CN101970478A

CN101970478A - 调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物

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Publication number: CN101970478A
Application number: CN2008801197876A
Authority: CN
Inventors: 杰恩·丹斯卡; 约翰·E·迪克; 塔蒂亚娜·普拉索拉瓦; 竹中克人
Original assignee: University Health Network
Current assignee: University Health Network
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2011-02-09
Also published as: US20100239578A1; EP2207797A1; EP2388270A2; EP2207797A4; EP2388270A3; US20130189253A1; CN103242444A; JP2011500005A; CA2702217A1; AU2008310263A1; EP2573112A1; WO2009046541A1; AU2008310263B2

Abstract

本发明涉及调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物。在某些实施方式中，提供分离的SIRPα和CD47多肽、片段及融合蛋白，用于增强造血干细胞植入。此外，还提供通过给予上述多肽而增加造血干细胞植入的方法。

Description

调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物

技术领域

本发明涉及调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物。在某些实施方式中，提供分离的SIRPα和CD47多肽、片段及融合蛋白，用于增强造血干细胞植入。此外，还提供通过给予上述多肽而增加造血干细胞植入的方法

背景技术

从骨髓(BM)或G-CSF动员的外周血(PB)中移植人造血干细胞(HSC)已经成为干细胞生物中最重要的临床应用之一。在患肿瘤性疾病的个体内进行HSC移植使得可能应用高剂量化疗方案及随后的HSC复苏来克服由于化疗导致的造血失败，提高血液和非血液肿瘤的治愈率。此外，遗传疾病如地中海贫血和某些免疫缺陷可通过基因修正HSC的自体移植或通过同种异体HSC移植而治疗。一个使HSC移植成功的关键发现是将人白细胞抗原(HLA)系统确定为人主要组织相容性复合物。尽管供者与宿主之间的HLA不匹配在移植排斥中起主要作用，但移植失败甚至常常发生在接受未经处理但HLA一致的移植物的患者身上(Thomas，E.D.et al.(1997)Blood 49，511-33；Storb，R.et al.(1977)N Engl J Med 296，61-6)。该情形中，移植排斥部分与次要组织相容性抗原的不匹配相关(Gale，R.P.et al.(1981)Blood 57，9-12)。除HLA单倍体之外，尚未表征其他调节HSC移植的基因。

HSC定位于由成纤维细胞间质、成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞和内皮细胞构成的支持性微环境壁龛中(Suda，T.et al.(2005)Trends Immunol 26，426-33)。去除HSC与这种壁龛的相互作用，例如通过封闭特异性粘附蛋白或趋化因子受体，则阻止HSC植入(Lapidot，T.et al.(2005)Blood 106，1901-10)。此外，自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞，为免疫系统的两种固有组分，已证实可分别在鼠类HSC移植(Murphy，W.J.et al.(1987)J Exp Med 165，1212-7)和人造血干细胞异种移植(McKenzie，J.L.et al.(2005)Blood 106，1259-61)中发挥作用。对移植后造血干细胞植入机制的深入理解，包括控制调节性通路的基因，可最终转化成较好的临床结局。

非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷NOD.Prdck^sc/sc(NOD.SCID)小鼠中的异种移植已经成为人HSC移植的“金标准”试验。该检测基于人HSC在静脉内注射后再植这些动物的免疫系统的能力(Hematopoiesis-A Development Approach(ed.Zon，L.I.)99-118(Oxford University Press，New York，USA，2001)中的Wang，J.C.Y.et al.“Normal and leukemic human stem cells assayed inimmune-deficient mice”)。启动人异种移植的细胞可操作性定义为SCID小鼠再植细胞(SRC)，拥有属于HSC的属性，且不同于体外分析的较成熟的祖细胞。该系统已使在人HSC区室内进行增殖、分化和自我更新属性的分析成为可能。

信号调节蛋白(SIRP)包括细胞表面糖蛋白家族，其在骨髓(包括巨噬细胞、粒细胞、髓系树突状细胞和肥大细胞)和神经细胞(在Barclay，A.N.&Brown，M.H.，Nat Rev Immunol 6，457-64(2006)总结了；另参见WO 97/48723)上表达。SIRP构成一个种类多样的多基因免疫受体家族，涵盖抑制性(SIRPα)、激动性(SIRPβ)、非信号性(SIRPγ)和可溶性(SIRPδ)成员。CD47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，作为SIRPα的细胞配体发挥作用，结合SIRPα的胞外NH₂末端。关于SIRPα在宿主细胞被巨噬细胞所吞噬过程中的抑制性作用，已有清楚的记载。然而，较近期的研究结果还证实了通过SIRPα结合介导的其他正向信号传导作用(Shultz，L.D.et al.(1995)J Immunol 154，180-91)。

为了达到生物学效果，人们已提出多种途径来破坏CD47-SIRPα相互作用。这些途径涵盖采用片段型/截短型SIRPα和/或CD47蛋白以及针对二者的抗体(见例如国际专利申请公开号WO 99/40940；美国专利申请公开号2003/0026803和2006/0135749；以及美国专利号6,913,894)，用于改善免疫功能(见例如，国际专利申请公开案号WO 99/40940；以及美国专利申请公开案号2003/0026803和2007/0113297)，以及用于异种移植(见例如美国专利申请公开案号2005/0255550和2007/0157328)。

目前仍然需要鉴定能够支持HSC植入以及移植后造血作用的分子。

发明内容

根据一个方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；b)一种由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段组成的多肽，其中该片段包含SEQ ID NO：1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个；以及c)a)和b)中多肽的一种，其中，在该多肽全长中，每7个氨基酸中包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID NO：1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个且结合人CD47。

根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：a)一种由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽；b)一种由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段组成的多肽；以及c)a)和b)中多肽的其中一种，在该多肽全长中，每7个氨基酸中包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代；其中：i)该多肽中SEQ ID NO：2位点31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126处残基的至少一个被SEQ ID NO：1的对应残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者ii)该多肽中，SEQ ID NO：2的残基129和130中的至少一个缺失。

根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：a)由一种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4-13组成的组；b)由一种氨基酸序列的片段组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4-13组成的组；以及c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽的全长中，每7个氨基酸中有至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽结合人CD47。

根据另一方面，本发明提供一种能够结合人Sirpα的多肽以及针对人Sirpα的抗体。优选地，该多肽是融合于IgG的Fc部分的人CD47的胞外区。

根据另一方面，本发明提供一种药物组合物，包含本文所述多肽以及一种药用载体。

根据另一方面，本发明提供一种用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的方法，包括给予该哺乳动物治疗有效量的本文所述多肽。

根据另一方面，本发明提供一种应用本文所述多肽来增加哺乳动物体内造血干细胞植入或者制备用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的药物的用途。

根据另一方面，本发明提供一种本文所述多肽，用于增加哺乳动物体内的造血干细胞植入。

根据另一方面，本发明提供一种包含编码本文所述多肽的序列的分离核酸。

根据另一方面，本发明提供一种包含本文所述核酸的表达载体。

根据另一方面，本发明提供包含本文所述载体的培养细胞。

根据另一方面，本发明提供一种生成多肽的方法，包括在允许该多肽表达的条件下培养本文所述细胞。

根据另一方面，本发明提供一种用于增加人体内造血干细胞植入的方法，包括调节人Sirpα与人CD4之间的相互作用。

根据另一方面，本发明提供一种鉴定可增加人体内造血干细胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirpα胞外区和人CD47胞外区中至少一种与至少一种待测化合物相接触；b)确定所述至少一种待测化合物可结合于该人Sirpα和人CD47中的至少一种；c)使该待测化合物与间质环境中的人造血细胞相接触；以及d)确定在待测化合物存在的情况下，造血干细胞植入是否增加。

根据另一方面，本发明提供一种测定人体内影响造血干细胞植入的遗传多态性的方法，包括a)对来自多个进行造血细胞移植的患者的Sirpα基因进行测序；b)测定多个患者Sirpα基因中的核苷酸差异；以及c)将该核苷酸差异与造血干细胞植入进行关联，以确定相关多态性。

根据另一方面，本发明提供一种确定受体体内造血干细胞植入的可能性的方法，包括a)对来自受体的Sirpα基因进行测序；以及b)确定该相关多态性是否存在。

附图说明

在下列具体说明中，本发明优选实施方式的这些以及其他特征将变得更加明显，其中参照了下列附图，其中：

图1示出了NOD品系背景中，体内及体外的人造血支持。(a)用人BM(上图；细胞剂量：RAG-2敲除品系40x10⁶单核细胞，SCID和NOD/SCID小鼠20x10⁶个细胞)或CB(下图，每个受体15x10⁶个细胞)细胞移植后4周，从小鼠BM提取的DNA的DNA印迹分析。通过比较样品泳道与对照人/小鼠DNA混合物中2.7kb α卫星条带(箭头)的强度，来测定人细胞植入的水平。(b、c)人Lin-CB细胞在受照小鼠BM间质上的嵌合LTC中产生的CFC数量。如所指明的，照射后，将来自NOD、NOR、B6、ICR、C3H和BALB/c雄性小鼠的BM细胞培养5周，随后以1.1x105(b)或0.6-6.0x10⁵(c)个Lin-CB细胞进行接种。培养5周后，收集细胞并在标准的克隆原细胞的甲基纤维素试验中测定CFC总数。数据以3-6次独立实验的平均值示出。

图2示出了Idd13基因座的品系特异性差异对体外和体内人造血细胞移植的支持的影响。(a)人Lin^-CB细胞在来自NOD同类系(NOR.NOD-Idd4、NOR.NOD-Idd5 NOR.NOD-Idd9、NOR.NOD-Idd13、)NOR同类系(NOR.NOD-Idd13)和B6.NOD-Idd13小鼠的间质上的嵌合LTC中CFC的生成情况。如图1b中所述建立鼠BM间质层，并接种0.36-2.0x10⁵(c)个人Lin^-CB细胞。培养5周后，收集细胞，并通过在甲基纤维素试验中铺种来测定CFC的数量。在每一个实验中，NOD间质均用做阳性对照，B6和NOR细胞均用做阴性对照。将数据针对NOD培养中生成的CFC数量(＝100％)进行标准化，并以至少3次独立培养的均值而示出。BB、Idd13纯合性B6的BM间质；NN，Idd13基因纯合性NOD的BM间质。(b)用350cGy照射8-9周龄的NOD.SCID(n＝11)或NOD.NOR-Idd13.SCID(n＝8)，并静脉内注射0.37-1.5x10⁵个Lin^-CD34⁺细胞。移植后6-7周，处死小鼠并通过流式细胞检测评估受体BM中人CD45⁺细胞的植入情况。

图3示出的是鉴定Idd13中与支持人造血作用相关的关键区域。(a)图示了NOD和NOR背景上多种同类系品系中染色体2。候选间隔的基因定位用指向右侧染色体示意图的条纹线表示。同类系品系的正式命名如下：1.NOD.NOR-D2Jyh443-D2Mit452，2.NOR.NOD-D2Jyh443-D2Jyh1493，3.NOR.BN-D2Jyh443-D2Jyh1493，4.NOR.NOD-D1Ngu146-Ramp1/D2Jyh443-D2Jyh1192，5.NOD.NOR-D2Jyh443-D2Gu1482，6.NOD.NOR-D2Jyh443-D2Jyh3941，7.NOR.NOD-D1Ngu146-Ramp1/D2Gul188-D2Jyh1493，8.NOR.BN-D2Jyh767-Flizl。(b)人Lin-CB细胞在a中所述NOD或NOR Idd13亚同类系小鼠间质上的嵌合LTC中的CFC生成情况。如图2a进行培养及表示数据。品系命名如a中所述。

