CN101974498A - 一种乙酰胆碱酯酶的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰胆碱酯酶的提取方法，本发明以家蚕为酶源，其工艺步骤包括从酶源中提取乙酰胆碱酯酶粗提液，以及用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶和用透析法脱硫酸铵，再将酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。本发明所提供的乙酰胆碱酯酶的提取方法，其家蚕原料来源广泛，制备工艺简单稳定，生产成本较低。用本发明方法所制备的乙酰胆碱酯酶产品，产品纯度高，用于对残留农药的检测，具有较高灵敏度，经测定检出极限为95～100μg／mL，且经本发明纯化后的乙酰胆碱酯酶灵敏度比酶粗提液提高4倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶的提取方法及其应用，更具体地说是涉及一种用于果蔬农药残留量测定的乙酰胆碱酯酶的提取方法。
背景技术
有机磷和氨基甲酸酯类农药因具有高效和低残留的优点而被广泛应用于果蔬生产中，但果蔬中农药残留可引起人急性中毒死亡，微量积累又会造成慢性中毒如致癌、致畸、致突变等，严重危害人们的身体健康。目前检测农药普遍采用的有色谱法、波谱法和酶抑制法等。色谱法检测准确，但成本高，检测时间长，需要具备一定技术水平的专业人员才能进行操作，只适合在实验室进行；波谱法干扰因素多，灵敏度不高，易出现假阴性结果，一般只能作为鉴别方法粗选；酶抑制法具有操作简便，速度快，适合现场检测和大批样品筛选检测的特点，且不需昂贵的仪器，因此作为一种检测农药的常用方法得到广泛应用。但目前广泛使用的快速测定产品--农药速测试纸，其主要原料乙酰胆碱酯酶依由于制备过程中产品原料和制备工艺复杂的原因，价格昂贵，使对果蔬中农药残留的快速测定产品难以普及应用。
发明内容
本发明的目的是提出一种能用于果蔬中农药残留量快速测定的，工艺简单且生产成本低廉的乙酰胆碱酯酶提取方法。
本发明的技术方案
本发明为一种从家蚕头部中提取乙酰胆碱酯酶的方法，包括以下工艺步骤：
(1)、将家蚕饥饿18-24h后，洗净并吸干表面水分，以1：5的比例剪取家蚕头部于pH7.5～8.0磷酸缓冲液中，冰浴匀浆，匀浆液于4℃、5000-15000 r.p.m离心，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；
(2)、用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶
a、在冰浴中边缓慢搅拌乙酰胆碱酯酶粗提液，边加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在30-80％的范围内；
b、上述所得溶液于0～4℃、5000～15000 r.p.m冷冻离心，保留沉淀；
c、再加入pH7.5-8.0的磷酸缓冲液小心溶解沉淀，并用pH 7.5-8.0磷酸缓冲液稀释2-10倍；
(3)、用透析法脱硫酸铵
将步骤（2）经过硫酸铵沉淀纯化后的乙酰胆碱酯酶的酶液装入透析袋中，用其体积20-30倍的蒸馏水透析，直至透析液不产生沉淀为止；
(4)、将步骤（3）所得的酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。。
本发明用于提取乙酰胆碱酯酶的原料采用四龄家蚕或五龄家蚕。
所述方法中的步骤(2)步，即用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶的工艺，经试验表明，使酶液中硫酸铵的饱和度在40-60％的范围内的效果较好。
所述方法中的步骤(4)，可采用真空冷冻干燥机，在0-4℃条件下浓缩酶液至固体。也可采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，于0-4℃下浓缩酶液。
本发明的有益效果
本发明所提供的提取乙酰胆碱酯酶的方法，其原料来源广泛，制备简单稳定，生产成本较低。用本发明方法所制备的乙酰胆碱酯酶产品，产品纯度高，用于对残留农药的检测，具有较高灵敏度，经测定检出极限为95～100μg／mL，且经本发明纯化后的乙酰胆碱酯酶灵敏度比酶粗提液提高4倍以上。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
乙酰胆碱酯酶的活性测定方法：乙酸-β-萘酯显色法；
