CN101953784B - 含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液及其制备方法 - Google Patents
含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液及其制备方法。该兽用混悬液是以阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙为有效成分的兽用混悬液。其制备方法包括以下步骤：1)取助悬剂、抗氧化剂和防腐剂溶于或分散于热分散媒中，得到A液；2)取配方量40-80％的分散媒倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入润湿剂；3)待全部辅料加入完全，依次加入阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；4)检查颗粒细度，符合要求后停止研磨，加分散媒至配方量，混匀，灌装，密封，灭菌，得到含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
Description
技术领域
本发明属于畜牧药物制剂领域，具体涉及的是一种含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用复方混悬液及其制备方法。
背景技术
随着我国畜禽养殖业的快速发展，近年来兽医临床上各种致病菌愈来愈复杂，大多病例均呈多病原混合感染，其中既有革兰氏阳性菌感染，又有革兰氏阴性菌感染，给兽医防治工作带来极大困难。由于缺乏成熟的对各种致病菌均有良好效果的复方制剂，兽医工作者常需联合使用多种单方药物制剂来治疗混合感染性疾病，且在感染早期常使用糖皮质激素类药如泼尼松龙、地塞米松等进行辅助治疗。所以，治疗一种疾病往往需同时给予多种药物制剂才能达到理想的治疗效果，既给兽药工作人员带来了巨大的工作量，又给患病动物带来了极大的应激反应。因此，研发一种对多种致病菌均有良好防治效果的长效复方制剂，是目前畜牧养殖业防治多病原混合感染性疾病的迫切需求，具有重要意义。
在防治多病原混合感染性疾病的复方制剂研究方面，国内尚无较成熟的产品上市，在国外，虽然美国辉瑞公司研制了阿莫西林、克拉维酸、泼尼松龙的供乳房灌注用灭菌油性复方混悬溶液，但其主要用途为治疗革兰氏阳性菌和阴性菌引起的奶牛泌乳期乳房炎；法国维克公司也成功研制了氨苄西林、硫酸粘菌素和地塞米松的复方注射用混悬液，但该产品亦主要用于奶牛乳房炎的治疗。以上现有的两种复方制剂由于主要适用奶牛乳房炎的治疗，适用范围窄，不能满足各种动物(尤其是猪)的混合感染性疾病。
发明内容
本发明提供了一种疗效确切的用于防治动物革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌引起的混合感染和继发感染的含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用复方混悬液。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，是以阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙为有效成分的兽用混悬液。
所述兽用混悬液中各有效成分的含量为：阿莫西林5-30％(重量/体积百分比浓度，g/100ml)，优选为10-20％(g/100ml)；硫酸粘菌素0.25-3％(g/100ml)，优选为0.5-2.5％(g/100ml)；泼尼松龙0.01-0.1％(g/100ml)，优选为0.02-0.05％(g/100ml)。
所述兽用混悬液中还包括以下药物辅料：分散媒、助悬剂、润湿剂、抗氧剂和防腐剂。
所述分散媒可选自注射用大豆油、油酸乙酯、三乙酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙脂和注射用蓖麻油中的一种或两种。
所述助悬剂可选自硬脂酸铝、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、胆固醇、凡士林、羧甲基纤维素钠和氢化蓖麻油中的一种或两种。
所述润湿剂可选自吐温-80、司盘-60、司盘-80和环氧乙烯-40-氢化蓖麻油中的一种。
所述抗氧剂可选自维生素E、硫脲、叔丁基羟基茴香醚、偏重亚硫酸钠和没食子酸丙脂中的一种。
所述防腐剂可选自苯甲醇、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯中的一种。
具体来讲，所述兽用混悬液中各成分的含量为：阿莫西林5-30％(g/100ml)，优选为10-20％(g/100ml)；硫酸粘菌素0.25-3％(g/100ml)，优选为0.5-2.5％(g/100ml)；泼尼松龙0.01-0.1％(g/100ml)，优选为0.02-0.05％(g/100ml)，助悬剂0.1-2％(g/100ml)，润湿剂0.2-2％(ml/100ml)，抗氧剂0.01-1％(g/100ml)，防腐剂0.005-1％(g/100ml)，其余为分散媒。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的方法。