图4示出了SIRPα的蛋白序列比对。从BM源巨噬细胞制备的cDNA用做PCR扩增NOD和NOR小鼠Sirpα转录本的模板。B6小鼠序列来自EnsEMBL数据库。蛋白结构域以开放的框表示。

图5示出了来自NOD、NOR和同类系NOR.NOD-Idd13小鼠品系的BM源性巨噬细胞中SIRPα的免疫印迹分析。(a)将制备自BM源性巨噬细胞(用或不用LPS(100ng/ml)和IFN-gamma(10ng/ml)进行处理)的裂解物利用针对SIRPα胞浆结构域的多克隆抗体进行免疫印迹分析，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为上样对照。(b)将BM源性巨噬细胞的裂解物在N-糖苷酶F存在或不存在的情况下，于37℃孵育12小时，随后针对SIRPα胞浆结构域的多克隆抗体进行免疫印迹分析。将N-糖苷酶F处理和未处理的样品进行共电泳。分子量标准以千道尔顿表示(kD)。

图6示出了Sirpα对鼠巨噬细胞介导的人造血作用抑制的调节。(a)巨噬细胞在LTC中介导的人造血作用抑制。将MS-5细胞接种于96孔组织培养板中(2000个细胞/孔)。将从NOD、NOR和NOR.NOD-Idd13杂合小鼠收集的腹腔巨噬细胞以200-20,000个细胞/孔的量进行接种(每个量重复5次)，第二天每个孔均加入2000个人Lin^-CB细胞。培养3-4周后，收集细胞并通过在甲基纤维素试验中铺种而测定人CFC数量。误差棒表示标准差。(b)示出的是用对照病毒(CEP)或表达NOD源性Sirpα的病毒(SIRP)感染前后，Jurkat细胞和NOR BM源性巨噬细胞中SIRPα表达的蛋白印迹分析。蛋白裂解物用针对SIRPα的多克隆抗体进行免疫印迹。泳道1：Jurkat细胞；泳道2：感染CEP的Jurkat细胞；泳道3：感染SIRP的Jurkat细胞；泳道4：NOR巨噬细胞；泳道5：感染SIRP的NOR巨噬细胞；泳道6：NOD巨噬细胞。感染SIRP慢病毒引起NOD巨噬细胞中NOD SIRPα的高水平表达(泳道5)。(c)Sirpα对巨噬细胞介导的人造血作用抑制的影响。NOR BM源性巨噬细胞用对照(NOR-CEP)慢病毒或表达NOD源性Sirpα基因的慢病毒(NOR-NOD SIRP)感染，然后以20-20,000个细胞/孔的量接种于已建立的MS-5间质培养基上(每个量重复5次)。如上所述，第二天每个孔加入2000个Lin-CB细胞，3.5周后，测定培养物中得到的人CFC。NOR-NOD SIRP孔中人造血作用的支持显著优于NOR-CEP孔(20个细胞/孔时，P＝0.032；2000-20,000个细胞/孔时，P＝0.008)。误差棒表示标准差。

图7示出了NOD SIRPα使与人CD47的种属交叉反应性增加。(a-d)人CD47(hCD47)与来自NOD和NOD.NOR-Idd13同类系小鼠的BM源性巨噬细胞上的鼠SIRPα结合的流式细胞分析。(a)CD11b表达的直方图；水平棒表示CD11b⁺门。图b至d中的图均以CD11b进行门控。(b)二维等高线图，示出了SIRPα和hCD47-Fc染色。(c)相比于同型对照(黑色)，SIRPα表达的直方图(灰色)。(d)hCD47-Fc染色(灰色)与人IgG-Fc对照(黑色)叠加的直方图。(e)鼠SIRPα与hCD47-Fc的免疫沉淀。将来自NOD、NOR和NOD.NOR-Idd13同类系小鼠的BM源性巨噬细胞的蛋白提取物在SDS-PAGE上进行电泳，并用多克隆抗SIRPα抗体进行免疫印迹。每一个图均展示了总裂解物、与对照人IgG-Fc蛋白的免疫沉淀物(IP hFc)以及与hCD47-Fc融合蛋白的免疫沉淀物(IP hCD47-Fc)。上图比较的是NOD和NOR提取物，下图比较的是NOD和NOD.NOR-Idd13(Idd13cg)提取物。

图8示出了鼠和人SIRPαIgV结构域的蛋白序列比对。(a)从BM巨噬细胞制备的cDNA用做PCR扩增NOD和NOR小鼠Sirpα转录本的模板。C57BL/6(B6)、BALB/c和129/Sv序列从EnsEMBL和NCBI数据库获得。开放框代表SIRPα的X线结晶结构中鉴定的b-折叠片层，对应Ig重链可变区中的类似区域。小鼠品系之间不同的氨基酸以阴影表示。B6用做母本序列。(b)包含IgV结构域的SIRPα的外显子3从人HapMap第一阶段发布的37个个体基因组DNA扩增而来。开放框区域和阴影氨基酸表示与(a)中相同的特征，V1用做母本序列。种属之间正向同源位置标记^*的残基在NOD与其他品系以及与人之间呈多态性。标记+的残基在人类呈多态性，且定位于该蛋白“顶端”暴露于溶剂的表面上，预测CD47在该位置结合。

图9示出了通过对从所示出人HapMap样品中每一个(表格的左侧)PCR扩增而来的SIRPαIgV结构域进行独立测序来验证三种SNP分析的区分能力。

图10示出了CD47蛋白，包含胞外IgV样环、5个跨膜区和较短的胞浆尾巴。

图11示出了(a)一个直方图，描绘通过用不同质粒骨架(paDNA和pIAP369)制备的mCD47-Fc和两个hCD47-Fc构建体转染的培养细胞上清中蛋白生成情况，以及(b)一个SDS-PAGE免疫印迹，描绘的是从培养上清中纯化后的融合蛋白。

图12示出了(a)将Kozak序列引入包含mCD47-Fc的pIAP369质粒构建体中以及(b)插入pIAP369质粒中的序列hCD47-Fc，展示了Kozak共有序列、hCD47片段、连接段和Fc。

图13示出了(a)用含Kozak的质粒转染的细胞上清中测定的小鼠和人CD47-Fc生成情况以及(b)展示抗人Fc抗体与蛋白G纯化的CD47-Fc蛋白发生反应的免疫印迹。

图14示出了一个试验，设计用来量化hCD47-Fc和mCD47-Fc(未示出)与NOD和NOR小鼠SIRPα的亲和性。

图15示出了(a)mCD47与NOD和NOR SIRPα结合的结果，以及(b)hCD47与NOD和NOR SIRPα结合的结果。

图16是一个展示SIRPα-CD47介导的信号传导的示意图。

图17示出了制备人HSC“容许”的截短型NOD SIRPα(“NOD-Δ-cyto”)(左侧)。

图18示出了利用感染了“空”慢病毒的NOR巨噬细胞(NOR-CEP“菱形”)、未感染病毒的NOD巨噬细胞(NOD uninf；填充三角形)、感染“空”慢病毒的NOD巨噬细胞(NOD-CEP；圆圈)、感染含全长NOD SIRPα的慢病毒的NOR巨噬细胞(NOR-SIRP；方形)以及感染含截短型NOD SIRPα的慢病毒的NOR巨噬细胞(NOD-Δ-cyto；开放三角形)的人HSC存活情况。

图19示出了一个研究的示意图，用来评估体内CD47融合蛋白对HSC植入的影响。

具体实施方式

以下说明书中列出了许多具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，应该理解，无需这些具体细节即可实施本发明。

如本文中使用的，“保守性氨基酸取代”指根据某些共同属性对氨基酸进行分组。一种确定单个氨基酸之间共同属性的功能性途径是分析同源生物的对应蛋白之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz，G.E.and R.H.Schirmer.，Principles and Structure，Springer-Verlag)。根据这些分析，可确定氨基酸分组，其中同一组内氨基酸可彼此优先互换，且因此在对整体蛋白结构的影响方面彼此最为相似(Schulz，G.E.and R.H.Schirmer.，Principles and Structure，Springer-Verlag)。以该方式进行氨基酸分组的实例包括：

(i)带电组，由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成，

(ii)带正电组，由Lys、Arg和His组成，

(iii)带负电组，由Glu和Asp组成，

(iv)芳香组，由Phe、Tyr和Trp组成，

(v)氮环组，由His和Trp组成，

(vi)较大的脂肪族非极性组，由Val、Leu和Ile组成。

(vii)轻微极性组，由Met和Cys组成，

(viii)小残基组，由Ser、Thr、Asp、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成，

(ix)脂肪族组，由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成，以及

(x)小羟基组，由Ser和Thr组成。

除了上面展示的组，每一种氨基酸残基还可形成其自己的组，由单个氨基酸形成的组可简单地由该氨基酸在本领域中通常使用的一个和/或三个字母缩略词表示。

如本文中使用的，“培养细胞”表示一种已在体外维持和/或繁殖的细胞。培养细胞包括原代培养细胞和细胞系。如本文中使用的，“培养所述细胞”表示提供有助于多肽表达的培养条件。这些培养条件在本领域中为人熟知。

如本文中使用的，“植入”干细胞特别是已扩增的造血干细胞，表示将该干细胞置入动物体内，例如通过注射，其中该干细胞在体内持续存在。这一点可通过造血干细胞如促进正在进行的血细胞形成的能力而简单测定。

如本文中使用的，提到多肽或多核苷酸时，“片段”表示仅由该参照序列的完整多肽序列和结构(或核苷酸序列和结构)的一部分构成的多肽或多核苷酸。多肽片段可包括该天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失，或者可由该分子的一个内在部分衍生而来。类似的，多核苷酸片段可包括该天然多核苷酸的3’和/或5’缺失，或者可由该分子的一个内在部分衍生而来。

如本文中使用的，“融合蛋白”指一种复合多肽，即一种单一的连续性氨基酸序列，由两个(或多个)独立的异源性多肽构成，而这两个多肽在平常情况下并非融合于一个单一的氨基酸序列内。因此，融合蛋白包括的单一氨基酸序列可包含两个完全不同的氨基酸序列或两个相似或相同的多肽序列，只要这些序列并非存在于天然的单一氨基酸序列的同一构象中。融合蛋白通常可利用重组核酸法即通过重组基因融合产物的转录和翻译而制备，该融合包括一个编码本发明所述多肽的节段以及一个编码异源性多肽的节段，或者通过本领域中熟知的化学合成法而制备。在融合蛋白的组成多肽之间，可包含一个连接多肽。术语“融合构建体”或“融合蛋白构建体”通常表示编码融合蛋白的多核苷酸。在一个实施方式中，融合蛋白是本文所述多肽融合于Ig分子的一部分。融合蛋白的Ig部分可包括免疫球蛋白的恒定区，例如人Cγ1结构域或Cγ4结构域(例如人Ig Cγ1或Ig Cγ4的铰链区、CH2和CH3区)(见例如，Capon et al.，U.S.Pat.No.5,116,964；5,580,756；5,844,095等)。在一个优选实施方式中，Ig融合蛋白包括本文所述与免疫球蛋白的恒定区(例如，Fc部分)结合的多肽。