即在含有1mL，16mmol/mL底物（乙酸-β-萘酯的丙酮溶液)的试管中，加入经硫酸铵沉淀纯化后的酶液5mL，再加入500、250、100、50μg/mL的甲胺膦溶液1mL，对照加1mL pH7.5磷酸缓冲液，混合均匀，在30℃恒温水浴中保温反应5分钟后，加入显色剂0．5ml (0.8％ 固兰B的3.6％SDS)溶液混合均匀，使其反应5分钟，观察颜色变化，呈红色为完全不被甲胺膦抑制，退色为部分抑制，呈无色为完全被抑制。
实施例1
采用四龄家蚕提取乙酰胆碱酯酶的方法步骤如下：
(1)、将家蚕饥饿24h后，洗净并吸干表面水分，以1：5的比例剪取家蚕头部于pH7.5磷酸缓冲液中，冰浴匀浆，匀浆液于4℃、6000 r.p.m离心30 分钟，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；
(2)、用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶
a、取在乙酰胆碱酯酶粗提液10mL，冰浴中边缓慢搅拌乙酰胆碱酯酶粗提液，边加入硫酸铵3.26克（根据硫酸铵饱和度用量表）；
b、上述所得溶液于0℃、10000 r.p.m冷冻离心10min，弃上清液，得到硫酸铵饱和度为55%的沉淀；
c、加入pH7.5的磷酸缓冲液1mL小心溶解沉淀，并用pH 7.5磷酸缓冲液稀释4倍；
(3)、用透析法脱硫酸铵：将上步经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积25倍的蒸馏水透析24h，期间换水4次，直至用BaCl2检测透析液不产生沉淀为止；
(4)、浓缩乙酰胆碱酯酶：用真空冷冻干燥机，在4℃条件下浓缩酶液至固体，然后干燥即得纯化的乙酰胆碱酯酶产品。所得的乙酰胆碱酯酶产品密封后于低温下(0℃)保存。
按本实施例提取方法制备的纯化乙酰胆碱酯酶产品根据乙酸-β-萘酯显色法，其活性经测定为0.412。
对该乙酰胆碱酯酶的灵敏度测定，测定结果表明：由55％硫酸胺饱和度纯化的乙酰胆碱酯酶液的检出极限为100μg／mL。经纯化的的乙酰胆城酯酶灵敏度比酶粗提液提高4倍。
实施例2
采用五龄家蚕提取乙酰胆碱酯酶的工艺步骤如下：
(1)、将家蚕饥饿18h后，洗净并吸干表面水分，以1：5的比例剪取家蚕头部于pH7.8磷酸缓冲液中，冰浴匀浆，匀浆液于4℃、8000 r.p.m离心20 分钟，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液。
(2)、用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶
a、取在乙酰胆碱酯酶粗提液10mL，冰浴中边缓慢搅拌乙酰胆碱酯酶粗提液，边加入硫酸铵3.61克（根据硫酸铵饱和度用量表）；
b、上述所得溶液于0℃、11000 r.p.m冷冻离心10min，弃上清液，得到硫酸铵饱和度为60%的沉淀；
c、加入pH7.8的磷酸缓冲液1mL小心溶解沉淀，并用pH 7.8磷酸缓冲液稀释4倍；
(3)、用透析法脱硫酸铵：将上步经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积30倍的蒸馏水透析24h，期间换水5次，直至用BaCl2检测透析液不产生沉淀为止；
(4)、浓缩乙酰胆碱酯酶：采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，用量为5毫升/克(W/V)，于4℃下浓缩酶液，然后将浓缩液干燥即得纯化的乙酰胆碱酯酶产品。所得的乙酰胆碱酯酶产品密封后于低温下(0℃)保存。
按本实施例提取方法制备的纯化乙酰胆碱酯酶产品根据乙酸-β-萘酯显色法，其活性经测定为0.409。
对该乙酰胆碱酯酶的灵敏度测定，测定结果表明：由60％硫酸胺饱和度纯化的乙酰胆碱酯酶液的检出极限为95μg／mL。经纯化的的乙酰胆城酯酶灵敏度比酶粗提液提高3.8倍。
应用实施例1
果蔬产品：取市售空心菜；
根据国家标准粮食、水果和蔬菜中有机磷农药测定气相色谱法（GB/T 14553-2003），经Agilent 6890N 气相色谱仪检测该空心菜中甲胺磷含量达1.38mg/kg（检测条件：恒定流量3.0mL/min；进样口温度250℃ ；采用程序升温方式：100℃保持lmin，以1O℃/min升至180℃ ；检测器温度250℃ ；氢气和空气流量分别为75mL／min和lOOmL／min；进样量1.0μL；以保留时间定性，以峰面积定量）。
采用本发明的方法所得的乙酰胆碱酯酶进行酶法检测：