本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤：
1)取助悬剂、抗氧化剂和防腐剂溶于或分散于热分散媒中，得到A液；
2)取配方量40-80％的分散媒倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入润湿剂；
3)待全部辅料加入完全，依次加入阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
4)检查颗粒细度，符合要求后停止研磨，加分散媒至配方量，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
在上述药物的制备方法中，所述分散媒可选自注射用大豆油、油酸乙酯、三乙酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙脂和注射用蓖麻油中的一种或两种。
所述助悬剂可选自硬脂酸铝、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、胆固醇、凡士林、羧甲基纤维素钠和氢化蓖麻油中的一种或两种。
所述润湿剂可选自吐温-80、司盘-60、司盘-80和环氧乙烯-40-氢化蓖麻油中的一种或两种。
所述抗氧剂可选自维生素E、硫脲、叔丁基羟基茴香醚、偏重亚硫酸钠和没食子酸丙脂中的一种或两种。
所述防腐剂可选自苯甲醇、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯中的一种或两种。
具体来讲，所述兽用混悬液中各成分的含量为：阿莫西林5-30％(g/100ml)，优选为10-20％(g/100ml)；硫酸粘菌素0.25-3％(g/100ml)，优选为0.5-2.5％(g/100ml)；泼尼松龙0.01-0.1％(g/100ml)，优选为0.02-0.05％(g/100ml)，助悬剂0.1-2％(g/100ml)，润湿剂0.2-2％(ml/100ml)，抗氧剂0.01-1％(g/100ml)，防腐剂0.005-1％(g/100ml)，其余为分散媒。
上述兽用混悬液的用法用量一般为0.1-0.2mL/kg体重，1天1次，连用3-5天。注射剂量和疗程可根据实际情况适当调整。
本发明提供了一种含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液及其制备方法。本发明的优点和积极效果如下：
(1)利用阿莫西林、硫酸粘菌素这两个具有不同抗菌机理的抗生素，联合使用发挥了两药的协同抗菌优势，拓宽了抗菌谱，增强抗菌效力，降低、延缓耐药性的产生。
(2)泼尼松龙给药后吸收迅速，血药浓度高，组织亲和力强，能迅速到达炎症部位发挥抗炎作用，本发明的混悬液对混合感染性疾病效果良好，为兽医临床提供了一种良好的制剂。
(3)将阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙联合使用，拓宽了抗菌谱，增强了抗菌效力，避免单药使用带来的局限性，延缓耐药性的产生，并且具有抗炎、抗毒素的作用。此外，采用复方制剂仅需每天给药一次，既可以降低由于频繁给药(原单药均需每天给药两或三次)对动物产生的应激反应，又节省人力、物力和财力。
(4)本发明的混悬液采用油性溶剂作为制剂的分散媒，不但解决了阿莫西林在水性溶液中易降解的难题，而且在油性混悬液中，硫酸粘菌素在体内缓慢释放，血药浓度平稳，降低了硫酸粘菌素的毒副作用。
此外，本发明的含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液是采用分散法将阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙分散于溶媒中，并加入助悬剂、润湿剂和抗氧剂，利用胶体磨研磨而得，生产工艺简单，降低成本，易于实现产业化。
综上所述，本发明将时间依赖型抗生素阿莫西林、浓度依赖型抗生素硫酸粘杆菌素有机地结合，既很好地利用单药的抗菌作用，又发挥了两药联用的协同抗菌优势，两药联用扩大了抗菌谱，增强了抗菌效力，同时结合泼尼松龙的抗炎、消炎优势，三者合用具有抗感染、抗炎的作用。针对近年来我国兽医临床畜禽疾病多呈混合感染或继发感染的流行特点，本发明临床上主要用于防治动物革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌引起的混合感染和继发感染。本发明制备工艺简单，易于实现产业化，且成本低、低毒而高效，具有极高的推广应用价值。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
本发明是国家“十一五”科技支撑计划课题(课题名称：兽用复方新制剂的研制与应用；课题编号：2006BAD31B08)的部分内容。
本发明为了提供一种能普遍用于各种动物的混合感染性疾病的复方注射液，以猪、牛、鸡等不同动物临床病例中分离的多种常见致病菌为研究对象，从恩诺沙星、阿莫西林、泰乐菌素、硫酸粘菌素等多种常用药物中筛选出协同作用较好且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有极强作用的复方组合(阿莫西林和硫酸粘菌素)，同时结合泼尼松龙的消炎作用，成功研制了可广泛应用于防治各种动物的混合感染性疾病的阿莫西林、硫酸粘菌素、泼尼松龙复方注射液。
