌氧培养2可在同一容器中进行。厌氧处理的材料13输送到分离器3，在其中主要液体的部分15与富含固体的厌氧处理的残留部分14分离。步骤3是任选的分离步骤。在这里，“主要液体的部分”指由分离产生的具有较低悬浮固体的部分。这部分一般是可流动的，且在一些实施方式中具有比其他部分高的透光百分比。可能必要的话，主要液体的部分15经进一步处理，使得分离燃料或所需的化学产品。分离器3可以是密度分离装置，如沉淀池、澄清池、离心机、水力旋流器等，或者它也可以是膜装置(如反渗透装置、横流微滤、超滤、纳米过滤等)，或者它也可以是过滤单元、或筛选单元、或浮选单元、或这些类型的装置的组合。厌氧处理的残留部分14可以被丢弃、回收利用、进一步加工或用这些方法的组合进行处理。
厌氧处理的残留部分14的进一步加工可以包括机械、化学和热处理步骤。在另一实施方式中，残留部分14通过发酵进行加工。在另一实施方式中，残留部分14由至少一个处理步骤和发酵的组合进行加工。处理后的残留部分14也可以为了销售其中存在的一种或多种产品而进行加工。
在图1中，厌氧处理的残留部分14经处理步骤4加工以产生处理的残留材料16，其然后再经发酵步骤5加工以产生发酵残留材料17。发酵残留材料17然后经分离步骤6处理，以部分或完全地分离有用的产品(例如燃料或化学产品)。在一个实施方式中，分离步骤6从富含固体的相18分离主要液体的相19。主要液体的相19然后可以进一步加工以分离和/或纯化用作燃料或化学产品的材料。主要液体的相19的至少一部分也可以在处理中回收。富含固体的相18可以被丢弃、回收利用、填埋、堆肥、用于向农作物施肥或用作其他与其组成(composition)有关的目的。
本发明的另一实施方式提供了一种用于生产乙醇的封闭系统方法，包括以下步骤：1)在能够由生物质产生糖的Clostridium phytofermentans细菌存在下和的能够需氧和厌氧地发酵糖并在厌氧发酵中产生乙醇的兼性厌氧菌的存在下，在至少大约35℃的温度下，在发酵容器中进行产生乙醇的厌氧发酵，2)从厌氧发酵连续地抽取发酵培养基的一部分；3)从抽取的发酵培养基分离细菌，并将分离的细菌返回到厌氧发酵中；和3)从抽取的发酵培养基的部分除去乙醇。在一种实施方式中，兼性厌氧细菌是大肠杆菌。
本发明的另一实施方式提供了一种由纤维素基质生产乙醇的方法，包括以下步骤：1)在反应容器中提供包含施予厌氧的糖分解酶的纤维素基质、Clostridium phytofermentans细菌和任选的运动发酵单胞菌的浆料形式的反应混合物；2)搅拌反应混合物持续第一选定的时间段，其中，反应混合物在足以引发并保持发酵反应的条件下反应；3)停止反应混合物的搅拌持续足够的时间以允许反应混合物的不溶性基质在第二选定的时间段中沉淀，从而形成基本上不含悬浮固体的含乙醇的流出物层和残留固体层；4)在第二选定的时间段结束时和任何进一步的搅拌之前，从反应容器除去含乙醇的流出物；5)向含有残留固体的反应容器中添加包含步骤1)的反应混合物的成分的第二反应混合物；和6)重复步骤2)至5)，以保持连续的发酵反应。
本发明还提供了组合物。在一些实施方式中，本发明提供了在基本上不存在外源提供的酶、空气和添加的营养物的情况下包含含有运动发酵单胞菌的第一培养物和不抑制发酵单胞菌属生长和发酵的量的Clostridium phytofermentans的第二培养物的发酵生物质的组合物。
原料-纤维素、半纤维素和木质纤维素材料的来源
可能含有纤维素、半纤维素和/或木质纤维素材料的原料可以源自农业作物、作物残茬、树木、木片、木屑、纸张、纸板、草和其他来源。
纤维素是葡萄糖的直链聚合物，其中，葡萄糖单元通过β(1→4)键连接。半纤维素是许多糖单体(包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖)的分支聚合物，并且可以具有同时存在的糖酸(如甘露糖醛酸和半乳糖醛酸)。木质素是主要对-香豆醇(p-coumarylalcohol)、松柏醇(conferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)的交联的外消旋大分子。这三种聚合物一起出现在植物生物质中的木质纤维素材料中。这三种聚合物的不同特点可以使该组合难于水解，因为各种聚合物倾向于屏蔽其他聚合物免受酶的攻击。
在一些实施方式中，原料材料可以在用于生产燃料和化学产品的生物过程之前进行任选的机械、热化学和/或生物化学预处理，但未经处理的木质纤维素材料也可以用于该方法中。机械方法可以减小木质纤维素材料的颗粒大小，以便它可以在生物过程中更方便地处理，还可以增加原料的表面积以促进与化学剂/生物化学剂/生物催化剂的接触。木质纤维素材料也可进行热和/或化学预处理以使植物聚合物更易利用，但因为各种实施方式可以加入木质纤维素处理的多个步骤，因此有可能会使用更温和和较便宜的热化学预处理条件。添加裂解植物聚合物的酶(糖化作用)可以用作常规的木质纤维素生物转化过程中的部分，且这些酶可以构成主要的成本。
