CN101978055A

CN101978055A - 新型过氧化氢生成型nadh氧化酶及编码其的dna

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Publication number: CN101978055A
Application number: CN200980109454XA
Authority: CN
Inventors: 宫本宪二; 太田博道
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2008-01-17
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2029-01-09
Also published as: CN101978055B; EP2246424A1; US20110045548A1; WO2009091054A1; JP5115708B2; JP2009165417A; US8546113B2; EP2246424A4

Abstract

本发明的目的在于提供对来自短杆菌属微生物的、pH稳定性及热稳定性优异的新型NADH氧化酶进行编码的DNA，本发明为对以下(a)或(b)的、来自短杆菌属微生物的NADH氧化酶进行编码的DNA：(a)含有由序列号18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶；(b)在由序列号18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。

Description

新型过氧化氢生成型NADH氧化酶及编码其的DNA

技术领域

本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶及其制造方法。更具体而言，本发明涉及在氧气分子(O₂)存在下底物特异性地将NADH氧化、生成过氧化氢(H₂O₂)、从短杆菌(Brevibacterium)属微生物获得的、对NADH测定等有用的NADH氧化酶及其制造方法。

背景技术

将还原型辅酶(NADH)再生为氧化型辅酶(NAD⁺)的酶，由于其通过与氧化还原酶的组合而能够氧化各种酒精，因此非常有用。关于NADH氧化酶，有各种报道(参考专利文献1～11)。

专利文献1特开平7-163378号公报

专利文献2特开2003-116585号公报

专利文献3国际公开第WO2004/011670号小册子

专利文献4欧州专利公开第1285962号公报

专利文献5特开平8-196281号公报

专利文献6欧州专利公开第623677号公报

专利文献7特开平5-344890号公报

专利文献8特开平5-84072号公报

专利文献9特开平4-365478号公报

专利文献10欧州专利公开第385415号公报

专利文献11特开平2-107186号公报

发明内容

本发明的目的在于提供来自短杆菌属微生物的、pH稳定性及热稳定性优异的、对新型NADH氧化酶进行编码的DNA。

已知有大量从各种微生物分离出的氧化酶。然而，还没有从短杆菌属微生物分离出的例子。

通常，进行酒精的氧化反应的氧化还原酶的最佳pH为弱碱性的9～10左右。因此，希望进行NAD+的再生的NADH氧化酶的最佳pH也与其为同等范围。然而，来自乳酸菌的NADH氧化酶(Evonik DegussaGmbH专利)的最佳pH为6附近，其不适合作为再生性酶。另外，作为再生性酶要求具有高的热稳定性。

本发明人等对于获得上述优异的特性的酶进行了反复研究。其结果发现，由本发明人等新分离出的来自短杆菌属微生物的NADH氧化酶具有偏碱性的最佳pH，且其热稳定性也较高，由此完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种NADH氧化酶，其为具有下述的酶学性质的、来自短杆菌属微生物的NADH氧化酶：

(1)以氧气作为受体而催化NADH的氧化反应，生成NAD⁺与过氧化氢；

(2)最佳pH为8～10附近；

(3)即使在70℃进行1小时的热处理也不失活且具有80％以上的残存活性；

(4)最佳温度为50～70℃；

(5)通过铵盐而被活化；以及

(6)在通过SDS-PAGE测定的情况下，分子量为50～60kDa。

[2]如[1]所述的酶，进一步具有以下的酶学性质：

(7)对于NADPH的氧化活性小，且不能认定由FAD或FMN引起的活化；

以及(8)Km为约0.022mM。

[3]如[1]或[2]所述的NADH氧化酶，其来自短杆菌sp.KU1309(保藏编号：FERM P-21008)。

[4][1]～[3]的任一项所述的NADH氧化酶的制造方法，包括培养短杆菌属微生物、从培养物中回收NADH氧化酶。

[5]如[4]所述的NADH氧化酶的制造方法，短杆菌属微生物为短杆菌sp.KU1309(保藏编号：FERM P-21008)。

[6]以下(a)或(b)的来自短杆菌属微生物的NADH氧化酶：

(a)含有由序列号18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶。

(b)在由序列号18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。

[7]对以下(a)或(b)的来自短杆菌属微生物的NADH氧化酶进行编码的DNA，

(a)含有由序列号18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶，

[8]对以下(c)或(d)的来自短杆菌属微生物的NADH氧化酶进行编码的DNA，

(c)含有由序列号17所表示的碱基序列的DNA，

(d)含有由序列号17所表示的碱基序列的DNA与含有互补序列的DNA在严格的条件下杂交，对具有NADH氧化酶活性的蛋白质进行编码的DNA。

[9]含有[8]的DNA的表达载体。

[10]利用[9]所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。

[11]一种NADH氧化酶的制造方法，其包括：将[10]所述的宿主细胞在DNA可表达的条件下进行培养以产生NADH氧化酶、并回收该NADH氧化酶。

[12]如[11]所述的制造方法，其中，宿主细胞为大肠杆菌，通过使[9]所记载的表达载体与蛋白伴侣质粒共表达而制造可溶性NADH氧化酶。

[13]使用[1]～[3]及[6]的的任一项所述的NADH氧化酶制造光学活性扁桃酸或D-苯丙氨酸的方法。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-008062号的说明书以和/或附图中所记载的内容。