本发明把阿莫西林、硫酸粘菌素、泼尼松龙三种药物研制成复方制剂的优点是克服了因同时给予多种药物对动物造成的应激反应，降低了兽医人员的工作量。尤其重要的是本复方制剂不但克服了单方制剂抗菌谱窄和现有复方制剂适用范围小的缺陷，而且增强了阿莫西林和硫酸粘菌素的抗菌效力，并延缓了此两种药物耐药性的产生。
本发明提供一种含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的复方制剂。在复方组配过程中，需要特别考虑药物之间的协同性，并通过筛选恰当的药用辅料来形成疗效确切且稳定性良好的制剂。
本发明中所用药物，优化使用有时间依赖型抗生素阿莫西林和浓度依赖型抗生素硫酸粘杆菌素，两种抗生素联用，可以协同抗菌优势，扩大抗菌谱，增强抗菌效力(参见后续实验一和实验二)；再结合使用具有抗炎、消炎优势的泼尼松龙，三者合用具有抗感染、抗炎的效果(参见后续实验三、四——临床效果试验)。其中注射液中各药物成分含量：阿莫西林5-30％(g/100ml)，优选为10-20％(g/100ml)；硫酸粘菌素0.25-3％(g/100ml)，优选为0.5-2.5％(g/100ml)；泼尼松龙0.01-0.1％(g/100ml)，优选为0.02-0.05％(g/100ml)。
本发明利用复方药物结合适宜的药用辅料制成兽用混悬液，包括使用分散媒、助悬剂、润湿剂、抗氧剂和防腐剂等药物辅料。
分散媒：可选自注射用大豆油、油酸乙酯、三乙酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙脂和注射用蓖麻油中的一种或两种的复合，优选油酸乙酯与注射用大豆油的复合分散媒。本发明中特别选用油性溶剂作为制剂的分散媒，解决了阿莫西林在水性溶液中易降解的难题，且在油性混悬液中，硫酸粘菌素在体内缓慢释放，血药浓度平稳，降低了硫酸粘菌素的毒副作用。
助悬剂：可选自硬脂酸铝、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、胆固醇、凡士林、羧甲基纤维素钠和氢化蓖麻油中的一种或两种的复合，助悬剂的种类和用量依据药物用量和分散媒种类进行调整，以利于形成稳定的注射液。在注射液中助悬剂含量为0.1-2％(g/100ml)。
润湿剂：可选自吐温-80、司盘-60、司盘-80和环氧乙烯-40-氢化蓖麻油中的一种，在制药过程中尽可能选用单一组分，但不排除使用多种复合的方式。在注射液中润湿剂含量为0.2-2％(ml/100ml)。
抗氧剂：可选自维生素E、硫脲、叔丁基羟基茴香醚、偏重亚硫酸钠和没食子酸丙脂中的一种，在制药过程中尽可能选用单一组分，但不排除使用多种复合的方式。在注射液中抗氧剂含量为0.01-1％(g/100ml)。
防腐剂：可选自苯甲醇、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯中的一种，在制药过程中尽可能选用单一组分，但不排除使用多种复合的方式。在注射液中防腐剂的含量为0.005-1％(g/100ml)。
依据本发明形成的兽用混悬液中各成分的含量可以为：阿莫西林5-30％(g/100ml)，优选为10-20％(g/100ml)；硫酸粘菌素0.25-3％(g/100ml)，优选为0.5-2.5％(g/100ml)；泼尼松龙0.01-0.1％(g/100ml)，优选为0.02-0.05％(g/100ml)，助悬剂0.1-2％(g/100ml)，润湿剂0.2-2％(ml/100ml)，抗氧剂0.01-1％(g/100ml)，防腐剂0.005-1％(g/100ml)，其余为分散媒(ml)。
以下以具体实施例进一步说明本发明。下述实施例1-10采用本发明的最佳实验方案，本领域的普通技术人员能够依据本发明公开的内容显而易见地想到一些雷同、替代方案，均应属于本发明的公开内容。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 20kg，
硫酸粘菌素 1.5kg，
泼尼松龙 0.04kg，
硬脂酸铝 1kg，
司盘-80 1L，
没食子酸丙酯 0.02kg，
苯甲醇 0.5kg
注射用大豆油 加至100L。
用本发明制备含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，具体方法包括以下步骤：
1)将配方量的硬脂酸铝、没食子酸丙酯加入2L注射用大豆油中，加热搅拌使其完全溶解，加入配方量的苯甲醇，得到A液；
2)取60L注射用大豆油倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-80；
3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
4)检查颗粒细度，结果符合要求(标准为粒径大于15μm的颗粒数应少于10％)，停止研磨，加注射用大豆油至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明的含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
实施例2