机械过程包括并不限于，洗涤、浸泡、碾磨、粉碎、过筛、剪切和大小分选过程。化学过程包括但不限于，漂白、氧化、还原、酸处理、碱处理、亚硫酸盐处理、酸式亚硫酸盐处理、碱式亚硫酸盐处理和水解。热过程包括但不限于，灭菌、蒸汽爆发、在水存在或不存在的情况下保持在升高的温度下和冷冻。生化过程包括但不限于用酶处理和用微生物处理。可以利用的各种酶包括纤维素酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡聚糖酶(gluconase)和其他多糖酶(polysaccharase)；溶菌酶；漆酶和其他木质素修饰酶；脂肪氧合酶、过氧化物酶和其他氧化酶；蛋白酶；和脂肪酶。机械、化学、热和生物化学过程中的一种或多种可以组合或单独使用。这种组合的过程也可以包括那些用于纸张、纤维素产品、微晶纤维素和纤维素的生产中的过程，且可包括制浆、牛皮制浆(kraft pulping)、酸性亚硫酸盐处理。原料可以是来自利用对纤维素、半纤维素和木质纤维素材料的这些处理的一种或多种的设施(如造纸厂、纤维素厂、棉花加工厂或微晶纤维素厂)的副产品流或废物流。原料还可以包括含纤维素或含纤维质的废料。
在准备用厌氧生物接种原料时，可以将如氮源、盐、维生素和微量元素的另外的营养物添加到培养液中。在接种之前、同时或接种后，培养液的氧含量降低到适于使用的特定生物体的水平。一种优选的生物体是C.phytofermentans。可以采用各种方法以减少氧含量。例如，可以用氮气或非含氧气体流冲洗培养液或发酵罐，培养基可以在排除氧的情况下配制，可以加热培养基，或可以添加需氧生物体。在一个实施方式中，利用也能够制造所需的燃料和/或其他化学产品的需氧生物体或兼性厌氧生物体。第一生物体向第二生物体的过渡然后可以通过改变通风模式和选择性溶解第一生物体来实现。
厌氧生物反应容器
对于本发明来说特别感兴趣的是具有裂解纤维素和半纤维素及代谢由木质纤维素材料的糖化作用产生的己糖和戊糖的能力的厌氧纤维素水解性微生物(例如，Clostridium phytofermentans)。为了促进也可以转化糖为燃料和/或化学产品的厌氧纤维素水解性生物催化剂的生长，有必要补充营养物以促进快速生长和生化活性，但是，可以至少部分基于所需要的营养物的简单性和低成本选择挑选用于该过程中的微生物培养。虽然厌氧微生物可以同时糖化木质纤维素材料和由植物聚合物产生的全部范围的己糖和戊糖转化为燃料和/或化学产品，但各种类型的戊糖或己糖转化为燃料和/或化学产品的速度会发生变化。因此，一些糖被厌氧生物催化剂比其他催化剂更快地转化为燃料和/或化学产品。因此，本发明的一种实施方式允许木质纤维素材料和厌氧纤维素水解性发酵生物催化剂之间的充分接触时间，以达到基本上完全的糖化，但只有糖向燃料和/或产品的部分转化。
在一个实施方式中，将包括至少一种能够水解纤维素、半纤维素或木质纤维素材料并生产所需的燃料和/或其他化学产品的厌氧菌的厌氧培养物添加到原料的一部分中，例如，原料12。在另一实施方式中，将包括至少一种能够水解纤维素、半纤维素或木质纤维素材料并在细胞内储存水解的物质的厌氧菌的厌氧培养物添加到原料的一部分。在一些实施方式中，添加到原料中的厌氧菌既可以在细胞内存储水解的物质，也可以产生所需的燃料和/或其他化学产品。在优选的实施方式中，厌氧菌是C.phytofermentans。
包含C.phytofermentans的厌氧培养物优选维持在大约30°大约120小时。但是，不同的生物体和不同的培养基组成可能需要较高或较低的温度和较长或较短的发酵时间。在这段时间内，厌氧菌可以代谢培养液中存在的碳水化合物，以产生所需的燃料和/或其他化学产品，并赋予残留的生物质更易于被另一种微生物后续发酵生物利用。在其他的实施方式中，厌氧微生物水解培养液中存在的碳水化合物并在细胞内存储水解的物质。在其他的实施方式中，厌氧微生物水解碳水化合物，并在细胞内存储水解的物质的一部分和由水解的和/或存储的物质的一部分产生燃料和/或其它化学产品。在一些实施方式中，如当存在的原料不完全水解时，厌氧微生物可进一步水解剩余的原料的至少一部分。产生的燃料和/或其他化学产品通常聚集在细胞外培养基中，但是，在某些情况下，燃料和/或其他化学产品将聚集在另一个位置。例如，气体产物(包括氢)可以积聚在生物反应器的顶部空间中，它可以在生物反应器的顶部空间排出、捕获等。其他燃料和/或其他化合物可以在细胞内聚集。
任选的厌氧处理原料的分离
当原料耗尽，植物多糖的水解速度已经减慢，生物体的碳存储已经放缓时，或由于其他原因(如保持平稳的发酵厂的运作)，厌氧发酵步骤可以停止。各种方法可以用来监测生物体的活性，并确定停止厌氧发酵的时间点(包括但不限于监测废气率(off-gas rate)和/或组成、培养液的pH值和培养基组成)。在某些情况下，可以监测当生产速率降低时停止的发酵中的CO2生产速率和/或氢生产速率。培养液然后可以分成富含固体的部分和主要液体的部分，例如通过离心、沉淀、过滤、用膜、旋流器处理等。例如，在图1中，培养液然后可以分成富含固体的部分14和主要液体的部分15。
在各种实施方式中，主要液体的部分(例如，液体部分15)可以包含一种或多种可进一步纯化或直接使用的需要的燃料/或其他化学产品。产品的例子包括醇类、酶类、有机酸类和有机酸酯类。采用的纯化方法可以包括浓缩方法(如蒸发、超滤等)、结晶、沉淀(如用盐或加入非溶剂)、液-液分离、蒸馏、色谱、离子交换、吸附、透析和干燥。
在一些实施方式中，一种或多种产品包含于富含固体的部分中，或一种产品可以在富含固体的部分中和相同或不同的产品可以在主要液体的部分中。当产品包含于富含固体的部分中时，富含固体的部分可以作为产品本身进行处理，或此部分可进一步加工，如通过干燥、洗涤、溶解、提取、衍生化(derivitizing)和/或通过其他技术加工，以达到预期的纯度和产品特性。
可选择地，厌氧处理的原料可直接分离成产品材料和残留部分。这个途径的例子是从静止底部为残留部分(例如，残留部分14)的厌氧处理原料蒸馏乙醇。