如本文中使用的，“造血干细胞”指骨髓、肝、脾或脐血来源能够发育成任何成熟骨髓和/或淋巴细胞的细胞。

如本文中使用的，提到核酸分子、多肽或其他生物分子时，“分离的”表示该核酸或多肽已从获得该多肽或核酸的遗传环境中分离出来，还可以表示与天然状态已经发生改变。例如，天然存在于活体动物内的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存物质中分离出来的相同多核苷酸或多肽则是“分离的”，如该术语在本文中所应用的。因此，重组宿主细胞内生成和/或包含的多肽或多核苷酸可认为是分离的。还可认为“分离的多肽”或“分离的核酸分子”是已从重组宿主细胞或天然来源部分或几乎全部纯化的多肽或核酸分子。

还可认为本发明所述肽可表现出调节生物学如细胞内事件的能力。如本文中使用的，“调节”指对感兴趣生物学过程的刺激性或抑制性效应，相对于本发明所述肽不存在时该过程的水平或活性。

如本文中使用的，术语“巨噬细胞抑制”或“抑制巨噬细胞”指减小或阻止巨噬细胞作用、活性和/或效应。

如本文中使用的，“核酸分子”表示DNA分子(例如，cDNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及例如通过采用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。核酸分子可以为寡核苷酸或多核苷酸，可为单链或双链。

如本文中使用的，“可操作性连接”指元件的排布，其中如此描述的元件经配置可发挥其通常功能。因此，可操作性连接于编码序列的控制元件能够实现该编码序列的表达。该控制元件无需与编码序列相邻，只要其能够发挥作用指导其表达即可。因此，例如，可在启动子和编码序列之间干扰未翻译但已转录的序列，启动子仍然可以认为是“可操作性连接于”编码序列。类似地，“与患者体内表达相容的控制元件”是那些能够实现该患者体内编码序列表达的元件。

如本文中使用的，“药用载体”表示任何以及所有溶剂、分散媒介、涂层、抗细菌和抗真菌试剂、等张和吸收延缓试剂以及可生理性相容的试剂等。药用载体的实例包括水、盐、磷酸缓冲盐、葡聚糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在多种情况下，优选该组合物中包括等张试剂例如糖类、多醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药用载体可进一步包括辅料如湿化或乳化剂、防腐剂或缓冲液，这将增强该药学试剂的保存期或有效性。

如本文中使用的，“多肽”和“蛋白”可互换使用，表示蛋白、蛋白片段、修饰的蛋白、氨基酸序列及合成的氨基酸序列。所述多肽可为糖基化或非糖基化。

如本文中使用的，“间质”指器官的支持组织或基质，可与该器官或实质的功能元件区分开。

如本文中使用的，“治疗有效量”指在某些剂量和必需的特定时间段时对获得预期治疗结局有效的量。药理学试剂的治疗有效量可随诸如疾病状态、年龄、性别和患者体重以及该药理学试剂消除个体内预期反应的能力等因素而不同。治疗有效量还可指一个量，其中该药理学试剂的治疗的有益效果超过任何毒性或有害效应。

根据一个方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；b)一种由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段组成的多肽，其中该片段包含SEQ ID NO：1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个；以及c)a)和b)中多肽的其中一种，其中，在该多肽全长中，每7个氨基酸中包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID NO：1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个且结合人CD47。

根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：a)一种由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽；b)一种由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段组成的多肽；以及c)a)和b)中多肽的其中一种，其中，在该多肽全长中，每7个氨基酸中包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代；其中：i)该多肽中SEQID NO：2的位点31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126处残基的至少一个被SEQ ID NO：1的对应残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者ii)该多肽中，SEQ ID NO：2的残基129和130中的至少一个缺失。

在某些实施方式中，该多肽是所述片段，且在SEQ ID NO：1内的残基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125或128-141之间，SEQ ID NO：2内的残基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125或128-143之间，在SEQ ID NO：4、7、8、9和12中任何一种的残基24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99或102-116之间；或者SEQ ID NO：5、6、10、11和13中的残基24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99或102-115之间的区域内包含至少3个连续的氨基酸。

在某些实施方式中，所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。

在一个优选实施方式中，该多肽结合人CD47。

在一个优选实施方式中，该多肽结合人Sirpα。

在某些实施方式中，该多肽是所述片段，且按照优先度逐渐增加的顺序，长度在6-30个氨基酸之间、在8-28个氨基酸之间、在10-26个氨基酸之间、在12-24个氨基酸之间以及在14-22个氨基酸之间。

本文所述多肽可融合于第二种多肽，其优选为IgG的Fc部分。

根据一个优选实施方式，本发明提供一种多肽，其包含的CD47胞外区融合于IgG的Fc部分，优选用于增加人体内的造血干细胞植入。

根据另一方面，本发明提供一种药学组合物，包含本文所述多肽以及一种药学可接受的载体。

根据另一方面，本发明提供一种用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的方法，包括给予该哺乳动物治疗有效量的本文所述多肽。优选地，造血干细胞植入的增加是由于巨噬细胞的抑制。

根据另一方面，本发明提供本文所述多肽在用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入或用于制备用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的药物中的应用。

根据另一方面，本发明提供一种分离的核酸，包含一个编码本文所述多肽的序列。

根据另一方面，本发明提供一种包含本文所述核酸优选包含Kozak共有序列的表达载体。

根据另一方面，本发明提供一种包含本文所述载体的培养细胞。

根据另一方面，本发明提供一种生成多肽的方法，包括在适于该多肽表达的条件下培养本文所述细胞。

根据另一方面，本发明提供一种用于增加人体内造血干细胞植入的方法，包括调节人Sirpα与人CD47之间的相互作用。优选地，其中人Sirpα与人CD47之间的相互作用通过给予至少一种治疗有效量的下列物质加以调节：a)一种能够结合于人Sirpα胞外区的多肽；b)针对人Sirpα的抗体c)一种能够结合于人CD47胞外区的多肽；以及d)针对人CD47的抗体。

因此，本发明还提供了前述多肽或方法用于增加人体内造血干细胞植入或用于制备增加人体内造血干细胞植入的药物的应用。优选地，造血干细胞植入的增加是由于巨噬细胞的抑制。

在一个实施方式中，能够结合于人Sirpα胞外区的多肽包括可溶性人CD47或其片段，优选CD47的胞外区。优选地，该可溶性人CD47或其片段融合于第二种蛋白。在另一个实施方式中，能够结合于人CD47胞外区的多肽包括可溶性人Sirpα或其片段，优选Sirpα的胞外区。优选地，该可溶性人Sirpα或其片段融合于第二种蛋白。在优选实施方式中，所述第二种蛋白是IgG的Fc部分。

根据另一方面，本发明提供一种鉴定可增加人体内造血干细胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirpα和人CD47胞外区中至少一种与至少一种待测化合物接触；b)确定所述至少一种待测化合物可结合于人Sirpα和人CD47中至少一种；c)使该待测化合物与间质环境中的人造血细胞相接触；以及d)确定在待测化合物存在的情况下，造血干细胞植入是否增加。

根据另一方面，本发明提供一种测定人体内影响造血干细胞植入的遗传多态性的方法，包括a)对来自多个进行造血细胞移植的患者的Sirpα基因进行测序；b)测定来自多个患者的Sirpα基因中的核苷酸差异；以及c)将该核苷酸差异与造血干细胞植入进行关联，以确定相关多态性。优选地，该核苷酸差异引起氨基酸差异。

优选地，该相关多态性引起的氨基酸差异优选为下列其中至少一个：(a)SEQ ID NO：2位点31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126处残基的至少一种被SEQ ID NO：1的对应残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者ii)SEQ ID NO：2的残基129和130中的至少一个缺失。

本发明的优势将进一步通过下列实施例加以阐述。本文中列出的这些实施例以及其特殊细节仅为了说明而不应理解为对本发明权利要求的限制。

实施例

材料&方法

小鼠

将CB17-scid/scid(SCID)、NOD/LtSz-Prdkc^sc/sc(NOD.SCID)(Shultz，L.D.et al.(1995)J Immunol 154，180-91)、C57BL/6(B6)、C3H、ICR和BALB/C小鼠在无菌条件下饲养并保管于Ontario肿瘤中心(多伦多，加拿大)。Rag^-2-/-(RAG-2)、RAG-2.Prf^/-和RAG-2.β₂m^-/-小鼠，均为B6背景，从GenPharm International(Mountain View，CA)获得。NOD、NOD.SCID、NOD.NOR-Idd13、NOD.NOR-Idd4、NOD.NOR-Idd5、NOD.NOR-Idd9、NOR.NOD-Idd13和B6.NOD-Idd13小鼠在病童医院(多伦多，加拿大)于无特异性病原体或屏障条件下供养。

所有的同类系小鼠均通过育种者的标记物指导性选择从NOD/Jsd与NOR/Lt祖先原始杂交而生成。按照家系，NOD与NOR基因组约88％一致，其基因组中的差异位点分布在染色体1、2、4、5、7、10、11、12、14和18上。育种者用微卫星标志物筛查所有可区分NOD与NOR的遗传基因座，因此所有同类系的亲本的背景等位基因均是纯合性的。本研究中用来定义同类系小鼠的微卫星标志物列于表1中。

表1.用来定位同类系小鼠的微卫星标志物。

10

TA

GAAAGACACA

Idd4

D11Mit90

11

70112196

TCTCCAGCCCCTTCATTATG

TGCCAAACACCCATGAGAC

77/78

Idd4

D11Jyh1081

11

80495333

TCCTTGGTGAGTCCACATCT

GGCTAGGCTCTGGAAGACA

79/80

IBD

D11Mit42

11

112795824

ACTAGCCATATGGTTTCTGATGG

GTAGCAGGGCTGTGAGCTTT

81/82

IBD＝家系一致；non-Idd＝四个Idd区之外，NOD与NOR之间的不一致区域

NOD.NOR-Idd13.SCID小鼠由NOD.NOR-Idd13小鼠与NOD.SCID小鼠的杂交得到，随后进行兄妹交配，并通过标志物辅助的基因分型进行筛查直至Idd13和SCID基因座均实现纯合性。

为了进行微卫星基因分型，从0.6-0.8cm剪断的尾巴制备基因组DNA，其中将剪下的尾巴于蛋白酶K和消化缓冲液(AutoGenAG00122)的溶液中于55℃消化过夜。稀释该粗制消化物并加热灭活蛋白酶K。PCR用5’末端用荧光标签进行修饰的寡核苷酸引物实施。PCR条件对于所有的微卫星引物均是相同的：在1.5mM的MgCl₂中，94℃30s、50℃30s、72℃1min共10个循环，然后是94℃30s、55℃30s、72℃1min共35个循环，。PCR扩增产物用ABI 3730XL测序仪进行检测，并借助于GeneMapper软件3.0版(Applied Biosystems，Foster City，CA)确认等位基因。