附图说明

图1A表示使用Butyl toyopearl色谱柱的、本发明的酶的精制结果的图。

图1B为表示本发明的酶的SDS-PAGE结果的图。

图2为表示本发明的酶的pH特性的图。

图3为表示本发明的酶的pH稳定性的图。

图4为表示本发明的酶的温度稳定性的图。

图5A为表示各种盐对于本发明的酶的效果的图。

图5B为表示铵盐对本发明的酶的效果的图。

图6为表示本发明的酶的由酸所导致的抑制的图

图7为表示本发明的酶的动力学的图。

图8A为表示由本发明的酶决定氧分子的还原状态的方法的图。

图8B为表示由本发明的酶引起的氧分子的还原状态的图。

图9A为表示本发明酶与扁桃酸脱氢酶的偶联反应的图。

图9B为表示本发明的酶与L-苯丙氨酸脱氢酶的的偶联反应的图。

图10为表示本发明的酶基因在克隆中的兼并PCR的结果的图。

图11为表示使用本发明的酶基因的片断的瑟慎印迹杂交(southernblotting)的结果的图。

图12为表示使用本发明的酶基因的反向PCR的结果的图。

图13A为表示本发明的酶基因的碱基序列的图。

图13B为表示本发明的酶基因的碱基序列的图(图13A的续图)。

图13C为表示本发明的酶基因的碱基序列的图(图13B的续图)。

图14为表示使用本发明的酶的重组大肠杆菌的、用于表达的质粒的结构的图。

图15为表示与蛋白伴侣共表达引起的本发明的酶的表达(可溶性馏分)的图。

具体实施方式

本发明的酶可以从在土壤中生息的短杆菌属微生物中分离。短杆菌属微生物的分离可以通过公知的方法进行。作为短杆菌属微生物，可以举出短杆菌sp.KU1309，短杆菌sp.KU1309在2006年8月29日(保藏编号：FERM P-21008)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、特许生物保藏中心(日本国、茨城县茨城市东1丁目1番地1中央第6)。

短杆菌sp.KU1309的菌学性质如下所示。

(a)形态

(1)细胞的大小：0.8×1.0～1.5μm(24h)、0.8×0.8～1.0μm(72h)的杆菌。有杆球菌周期(Rod-coccus cycle)。

(2)革兰氏染色性：阳性。

(3)有无孢子：无。

(4)运动性：无。

(5)菌落形态(培养基：Nutrient Agar，培养时间：24小时)：

圆形，整个边缘光滑，低凸状，有光泽，黄色。

(6)生育温度：37℃为+、45℃为-。

(7)过氧化氢酶：阳性。

(8)氧化酶：阴性。

(9)产生酸/气体(葡萄糖)：-/-。

(10)O/F试验(葡萄糖)：-/-。

另外，序列号1表示16S rDNA碱基序列。

根据上述的菌学性质，鉴定了本发明的短杆菌sp.KU1309是新种微生物。

本发明的酶通过上述微生物培养物可以作为具有高的酒精氧化活性的NADH氧化酶而精制。微生物的培养可以通过公知的方法而进行。例如，可以使用含有普通肉汤20g(极东制药工业)、酵母提取物5g(极东制药工业)的培养基进行培养。培养上述微生物1～2天，破坏菌体，从菌体提取液可以精制本发明的酶。本发明酶的精制也可以通过公知的方法进行。例如，使用超声波破坏、使用玻璃珠的机械破坏、弗式压碎器、表面活性剂、溶菌酶等，将菌体破坏，得到提取液，可进一步对提取液通过硫酸胺或十水硫酸钠等的盐析法、氯化镁或氯化钙等金属凝集法、精蛋白或乙烯亚胺聚合物等的凝集法、热处理、离子交换色谱法等进行精制。例如可以使用Butyl toyopearl色谱柱(东丽)来进行。

本发明的酶的酶活性可以通过利用吸光光度计测量NADH被氧化成NAD⁺时所减少的340nm的吸光度进行测定。以每一分钟氧化1μ摩尔NADH的酶的量为1个单位(U)。