这一途径的变型是在发酵过程中回收一种或多种气体产物(如氢或甲烷)。在图1所示的实施方式中，分离过程3可以在发酵过程中在发酵容器内进行而不是在停止发酵后进行，并包括从发酵培养液14分离气态产物流15。
液体部分
主要液体的部分(如液体部分15)经常含有厌氧发酵过程中产生的燃料和/或化学产品。所需的燃料和/或其他化学产品的回收取决于微生物产生的具体化合物。例如，在醇类(如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等)的情况下，可以蒸馏液体部分以生产高浓度的醇，其然后可以进一步脱水，例如用分子筛、过蒸汽化(pervaporation)、另外的蒸馏步骤(包括用试剂破坏共沸物或以其他方式促进分离)或进行分离的其他技术。所需的燃料和/或其他化学产品也可以被纯化，以除去其他微量成分，或也可以直接使用。
当没有任选的分离步骤时，厌氧处理的残留部分和厌氧处理的培养液 的处理
当没有利用任选的分离步骤(例如，分离步骤3)时，厌氧处理的残留物(如厌氧处理的残留物14)或厌氧处理的培养液(如厌氧处理的培养液13)进行机械、热化学和/或生化处理(如生化处理4)以进一步释放难以处理的(recalcitrant)植物聚合物，糖化植物聚合物和/或释放未代谢的糖类或来自微生物细胞的细胞内内容物的储存糖类/糖聚合物和可溶性营养物。如此处理的材料将称为“处理的残留材料”，无论加工中是否采用任选的分离步骤(如分离步骤3)。由此加工固体或厌氧处理的培养液的这一进一步的处理产生的处理的残留材料(如处理的残留材料16)可以用作动物饲料，作为燃料燃烧，或以其他方式利用，如通过另外的加工或在该过程中反复利用。
使用的加工技术可以包括细胞裂解，如通过超声波、高剪切混合、蒸汽爆发、酶处理、化学品处理、渗压震扰或其他适当的技术。其他加工技术可以包括蛋白质和/或多糖的水解，如通过用酶、酸、温度或其他合适技术处理。
其他产物(如胞外和/或分泌的酶)可以通过适当的技术回收。这些技术的例子可以包括超滤、纳米过滤、反渗透、过滤、离心、重力沉降、浮选、干燥、透析、盐沉淀、通过加入非溶剂沉淀、达到或接近等电点的沉淀以及通过这些方法和其他方法的组合的沉淀。
可以利用的酶包括单独或组合的溶菌酶、蛋白酶、多糖酶、脂肪酶。在一些实施方式中，使用这些种类中一种的1种以上的酶，例如使用两种或多种蛋白酶。可以通过加入纯化或部分纯化形式的单个的酶或通过加入具有存在的多种酶和酶类型的酶混合物，来利用这些酶。
在一些实施方式中，可以通过酶的加入利用化学、热或机械处理。这种额外的处理可以在酶的加入之前，期间和/或之后进行。这样的处理可以包括加热、冷却、渗透压的变化、加入螯合剂、高剪切混合、均质化、超声、加入氧化剂、加入还原剂及这些和其他合适技术的组合。
在一些实施方式中，通过溶解步骤暴露的细胞内物质可以包括含糖化合物。这些含糖化合物(包括多糖)的水解可以释放单糖、二糖、三糖或较高级的糖。一般来说，这种水解的目的是提高这些糖类对于随后的微生物培养的生物利用度。这种培养可以作为循环步骤的部分，或用于随后的下游发酵步骤。
处理的残留材料的发酵
处理的残留材料(如残留材料16)可以用一种或多种另外的生物体(例如厌氧微生物)发酵，以产生发酵的残留材料(如发酵残留材料17)，其包括一种或多种用作燃料或化学产品的化合物。示例性的另外的微生物包括酿酒酵母、运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌、C.phytofermentans、热纤梭菌、食纤维梭菌以及产生或经工程化以产生醇类、有机酸、有机酸衍生物、醛、酮、氢或甲烷的其他生物体。
在一些实施方式中，另外的生物体可以是优先利用只是被厌氧培养步骤中使用的微生物缓慢利用的糖的生物体。例如，对于C.phytofermentans，缓慢利用的糖类包括乳糖、阿拉伯糖和木糖，而更迅速利用的糖类包括葡萄糖、纤维二糖和半乳糖。对于运动发酵单胞菌，更迅速利用的糖类包括葡萄糖、果糖和蔗糖。在此步骤产生的产物可能与在厌氧发酵步骤产生的相同或不同。处理的残留材料的发酵条件根据所使用的具体生物体和最终需要的产物而变化。对于C.phytofermentans，在排除氧和低于大约8.5的pH的条件下，使用大约28℃至大约38℃或优选大约33至36℃或大约35℃的温度。其他培养条件可以在2007年8月2日提交的题为“System and Methods forProducing Biofuels and Related Materials”的美国专利申请11/698,727和Thomas A.Warnick等人，Clostridium phytofermentans sp.nov.，Acellulolytic Mesophile from Forest Soil，52 International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology 1155(2002)中发现，本文通过引用将其完整引入。
发酵的残留材料的分离
发酵的残留材料(如发酵的残留材料17)可通过例如离心、沉淀，过滤和用膜、旋流器处理等分为富含固体的部分(如富含固体的部分18)和主要液体的部分(如液体部分19)。
在一些实施方式中，发酵的残留材料可直接分离成产品材料和富含固体的材料。这种方法的例子是从静止底部为富含固体的材料(例如，富含固体的材料18)的厌氧处理原料蒸馏乙醇。在其他的实施方式中，如当产品是气体(如氢或甲烷)时，可以通过从发酵罐除去气相而在发酵罐中发生从发酵的残留材料(如发酵的残留材料17)分离产品。当从培养液直接分离产物时和当从发酵罐收集气体产物时，可以对产物流进行额外的纯化或处理步骤。