为了进行MS-5鼠间质细胞的LTC，将未照射的MS-5细胞接种于96孔组织培养板中(2000细胞/孔)，如Gan，O.I.et al.(1999)ExpHematol 27，1097-106中所述。3天后，以20-20,000/孔的量接种鼠腹腔巨噬细胞，每个量重复5个孔。第二天，将2000个人Lin CB细胞/孔加入200μl不含氢化可的松的人LTBMC培养基中。将培养物保持在33℃(对于基因转染实验，则为37℃)，每周进行半换液。3-4周后，细胞用胰酶消化，将每一孔中的一半细胞铺到所述的祖细胞试验中。

人特异性造血祖细胞分析

将来自T25瓶的7500个细胞或来自96孔板半孔量的细胞在选择性用于人类细胞的条件下铺于1ml甲基纤维素培养物中，如Larochelle，A.et al.(1996)Nat Med 2，1329-37中所述。将所述培养物于37℃孵育14天，计数由克隆形成细胞(CFC)产生的克隆总数。来自T25瓶的细胞进行铺种，重复三份。

鼠巨噬细胞制备

鼠腹腔巨噬细胞通过用10ml含10％FCS的αMEM进行腹腔灌洗而得到。BM源性巨噬细胞通过用10ml补充了10％FCS、10mMHEPES(pH7.0)、50nM 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、1x非必需氨基酸和1％青霉素/链霉素的DMEM(“完全DMEM”)冲洗股骨、胫骨和髂骨嵴而获得。将BM细胞以1x10⁶细胞/ml的浓度铺种于含10ng/ml重组小鼠GM-CSF(R&D Systems，Minneapolis，MN)的完全DMEM中。每隔一天，用含GM-CSF的新鲜完全DMEM更换培养基，7天后通过轻刮收集巨噬细胞。

Idd13候选基因的实时PCR分析

0.96Mb关键Idd13间隔内的基因表达通过cDNA的PCR扩增进行分析，cDNA则由BM间质和纯化的巨噬细胞制备而来。实时PCR利用ABI/PRIZM 7900HT PCR仪(Applied Biosystems)而实施，条件如下：95℃15s、59℃1min，共40个循环，并加入SYBRGreen缓冲液(Applied Biosystems)。含该基因序列的质粒的系列稀释液作为标准曲线计算的参照。荧光阈值和相对应的拷贝数利用SDS2.0软件进行计算(Applied Biosystems)。反应平行进行三份，转录的量对于β肌动蛋白进行标准化。

鼠Sirpα的分子遗传学分析

将来自NOD、NOR和BALB/c品系的Sirpα的编码区进行测序。cDNA从BM源性巨噬细胞制备而来，用作PCR模板，条件为在2mM的MgSO₄，94℃30s、60℃30s和68℃1min，共30个循环，并采用高保真性Taq聚合酶(Invitrogen Life Technologies，Carlsba，CA)。Sirpα的非翻译(UTR)区也在NOD和NOR品系中进行扩增并测序，利用基因组DNA作为模板并采用相同的PCR条件。测序引物利用Primer Express1.5软件(Applied Biosystems)进行设计并列于表2中。PCR产物按照生产商的说明书(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，并在病童医院加拿大多伦多(TCAG；www.tcag.ca)的应用基因组学中心对两条链均进行测序。B6、BALB/c和129/Sv小鼠的Sirpα序列文件从EnsEMBL(www.ensembl.org)和NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获得。序列文件用Lasergene软件(DNASTAR，Madison，WI)进行比对和分析。

表2.用来进行鼠和人SIRPα编码区和非翻译区的PCR扩增和测序的引物

	正向引物	反向引物	SEQIDNO.
				小鼠
Sirpα-1	AGTCCACCTTAAGAGGACCAAGTAGC	TGTACAGAAACAGGACGCGGA	101/102

Sirpα-2	TCTCCCTCCTTGCTCTGCAG	TACCTCGCAGATGACCTTAGAATTAA	103/104
				Sirpα-3	CCTAGTGGAAAGAATGTCTCCTACAACA	CATATTCTGTGTGGTTGTTAGGCTCA	105/106
Sirpα-4	CCAGGTACAGTCTTTGATCCAGGA	CCAGGGAGTCTCTGCTGGTCTA	107/108

Sirpα-5	CATCTGTGGAAGAACTACACCAGAAGTC	TACCTCAGAGAGCTGGCCGAGT	109/110
				Sirpα-6	CCAATGCTGACCTAATGTTGGC	CATCTATACACCCGTGTGTGTATACACA	111/112
Sirpα-7	AACTTGTCTTTGTCCGGGCC	GGCACAGTTCATCCTCACCC	113/114

人
				Sirpα	TAGAATACAGGCTCATGTTGCAGGT	GCCTTCAGCAAATAGCATGACGT	115/116

人SIRPα的分子遗传学分析

从HapMap收集品中选择37个无关个体，用于根据外显子3内编码的IgV结构域外侧两个标志物的基因型变异而进行测序(rs6075340和rs611968)。DNA样品来自TCAG，外显子3通过PCR利用高保真Taq聚合酶(Invitrogen Life Technologies)进行扩增。将所得扩增产物进行克隆，并在TCAG利用质粒多克隆位点外侧的引物(表2)对来自每个个体的2-4个独立克隆的外显子3进行双链测序。序列利用Lasergene软件进行比对。

SIRPα的生物化学分析

BM源性巨噬细胞用冰冷的PBS进行洗涤，随后在含5mMNaF、抑肽酶(10ug/ml)和1mM钒酸钠的缓冲液(20mM Tris-HClpH7.6，140mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40)中裂解。该裂解物以1000g在4℃离心15min，所得上清如下进行免疫印迹分析：蛋白(20μg/孔)在10％十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并转移至0.2μM的硝基纤维膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。蛋白印迹利用抗SIRPα抗体(Stressgen，Victoria，BC，加拿大)进行分析，并用HRP-ECL系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)进行显影。通过将细胞裂解物在0.5％SDS和1％β巯基乙醇中煮沸5分钟使糖蛋白变性，随后与N-糖苷酶F(40单位/ml，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)一起于37℃孵育12小时，可将N联寡糖从SIRPα除去。为了进行免疫沉淀，将250μgBM源性巨噬细胞裂解物与50μl蛋白G微珠(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)一起加入hCD47-Fc(10μg/ml)或对照人IgG Fc(10μg/ml)中。冰上孵育60分钟后，按照生产商的说明书在μMACS分选器上收集免疫复合物，并用SDS-PAGE凝胶上样缓冲液从柱上洗脱。

Sirpα慢病毒感染步骤

将NOD Sirpα的cDNA克隆入三代慢病毒骨架中EIFα启动子的下游，该骨架包含一个由人PGK启动子驱动的Gfp报告子基因(SIRP)。对照载体(CEP)仅包含Gfp。通过测序来确认载体构建。用水泡性口炎病毒G蛋白假模的病毒通过瞬时转染293T细胞而生成，如Guenechea，G.et al.(2000)Mol Ther 1，566-73中所述，并通过超速离心进行浓缩。通过感染HeLa细胞测得的SIRP和CEP病毒的功能滴度分别为每毫升2.1-5.1x10⁸和4-7.6x10⁸个感染性颗粒。培养5天后，以感染重复数(multiplicity)20-25将病毒加入NOR BM源性巨噬细胞培养瓶中，第12天时收集受感染的巨噬细胞。利用流式细胞仪通过GFP荧光评估基因转移入巨噬细胞内的效率为51-88％。将受感染的巨噬细胞用PE轭合的抗小鼠CD11b mAb(Beckman Coulter，Fullerton，CA)进行染色，并在Dako CytomationMoFlo(Fort Collins，CO)上进行分选得到GFP⁺CD 11b⁺的细胞。未感染的对照巨噬细胞经染色和分选得到CD11b⁺细胞。纯化的巨噬细胞(纯度97-99％)用于进一步的实验。

可溶性人CD47-Fc的制备

利用Superfect转染试剂盒(Qiagen)将293T细胞用包含人CD47胞外区的pcDNA-CD47Fc(其融合于受CMV启动子(Latour，S.etal.(2001)J Immunol 167，2547-54)指导的人IgG1 Fc)进行转染，并用100μg/ml的博来霉素(Zeocin)(Invitrogen，Carlsbad，CA)筛选。通过培养基上清的免疫印迹分析鉴定可生成可溶性人CD47-Fc(hCD47-Fc)的细胞系。hCD47-Fc蛋白在蛋白G-Sepharose(Pierce，Rockford，IL)上纯化并共价结合于生物素，用于流式细胞分析中。

流式细胞术

流式细胞分析利用FACSCalibur(BD，Franklin Lakes，NJ)实施。为了分析小鼠体内的人细胞植入情况，将从鼠BM收集的细胞用藻红蛋白(PE)花青素5-轭合的抗人CD45抗体(Beckman Coulter)染色。为了分析SIRPα的细胞表面表达和hCD47-Fc的结合，将1x10⁶个鼠BM白细胞用纯化的抗SIRPαmAb P84(BD)与Alexa 633结合的羊抗大鼠(Molecular Probes，Carlsbad，CA)、FITC轭合的抗CD11b mAb(SWRI，San Antonio，TX)以及生物素化的hCD47-Fc与亲和素-APC或者对照人IgG Fc片段与生物素化的抗人IgG mAb和亲和素-APC进行染色。通过碘化丙啶排除法选择存活的白细胞。同型对照为结合于恰当荧光染料的小鼠或大鼠IgG。GFP荧光在FL1中进行检测，针对异硫氰酸盐荧光素的发射谱进行校正。

统计分析

不同组之间利用单向ANOVA进行比较，当存在差异时，则利用Dunn’s法进行全部的成对多重比较。对于基因转染实验，则利用Wilcoxon秩和检验比较CEP和SIRP的条件。

蛋白质合成

将人CD47IgV区的cDNA序列以读码框形式克隆入人IgG FccDNA序列的上游，插入恰当的表达载体，转染入293F细胞内，所得到的融合蛋白(hCD47-Fc)则利用亲和层析在蛋白G珠子上从培养上清中加以纯化。小鼠CD47-Fc(mCD47-Fc)融合蛋白利用相同的方法进行制备。

hCD47和mCD47对小鼠巨噬细胞上表达的mSIRPα的亲和性检测

图14是一个试验的示意图，设计该试验是为了量化hCD47-Fc和mCD47-Fc(未示出)与NOD和NOR小鼠的SIRPα的亲和性。将获自NOD或NOR小鼠的巨噬细胞贴附于组织培养板两个小时，然后用缓冲盐水进行洗涤。往孔内加入等级量的纯化hCD47-Fc或mCD47-Fc融合蛋白，使其在37℃结合20分钟，然后用缓冲盐水彻底冲洗各个孔。结合hCD47的量通过HRP反应后用过氧化氢和过氧化物酶处理、利用分光光度计的比色分析而评估。