本发明的酶有时也称作NOX。

本发明的NADH氧化酶具有以下性质。

(1)本发明的酶通过下述反应式以氧气作为受体催化NADH的氧化反应，生成NAD⁺与过氧化氢

NADH+H⁺+O₂→NAD⁺+H₂O₂；

(2)本发明的酶的最佳pH为8～10附近，适合用于与氧化还原酶一起进行酒精的氧化反应；

(3)本发明的酶的温度稳定性优异，在70℃热处理1小时也不会失去活性，且还具有80％以上、优选为90％以上、进一步几乎100％的残存活性。该性质在物质生产工序中是理想的；

(4)本发明的酶的最佳温度为50～70℃，优选为约60℃；

(5)本发明的酶由铵盐而被活化。将反应体系保持为弱碱性时如果使用氨水，则酶也被活化，因而是理想的；

(6)本发明的酶被Zn²⁺(39％)、Cu²⁺(42％)、Ag⁺(37％)等弱酸抑制；

(7)本发明的酶对NADPH的氧化活性小，且不能认定由FAD或FMN所导致的活化。本酶的不能氧化NADPH的特性存在可以选择性测定NADH与NADPH混存的生物材料中的NADH量的优点；

(8)本发明的酶的Km为0.1mM以下、优选为约0.02mM例如0.022mM；

(9)使用本发明的酶氧化1mol的NADH时，生成1mol的过氧化氢；以及

(10)本发明的酶形成同型二聚体，亚基的分子量通过SDS-PAGE进行测定时为50kDa～60kDa、优选为约57kDa。通过凝胶过滤所推测的同型二聚体分子量为约102kDa。另外，从氨基酸序列所推定的亚基的分子量为约49kDa。

对本发明的酶进行编码的DNA的碱基序列示于图3及序列号17。另外，本发明的酶的氨基酸序列示于图3及序列号18。

本发明的酶，只要由其氨基酸序列所形成的蛋白质具有NADH氧化酶的酶活性，则对于该氨基酸序列而言，在至少1个、优选为1个或多个氨基酸上可发生缺失、置换、添加等变异。

例如，由序列号18所表示的氨基酸序列的至少1个，优选为1个或多个(例如1～10个、较优选为1～5个)氨基酸可以发生缺失，或者由序列号18所表示的氨基酸序列中的至少1个、优选为1个或多个(例如1～10个、较优选为1～5个)的氨基酸可以发生添加，或者由序列号18所表示的氨基酸序列中的至少1个、优选为1个或多个(例如1～10个、较优选为1～5个)的氨基酸可以置换成其它的氨基酸。

作为在上述的序列号18的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、置换或添加的氨基酸序列，可以举出使用序列号18的氨基酸序列与BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information(美国国立生物学信息中心的基本局部序列检索工具))等(例如默认或初始化参数)进行计算时，具有至少为85％以上、优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为97％以上的同源性的氨基酸序列。

在上述的序列号18的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸发生缺失、置换或添加的氨基酸序列的蛋白质与具有序列号18的氨基酸序列的蛋白质在实质上是相同的。

另外，作为由序列号17所示碱基序列形成的DNA与由互补序列形成的DNA在下述严格的条件下可发生杂交的DNA、对具有NADH氧化酶活性的蛋白质进行编码的DNA也包含在本发明的DNA内。即指的是使用固定有DNA的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl的存在下在68℃进行杂交后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC是指包含150mM NaCl、15mM柠檬酸纳)，通过在68℃进行洗涤而能够鉴定的条件。或者通过瑟慎印迹(southern blotting)杂交法将DNA转录、固定至硝化纤维素膜上后，在杂交缓冲液〔50％甲酰胺，4×SSC，50mMHEPES(pH7.0)，10×邓哈特溶液(Denhardt’s)溶液、100μg/ml三文鱼精子DNA〕中在42℃下反应一夜，由此而能够形成杂交的DNA。

进一步，相对于上述DNA的RNA、或能够与该RNA在严格的条件下发生杂交的且对具有NADH氧化酶活性的蛋白质进行编码的RNA也包括在本发明中。

本发明的重组载体可以通过在适当的载体上连接(插入)本发明的DNA而得到。用于插入本发明的DNA的载体，只要是在细菌、酵母或动物细胞等宿主细胞中能够复制的载体即可，没有特殊的限制，例如，可以举出质粒DNA、噬菌体DNA等。用于构建表达载体的载体DNA可以使用广泛普及的容易获得的物质。例如可举出pET载体、pQE载体、pCold载体、pUC19载体等。

本发明的表达载体构建方法可以没有特别限制地通过常规方法进行。

由本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞只要能够表达本发明的DNA即可，没有特殊的限制，例如作为细菌可以举出大肠杆菌、枯草菌等，作为酵母可以举出酿酒酵母菌等，作为动物细胞可以举出中国仓鼠卵巣(CHO)细胞、猴COS细胞、小鼠纤维母细胞等。