富含固体的材料
富含固体的部分(如富含固体的部分18)一般含有木质纤维素材料和微生物细胞。在一些实施方式中，这部分可能会被丢弃，用作动物饲料、肥料或掩埋。在其他的实施方式中，可以用机械、化学、热方法或这些方法的组合处理这些固体。处理的固体可以具有回收的其它产物，或它们可以在该过程的上游点回收，或者它们可以例如在额外的发酵步骤中处理。在一些实施方式中，可以处理富含固体的材料以分离含有糖和/或营养物的主要液体的部分。可以以与材料的剩余部分同样的方式或不同的方式利用这种主要液体的部分。
处理的固体的随后发酵
在各种实施方式中，将分离的富含固体的部分返回至较早的培养步骤中，以便比以另外的方式可能实现的更完全地将植物聚合物转化为糖和有用的产品。在一些实施方式中，与“单程”方法相比，更温和的处理和/或更经济的处理步骤是可能的，因为木质纤维素材料会由于微生物对原料作用的结果而被明显软化。此外，由在该方法的培养阶段生长的细胞释放的细胞材料的循环利用可以作为在那些阶段中的营养物，这导致成本降低。
在其他的实施方式中，用另外的生物体培养经处理的处理固体以产生燃料和/或其他化学产品。优选的生物体包括那些快速利用只是被用于厌氧培养步骤中的微生物缓慢利用的糖的生物体。此步骤产生的产物可能与厌氧发酵步骤中产生的产品相同或不同。
任选的需氧生物反应器预处理
在一些实施方式中，预处理或未预处理的木质纤维素材料可以任选地与同时和/或顺序地促进糖化和氧消耗的活性纤维素水解性需氧微生物(例如，里氏木霉(Trichoderma reesei))接触。糖化酶的原位产生可以减少处理成本，且除去氧产生了适于纤维素水解性厌氧微生物生长的环境。
在一个实施方式中，将包含至少一种纤维素水解性需氧微生物的培养物添加到原料中。如需要，额外的营养物(如氮源、维生素、矿物质和微量元素)可以通过微生物添加。加入足够的接种体以在合理时间内提供良好的生长。可以控制或缓冲pH值到微生物的合适的范围。如需要，可以为生物体提供通风，并将温度操控在合适的范围内。
在另一实施方式中，如上，将包含至少一种纤维素水解性需氧微生物的培养物添加到含有对于需氧细胞增殖足够的原料和营养物的浆料中。将这种培养物维持在对于生物体适当的温度和pH值并结合足够的通风以支持生物体生长。此外，可以使用富氧气流来代替或与空气流结合，以达到所需要的细胞活性或溶解氧含量。
在需氧发酵末期，如通过监测木质纤维素基质的水解速率或其他适当的方法所确定的，减少通风以使生物体消耗剩余的氧，以准备用于厌氧培养的生长。可以采用各种方法以降低氧含量。例如，在批培养中，可以简单地关闭进风，或可以用氮气或氧耗减的气流取代空气。可选择地，可以将培养物转移(例如，通过管道)到另一个容器，并在转移过程中，将培养物与氧供应切断。在连续培养中，培养液可以通过其中不添加氧的区域。这样的区域可以是生物反应器的部分、管道、另一容器等。
实施例
实施例1.MB1培养基的制备
可以在烧杯中通过混合以下成分制备MB1培养基：
a.750毫升双蒸水
b.8克K2HPO4
c.4克KH2PO4
d.1克(NH4)2SO4
e.6克半胱氨酸
f.6克Amberex695AG 6克(经济的酵母提取物：可以使用Bacto)
g.底物-例如，纤维二糖、葡萄糖、纤维素以及本文所述的其他底物
如果底物是不溶性的(如玉米秸秆、纸浆(paper sludge))，培养基的pH值在没有底物的情况下进行调整。将培养基分布于分离的容器中，并将底物分别添加到各个容器中。接种体繁殖(inoculumpropagation)的标准品为0.3％的纤维二糖。用NaOH或KOH将pH值调整到7.50。将ddH2O添加至1L的体积。将培养基分布于独立的容器中，密封，并使得绝氧。
将培养基在设定为121℃的液体中高压灭菌持续最少20分钟。如果高压灭菌器中的总体积大于3升或容器容纳大于500毫升，那么时间增加。可以使用其他时间和温度，限制是过多热量或过长时间可能会破坏糖底物。可以由Sensient Flavors Co.，330S.Mill Street，Juneau WI53039(920-386-4527)获得Amberex 695AG。
可以在高压灭菌前添加底物。并不需要使用刃天青(Resazurin)。任选地，可以添加刃天青以保证该容器是绝氧的。将所有成分都放入烧杯中。加入水，且如果需要，用6N KOH调整pH至pH 7.50。用微波加热混合物至刚刚沸腾。迅速取出后，使用Hungate方法用来形成绝氧或使用真空歧管来用氮气使试管或烧瓶绝氧。
如果使用真空歧管，则培养基应置于适用橡胶隔片的试管或/瓶中。凸缘试管(如Cat#2048-11800 Bellco Glass Inc，Vineland NJ)通常用橡胶隔片密封，或对于较大的培养体积，使用配备位于螺丝盖的适当位置的适当大小的橡胶隔片的螺丝盖瓶/烧瓶。随后可以用无菌针刺穿试管和烧瓶的橡胶隔片，以加入接种物或底物或取出样品进行分析。
实施例2.GS-2培养基的制备
可以在烧杯中通过混合以下成分制备GS-2培养基：
a.750毫升双蒸水
b.2.90克K2HPO4
c.1.50克KH2PO4
d.2.10克尿素
e.2.00克盐酸半胱氨酸
f.10.00克MOPS
g.3.00克二水合柠檬酸三钠
h.6克Bacto酵母提取物(Catalogue#212750 Becton，Dickinson Co.)