实施例1

含NOD品系背景的免疫缺陷小鼠支持体内的人造血干细胞植入

包括我们在内的几个研究小组已经证实，与包括CB17的其他品系背景的SCID小鼠相比，Prkdc^scid(SCID)纯合突变的NOD小鼠支持较多的人造血干细胞植入(Greiner，D.L.et al.(1995)Am JPathol 146，888-902；Larochelle，A.et al.(1996)Nat Med 2，1329-37)。对于该异种移植效率的品系差异的分子和细胞基础尚不可知。然而，NOD.SCID小鼠具有较高的自发性胸腺淋巴瘤的发病率，限制了其用于长期实验的用途。C57BL/6(B6)背景且携带重组酶激活基因2(Rag-2)的无效等位基因的小鼠在T和B细胞发育方面具有与CB 17.SCID小鼠类似的障碍，但未表现出自发性的恶性淋巴肿瘤(Shinkai，Y.et al.(1992)Cell 68，855-67)。还携带β2微球蛋白(RAG-2.β2m^-/-)或穿孔素(RAG-2.Prf^-/-)的同源性无效等位基因的Rag-2^-/-(RAG-2)小鼠，在自然杀伤(NK)细胞功能方面还具有其他缺陷(Zijlstra，M.et al.(1990)Nature 344，742-6；Kagi，D.et al.(1994)Nature 369，31-7)。因此，我们检测了其他几种品系免疫缺陷小鼠支持人造血作用的能力。

将人BM和CB细胞移植入每一种品系小鼠体内，并通过DNA印迹分析而评估植入情况(图1A)。在NOD.SCID小鼠体内检测到持续较高水平的植入，而CB17.SCID小鼠则表现出较低的植入频率和水平，如之前所报道的(Larochelle，A.et al.(1996)Nat Med 2，1329-37)。如所预期的，在免疫活性NOD受体中未检测到植入。令人吃惊的是，尽管存在广泛的免疫缺陷，但在B6背景的RAG-2、RAG-2.Prf^-/-和RAG-2.β₂m^-/-小鼠中植入出现失败。相反，NOD.Rag-1^-/-小鼠已证实可支持高水平的人造血细胞植入(Shultz，L.D.et al.(2000)J Immunol 164，2496-507)。这些观察结果表明，异种移植时除了小鼠品系背景的免疫缺陷以及/或者宿主BM微环境之外，还有其他一些因素显著影响造血细胞植入。

实施例2

人长期培养起始细胞的支持需要染色体2上的NOD等位基因

长期培养起始细胞(LTC-IC)是可在体外进行分析的最原始人造血细胞(Wang，J.C.Y.et al.“Nomal andleukemic human stem cells assayed in immune-deficient mice”in：Hematopoiesis-ADevelopmental Approach(ed.Zon，L.I.)99-118(Oxford University Press，New York，uSA，2001)，并且用作在受限微环境条件下人造血作用的一个替代指标。LTC-IC根据其5周间质培养后生成克隆形成细胞(CFC)的能力而量化。为了鉴定在支持人造血作用方面的品系差异，我们比较了来自NOD/Jsd(NOD)与其他品系的BM间质细胞支持LTC-IC的能力。来自NOD小鼠的间质层支持人CFC生成达5周的培养时间，而来自所有其他品系的BM间质则在用等量Lin^-CB细胞接种后不支持人LTC-IC(图1B)。即使当Lin^-CB细胞的总量(0.6x10⁵；图1C)较低时，NOD间质仍然具有支持性。该试验中，我们检测了NOR/Lt(NOR)小鼠，因为其是一种重组近交品系，按照家系88％等同于NOD，仅在4个Idd基因座(Idd4、Idd5、Idd9和Idd13)存在差异(Prochazka，M.et al.(1992)Diabetes 41，98-106)。与NOD相反，NOR培养物仅在接种10倍以上数量的Lin^-CB细胞时才支持LTC-IC(图1C)，且得到的CFC尺寸较小。这些数据表明，在体外和体内观察到的NOD小鼠对原始人造血作用的独特支持受NOD与NOR小鼠之间遗传不一致(genetic non-identity)区域的控制。为了定位可赋予NOD品系支持人造血作用的较高能力的基因座，在嵌合LTC中检测了来自NOD和NOR母本小鼠、一系列NOD和NOR-Idd同类系品系和B6.NOD-Idd13小鼠的间质细胞(图2A)。与NOD间质相比，B6品系或者NOR母本品系均不能支持人LTC-IC形成。在Idd4、Idd5和Idd9与NOR等位基因同类系的NOD小鼠表现出与NOD母本等同的LTC-IC结果。相反，从NOD.NOR-Idd13小鼠分离的间质细胞(Idd13-BB基因型)不能支持人LTC-IC，而B6和与NOD Idd13同类系的NOR小鼠(Idd13-NN基因型；B6.NOD-Idd13和NOR.NOD-Idd13)均具有支持性。因此，染色体2上NOD源性的Idd13基因座(Serreze，D.V.et al.(1994)J.Exp.Med.180，1553-1558)赋予了BM间质细胞在体外显著增强的支持人LTC-IC的能力。

实施例3

Idd13基因型决定了对体内人造血干细胞植入的支持

为了检测Idd13基因座是否控制对能够在体内再植的人造血细胞(命名为SCID再植细胞，SRC)的支持，我们生成了一种与NOR源性Idd13同源的免疫缺陷NOD同类系品系(NOD.NOR-Idd13-SCID)。随后，受照的NOD.SCID和NOD.NORIdd13-SCID小鼠用Lin^-CB细胞(相当于0.37-1.5x10⁵个CD34⁺细胞)进行静脉移植，6-7周后，用流式细胞仪评估人CD45⁺细胞的植入(图2B)。如所预期的，NOD.SCID在整个CB细胞量范围内均支持人细胞植入。相反，在NOD.NOR-Idd13-SCID小鼠则未检测到人细胞植入。这些结果确认了体外LTC-IC数据，并证实NOD在Idd13基因座处的等位基因赋予了对体内人造血作用的支持。

实施例4

在Idd13调节人造血作用支持的候选基因的精确定位

为了细化调节人造血支持的基因在Idd13的定位，我们采用了一种涉及NOD或NOR背景上Idd13同类系品系生成的定位方法(图3A)。在嵌合性LTC分析中检测了来自这些同类系动物的间质细胞(图3A和3B)。有趣的是，来自Idd13杂合小鼠的间质细胞(Idd13-BN)支持人LTC-IC，然而所生成的CFC数量始终是在NOD培养中所观察到数值的约50％(图3A和3B；从左数第三个棒)。这些数据与NOD Idd13等位基因对人LTC-IC支持的显著作用一致。通过在8个NOD和NOR背景上的新Idd13同类系品系上重复这些分析，将对人LTC-IC表型的支持确定至一个960kb的区域(图3A和3B)，通过Flizl的单核苷酸多态性和微卫星D2Ngul1849界定(表3)。在该间隔的15个基因中，8个具有功能注释。利用实时PCR评估了该8个基因中的7个在NOD和NOR品系的BM间质和巨噬细胞中的表达情况(表4)。Sirpa(也称作Shps-1和Ptpns1)是唯一一个在BM间质表达且表现出NOD与NOR之间编码序列多态性的基因，因此，被选为用于进一步研究最具前景的候选基因。

表3.支持人LTC-IC的Idd13候选间隔

染色体

起始位点

染色体组标志物

EnsEMBL基因ID

基因号

引物1

引物2

SEQ IDNO.

2	128675293	Flizl	ENSMUSG00000027387	Zc3hdc8
								2	128716430	ENSMUSG00000042851	ZCC6_MOUSE
2	128744547	D2Ngul1725			GCCACTACCATCCGATTCTT	CCTGTCTTGAAAACCCAAAA	117/118
								2	128815007	ENSMUSG00000027394	Tt1
2	128850037		ENSMUSG00000027395	Rpo1-2
								2	128878840	ENSMUSG00000037938	Chchd5
2	128917969		ENSMUSG00000043404	-
								2	128947823	ENSMUSG00000027397	Slc20a1
2	128967992		ENSMUSG00000056738	A730036117Rik
								2	129017904	ENSMUSG00000048327	2610318C08Rik
2	129048633		ENSMUSG00000027399	I11α
								2	129113614	ENSMUSG00000027398	I11β

2	129118920		ENSMUSG00000056635	NM_177848
								2	129207382	ENSMUSG00000043727	F830045P16Rik
2	129342601		ENSMUSG00000037902	Sirpα＝Ptpns1
								2	129435589	ENSMUSG00000027400	NDDB_MOUSE
2	129530898	D2Jyh3941			AATGACTTGTTTGCCAAGGA	TTTTATGCCCTAGGAGCCTC	119/120
								2	129549775	ENSMUSG00000037885	Stk35
2	129635018	D2Ngul1849			ACTCTCTGAGTAGCCTGCCCC	CCTCACCCTTACTTGGCACC	121/122

支持人LTC-IC的候选间隔由Flizl和D2Ngul1849进行界定(图3A)，确定了染色体2上包含15个基因的0.96Mb间隔。最小候选基因座由微卫星标志物D2Ngul1725和D2Jyh3941界定，包含13个基因。所有的基因组位置和基因属性均基于26.33b.1版的EnsEMBL。设计Flizl引物检测NOD与NOR品系之间5’UTR中的多态性。

表4.Idd13候选间隔中注释基因的表达

基因号	EnsEMBL ID	基因型	细胞类型	平均拷贝数±SD	针对β肌动蛋白标准化的平均拷贝数±SD(×10^-3)
						Flizl	ENSMUSG00000027387	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	2180±1772107±257UDUD	2.04±0.171.97±0.24UDUD
Rpo1-2	ENSMUSG00000027395	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	9955±18364938±1234399±23225±39	7.66±1.416.86±1.710.40±0.020.54±0.09
						Chchd5	ENSMUSG00000037938	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	UDUDUDUD	UDUDUDUD

Slc20a1	ENSMUSG00000027397	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	13762±46719926±1767NDND	23.80±0.8122.39±1.99NDND
						I11α	ENSMUSG00000027399	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	12104±120611193±32292321338±57100843037Z5±191113	10.09±1.019.33±2.691304.12±320.791198.81±53.24
I11β	ENSMUSG00000027398	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	19813±170112324±31859167234±1227948730824±608149	17.08±1.4015.40±3.907051.72±94.464595.18±320.08
						Stk35	ENSMUSG00000037885	NORNOR.NOD-Idd13NORNOR.NOD-Idd13	间质间质巨噬细胞巨噬细胞	221±16400±15NDND	0.44±0.440.57±0.02NDND