本发明包含一种NADH氧化酶的制造方法，该方法包括将含有上述DNA的宿主细胞在DNA能够表达的条件下培养，以产生NADH氧化酶，进而回收该NADH氧化酶。

在大肠杆菌上大量表达本发明的酶的情况下，不能良好地进行蛋白质的折叠，易于作为包涵体产生于不溶性馏分中。在此，优选在大肠杆菌中使其与蛋白伴侣质粒共表达，促进蛋白伴侣所导致的可溶化。作为蛋白伴侣质粒可以举出pGro7、pKJE7、pTf16等。

由宿主细胞所产生的NADH氧化酶例如可以单独或组合使用凝胶过滤色谱、超滤、离子交换色谱、亲和层析、疏水层析、等电点电泳法、凝胶电泳法等公知的精制法而精制。

本发明的酶可以将氧化反应中所必需的还原型辅酶(NADH)再生为氧化型辅酶(NAD⁺)。通过将本发明的酶与其他的氧化还原酶相组合，能够氧化各种酒精。另外，例如通过与扁桃酸脱氢酶或L-苯丙氨酸脱氢酶相组合进行偶联反应，可以制造光学活性(S)-扁桃酸或光学活性D-苯丙氨酸。另外，本发明的酶与H₂O₂定量法相组合，可以用于与NADH参与的各种脱氢酶的活性测定以及以NAD为辅酶的各种脱氢酶的底物量的测定。另外，还期待将其用于生物燃料电池或酶诊断试剂。

通过下述实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不限于下述实施例。

实施例1 酶的精制

(1)细胞的培养

从土壤分离短杆菌属微生物短杆菌sp.KU1309，通过以下的方法进行培养。分离的短杆菌sp.KU1309于2006年8月29日保藏(保藏编号：FERM P-21008)于独立行政法人产业技术综合研究所、特许生物保藏中心(日本国茨城县茨城市东1丁目1番地1中央第6)。

培养基使用下述物质，即将每升溶解有普通肉汤20g(极东制药工业)、酵母提取物5g(极东制药工业)的物质用2M氢氧化钠调节至pH7.0，继而在120℃加热灭菌20分钟。

向装有培养基10ml的试验管中，通过白金勺接种固体培养基上的短杆菌，在30℃下振荡培养24小时。将1ml该细胞悬浊液加入装有100ml培养基的500ml振荡瓶中，在30℃下进行24小时的振荡培养，通过离心分离回收细胞。将所得到的细胞通过磷酸缓冲液进行洗涤，再次通过离心分离回收细胞。上述物质在-20℃下可以相当长期地保存。

(2)酶精制

无细胞提取液的调制

将湿润的细胞(20g)悬浮于100mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)5mM 2-巯基乙醇，由戴诺磨(Willy A.Bachofen Co.)进行破坏。对该混合物进行离心分离，回收上清，以此作为无细胞提取液。

(3)酶活性的测定

酶活性通过以吸光光度计测定NADH被氧化为NAD⁺时所减少的340nm的吸光度进行评价。反应为向0.1mM NADH、100mM Tris-盐酸(pH8.8)、500mM硫酸铵中加入酶溶液而进行。将每分钟氧化1μ摩尔NADH的酶的量定义为1单位。

(4)硫酸铵分馏

在0℃下搅拌无细胞提取液的同时，用15分钟的时间逐渐加入硫酸铵至35％饱和浓度。此后进一步搅拌1小时。通过离心分离除去沉淀，在上清中用15分钟的时间逐渐加入硫酸铵至65％饱和浓度。从加入结束开始至搅拌1小时后，通过离心分离回收沉淀。将该沉淀溶解在含有10mM磷酸缓冲溶液、5mM的2-巯基乙醇、30％饱和硫酸铵的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)中。