i.1.00毫升0.1％的刃天青
j.底物-例如，纤维二糖、葡萄糖、纤维素以及本文所述的其他底物
添加ddH2O到补足900mL。如果底物是不溶性的(玉米秸秆、纸浆)，在没有底物的情况下调整pH值。然后将培养基分布于单独的容器中，并将底物分别添加到各个容器中。接种体繁殖的标准品为0.3％的纤维二糖。用NaOH或KOH将pH值调整到7.50。
将培养基转移到圆底烧瓶中并用微波加热至沸腾，而不将培养基沸腾。将烧瓶放置在Hungate仪器附近的加热的搅拌板上，并保持加热至恰未沸腾，同时用氮气冲洗，直到培养基“去粉红色(depinks)”。
在恒定的氮气气氛下，将8.7毫升分配到各管，用氮气冲洗直到刃天青无色。冷却培养基至室温，然后，在冰浴中冷却10分钟。
将管放置在具有向下牢固地拧紧在塞子顶部的顶板和垫的压热锅(autoclave press)中。(使用在底部具有橡胶垫的试管架以避免管开裂。)
将培养基在设定为121℃的液体中高压灭菌持续最少20分钟。如果高压灭菌器中的总体积大于3升或容器容纳大于500毫升，那么增加时间。可以使用其他时间和温度，限制是过多热量或过长时间可能会破坏糖底物。经过高压灭菌后，使得试管达到室温，并从压热锅中取出。
使用Hungate仪器和恒定的氮气流，添加1.0毫升的无菌GS-2盐。高压灭菌后，加入10％v/v的GS-2盐。GS-2盐的配方如下：
GS-2盐
a.ddH2O       100毫升
b.MgCl2*6H2O  1.0克
c.CaCl2*2H2O  0.15克
d.FeSO4*7H2O 0.00125克
可以使得培养基绝氧或需氧地使用。如果有氧，添加时培养基会变成微粉红色；它由于培养基中的半胱氨酸会很快地去粉红色。如对培养基(上文)一样高压灭菌。
在二者都冷却之后和接种前，向培养基添加10％v/v的盐：如果是培养基管，则达到最终的10毫升体积，9mL的GS-2培养基和1mL的GS-2盐。
实施例3.培养基高压灭菌程序
高压灭菌
设定温度为121℃，其相当于15psi的压力。
液体循环：如果高压灭菌器中的培养基总体积小于或等于3升，运行20分钟，如果高压灭菌器中的培养基的总体积大于3升或如果单独的容器容纳500毫升或更多，增加高压灭菌的时间。
高压灭菌器循环的时间和温度的最大限制因素是，存在着培养基中的可溶性糖的“焦糖化(carmelizing)”的危险-它会变成深褐色且结构变化。这改变了糖的性质，因而应该避免。
容器
10毫升培养基体积Bellco玻璃厌氧管，20mm的嘴
*具有Bellco blue 20mm塞的塞子
*具有Wheaton grey 20mm塞的塞子
*来自Bellco或Wheaton的具有20mm铝卷曲的卷曲
*来自Bellco orWheaton的用″卷曲机″工具固定的卷曲Hungate管
*管是只对于～$8/管的特定型号
*塞子是绿色橡胶，渐缩的用于适配，可用于各种位置50mL的培养基体积
血清瓶，20mm的嘴
*具有Bellco blue 20mm塞的塞子
*具有Wheaton grey 20mm塞的塞子
*来自Bellco或Wheaton的具有20mm铝卷曲的卷曲
*来自Bellco或Wheaton的用″卷曲机″工具固定的卷曲100-200毫升培养基
体积
分刻度的250mL血清瓶，30mm的嘴
*具有Wheaton grey 30mm塞的塞子
*来自Wheaton的具有30mm铝卷曲的卷曲
*来自Wheaton的用″卷曲机″工具固定的卷曲
＜200毫升的培养基分刻度的250mL螺丝盖培养基瓶体积
*用EDPM冻干式黑色塞子塞住的
*用塑料螺丝帽w/中心孔固定的
分刻度的500mL、1升或2升螺丝盖培养基瓶
*用EDPM冻干式黑色塞子塞住的
*用塑料螺丝帽w/中心孔固定的
实施例4.从培养基去除氧的程序
绝氧指示剂：刃天青-粉红＝有氧
无色＝厌氧
当培养基进入高压灭菌器时，刃天青应该是无色的。如果是粉红色的，容器中存在氧。
但是，半胱氨酸是缓慢的还原剂，在充气后对于100毫升的瓶去粉红色耗时10分钟是不寻常的。
如果当培养基从高压灭菌器出来时它仍然是粉红色或在摇晃新从高压灭菌器取出的容器后变成粉红色，则氧存在。
当充气MB1时：如果培养基太暗以至于不能可靠地观察刃天青的颜色，那么准备具有等于分布的培养基容器体积的绝氧指示剂溶液的容器。绝氧指示剂溶液的配方如下：
绝氧指示剂溶液100毫升
a.100毫升ddH2O
b.0.06克半胱氨酸
d.0.01毫升1％的刃天青溶液
对同时具有培养基的绝氧指示剂溶液的容器充气和使用清晰可见的刃天青反应来判断培养基需氧条件。
真空歧管的程序
这是设计用于制备卷曲盖管和烧瓶中的无氧环境、HPLC缓冲液的过滤、残留底物过滤和真空干燥的多功能装置。
打开氮气罐
a.检查以观察氮气罐正确地连接到调节器。
i.如果关闭：通过放松调节器前的黄铜T型阀来缓解隔膜(diaphragm)上的压力，然后打开氮气罐顶部的阀门