乙酰胆碱酯酶：采用实施例2所得的从五龄家蚕提取的乙酰胆碱酯酶。
用实施例2所得的从五龄家蚕提取的乙酰胆碱酯酶进行上述市售空心菜产品中甲胺磷含量的酶法检测，检测方法如下：
在含有1mL，16mmol/mL底物（乙酸-β-萘酯的丙酮溶液)的试管中，加入纯化后的酶液5mL，再加入500、250、100、50μg/mL的甲胺膦溶液1mL，对照加1mL pH7.5磷酸缓冲液，混合均匀，在30℃恒温水浴中保温反应5分钟后，加入显色剂0．5ml (0.8％ 固兰B的3.6％SDS)溶液混合均匀，使其反应5分钟，在595 nm处测其溶液吸光度，绘制标准曲线。将空心菜打浆后，过滤，滤液经稀释后，采用同样方法检测，对比标准曲线，最终测定该空心菜中的甲胺磷含量为1.45mg/kg,与气相色谱检测基本一致。
从上述的气相色谱检测法和本发明所得的乙酰胆碱酯酶进行酶法检测的方法所得的最终结果进行对比，结果表明用本发明所得的乙酰胆碱酯酶进行果蔬中农药残留量酶法检测，具有检测方法简单，检测灵敏度高，检测成本低，检测速度快等方面的优点。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)、将家蚕饥饿18-24h后，洗净并吸干表面水分，以1：5的比例剪取家蚕头部于pH7.5～8.0磷酸缓冲液中，冰浴匀浆，匀浆液于4℃、5000-15000r.p.m离心20～30min，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；
(2)、用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶
a、在冰浴中边缓慢搅拌乙酰胆碱酯酶粗提液，边加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在30-80％的范围内；
b、上述所得溶液于0～4℃、5000～15000r.p.m冷冻离心10min，保留沉淀；
c、再加入pH7.5-8.0的磷酸缓冲液小心溶解沉淀，并用pH7.5-8.0磷酸缓冲液稀释2-10倍；
(3)、用透析法脱硫酸铵
将步骤（2）经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积20-30倍的蒸馏水透析，直至透析液不产生沉淀为止；
(4)、将步骤（3）所得的酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于用于提取乙酰
胆碱酯酶的原料采用四龄家蚕或五龄家蚕。
3.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于：步骤（1）
中所述的匀浆液离心转速优选6000-8000r.p.m；步骤（2）中用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶，酶液中硫酸铵的饱和度优选40-60％，其中所用的磷酸缓冲液pH优选为7.5-7.8。
4.根据权利要求3所述的乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于：步骤（2）中用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶，酶液中硫酸铵的饱和度优选55-60％。
5.根据权利要求l所述的乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于步骤(4)中所
得的酶液浓缩、干燥，即采用真空冷冻干燥机，在0-4℃条件下浓缩酶液至固
体。
6.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于步骤(3)中所
述的采用透析法浓缩酶液，即将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，于4℃下浓缩酶液。
7.如权利要求1～6任一所述的乙酰胆碱酯酶的提取方法所得的乙酰胆碱酯酶可用于果蔬中农药残留量测定。
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| 《四川大学学报》 20080229 彭霞等 农药靶标乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究 1-7 第45卷, 第1期 2 * |
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