(5)层析

将试料置于用含有5mM 2-巯基乙醇、30％饱和硫酸铵的10mM磷酸缓冲溶液(＝缓冲溶液A)进行过平衡的Phenyl toyopearl色谱柱(东丽、色谱柱体积150ml)上。使用Econo梯度泵(Bio Rad)进行层析(流速1.5ml/min)。在用450ml的缓冲溶液A洗涤后，通过450ml的缓冲溶液A与450ml的含有5mM的2-巯基乙醇、20％饱和硫酸铵的10mM磷酸缓冲溶液B(pH7.0)的硫酸胺线性梯度使蛋白质析出。研究各馏分的酶活性，收集活性馏分并于10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)进行透析。将该馏分池置于用含有5mM的2-巯基乙醇、200mM NaCl的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)(缓冲溶液C)进行过平衡化的DEAE toyopearl色谱柱(东丽、色谱柱体积50ml)上。用150ml的缓冲溶液C洗涤后，通过150ml的缓冲溶液C与150ml的含有5mM的2-巯基乙醇、300mM NaCl的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)(缓冲溶液D)所产生的NaCl线性梯度使蛋白质析出(流速1ml/min)。从其中回收具有活性的馏分，加入硫酸铵直至达到30％饱和。将该溶液置于用含有5mM的2-巯基乙醇、30％饱和硫酸铵的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)(＝缓冲溶液E)进行过平衡化的Butyl toyopearl色谱柱(东丽、色谱柱体积10ml)中。用30ml的缓冲溶液E洗涤后，通过30ml的缓冲溶液E与30ml的含有5mM的2-巯基乙醇、300mM NaCl的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)(缓冲溶液F)的硫酸铵线性梯度使蛋白质析出(流速1ml/min)。回收活性的馏分，于10mM的磷酸缓冲溶液(pH7.0)进行透析。由Butyl toyopearl色谱柱得到的各馏分的酶活性示于图1B。如图lA所示确认了单一的峰。进一步，在精制后进行SDS-PAGE。由CBB染色时在50kDa附近(56.8kDa)能够确认均匀的谱带(图lA)。另外作为凝胶过滤色谱法的结果，在非变性状态下的分子量为102kDa，由此可知该酶作为二聚体而存在。另外，从所精制的酶的溶液为黄色透明推测该酶为黄素酶。

将精制过程中的酶活性、收率归纳于下述表1。

表1

精制过程中的酶活性、收率

实施例2 从短杆菌sp.分离的NADH氧化酶的酶特性

(1)pH依赖性

在pH5.5～11.5范围内测定氧化反应的最佳pH。缓冲溶液采用适合于该pH范围的缓冲溶液，即MES(pH5.5～6.5)、MOPS(pH6.5～7.4)、HEPES(pH7.0～8.0)、Tris(pH7.5～8.8)、甘氨酸(pH8.8～10.4)、CAPS(pH9.4～10.8)、磷酸钠(pH10.54～11.52)。各pH下的相对反应速度归纳于图2中。

可知，该酶在碱性侧(pH8.5～10)具有最佳pH。

(2)pH稳定性

将酶在pH4.5～11.5的各pH下70℃下培育1小时，测定此后的残存活性。缓冲溶液采用柠檬酸(pH4.7)、MES(pH5.5、6.3)、MOPS(pH6.6、7.4)、Tris(pH7.4、8.5)、TAPS(pH8.4、9.2)、CAPS(pH9.4、10.2)、磷酸钠(pH10.5、11.5)。

以70℃下未进行加热的状态为100％，对残存活性作图，结果如图3所示。

如图所示在pH6～10的较宽pH范围内稳定。

(3)热稳定性

研究在MOPS缓冲溶液(pH6.6)中对热的稳定性。在各温度下培育1小时，在室温下测定其后的活性。其结果示于图4的曲线(◆)。另外，测定各温度(30℃～70℃)下的酶活性，示于图4的曲线(□)。

如图所示，对于70℃、培育1小时几乎100％稳定。

(4)盐的效果

加入各种盐进行反应，测定340nm的吸光度以决定反应速度。在图5A中给出各种盐对于酶活性的效果。由此可知，加入铵盐时酶活性提高。对此，研究了铵盐浓度对酶活性的影响。方法是在存在0M～4.35M的各浓度的硫酸铵下进行反应，算出反应速度的相对值。图5B中示出铵盐对于酶活性的效果。

如图所示，对于活性而言铵盐是必要的，活性变得最大时的铵盐浓度([NH₄ ⁺])为3.0M。

(5)抑制试验

将酶溶液加入100mM Tris-HCl(pH8.8)中，加入抑制剂直至其最终浓度为1mM，进行3分钟的培育。此后，加入NADH使其浓度为10μM、加入(NH₄)₂SO₄使其浓度为500mM，通过测定340nm的吸光度，决定反应速度。

图6中给出相对活性值。如图6所示，被Zn²⁺(39％)、Cu²⁺(42％)、Ag⁺(37％)等弱酸抑制。

(6)动力学分析

动力学分析是NADH浓度在10μM至100μM之间测定反应速度，由其值通过双倒数作图法(赖氏方程，Lineweaver-Burk)作图。反应如下进行。将反应液{NOX；0.28ug/ml、NADH；10μM-100μM、(NH₄)₂SO₄；500mM、Tris-HCl；100mM(pH8.8)}放入吸光光度计用池内，通过测定340nm的吸光度决定反应速度。