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 20kg，
硫酸粘菌素 1kg，
泼尼松龙 0.03kg，
氢化蓖麻油 1kg，
司盘-60 0.5L，
没食子酸丙酯 0.02kg，
尼泊金甲酯 0.05kg，
肉豆蔻酸异丙脂 加至100L。
用本发明的方法制备含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，具体方法包括以下步骤：
1)取配方量的氢化蓖麻油、没食子酸丙酯和尼泊金甲酯加入2L肉豆蔻酸异丙脂中，加热搅拌使其完全溶解得到A液；
2)取40L肉豆蔻酸异丙脂倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-60；
3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
4)检查颗粒细度，结果符合要求，停止研磨，加肉豆蔻酸异丙脂至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明的含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
实施例3
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 10kg，
硫酸粘菌素 1kg，
泼尼松龙 0.05kg，
氢化蓖麻油 0.5kg，
凡士林 0.25kg，
司盘-80 0.2L，
硫脲 0.2kg，
尼泊金甲酯 0.05kg，
油酸乙酯 30L，
注射用大豆油 加至100L。
用本发明的方法制备含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，具体方法包括以下步骤：
1)取配方量的氢化蓖麻油、凡士林、硫脲和尼泊金甲酯加入2L注射用大豆油中，加热搅拌使其完全溶解，得到A液；
2)取配方量的油酸乙酯和30L注射用大豆油倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-80；
3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
4)检查颗粒细度，结果符合要求，停止研磨，加注射用大豆油至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明的含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
实施例4
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 15kg，
硫酸粘菌素 2.5kg，
泼尼松龙 0.04kg，
卵磷脂 0.8kg，
司盘-80 1L，
维生素E 0.05kg，
尼泊金丙酯 0.05kg，
注射用蓖麻油 加至100L。
用本发明的方法制备含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，具体方法包括以下步骤：
(1)取配方量的卵磷脂、维生素E和尼泊金丙酯加入2L注射用蓖麻油中，加热搅拌使其完全溶解，得到A液；
(2)取80L注射用蓖麻油倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-80；
(3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
(4)检查颗粒细度符合要求后，停止研磨，加注射用蓖麻油至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明的含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
实施例5
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 15kg，
硫酸粘菌素 2kg，
泼尼松龙 0.05kg，
卵磷脂 0.2kg，
氢化蓖麻油 0.5kg，
司盘-60 0.8L，
叔丁基羟基茴香醚 0.05kg，
尼泊金甲酯 0.05kg，
油酸乙酯 加至100L。
用本发明的方法制备含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，具体方法包括以下步骤：
1)取配方量的氢化蓖麻油、卵磷脂、叔丁基羟基茴香醚和尼泊金甲酯加入2L油酸乙酯中，加热搅拌使其完全溶解，得到A液；
2)取60L油酸乙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-60；
3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，开始研磨，采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
4)检查颗粒细度，结果符合要求，停止研磨，加油酸乙酯至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明的含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