ii.用大的黑色刻度盘调整调节器压力至3或4psi
iii.调节调节器侧的小铜刻度盘以让氮气流向N2/真空选择阀
激活冷阱和真空泵
iv.移动冷阱W的顶部/浸泡冷却器探针进入阱桶中，打开冷却器。
v.等待10分钟使得探针冷却阱；你会发现防冻剂冻结到较低的线圈。
vi.通过按冷却器旁边的电源板上的开关打开真空泵。
b.脱气管和烧瓶
i.将22号针应用于真空歧管的5个端口中的各个。你可以重复使用针。
ii.关闭主歧管上的所有5个黑色塑料阀。不调整连接到超压释放阀的第六个黑色塑料阀。
iii.刺穿你的管或烧瓶的隔片
iv.使用玻璃倾斜双联阀选择真空功能
v.打开5个黑色塑料歧管阀并将真空应用到各个端口。
vi.以300mBars或更低的压力使管真空2分钟，使小于500毫升的烧瓶真空2分钟，使500毫升以上的烧瓶真空5分钟
vii.调整玻璃选择阀至氮气，并冲洗管，直到过压安全阀底部的白色聚四氟乙烯球发出丁当声。(大约20秒)
viii.检查以观察液体表面停止起波纹(大约5秒钟以上)
ix.调整玻璃倾斜双联阀来重复真空循环
x.用氮第三次冲洗后，从隔片移除针，关闭所有5个端口，调整倾斜双选择器至真空并切换到5个新的管或烧瓶。
c.过滤HPLC缓冲液
i.关闭主歧管上的所有5个黑色塑料阀。不调整连接到超压释放阀的第六个黑色塑料阀。
ii.将通过单孔塞将侧臂锥形过滤烧瓶连接到大的金属歧管。用#8塞子密封其余端口。
iii.将0.45微米过滤器放置在过滤器支架中，用夹子固定，并置于锥形烧瓶中
iv.使用玻璃阀打开真空管到歧管上。
v.将缓冲液倒入过滤器漏斗并重复直到溶液过滤
vi.关闭到真空泵的真空管角的玻璃阀
vii.用黑色刻度盘打开歧管端口，以恢复到大气压力
viii.除去过滤的缓冲液。
d.过滤残留底物
i.关闭主歧管上的所有5个黑色塑料阀。不调整连接到超压释放阀的第六个黑色塑料阀。
ii.将玻璃过滤漏斗放置于歧管上的6个端口的各个中。
iii.将预先称重的0.45微米过滤器放置于各个漏斗中
iv.确保用于过滤歧管的液体阱是空的。
v.将上清液倒入过滤漏斗
vi.调整玻璃阀以将真空管应用于歧管。
vii.当过滤完成时，关闭玻璃阀以阻止真空流。通过打开黑色塑料阀恢复到大气压力
viii.除去滤纸和残留固体
e.激活真空炉
i.关闭主歧管上的所有5个黑色塑料阀。不调整连接到超压释放阀的第六个黑色塑料阀。
ii.将干燥炉真空管通过单孔塞连接到歧管。用#8塞子密封其余端口。
iii.调整玻璃阀以将真空管应用于干燥炉。
iv.使用炉顶部的刻度盘以调节压力。当达到预期的压力时密封阀。
v.当完成时，关闭玻璃阀以阻止真空流。
关机
f.关闭玻璃阀以阻止通过歧管的真空流。
g.关闭真空泵。
h.关闭冷却器。
i.通过调节器侧面的小铜刻度盘关闭氮气流。你可以使罐开放。
i.通过打开歧管前面的黑色塑料阀使歧管恢复到大气压力。
Hungate程序
打开Hungate
a.滑动玻璃管，使得所有的铜在加热单元之内。
b.通过向下翻转开关打开变阻器至120伏特：上面的刻度盘调节热-一旦调整，不要动！
c.打开氮气
i.垂直于显示器的大旋钮应该是松的
ii.打开罐上的主阀
iii.大旋钮拧紧，直到左侧的刻度盘中的针移动。它不是必须移动许多。该旋钮调节隔膜片上的弹簧，其调节流量；它们可能通过压力的突然变化损坏，这就是在打开罐时为什么它应该松的原因。
iv.通过使用调节器上的小的侧面旋钮(连接显示器)调节流量。允许小流量只通过一个端口，直到预备好为培养基加气；这确保了氮气相对于大气的正向流动。
d.使用Hungate前，允许用空气流加热铜(copper)40分钟。
使用Hungate以使培养基除气(gas out)
a.转移培养基至烧瓶，并在微波炉中或加热板上加热至沸腾-不要煮沸溢出。
b.将烧瓶放置在Hungate仪器附近的加热的搅拌板上。保持烧瓶恰低于沸腾下加热，并用来自Hungate的氮气冲洗直到培养基去粉红色。分配的同时继续冲洗和加热。
c.将培养基分配到容器，各用氮气冲洗。轻轻地将塞子置于冲洗套管上。
*在分配过程中培养基变为微粉红色：冲洗直到去粉红色，同时在冰浴中冷却至略低于室温。*
d.取出套管，同时保持塞子向下，以最小化大气污染。
e.将管架放置于管架压力机中。固定用于其他容器的塞子。如对于容器和总体积(如上所述)适宜地进行高压灭菌。
关闭Hungate
a.除了一个之外，所有端口应关闭，通过该端口具有非常小的流量。
b.关闭变阻器：开关应在中间位置(最多＝140伏)。
c.滑动玻璃管，使得所有的铜在加热元件之外。
d.关闭氮气前使得铜冷却15-20分钟(直到徒手触摸舒适)。
e.关闭氮气
i.关闭主罐阀
ii.等待两个刻度盘指针静止于零。
iii.当两个表盘读数为零时，通过逆时针转动大的旋钮直至变松以释放隔膜片调节器
实施例5.发酵条件-C.phytofermentans
温度：35℃或30℃
a.35°促进生长，并用于可溶性底物
b.30°用于不溶性底物