图7中给出了双倒数作图法的结果。

表2中给出相对于NADH的动力学特性。

表2相对于NADH的动力学特性

*以分子量为101.68kDa进行计算。

表3中给出底物及辅因子所产生的活性。

表3

本发明的酶的Km为0.022mM，非常小。另外，对NADPH的氧化活性较小。进一步，未能发现由FAD或FMN所导致的活化。

(7)酶导致的氧分子的还原状态

NOX被分为H₂O副产品型与H₂O₂副产品型。利用图8A所示的分析法确认H₂O₂的生成并进行定量。

首先，使用已知浓度的过氧化氢与邻联茴香胺、过氧化物酶进行反应，制得[H₂O₂]vs Abs460的标准曲线。由此得到的图形用图8B的(◆)表示。接着，实际上进行利用NOX的NADH氧化反应，测定反应后生成的过氧化氢的浓度。即，在NADH浓度75μM、100μM、150μM下进行利用NOX的氧化反应，以充分的反应时间结束反应。通过吸光光度计确认反应结束。将50μl该反应液加入含有邻联茴香胺、过氧化物酶的100mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)中，测定吸光度。由此得到的图形用图8B的(□)表示。从最左边开始分别为NADH浓度为75、100及150μM时的Abs460。由此可知，其与[H₂O₂]浓度为相同的值。

由此可以确认H₂O₂的生成。另外可知，氧化1mol的NADH则生成1mol的过氧化氢。

实施例3 NADH氧化酶的利用例

(i)通过与扁桃酸脱氢酶同时使用来调制光学活性扁桃酸

通过将来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)IAM 10071的扁桃酸脱氢酶(Tamura，Y.，et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：957-957)与来自短杆菌sp.的NADH氧化酶组合，进行扁桃酸的氧化。

扁桃酸脱氢酶经简单精制后使用。方法如下所示。

向装有10ml的MRS培养基的试管中利用白金勺接种来自固体培养基的粪肠球菌IAM 10071，此后在30℃下振荡培育24小时。将该培养液全部移入装有1.2升MRS培养基的5升三角瓶(带有挡板)中，在30℃下旋转培养48小时。通过离心分离从培养液回收细胞，得到9.2g湿润细胞。将其悬浮于100mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)、5mM的2-巯基乙醇中，通过研磨机将细胞破坏。通过离心分离除去未破坏的菌体，得到无细胞提取液。关于扁桃酸脱氢酶的酶活性，通过吸光光度计测定伴随着扁桃酸的氧化而生成的NADH在340nm的吸光度。将酶溶液加入到50mM外消旋形式扁桃酸、1mM NAD+、100m M的Tris-盐酸(pH8.8)中进行反应。利用离心分离对通过25％～60％饱和硫酸铵沉淀的蛋白质进行回收，溶解于10mM的Tris-盐酸缓冲溶液(pH7.5)中，以该缓冲液进行透析。将该酶溶液置于通过含有5mM的2-巯基乙醇、100mM NaCl的10mM的Tris-盐酸(pH7.5)进行了平衡化的DEAEtoyopearl色谱柱(色谱柱体积50ml、流速1ml/min)。在用平衡化后的缓冲溶液进行洗涤后，使用150ml的平衡化的缓冲溶液与150ml的含有5mM 2-巯基乙醇、200mM NaCl的10mM Tris-盐酸(pH7.5)，通过线性梯度使蛋白质析出。从该馏分中收集活性部分，通过Amicon Ultra(MILLIPORE)进行浓缩得到扁桃酸脱氢酶的部分精制酶。

同时使用扁桃酸脱氢酶与NADH氧化酶的反应以下述组成来进行。将2mM外消旋形式扁桃酸、0.1mM NAD+、250mM硫酸铵、100mMTris-HCl(pH 8.8)、NADH氧化酶0.1U/ml、扁桃酸脱氢酶0.1U/ml的混合物在30℃下进行培育，通过HPLC研究体系中的扁桃酸的光学纯度。[HPLC条件：CHIRALCEL OD-H(DAICEL化学工业)，展开相：正己烷/异丙醇＝19/1和0.2％三氟乙酸，流速：0.5ml/min，检测UV：254nm，保持时间：(S)-扁桃酸22.14min，(R)-扁桃酸27.23min]。

本发明的酶与扁桃酸脱氢酶的偶联反应的反应机理示于图9A。

其结果，48小时后R型的扁桃酸被全部氧化，得到光学活性(S)-扁桃酸。

(ii)通过同时使用L-苯丙氨酸脱氢酶来调制D-苯丙氨酸

L-苯丙氨酸脱氢酶使用从和光纯药购入者。

反应以下述组成来进行。将2.5mM DL苯丙氨酸、0.1mM NAD+、10mM硫酸铵、100mM CAPS(pH 10.2)、NADH氧化酶0.2U/ml、L-苯丙氨酸脱氢酶0.2U/ml的混合物在30℃下进行培育，通过HPLC研究体系中的苯丙氨酸的光学纯度。[HPLC条件：Crownpak CR(+)，展开相：5.7％高氯酸，流速：0.5ml/min，检测UV：200nm，保持时间：D-苯丙氨酸18.5min、L-苯丙氨酸25.1min]。