实施例6
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 20kg
硫酸粘菌素 2kg
泼尼松龙 0.04kg
氢化蓖麻油 0.3kg
卵磷脂 0.5kg
司盘-80 0.6L
维生素E 0.05kg
尼泊金甲酯 0.05kg
油酸乙酯 加至100L
所述的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的制备方法包括如下步骤：
(1)取配方量的氢化蓖麻油、卵磷脂和尼泊金甲酯溶于2L热油酸乙酯中，为A液；
(2)取60L油酸乙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-80；
(3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，开始研磨，采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
(4)检查颗粒细度符合要求后，停止研磨，加油酸乙酯至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，即得所述的混悬液。
实施例7
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 20kg
硫酸粘菌素 2kg
泼尼松龙 0.04kg
氢化蓖麻油 0.3kg
卵磷脂 0.3kg
司盘-80 1.5L
维生素E 0.075kg
尼泊金甲酯 0.05kg
油酸乙酯 10L
注射用大豆油 加至100L
所述的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的制备方法包括如下步骤：
(1)取配方量的氢化蓖麻油、卵磷脂和尼泊金甲酯溶于2L热注射用大豆油中，为A液；
(2)取50L注射用大豆油和配方量的油酸乙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-80；
(3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，开始研磨，采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
(4)检查颗粒细度符合要求后，停止研磨，加注射用大豆油至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，即得所述的混悬液。
实施例8
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 15kg
硫酸粘菌素 2.5kg
泼尼松龙 0.05kg
卵磷脂 1.5kg
司盘-60 0.5L
维生素E 0.075kg
尼泊金甲酯 0.05kg
肉豆蔻酸异丙脂 加至100L
所述的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的制备方法包括如下步骤：
(1)取配方量的卵磷脂、维生素E和尼泊金甲酯溶于2L热肉豆蔻酸异丙脂中，为A液；
(2)取60L肉豆蔻酸异丙脂倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的司盘-60；
(3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，开始研磨，采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
(4)检查颗粒细度符合要求后，停止研磨，加注射用肉豆蔻酸异丙脂至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，即得所述的混悬液。
实施例9
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 30kg
硫酸粘菌素 0.5kg
泼尼松龙 0.02kg
胆固醇 0.1kg
环氧乙烯-40-氢化蓖麻油 1.0L
叔丁基羟基茴香醚 0.01kg
尼泊金甲酯 0.005kg
三乙酸甘油酯 加至100L
所述的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的制备方法包括如下步骤：
(1)取配方量的胆固醇、尼泊金甲酯和叔丁基羟基茴香醚溶于2L三乙酸甘油酯中，为A液；
(2)取60L三乙酸甘油酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入配方量的环氧乙烯-40-氢化蓖麻油；
(3)待全部辅料加入完全，依次加入配方量的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，开始研磨，采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
(4)检查颗粒细度符合要求后，停止研磨，加注射用三乙酸甘油酯至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，即得所述的混悬液。
实施例10