U

D＝低于检测限

ND＝未检测

参见描述实时PCR的材料和方法。

实施例5

Idd13候选基因Sirpα的品系依赖性序列和生物化学变异

信号调节蛋白α(SIRPα)是IgG超家族的跨膜蛋白，具有对两个含Src同源区的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2的胞内对接点(Barclay，A.N.&Brown，M.H.(2006)Nat Rev Immunol 6，457-64)。Sirpα在BM间质和造血细胞中大量表达(数据未示出)。我们采用BM源性巨噬细胞的cDNA的PCR扩增和双向测序来鉴定NOD、NOR和BALB/c小鼠编码区中的变异。NOR序列等同于B6，只是B6源性胞内区中多包含4个氨基酸(图4)，其可能反映外显子7中2个供体剪接位点之间的变异(Sano，S.et al.(1999)Biochem J 344 Pt 3，667-75)。NOD与NOR之间Sirpα编码区的比较表明存在24个氨基酸的差异，20个位于分子的胞外IgV样结构域中，其中相比于NOR和B6，NOD序列表现为18个取代和2个缺失(图4和图8A)。在NOD与NOR或B6之间Sirpα的N末端IgV样结构域内观察到的变异相比，之前报道的B6、BALB/c与129/Sv品系之间该区域的变异要更加广泛(Sano，S.et al.(1999)Biochem J 344 Pt 3，667-75)。

为了评估NOD与NOR小鼠之间SIRPα序列变异的结果，从BM源性巨噬细胞制备蛋白裂解物，并利用免疫印迹通过针对胞浆区的多克隆抗体检测SIRPα的表达，NOD和NOR小鼠中胞浆区的序列是相同的(图4)。在所检测的条件下，未检测到SIRPα表达的可量化的品系差异。NOD蛋白的电泳迁移率略低于NOR蛋白(图5A)。SIRPα是糖基化的(van den Nieuwenhof，I.M.et al.(2001)J Cell Sci 114，1321-9)，因此我们检测了表观分子量的品系差异反映差异糖基化的可能性。将来自BM源性巨噬细胞的蛋白裂解物用N-糖苷酶F进行处理，并通过免疫印迹进行检测(图5B)。去除了N联聚糖后，来自两种品系的SIRPα的迁移均较为快速，迁移率几乎相等。这些结果表明，我们在NOD与NOR蛋白胞外区部分检测到的广泛多态性引起了差异糖基化。因此，NOD与NOR品系之间的氨基酸序列和翻译后修饰的相异性与Sirpα引起Idd13基因赋予人造血作用支持方面品系特异性差异相一致。

实施例6

鼠巨噬细胞表现出人LTC-IC支持方面的品系特异性变异

鼠SIRPα在神经和骨髓细胞中表达最为广泛(Veillette，A.etal.(1998)J Biol Chem 273，22719-28)，且已证实心脏、肝脏、肾和其他组织中存在差异糖基化形式(Sano，S.et al.(1999)Biochem J 344Pt3，667-75)。SIRPα连接作用调节多种巨噬细胞功能，包括抑制吞噬过程(Oldenborg，P.A.et al.(2001)J Exp Med 193，855-62；Blazar，B.R.et al.(2001)J Exp Med 194，541-9)和TNFα生成(Smith，R.E.et al.(2003)Blood 102，2532-40)以及增加一氧化氮生成(Alblas，J.et al.(2005)Mol Cell Biol 25，7181-92)。我们以及其他研究者均证实，在异种移植过程中，一种不同于NK细胞的人CD122⁺细胞，可能是巨噬细胞，会在对人造血细胞植入的宿主抵抗中发挥作用(McKenzie，J.L.et al.(2005)Blood 106，1259-61；Shultz，L.D.et al.(2003)Exp Hematol 31，551-8)。此外，巨噬细胞是造血支持性BM间质培养的一个部分(Hauser，S.P.et al.(1995)J Histochem Cytochem 43，371-9)。根据这些观察结果，我们检测了是否巨噬细胞赋予了我们在嵌合性LTC-IC试验中观察到的人造血作用支持方面的品系特异性差异。收集来自NOD、NOR和NOR同类系小鼠(NOR.BN-Idd13，Idd13基因座为杂合性)的腹腔巨噬细胞，并加入应用MS-5间质细胞的LTC-IC培养物中，MS-5间质细胞是一种支持人造血作用的鼠细胞系(Issaad，C.et al.(1993)Blood 81，2916-24)。将鼠巨噬细胞以每孔200、2,000和20,000的量接种于已建立的MS-5培养物上，24小时后，加入2000个Lin^-CB细胞。所有品系的巨噬细胞均对3-4周后LTC中得到的CFC数量具有剂量依赖性效应(图6A)。NOR巨噬细胞在所有的细胞量下均表现出比NOD巨噬细胞更强的抑制；在2,000和20,000个巨噬细胞/孔，品系差异呈显著性(p＜0.008)。NOR.BN.-Idd13在NOR与NOD巨噬细胞之间具有媒介物的作用，这与我们之前的观察结果即Sirpα等位基因对人造血作用的支持具有(共)-显性作用是一致的。用BM源性巨噬细胞实施的平行实验显示为类似的结果(数据未示出)。这些发现证实了鼠巨噬细胞对体外人造血作用的Idd13基因型特异性、剂量依赖性抑制作用。

实施例7

Sirpα赋予了NOD巨噬细胞支持人造血作用的差异能力

为了直接检测是否NOD Sirpα变异体赋予了所观察到的巨噬细胞介导人造血作用抑制的品系特异性效应，我们构建了表达NOD源性Sirpα加Gfp(SIRP)或仅表达Gfp(CEP)的慢病毒载体。用SIRP感染Jurkat细胞或NOR BM源性巨噬细胞得到SIRPα蛋白的高水平表达，在巨噬细胞中，该蛋白在蛋白印迹中表现为NOD类型的迁移率，表明其在这些细胞中可能为糖基化状态(图6B)。为了评估Sirpα在嵌合性LTC中的效应，用SIRP或对照CEP慢病毒感染NOR BM源性巨噬细胞，然后接种于MS-5间质培养上。第二天加入人Lin^-CB细胞，25-31天后评估CFC生成情况。在这种情况下，细胞量效应仍然比较明显，其中接种20,000个巨噬细胞/孔时，无论Sirpα基因型如何，均能抑制人造血作用。然而，由NOR巨噬细胞表达NOD源性SIRPα相比于未操作或CEP感染的NOR巨噬细胞可得到大大增强的人CFC支持(图6C，数据未示出)。这些功能获得性实验的结果证实了SIRPα赋予了嵌合性LTC中的巨噬细胞介导的品系特异性效应，提供了该基因与Idd13基因座对体外和体内人造血作用支持有关的直接证据。

实施例8

鼠Sirpα中的等位基因变异赋予了与人CD47的差异结合

SIRPα的细胞配体是广泛表达的整合素相关蛋白CD47，其也是Ig超家族的成员之一(Seiffert，M.et al.(1999)Blood 94，3633-43)。CD47结合于SIRPα的胞外IgV样结构域(Seiffert，M.et al.(2001)Blood 97，2741-9；Vemon-Wilson，E.F.et al.(2000)Eur J Immunol 30，2130-7)。前期研究已证实，人SIRPα表现出与猪CD47的种属交叉性结合，但不与小鼠(B6)、大鼠或牛的CD47结合(Subramanian，S.et al.(2006)Blood 107，2548-56)。之前已鉴定出NOD与NOR的SIRPα等位基因之间的IgV样结构域内存在20个氨基酸的差异(图4)，我们想知道是否这些变异赋予了鼠SIRPα与人CD47的差异结合。来自NOD和NOD.NOR-Idd13小鼠的BM源性巨噬细胞具有类似比例的CD11b⁺细胞(图7A)，且这些细胞表达相等量的SIRPα(图7B和C)。然而，融合于人IgG1 Fc的人CD47胞外区(hCD47-Fc)(Latour，S.et al.(2001)J Immunol 167，2547-54)与NOD.NOR-Idd13巨噬细胞相比，表现出强得多的与NOD的结合(图7B和D)，证实了鼠SIRPα与人CD47之间的Idd13基因型依赖性相互作用。NOD、NOR和NOD.NOR-Idd13巨噬细胞提取物包含等量SIRPα，但NOR和NOD.NOR-Idd13裂解物中hCD47-Fc与SIRPα的免疫共沉淀可以忽略，相反NOD裂解物中则可以达到有效回收(图7E)。综上，这些数据表明相比于NOR(或B6)源性蛋白，NOD源性SIRPα表现出与人CD47的更高反应性，提供了一种NOD.SCID小鼠中对人造血作用支持增强的分子机制。

实施例9

鼠和人SIRPαIgV结构域的蛋白序列比对以及人群中Sirpα多态性

以上我们已经采用定位遗传学方法结合造血作用的功能分析将Sirpα鉴定为人干细胞和祖细胞与体外和体内BM微环境之间的一种重要调节剂。我们证实了鼠巨噬细胞上能够结合人CD47的SIRPα蛋白变异体的表达对于嵌合性LTC内人造血作用的支持既必要又足够。这些发现表明巨噬细胞在造血干细胞移植后是重要的植入调节剂。

与其他免疫缺陷小鼠品系相比，NOD.SCID小鼠中得到的较高人造血细胞植入提示其他宿主品系特异性因素影响造血细胞植入。我们发现鼠巨噬细胞中Idd13基因座与嵌合性培养及体内人造血作用支持之间存在较强的遗传学关联。利用慢病毒基因转移进行直接功能获得性研究确证了体外LTC-IC数据并表明Sirpα是造成Idd13基因座效应的基因。在造血系统中，SIRPα主要在骨髓细胞上表达，并含有胞浆免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，其介导导致巨噬细胞吞噬减少、中性粒细胞迁移抑制及炎性细胞因子TNFα生成减慢的抑制性信号(见综述Barclay，A.N.&Brown，M.H.(2006)Nat RevImmunol 6，457-64)。CD47是唯一已知的SIRPα细胞配体，它普遍表达并调节对造血细胞的多重细胞作用包括血小板激活、迁移和粘附，白细胞粘附和细胞因子生成以及T细胞反应性(见综述Brown，E.J.&Frazier，WA.(2001)Trends Cell Biol 11，130-5)。SIRPα和CD47均是免疫球蛋白超家族成员，其相互作用通过其各自的IgV样结构域介导(Seiffert，M.et al.(2001)Blood 97，2741-9)。我们鉴定出NOD与NOR SIRPα之间的IgV样结构域存在20个氨基酸的差异以及两个蛋白之间的不同糖基化，表明与人CD47的差异相互作用可能造成Sirpα变异对体外和体内人造血作用的较强影响。该机制得到我们的生物化学和流式细胞学分析的支持，所述分析表明与NOR源性蛋白相比，NOD源性SIRPα与人CD47的结合有所增强。

CD47-SIRPα相互作用与吞噬过程介导的红细胞(Oldenborg，P.A.et al.(2000)Science 288，2051-4)和白细胞(Gardai，S.J.et al.(2005)Cell 123，321-34)清除的调节有关，其中造血细胞上的CD47表达作为“自身标志物”抑制表达SIRPα的巨噬细胞的吞噬。根据体外观察结果即通过将人巨噬细胞与人CD47-Fc提前孵育或者通过在LCL转染体上异常表达人CD47可减弱吞噬过程，提示存在一种类似的机制调节从肝的同种异体移植物收集的人巨噬细胞吞噬猪淋巴母细胞系(LCL)的过程(Ide，K.et al.(2007)ProcNatl Acad Sci USA 104，5062-6)。我们的证据通过证实SirpαIgV结构域影响CD47相互作用的程度且可对人HSC的植入发挥“全或无”的作用而延伸了这些前期结果，将之前的发现与体内移植情况联系在了一起，体内移植的结果受宿主巨噬细胞的调节。重要的是，但不限于任何理论，巨噬细胞介导的吞噬过程可能并非构成体外或体内造血作用支持的唯一或主要效应机制，因为我们观察到NOR嵌合培养中人造血细胞逐渐消失(数据未示出)，这与基于吞噬过程的快速清除不大一致。而且，来自所有小鼠品系的巨噬细胞均表现出对人LTC-IC生长的剂量依赖性抑制作用，表明SIRPα信号抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子如TNFα，如之前证实的巨噬细胞受病原体产物的刺激(Smith，R.E.et al.(2003)Blood 102，2532-40)。除了SIRPα对巨噬细胞的作用，SIRPα-CD47结合可能激活人造血细胞内CD47诱导的信号传导途径。因此，SIRPα-CD47相互作用多效性中的任何一种或几种均可影响HSC存活和植入。

我们在异种移植中的观察结果可能对于临床HSC移植具有更为广泛的意义。现有大量的证据表明，所观察到已移植入NOD.SCID小鼠体内的原始造血干细胞/祖细胞的性质可预测临床情形(Wang，J.C.Y.et al.“Normal andleukemic human stem cells assayed in immune-deficient mice”in：Hematopoiesis-ADevelopmental Approach(ed.Zon，L.I.)99-118(Oxford University Press，New York，USA，2001).