搅拌：试管培养在没有搅拌的情况下静态生长。
培养物可以静态地或以不同的搅拌速度在烧瓶中生长。如果底物是不溶性的(即Avicel)那么搅拌是有用的，且可获得的底物表面积可能是限制因素。调整搅拌速度以保持底物悬浮，且这根据底物的类型和底物浓度变化。
pH值：7.50(见培养基SOP)
C.phytofermentans可以在6.5-8.5的pH值下生长，最好在较高的中间范围内。
基质：0.3％纤维二糖-维持接种物的标准物
高于2.5％可能会导致抑制。
一些人证明了依赖葡萄糖的生长抑制纤维素酶产生，这种抑制在转移到纤维素前向纤维二糖的中间转移是可逆的。
转移条件
通常情况下，C.phytofermentans的工作原液作为含0.3％纤维二糖的GS-2或MB1培养基中活跃生长的植物性培养而保持。使用用于试管中繁殖的2％接种体积，将培养转移生长的中对数期(见下文)。通常使用10％接种体积接种生物反应器。可以调整接种体积，以实现需要支持实验要求的时间的中对数期生长。通过测量660nm波长处的OD可以确定C.phytofermentans的生长(图2)。中对数的OD为底物依赖的：
a.0.3％底物：OD 660nm处转移0.500-0.700吸光度单位，底物是限制的，且培养物在0.700吸光度单位后不久进入静态生长
b.1％+底物：OD处转移0.500-0.700吸光度单位
实施例6.冷冻C.phytofermentans原液的制备
为了制备C.phytofermentans的冷冻原液，制备中对数期培养，加入等体积的无菌甘油(30％原液)，并放于-80℃冰箱内。这些冷冻原液可以无限期储存。为了使冷冻原液恢复活性，在冰上解冻原液，而且将培养物挑染到适当的琼脂板上或者2％的接种体用于液体培养基中，通常在试管中。如果将培养物挑染到琼脂板上，那么在30℃的3至5天的无氧接种可取得良好的生长。无菌接种环用于将单一菌落转移到微离心管中的1毫升无菌培养基(GS-2或MB 1)中，并搅拌以产生细菌细胞的悬浮液。无菌注射器用于吸取细菌悬浮液，并将它接种到密封的绝氧试管中。如果将解冻的培养物直接加入到试管中，则无菌注射器用于吸取适当体积(2％的接种体积是典型的)的微生物细胞悬浮液，并通过含GS-2或MB-1培养基的密封无氧试管的隔膜注射它。所有这些操作都在绝氧手套箱中进行的。使冷冻培养恢复活性后，在作为营养工作原液使用之前，允许至少2次分培养事件。这使得冷冻的原液适应在液体培养中生长并产生可靠的生长动力学。
实施例7.糖和乙醇分析
产物形成和剩余底物浓度的数据来自HPLC分析。
1)无氧地对培养物采样：优选22号针用于通过塞子无氧取样。遵循以下步骤：
a.将无氧气体吸入注射器，并排空注射器至少两次
b.吸保持等于样品体积的量的无氧气体进入注射器
c.将无氧气体注入容器中
d.采取样品(通常1至1.5毫升)
2)将样品放置于微量离心机并以12000rpm离心10分钟。
3)上清液用0.45微米注射器过滤器过滤进入HPLC取样瓶的(可以使用插入物)。
4)使用在55℃下运行的Aminex HPX-87H柱用0.005mM的硫酸流动相，通过高压液相色谱进行样品分析。也可以用在样的柱上或使用水流动相在80℃下的Aminex HPX-87P柱，对纤维二糖的浓度进行定量。
实施例8.对于培养物污染的评估
可以以各种方法检测污染。例如：
a.通过在显微镜下观察样品。如果看到除了C.phytofermentans之外的其他任何东西，则样本被污染。
b.通过监测培养物的pH值，如果pH值低于6.8，则怀疑受到污染。
c.HPLC数据有时可以表明更常见的污染物中的一种：如果检测到非常大量的乳酸，则培养物被污染。
d.可以将培养物的样品挑染到琼脂板上(参见，用于琼脂培养基的SOP，以得到对于C.phytofermentans选择性的琼脂或其他琼脂的配方)。如果形态明显不同的菌落在画线路径上生长，则培养污染。
可以用于本文所述的实施例中的试剂的例子和订购详情如下表所述。
Figure BPA00001231247400371
Figure BPA00001231247400381
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选方式，对于本领域的技术人员显而易见的是，提供这样的实施方式只是为了举例。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应该理解，在实践本发明时，可以使用本文所述的本发明的实施方式的各种替代方案。意味着：下列权利要求定义本发明的范围，因此这些权利要求范围内的方法和结构及其等价物由本发明覆盖。

Claims (23)

1.一种用于产生乙醇和其他化学产品的方法，包括：
提供包含植物多糖的预处理的源自生物质的材料；
在氧的存在下，用包含纤维素水解性需氧微生物的第一培养物接种所述的预处理的源自生物质的材料，以产生需氧培养液，其中，所述需氧微生物能够至少部分地水解植物多糖；