本发明含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的配方如下：
阿莫西林 10kg
硫酸粘菌素 2kg
泼尼松龙 0.1kg
卵磷脂 0.5kg
胆固醇 0.5kg
尼泊金甲酯 0.5kg
油酸乙酯 50L
注射用大豆油 加至100L
所述的阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的制备方法包括如下步骤：
(1)按量取卵磷脂、胆固醇、尼泊金甲酯溶于2L油酸乙酯中，为A液；
(2)取余量油酸乙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边按量加入环氧乙烯-40-氢化蓖麻油；
(3)待全部辅料加入完全，依次加入阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，开始研磨，采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
(4)检查颗粒细度符合要求后，停止研磨，加注射用大豆油至100L，混匀，灌装，密封，灭菌，即得所述的混悬液。
实验一、阿莫西林与硫酸粘菌素联合抗菌作用
为探讨阿莫西林与硫酸粘杆菌素联合应用是否能增强对猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、奶牛乳房炎性金葡球菌、奶牛乳房炎性链球菌等常见病原菌感染的疗效，本发明进行了两药的体外联合抗菌试验。
1材料与仪器
1.1供试药品
阿莫西林(AMO)，含量为99.5％，批号20080312，珠海联邦制药股份有限公司；
硫酸粘杆菌素(COS)，含量为23694IU/mg，批号N0710003J，丽珠集团福州福兴制药股份有限公司；
1.2受试菌株
分离菌株：猪大肠杆菌17株；猪巴氏杆菌6株；猪、鸡沙门氏菌共8株；奶牛乳房炎金葡球菌10株；猪、牛链球菌共16株；猪胸膜肺炎放线杆菌7株。
质控菌株：ATCC25922、ATCC29213、ATCC49619，均购自中国兽药监察所。
1.3培养基
MH肉汤培养基，批号20071102，MH琼脂培养基，批号20071103，北京奥博星生物技术责任有限公司。上述各种培养基按照常规方法制备，经过无菌检查合格后，置于4℃冰箱中保存，用于培养大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌和金葡球菌。用于培养猪多杀性巴氏杆菌、链还球菌的培养基则在上述配制方法中添加5％(V/V)的优级胎牛血清。用于培养猪胸膜肺炎放线杆菌的培养基为PPLO培养基。
1.4主要仪器
(1)分光光度计：721型，山东高密分析仪器厂。
(2)微量棋盘稀释法联合药敏试验板：天津金章科技开发有限公司。
(3)连续微量加样器、八道微量加样器：美国Eppendorf公司。
2试验方法
2.1药物原液的配制及保存
阿莫西林原液：用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)将阿莫西林配成浓度为1280μg/mL的药物原液，用高压灭菌过的0.2μm孔径滤头过滤，分装至2mL离心管中，置-20℃冰箱中保存，待用。
硫酸粘菌素原液：用蒸馏水将硫酸粘菌素配成浓度为2560μg/mL的药物原液，用高压灭菌过的0.2μm孔径滤头过滤，分装至灭菌2mL塑料离心管中，密封，置-20℃冰箱中保存，待用。
2.2菌液的制备
2.2.1大肠杆菌、沙门氏菌、金葡球菌菌液的制备
从保存菌种的培养基斜面上蘸取少许菌落，接种于MH肉汤培养液中，在37℃培养18h，将培养所得原菌液以10-1倍比稀释，分别如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；将各菌液分别取10-6、10-7、10-8的浓度以微量加样器取100μL到预先准备好的MH琼脂平板中，L型玻璃棒灼烧灭菌，冷却后，将菌液均匀涂布在培养基表面(无菌检查合格)；然后将平板培养基放入隔水式恒温培养箱中，培养24小时后观察，计算菌液浓度。确定原菌原液的浓度，然后用灭菌生理盐水稀释到106CFU/ml，置4℃冰箱备用，保存时间不超过6h。
2.2.2多杀性巴氏杆菌、链球菌菌液的制备
从保存菌种的斜面上蘸取少许菌苔，接种鲜血MH肉汤培养液中，在37℃培养18h，将原菌液以10-1倍稀释，分别如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；将各菌液分别取10-6、10-7、10-8的浓度以微量加样器取100μL到预先准备好的鲜血MH琼脂平板中，将L型玻璃棒在火焰上灼烧灭菌，冷却后，将菌液均匀推散在培养基表面(无菌检查合格)；然后将平板培养基放入隔水式恒温培养箱中，培养24小时后观察，计算菌液浓度。确定菌原液的浓度，然后用灭菌生理盐水稀释到106CFU/ml，置4℃冰箱备用，保存时间不超过6h。
2.2.3猪胸膜肺炎放线杆菌菌液的制备
从保存菌种的斜面上蘸取少许菌苔，接种于PPLO培养基中，在37℃培养18h，将原菌液以10-1倍稀释，分别如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；将各菌液分别取10-6、10-7、10-8的浓度以微量加样器取100μL到预先准备好的PPLO培养基中，将L型玻璃棒在火焰上灼烧灭菌，冷却后，将菌液均匀推散在培养基表面(无菌检查合格)；然后将平板培养基放入隔水式恒温培养箱中，培养24小时后观察，计算菌液浓度。确定菌原液的浓度，然后用灭菌生理盐水稀释到106CFU/ml，置4℃冰箱备用，保存时间不超过6h。