本发明的酶与L-苯丙氨酸脱氢酶的偶联反应的反应机理示于图9B。

其结果，48小时后L型的苯丙氨酸被全部氧化，得到光学活性D-苯丙氨酸。

如上所述，由于来自短杆菌sp.的NADH氧化酶具有广范围的pH适应性(特别是弱碱一侧)与高的稳定性，因此通用性非常高。

实施例4 酶基因的克隆

分离的酶基因的克隆通过在解析N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列后，利用使用兼并引物的PCR获得片断而由反向PCR进行整个基因序列的克隆。以下进行详细说明。

N末端氨基酸序列

对利用实施例1中所记载的方法进行了精制的酶进行SDS-PAGE。使用半干印迹仪从丙烯酰胺凝胶转印在PVDF膜上。对该膜进行CBB染色，对目标谱带通过蛋白质定序进行分析，结果可知该酶的N末端为XDELTYDLVVLGGGTGG(序列号2)。

内部氨基酸序列

对利用实施例1中所记载的方法进行了精制的酶进行SDS-PAGE。在SDS-PAGE后进行CBB染色并切取目标谱带，进行凝胶内消化。最初尝试了利用赖氨酰内肽酶的消化，但难以分解为肽片断，在HPLC中观察到被认为是未被剪切的片断的峰。于是，使用胰蛋白酶进行消化。由于胰蛋白酶是将赖氨酸与精氨酸的C末端剪切的酶，相比较于使用赖氨酰内肽酶的情况，期望能够消化为微小的片断。其结果成功地实现了片断化，通过蛋白质定序进行分析可知其为GPVTEGFGFEEQGIPMDR(序列号3)。

兼并PCR

以所得到的N末端及内部序列为基础如下所述设计兼并的正义引物(F01，F02)和反义引物(R01，R02)。

对应于DELTYDLVVL(序列号4)的NOX兼并引物F01

5’-GAYGARYTIACITAYGAYYTIGTIGTNYT-3’(序列号5)

对应于VLGGGTGGY(序列号6)的NOX兼并引物F02

5’-AARYTIGGNGGIGGNACIGGIGGNTA-3’(序列号7)

对应于PVTEGFGFE(序列号8)的NOX兼并引物R01

5’-TCRAANCCRAAICCYTCIGTNACNGG-3’(序列号9)

对应于TEGFGFEEQ(序列号10)的NOX兼并引物R02

5’-TCCATIGGDATNCCYTGYTCYTCRAA-3’(序列号11)

反应通过表4所示的组成及方法将引物与(F01×R01)、(F01×R02)、(F02×R01)、(F02×R02)组合而进行。最初以基因组DNA为模板进行了尝试但扩增不稳定，回收量少。因而，使用EcoR I消化物、PstI消化物进行反应时，在利用EcoR I消化物进行反应的结果如图10的泳道5所示，能够得到800b.p.左右的DNA片断。此时，使用肌苷以防止兼并度增加过大。图10中泳道1～4为在模板中使用PstI消化物时的结果，从泳道5开始为在模板中使用EcoR I消化物时的结果。关于引物的组合，泳道1及5为F01×R01、泳道2及6为F01×R02、泳道3及7为F02×R01、泳道4及8为F02×R02。

表4

对得到的DNA片断进行精制并连接于pGEM(注册商标)T-easy载体(16℃，30min)。转化XL10-Gold(Z感受态单元)并被涂布于含有氨苄西林的LB琼脂培养基。通过Colony direct PCR进行嵌段的确认，从阳性克隆中提出质粒(pGEMNOXin)。对所得到的质粒使用M13引物进行序列解析，从而鉴定825b.p.的内部基因序列。

瑟慎印迹杂交(southern hybridization)

使用所得到的基因片断进行瑟慎印迹杂交。利用NotI从pGEMNOXin剪切酶的内部序列，精制后将其作为探针进行基因组瑟慎印迹杂交。在55℃下振荡整夜进行杂交。另外，最初的洗涤也在55℃下进行。其结果示于图11。图11(a)给出利用UV的基因组消化物的检测结果，图11(b)给出利用酶发酵检测到的结果。所使用的试样为泳道1～6下的各Sal I消化物、Sac I消化物、Hinc II消化物、Xho I消化物、Bgl I消化物、Sma I消化物，M为标记。在Sal I消化物中检测到约3000b.p.左右的片断。