孵育所述需氧培养液直到所述纤维素水解性需氧微生物消耗至少一部分氧和水解至少一部分植物多糖，从而将需氧培养液转化成包含具有可发酵糖的水解产物的厌氧培养液；
用包含能够将可发酵糖转化成为乙醇和其他化学产品的厌氧微生物的第二培养物接种所述厌氧培养液；和
发酵接种的厌氧培养液，直到可发酵糖的至少一部分被转化成乙醇和其他化学产品。
2.根据权利要求1的方法，其中，从发酵的厌氧培养液回收至少一部分乙醇。
3.根据权利要求1或2的方法，进一步包括溶解发酵的厌氧培养液中的需氧和厌氧微生物，以产生包含剩余的可发酵糖和细胞内容物的溶解产物。
4.根据权利要求3的方法，进一步包括对所述溶解产物进行另外的物理和/或化学处理。
5.根据权利要求3的方法，进一步包括用能够加快剩余的可发酵糖转化为乙醇和其他化学产品的另一种微生物和/或酶混合物接种所述溶解产物。
6.一种用于制造适合作为燃料的材料的方法，包括：
提供包含多糖的源自植物的材料；
用包含纤维素水解性需氧微生物的第一培养物接种所述源自植物的材料，以产生需氧培养液，其中，所述需氧微生物能够至少地部分水解多糖；
在氧的存在下，孵育所述培养液，使得多糖的至少一部分水解成为一种或多种糖类物质；
在一定条件下孵育所述培养液以降低氧浓度，从而将所述培养液转化为厌氧培养液；
用包含能够将所述的一种或多种糖类物质转化成适合作为燃料的材料的厌氧微生物的第二培养物接种所述厌氧培养液；
发酵接种的厌氧培养液，以产生适合作为燃料的材料。
7.根据权利要求6的方法，其中，从发酵的厌氧培养液回收至少一部分适合作为燃料的材料。
8.根据权利要求6或7的方法，进一步包括溶解发酵的厌氧培养液中的需氧和厌氧微生物，以产生包含细胞内糖和细胞内容物的溶解产物。
9.根据权利要求8的方法，进一步包括对所述溶解产物进行另外的物理和/或化学处理。
10.根据权利要求9的方法，进一步包括用另一种微生物接种所述溶解产物。
11.根据权利要求6的方法，其中，所述源自植物的材料在用纤维素水解性需氧微生物接种之前进行预处理。
12.根据权利要求6的方法，其中，所述适合作为燃料的材料包括乙醇。
13.一种制造乙醇和其他化学产品的方法，包括：
提供包含植物多糖的源自生物质的材料；
在厌氧条件下，用包含Clostridium phytofermentans细胞的第一培养物接种所述源自生物质的材料，以水解植物多糖的至少一部分，其中，所述培养物的细胞吸收水解的植物多糖的至少一部分作为细胞内化合物；
溶解Clostridium phytofermentans细胞以产生溶解的培养液；
用包含能够将可发酵糖转化为乙醇和/或其他化学产品的厌氧微生物的第二培养物接种所述溶解的培养液；和
发酵接种的厌氧培养液，直到可发酵糖的至少一部分被转化成乙醇和/或其他化学产品。
14.一种生产生物燃料的方法，包括如下步骤：
在厌氧条件下在封闭的容器中提供生物质材料，其中，所述生物质没有用外源供给的化学产品或酶进行处理；
用非遗传修饰的厌氧细菌的第一培养物处理所述生物质，其中，所述非遗传修饰的厌氧细菌将生物质的至少一部分转化为单糖和二糖；和
用非专性需氧的微生物的第二培养物处理所述生物质，其中，所述单糖和二糖转化为生物燃料。
15.根据权利要求14的方法，其中，所述非遗传修饰的细菌的第一培养物是Clostridium phytofermentans。
16.根据权利要求14的方法，其中，所述微生物的第二培养物选自酿酒酵母、运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌、C.phytofermentans、热纤梭菌、食纤维梭菌。
17.根据权利要求14的方法，进一步包括溶解发酵的厌氧培养液中的需氧微生物，以产生包含剩余的可发酵糖和细胞内容物的溶解产物。
18.根据权利要求17的方法，进一步包括对所述溶解产物进行另外的物理和/或化学处理。
19.根据权利要求14的方法，进一步包括从残留的生物质和培养基分离和回收转化的生物燃料。
20.根据权利要求14的方法，其中，所述生物质包括含纤维素和半纤维素的材料。
21.根据权利要求14的方法，其中，所述生物质包括木质素。
22.根据权利要求22的方法，进一步包括将所述生物质与具有足以水解含木质素的生物质的至少一部分的浓度的碱性水溶液接触，并中和处理的生物质至7-8的pH。
23.一种生产生物燃料的方法，该方法包括在中温条件下，在Clostridium phytofermentans和选自丙酮丁醇梭菌、热纤梭菌和食纤维梭菌的第二种梭菌属细菌的共培养物存在下，使包括含纤维素和半纤维素的植物材料的生物质进行发酵，所述培养物的比例为使得纤维素：乙醇和半纤维素：乙醇的转化率高于通过单独使用Clostridiumphytofermentans或所述第二种梭菌属细菌获得的转化率的量。
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