2.3MIC的测定
2.3.1大肠杆菌、沙门氏菌和金葡球菌MIC的测定
采用肉汤微量稀释法：以灭菌MH肉汤将阿莫西林原液、硫酸粘杆菌素原液倍比稀释11个浓度(阿莫西林从0.125-512μg/mL，硫酸粘杆菌素从0.0625-128μg/mL)，分别取100μL加入96孔板微量孔中，之后加入一定浓度菌悬液，使每孔最终细菌浓度为5×105CFU/mL，并设细菌生长对照和空白对照，37℃恒温培养箱中培养24h，以无细菌生长的最低抗菌单药药物浓度为MIC。大肠杆菌ATCC25922为MIC测定的质控菌。
2.3.2巴氏杆菌和链球菌MIC的测定
采用肉汤微量稀释法：以血清肉汤将阿莫西林原液、硫酸粘菌素原液倍比稀释11个浓度(阿莫西林从0.125-128μg/mL，硫酸粘杆菌素从0.031-64μg/mL)，分别取100μL加入96孔板微量孔中，之后加入一定浓度菌悬，使每孔最终细菌浓度为5×105CFU/mL，并设细菌生长对照和空白对照，37℃恒温培养箱中培养24h，以无细菌生长的最低抗菌单药药浓度为MIC。
2.3.3猪胸膜肺炎放线杆菌MIC的测定
以PPLO培养基将阿莫西林原液、硫酸粘菌素原液倍比稀释11个浓度(阿莫西林从0.125-128μg/mL，硫酸粘杆菌素从0.031-64μg/mL)，分别取100μL加入96孔板微量孔中，之后加入一定浓度菌悬，使每孔最终细菌浓度为5×105CFU/mL，并设细菌生长对照和空白对照，37℃恒温培养箱中培养24h，以无细菌生长的最低抗菌单药浓度为MIC。
2.4联合药敏试验
根据单药的MIC的结果，将阿莫西林原液、硫酸粘菌素原液分别用肉汤倍比稀释成6个不同的工作浓度，按棋盘法设计，将两药先后分别加入到96孔板的每个孔中，每孔中每种抗菌药物取50μl，使各孔中的每种药物最终浓度分别为其单药的1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC、2MIC和4MIC，并分别设两药的单药对照、细菌生长对照和空白对照。再将106CFU/mL的菌液100μL加入各孔中，使各孔中细菌的终浓度为5×105CFU/mL，37℃培养24h，观察并记录结果。每菌株重复棋盘试验3次。选择最佳组合效应时各自的MIC甲药联用、MIC乙药联用以计算FIC指数。
FIC指数计算与判读标准：
FIC指数≤0.5，协同作用；＞0.5～1，相加作用；＞1～2，无关作用；＞2，拮抗作用。
3试验结果
3.1阿莫西林与硫酸粘菌素单用及联用时对大肠杆菌、金葡萄球菌等的体外药敏试验结果见表1-1～表1-6。
表1-1AMO与COS单用及联用对猪大肠杆菌的体外药敏试验结果(MIC单位为ug/mL)
表1-2AMO与COS单用及联用对金黄色葡萄球菌的体外药敏试验结果(MIC单位为ug/mL)
表1-3AMO与COS单用及联用对链球菌的体外药敏试验结果(MIC单位为ug/ml)
表1-4AMO与COS单用及联用对沙门氏菌的体外药敏试验结果(MIC单位为ug/ml)
表1-5AMO与COS单用及联用的对巴氏杆菌的体外药敏试验结果(MIC单位为ug/ml)
表1-6AMO与COS单用及联用对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外药敏试验结果(MIC单位为ug/ml)
据联合药敏试验可知，联合用药后，阿莫西林联用后的MIC为单用时MIC的1/16～1，部分菌株的MIC值明显下降；尤其对一些耐阿莫西林的大肠杆菌菌株和金葡球菌，联用后AMO的MIC值降至耐药断点(breakpoint)以下，使耐药菌株变为敏感菌株；硫酸粘菌素联合后的MIC为单用时MIC的1/8～1，MIC值也有不同程度的下降。
3.2AMO与COS联合应用的FIC指数分布(见表1-7)，AMO与COS联合应用，FIC指数分布集中在0.5～1，表明两者联用对大多数细菌呈相加作用(70％～100％)，对金葡球菌有30％呈协同作用，对巴氏杆菌则有33.33％呈无关作用，但均无拮抗作用。
表1-7AMO与COS联用后对细菌MIC的影响
4结论
上述实验结果表明，将阿莫西林、硫酸粘菌素制成复方制剂使用对链球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌均有协同或相加作用，拓宽了抗菌谱，增强了抗菌效力。
实验二、阿莫西林与硫酸粘菌素联合对大肠杆菌防突变浓度的研究
为探讨阿莫西林与硫酸粘杆菌素联合应用是否能延缓药物耐药性的产生，本发明用标准肉汤稀释法测定了阿莫西林、硫酸粘杆菌素对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)，并用琼脂稀释法测定了阿莫西林对大肠杆菌的防突变浓度(MPC)，考察了与硫酸粘菌素联合使用后，阿莫西林对大肠杆菌防突变浓度及耐药频率的变化。
1材料与仪器
1.1供试药品
阿莫西林(AMO)，含量为99.5％，批号20080312，珠海联邦制药股份有限公司；