为了进一步探索我们在鼠类系统中观察到的功能变异在人类是否适用，我们研究了人群中的SIRPα多态性。我们将来自人类HapMap基因组计划的37个无关正常高加索(CEU)、非洲(YRI)、中国(CHB)和日本(JPI)个体的SIRPαIgV结构域进行测序(表5)，鉴定了10种反映18个氨基酸组合变异的独特SIRPαIgV等位基因(图8b)。最近报道的高分辨率X光SIRPαIgV结构域的结晶结构预测了促进CD47结合表面的关键残基(Subramanian，S.et al.(2006)Blood Cells Mol Dis 36，364-72)。令人吃惊的是，我们在预测的CD47结合残基观察到了人等位基因变异(图8b)。此外，我们在SIRPαIgV结构域中可区分NOD与NOR等位基因(以及其他小鼠品系；图4和图8b)的相同亚区观察到了成簇的人等位基因变异。在与NOD和NOR之间变异(氨基酸72位丝氨酸对天冬酰胺)正向同源的位点也观察到了人多态性(图5b和图8b)，所述变异可促成我们在这些小鼠品系中观察到的SIRPαN联糖的独特加成模式。综上，这些数据证明如在实验室小鼠中一样，人SIRPα在IgV结构域呈高度多态性，且表明等位基因变异体将影响翻译后加工和CD47配体的相互作用。

我们的研究结果鉴定了HSC植入遗传调节的一个新轴心。经典的移植排斥是由残存宿主T细胞或NK细胞介导的免疫学现象，其排斥速率与受体与供体之间HLA不一致的程度相关。我们则证明，除了T细胞和NK细胞，宿主巨噬细胞可能在通过SIRPα-CD47相互作用介导的植入中发挥重要作用。而且我们的发现可能与具有免疫介导性发病机制的BM衰竭综合征有关。

已证实，小鼠巨噬细胞对人HSC支持的作用依赖于SIRPα等位基因(为序列依赖性)，且依赖于LTC-IC试验中小鼠巨噬细胞的数量。这些试验中，当细胞总量较高时，甚至NOD-源性巨噬细胞也降低对人HSC的支持。在所移植的人HSC数量有限且受体携带SIRPα的巨噬细胞数量巨大的临床情形中，可通过用治疗量的CD47-Fc或能够有效且特异性激活受体巨噬细胞中SIRPα抑制信号的等量可溶性试剂处理受体而实现植入增加。一旦HSC及其谱系进行后代植入并再植于受体，随着已建立的移植物产生大量CD47+细胞从而得到相对于其余受体源性巨噬细胞较为有利的比值，对治疗性SIRPα使用的需求可能降低。

本领域的熟练技术人员将能够理解，通过从病童应用基因组学中心(多伦多，加拿大)获得的人HapMap样品对正常的无关个体进行测序，可进一步分析人SIRPα多态性的程度。例如，来自HLA实验室中供体和受体存档血液样品的1-2毫克DNA样品将用于利用标准测序设备进行SIRPα测序。以独特的匿名ID命名供体/受体冷冻血液样品对而无任何诊断或任何结局细节。将特别注意该基因外显子3的测序，因为其编码对于配体结合和功能非常关键的IgV结构域，还将特别注意另外两个编码该基因胞内区的外显子的测序，其包括对于传递发自SIRPα的信号非常重要的氨基酸残基。技术人员将建立这些个体SIRPα序列的数据库，去除任何患者标识，并统计分析供体-宿主对中SIRPα变异与骨髓植入结局之间的关联。

参照图9，建立了3个SNP分析(给予Ds#标志)来检测与我们在人HapMap样品中检测到的非同义性编码多态有关的可变核苷酸。聚合酶链反应(PCR)扩增引物和检测探针基于Applied Biosystems TaqMan system(www.appliedbiosystems.com)进行设计。SIRPα变异体(V1、V2...等)之间的差别列于图9中的表格底部，图9示出了通过对从每一个人HapMap样品(在表格左侧列出)PCR扩增的SIRPαIgV结构域的进行独立测序验证每一种SNP分析的鉴别能力。正常人SIRPαIgV结构域序列中的多态性程度有待测定，SNP分析和测序用于临床研究有待于优化。所采用的方法和数据易于获得且为本领域中的普通技术人员所知，参见例如国际HapMap计划(www.hapmap.org)。

实施例10

hCD47-Fc蛋白的生成

图10a图示了CD47蛋白，包括胞外IgV样环、5个跨膜区和一个较短的胞浆尾巴。图10b描绘了CD47-Fc融合蛋白，表示CD47IgV样结构域融合至人Ig Fc区。

CD47-Fc融合蛋白如上文方法和材料中所述进行制备。

图11a示出了一个直方图，描绘的是利用通过不同质粒骨架(pcDNA和pIAP369)制备的mCD47-Fc和两个hCD47-Fc构建体转染的培养细胞上清中的蛋白生成情况。图11b是SDS-PAGE免疫印迹，示出了从培养上清纯化后的融合蛋白。所生成的hCD47-Fc构建体以及mCD47-Fc构建体均不需要进一步优化。

实施例11

hCD47-Fc蛋白生成的优化

申请者引入了一个共用起始位点来增加蛋白生成。参照图12a，包含mCD47-Fc的质粒pIAP369用作引入真核翻译起始位点的支架(Kozak，M Nucleic Acids Res.1984.12(2)：857-72)，称为Kozak序列。所得到的质粒随后用限制性酶进行消化而去除mCD47区域，并通过连接和在细菌中重新克隆而用hCD47 IgV样结构域的序列进行取代。将得到的质粒进行测序，以确保hCD47序列以读码框形式引入并核实Kozak序列。前述利用的典型分子克隆技术对于本领域的普通技术人员而言将是已知的。图12b示出了插入pIAP369质粒中的hCD47-Fc序列，展示了Kozak共有序列(SEQ ID NO：123)、hCD47片段(SEQ ID NO：124)、连接段(SEQ ID NO：125)和Fc(SEQ ID NO：126)。

图13a示出了在如上制备的4种不同构建体之一转染的细胞上清中检测到的小鼠和人CD47-Fc生成情况。数据表明，引入真核起始(Kozak)序列将hCD47-Fc的产量增至上清中30mg/L(比较右边两个柱子)。图13b示出的免疫印迹，展示了与蛋白G纯化的CD47-Fc蛋白发生反应的抗人Fc抗体。应注意，翻译后加成糖基团的差异造成了小鼠和人CD47-Fc的SDS-PAGE迁移率差异。

申请人已成功生产了大量适用于NOD.SCID异种移植模型中体内检测的高纯CD47-Fc融合蛋白。

实施例12

小鼠CD47-Fc与NOD和NOR SIRPα结合

新鲜制备的NOD和NOR巨噬细胞表面上mCD47-Fc与SIRPα结合的检测可参照图14利用材料和方法部分描述的试验而测定。图15示出的结果即NOD SIRPα-mCD47结合的Kd比NORSIRPα-mCD47相互作用的Kd低4倍(约4.7倍)以上，表明与NOR变异体的SIRPα相比，与NOD相互作用的亲和性高4倍以上。这些数据提示，我们在人SIRPαIgV结构域序列中观察到的SIRPα变异预计可赋予与人CD47结合的显著性差异，其可影响HSC移植的有效性。

实施例13

人CD47-Fc与NOD和NOR SIRPα结合

新鲜制备的NOD和NOR巨噬细胞表面上hCD47-Fc与SIRPα结合的检测可参照图14利用材料和方法部分描述的试验而测定。检测了2种条件：第一种，与未处理的新鲜巨噬细胞上SIRPα的结合(“非聚集的”；三角形)，第二种，与用抗SIRPα外功能区的单克隆抗体提前处理的巨噬细胞的结合(“聚集的”；方形)。检测后一种条件是为了模拟位于人HSC及其子代细胞表面上的结合CD47的效应。在该情形中，CD47结合将生成较高的效价，将结合的SIRPα蛋白“聚集”于小鼠巨噬细胞上。图15b中，结果表明NODSIRPα-hCD47结合的Kd是1.6M，代表较高的亲和性相互作用。令人吃惊的是，在该聚集条件下，亲和性上升10倍以上，提供的Kd为0.16nM。这些数据表明人CD47与NOD源性SIRPαIgV结构域的结合很高，且可预测CD47-Fc融合蛋白在体内的较强疗效。

实施例14

评估SIRPα介导的信号转导对HSC植入的作用

其他研究表明，SIRPα-CD47结合通过这两种蛋白中的每一种触发双向信号(由图16中展示的示意图来表示)。申请者评估了通过SIRPα由CD47结合介导的信号是否为HSC植入所必需。图17示出了人HSC“容许性”截短型NOD SIRPα(“NOD-Δ-cyto”)(左侧)，由于特意的缺失连接于关键性下游磷酸酶SHP-1和SHP-2(右侧)的两个免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)而不能传递信号。

长期培养起始细胞(LTC-IC)试验(利用Takenaka et al Nature Immunol 2007 Dec，8(12)：1313-23中描述的方法而实施)，用来确定SIRPα-CD47介导的信号传导在人HSC存活中的必要性。

该实验比较了全长和胞浆截短型NOD SIRPα在LTC-IC试验中支持人HSC存活的能力。利用以不同的慢病毒转导的分等级量的NOD或NOR源小鼠巨噬细胞测试了5种条件：

1)NOR巨噬细胞，感染“空”慢病毒(NOR-CEP“菱形”)

2)NOD巨噬细胞，未感染病毒(NOD uninf；填充三角形)

3)NOD巨噬细胞，感染“空”慢病毒(NOR-CEP；圆圈)

4)NOR巨噬细胞，感染含全长NOD SIRPα的慢病毒(NOR-SIRP；方形)

5)NOR巨噬细胞，感染含截短型NOD SIRPα的慢病毒(NOD-Δ-cyto；未填充三角形)