反向PCR

通过琼脂凝胶分离基因组DNA的Sal I消化物，切取2.0kb.p.3.4kb.p.的部分进行精制，溶解于TE，获得DNA片断溶液(20ng/μL)。向20μL该溶液中加入80μL水和100μL的TOYOBO社制2×Ligation high，在16℃下放置整夜。精制该溶液制并制成50μL的TE溶液，用于反向PCR。在反向PCR中采用下述引物的组合。

NOX反向引物F01：

5’-ACGGTGCAGGCAGGTGCCTCCCACCTTGTC-3’(序列号12)

NOX反向引物F02：

5’-GCGTTCGATCAAAGCGACCTTCATGTCGAG-3’(序列号13)

NOX反向引物R01：

5’-GGCGTCATGTTCAAGGGCGTCGAAGAGACG-3’(序列号14)

NOX反向引物R02：

5’-GCCGACGGGGTCAAGGTCACTCTCGAAGAC-3’(序列号15)

反应以表5所示的组成及方法进行。

表5

将结果示于图12。如图12所示，由此通过引物(F02×R02)的组合得到2.6kb.p.左右的DNA片断。通过琼脂糖凝胶电泳切取该片断进行精制。对该PCR产物采用NOX inverse primer F02，NOX inverse primer R02进行序列解析，对N末端的兼并部分与直至1300b.p.的基因序列进行了解析。为了对直至C末端进行解析，采用下述引物对nox的整个基因进行鉴定。

NOX序列2；5’-TCCGTCGGACTCTCCTCTGCACAG-3’(序列号16)

关于该片段通过序列解析，取得对所精制的酶进行编码的整个碱基序列。由基因序列解析可知该酶为由氨基酸462残基所形成的48909.99Dalton的酶。配列解析的结果示于图13A～C。另外，碱基序列示于序列号17、氨基酸序列示于序列号18。

实施例5构建利用源于短杆菌sp.KU1309的NADH氧化酶的重组大肠杆菌的大量表达体系。

利用大肠杆菌对本发明酶的大量表达进行了研究。

基因的调制

以短杆菌sp.KU1309基因组为模板，如下所示设计引物。将N末端的缬氨酸(GTG)变换为蛋氨酸(ATG)进行了设计。

NOXForNde01：

5’-GGAATTCCATATGAGTGACGAATTGACCTACGACCTT -3’(序列号19)

(下划线部分表示Nde I位置)

NOXRevEco01：

5’-GGAATTCTTATGAGTGGAAGTGCAGGGGTTTGCC-3’(序列号20)

(下划线部分表示EcoR I，斜体部分表示终止密码子)

以该引物与KU1309的基因组DNA(SalI)消化物为模板通过表6所示的组成以及方法进行PCR。

表6

构建载体

使用所得的基因(nox基因)，制作组入pET21-b(+)和pCold III的质粒pET21BNOX和pCBNOX。插入pET21BNOX，以使得在T7启动子的控制下表达野生型BNOX。插入pCBNOX，以使得在冷休克启动子控制下表达TEE融合型BNOX(图14)。

研究表达

使用所构建的质粒载体，对于各种宿主进行表达研究。通过下述进行表达，即在37℃下培养后，添加IPTG后诱导数小时。将所得到的菌体通过超声波破坏，测定其上清中的NADH氧化活性。由于即使在未添加IPTG的情况下大肠杆菌自身也具有NOX活性，所以对与未添加IPTG时相比存在显著性差异的体系进行研究。其结果示于表7。

表7

*由添加与不添加IPTG时的差异计算。

如表7所示，虽然在一部分宿主中大量表达，但几乎都形成了包涵体。因此，为了解决该问题，使用导入了蛋白伴侣质粒的大肠杆菌以尝试表达。大肠杆菌根据之前研究的结果，使用作为可溶性活性酶而表达的BL21(DE3)。其结果示于表8。另外，SDS-PAGE的结果示于图15。在图15中，泳道1表示与pGro7的表达(有诱导)、泳道2表示与pGro7的表达(无诱导)、泳道3表示与pKJE7的表达(有诱导)、泳道4表示与pKJE7的表达(无诱导)。

表8

如表8所示，在使用pGro7或pKJE7的情况下可以发现活性提高。另外，如图15所示，在可溶性部分中成功实现了能由肉眼观察的程度的表达。

产业实用性

本发明的NADH氧化酶的pH稳定性及热稳定性优异，作为必不可缺的辅酶再生性酶非常有用，能够实现高效的反应步骤。

本说明书中所引用的所有出版物、专利以及专利申请直接作为参考，引入本说明书中。