参照图18，相比于用空病毒感染的NOR巨噬细胞，用含全长NOD SIRPα构建体的慢病毒感染NOR巨噬细胞，显著增强了人HSC的存活(方形与菱形)。相反，用包含胞浆截短型NOD SIRPα的慢病毒感染NOR巨噬细胞，则不能与用空病毒感染NOR巨噬细胞区分开(菱形与未填充三角形)。这些数据证实，人HSC的支持依赖于利用SIRPα的CD47依赖性信号传导。因此，开发增强患者体内人HSC移植、存活和分化的治疗性进展应该集中于通过SIRPα处理信号。

申请者推测，Takenaka等(上文)中报道的异种移植数据模仿了临床情形，其中接受小群HSC的患者含有大量表达SIRPα的巨噬细胞。在该“非骨髓性”情形中，供体HSC上的CD47与患者巨噬细胞上表达的SIRPα之间的结合亲和性，可控制触发SIRPα介导的信号的效率，且可确定HSC持续存在还是被清除。

实施例15

人HSC植入过程中hCD47-Fc疗法的体内评估

图19是一个研究的概况，该研究被设计用来评估体内CD47融合蛋白对HSC植入的影响。将hCD47-Fc融合蛋白注射入NOD.SCID宿主，并导入分等级量的人新生儿脐血中的造血干细胞。人HSC通过利用单克隆抗体与免疫磁珠去除成熟种系-定向细胞而制备，如前所述(J.L.McKenzie et al.，Nat Immunol.2006，11：1225-33)。HSC植入后，通过针对受体小鼠血液、脾脏和骨髓中细胞表面标志物(CD34、CD45)的人特异性抗体进行流式细胞检测。

人CD47-Fc融合蛋白使人HSC的植入增加

我们进行了一个研究，以确定移植入NOD.SCID后用人CD47-Fc融合蛋白进行处理是否将影响人脐血干细胞的植入。利用我们之前发表的方法(Vormoor J，Lapidot T，Pflumio F，Risdon G，Patterson B，Broxmeyer HE，Dick JE.Blood.1994，83(9)：2489-97)，通过针对血细胞种系标志物的抗体混合物而减少人的新生儿脐血细胞，得到富集的HSC群。年龄匹配的雌性NOD.SCID小鼠队列通过低剂量照射而预先准备，如我们之前所述(Vormoor J，Lapidot T，Pflumio F，Risdon G，Patterson B，Broxmeyer HE，Dick JE.Blood.1994，83(9)：2489-97)。将20,000-40,000个谱系衰竭的CB细胞注射入NOD.SCID小鼠体内，该小鼠已用纯化的人CD47-Fc蛋白或无关人Fc同种型对照制剂进行了腹膜内注射。注射CB细胞前3小时给予该处理，每周3次，共注射3周(每次为7.5-30毫克)。在实验结束时，处死全部小鼠并用胫骨和股骨制备骨髓。骨髓细胞用一系列单克隆抗体染色并通过流式细胞仪进行分析。将抗人CD45染色的细胞进行量化，以确定人HSC植入的程度。

参照图20，在8只接受对照人Fc蛋白的NOD.SCID小鼠中，检测不到人CD45+细胞。相反，用hCD47-Fc蛋白处理的3只小鼠中有2只表现出清楚的人HSC植入迹象。这些数据与一种观念一致，即用SIRPα的蛋白或小分子激动剂处理可促进临床移植情形中人HSC植入。

尽管本文中已阐述了本发明的优选实施例，但应该理解，本领域中的熟练技术人员可对其进行改动而不背离本发明的的精神或所附权利要求的范围。本文所披露全部文献的内容均通过引用结合于此。

Claims

1.一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：

a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的多肽；

b)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段组成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO：1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个；以及

c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽全长中，每7个氨基酸中有至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID NO：1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个且结合人CD47。

2.一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：

a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽；

b)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段组成的多肽；以及

c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽全长中，每7个氨基酸包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代；

其中：

i.所述多肽中SEQ ID NO：2的位点31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126处残基的至少一个被SEQ ID NO：1的对应残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者

ii.所述多肽中，SEQ ID NO：2的残基129和130中的至少一个缺失。

3.一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组：

a)由一种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4-13组成的组；

b)由一种氨基酸序列的片段组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4-13组成的组；以及

c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽的全长中，每7个氨基酸中有至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽结合人CD47。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQ ID NO：1内的残基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125或128-141之间区域的至少一个内包含至少3个连续的氨基酸。

5.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQ ID NO：2内的残基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125或128-143之间区域的至少一个内包含至少3个连续的氨基酸。

6.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQ ID NO：4、7、8、9和12的任何一个内的残基24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99或102-116之间区域或者在SEQ ID NO：5、6、10、11和13内的残基24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99或102-115之间区域中至少一个内包含至少3个连续的氨基酸。。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，没有氨基酸的插入、缺失或取代。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合人CD47。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且长度在6到30个氨基酸之间。

11.根据权利要求10所述的多肽，其中所述片段的长度在8到28个氨基酸之间。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述片段的长度在10到26个氨基酸之间。

13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述片段的长度在12到24个氨基酸之间。

14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述片段的长度在14到22个氨基酸之间。

15.一种多肽，包含权利要求1-14中任一项所述的多肽融合于第二种多肽。

16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述第二种蛋白是IgG的Fc部分。

17.一种药物组合物，包含权利要求1-16中任一项所述的多肽以及一种药用载体。

18.一种用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的方法，包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1-16中任一项所述的多肽。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，造血干细胞植入的增加是由于巨噬细胞的抑制。

20.权利要求1-16中任一项所述的多肽在增加哺乳动物体内的造血干细胞植入中的应用。

21.权利要求1-16中任一项所述的多肽在制备用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的药物中的应用。

22.根据权利要求1-16中任一项所述的多肽，用于增加哺乳动物体内的造血干细胞植入。

23.一种分离的核酸，包含编码权利要求1-16中任一项所述多肽的序列。

24.一种表达载体，包含可操作性地连接于表达控制序列的权利要求23所述的核酸。

25.一种培养细胞，包含权利要求24所述的载体。

26.一种生产多肽的方法，包括在适于所述多肽表达的条件下培养权利要求25所述的细胞。

27.一种用于增加人体内造血干细胞植入的方法，包括调节人Sirpα与人CD47之间的相互作用。

28.根据权利要求27所述的方法，其中人Sirpα与人CD47之间的相互作用通过给予至少一种治疗有效量的下列物质进行调节：

a)能够结合于所述人CD47胞外区的多肽；以及

b)针对人CD47的抗体。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述能够结合于所述人CD47胞外区的多肽包括可溶性人Sirpα或其片段。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。

31.根据权利要求29和30中任一项所述的方法，其中所述多肽融合于第二种蛋白。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二种蛋白是IgG的Fc部分。

33.根据权利要求27所述的方法，其中人Sirpα与人CD47之间的相互作用通过给予至少一种治疗有效量的下列物质进行调节：

a)一种能够结合于所述人Sirpα胞外区的多肽；以及

b)针对人Sirpα的抗体。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述能够结合于所述Sirpα胞外区的多肽包括可溶性人CD47或其片段。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。

36.根据权利要求34和35中任一项所述的方法，其中所述多肽融合于第二种蛋白。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二种蛋白是所述IgG的Fc部分。

38.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞植入的增加是由于巨噬细胞的抑制。

39.一种化合物在增加人体内的造血干细胞植入中的应用，所述化合物包括：

a)一种能够结合所述人CD47胞外区的多肽；以及

b)针对人CD47的抗体。

40.一种化合物在制备用于增加人体内造血干细胞植入的药物中的应用，所述化合物包括：

a)一种能够结合所述人CD47胞外区的多肽；以及

b)针对人CD47的抗体。

41.根据权利要求39和40中任一项所述的应用，其中所述能够结合所述人CD47胞外区的多肽包括可溶性人Sirpα或其片段。

42.根据权利要求41所述的应用，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。

43.根据权利要求41和42中任一项所述的应用，其中所述多肽融合于第二种蛋白。

44.根据权利要求43所述的应用，其中所述第二种蛋白是所述IgG的Fc部分。

45.一种化合物在增加人体内的造血干细胞植入中的应用，所述化合物包括：

a)一种能够结合于所述人Sirpα胞外区的多肽；以及

b)针对人Sirpα的抗体。

46.一种化合物在制备用于增加人体内造血干细胞植入的药物中的应用，所述化合物包括：

a)一种能够结合于所述人Sirpα胞外区的多肽；以及

b)针对人Sirpα的抗体。

47.根据权利要求45和46中任一项所述的应用，其中所述能够结合于所述Sirpα胞外区的多肽包括可溶性人CD47或其片段。

48.根据权利要求47所述的应用，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。

49.根据权利要求47和48中任一项所述的应用，其中所述多肽融合于第二种蛋白。

50.根据权利要求49所述的应用，其中所述第二种蛋白是所述IgG的Fc部分。

51.根据权利要求39-50中任一项所述的应用，还用于巨噬细胞的抑制。

52.一种多肽，包含融合于所述IgG的Fc部分的所述CD47的胞外区。

53.根据权利要求52所述的多肽，其中所述多肽由SEQ IDNO：124、125和126连续编码。

54.一种药物组合物，包括权利要求52和53中任一项所述的多肽以及一种药用载体。

55.根据权利要求52和53中任一项所述的多肽，用于增加人体内的造血干细胞植入。

56.一种分离的核酸，包含编码权利要求52和53中任一项所述多肽的序列。

57.一种表达载体，包含可操作性地连接于表达控制序列的权利要求56所述的核酸。

58.根据权利要求57所述的表达载体，进一步包括核酸的Kozak共有序列。

59.一种培养细胞，包含权利要求57和58中任一项所述的载体。

60.一种生产多肽的方法，包括在适于所述多肽表达的条件下培养权利要求59所述的细胞。

61.一种鉴定增加人体内造血干细胞植入的化合物的方法，包括：

a)使人Sirpα胞外区和人CD47胞外区中的至少一种与至少一种待测化合物接触；

b)确定至少一种结合于人Sirpα和人CD47中的至少一种的所述待测化合物；

c)使所述待测化合物与间质环境中的人造血细胞接触；以及

d)确定在所述待测化合物存在的情况下，造血干细胞植入是否增加。

62.一种测定人体内影响造血干细胞植入的遗传多态性的方法，包括：

a)对来自多个进行造血细胞移植的人的Sirpα基因进行测序；

b)测定所述多个人中所述Sirpα基因中的核苷酸差异；以及

c)将所述核苷酸差异与造血干细胞植入进行关联，以确定相关多态性。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述核苷酸差异引起氨基酸差异。

64.一种确定受体内造血干细胞植入的可能性的方法，包括

a)对来自所述受体的Sirpα基因进行测序；以及

b)确定权利要求62所述的相关多态性是否存在。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述核苷酸差异引起氨基酸差异。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述氨基酸差异是下列中的至少一种：

a)SEQ ID NO：2的位点31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126处残基的至少一个被SEQ ID NO：1的对应残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者

b)SEQ ID NO：2的残基129和130中的至少一个缺失。