硫酸粘杆菌素(COS)，含量为23694IU/mg，批号N0710003J，丽珠集团福州福兴制药股份有限公司；
1.2受试菌株
受试菌株9株，其中大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)购自中国兽药监察所；另8株猪大肠杆菌为临床分离株。
1.3培养基
MH肉汤培养基，批号20071102，MH琼脂培养基，批号20071103，北京奥博星生物技术责任有限公司。上述各种培养基按照常规方法制备，经过无菌检查合格后，置于4℃冰箱中保存。
1.4主要仪器
(1)分光光度计：721型，山东高密分析仪器厂。
(2)微量棋盘稀释法联合药敏试验板：天津金章科技开发有限公司。
(3)连续微量加样器、八道微量加样器：美国Eppendorf公司。
2试验方法
2.1药物原液的配制及保存
阿莫西林原液：用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)将阿莫西林配成浓度为1280μg/mL的药物原液，用高压灭菌过的0.2μm孔径滤头过滤，分装至2mL离心管中，置-20℃冰箱中保存，待用。
硫酸粘菌素原液：用蒸馏水将硫酸粘菌素配成浓度为2560μg/mL的药物原液，用高压灭菌过的0.2μm孔径滤头过滤，分装至灭菌2mL塑料离心管中，密封，置-20℃冰箱中保存，待用。
2.2菌液的制备
从保存菌种的培养基斜面上蘸取少许菌落，接种于MH肉汤培养液中，在37℃培养18h，将培养所得原菌液以10-1倍比稀释，分别如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；将各菌液分别取10-6、10-7、10-8的浓度以微量加样器取100μL到预先准备好的MH琼脂平板中，L型玻璃棒灼烧灭菌，冷却后，将菌液均匀涂布在培养基表面(无菌检查合格)；然后将平板培养基放入隔水式恒温培养箱中，培养24小时后观察，计算菌液浓度。确定原菌原液的浓度，然后用灭菌生理盐水稀释到106CFU/ml，置4℃冰箱备用，保存时间不超过6h。
2.3MIC的测定
采用肉汤微量稀释法：以灭菌MH肉汤将阿莫西林原液、硫酸粘杆菌素原液倍比稀释11个浓度(阿莫西林从0.5-512μg/mL，硫酸粘杆菌素从0.031-32μg/mL)，分别取100μL先后加入96孔板的每个微量孔中，之后在每个孔中加入一定浓度菌悬液，使每孔最终细菌浓度为5×105CFU/mL，并设细菌生长对照和空白对照，37℃恒温培养箱中培养24h，按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准判定MIC值。大肠杆菌ATCC25922为MIC测定的质控菌。
2.4防突变浓度(MPC)测定：
防突变浓度(MPC)是指防止耐药突变菌株被选择性富集扩增所需的最低抗菌药物浓度。MPC理论为有效抑制细菌耐药及制定抗菌药物应用策略提供了新的思路和参考依据。
单药MPC测定：将单个菌落接种于20mL MH肉汤中，37℃过夜振荡培养，4℃3000r/min离心富集后，细菌再悬浮在200mL MH肉汤(10倍原液)中，振荡培养6h，菌液浓度达6×109～9×109CFU/mL时，收集全部菌液，4℃3000r/min离心30min富集后，用新鲜肉汤将菌液浓度调整为3×1010CFU/mL。取100μL菌液分别置于90mm直径含不同浓度AMO、COS的M-H平板上，用L棒将菌涂匀，35℃培养72～96h，进行菌落计数，按文献(Zhao X，Drlica K.Restricting the selection of antibioticresistant mutant bacteria：measurement and potential use of the mutantselection window[J].J Infect Dis，2002，185：561-565.)的方法计算单药的MPC。所有实验重复3次，取其均值。
联合用药MPC测定：取上述菌液100μL分别置于含1×、2×、4×、8×、16×、32×MIC的AMO及加有COS 2mg/L的平板孔内，用L棒将菌涂匀，35℃培养72～96h，计数菌落。耐药频率计算按文献(Zhanel G G，Mayer M，Laing N，et al.Mutantprevention concentrations of levofloxacin，ciprofloxacin alone and incombination with azithromycin cef-tazidime，colistin(polymyxin E)，meropenem，piperacillin tazobactam，and tobramycin gainst Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob，Agents Chemother.2006.50(5)：2228-2230.)：将不同浓度的阿莫西林、硫酸粘菌素平板上的菌落数除以接种的菌落数。所有实验重复3次，取其均值。
2.5数据分析采用SPSS 10.0统计软件对各组数据进行秩和检验。
3结果
3.1阿莫西林和硫酸粘菌素单药对猪大肠杆菌的MIC值见表2-1。
表2-1AMO和COS对猪大肠杆菌的MIC值(mg/L)
3.2阿莫西林单用及与硫酸粘菌素联合使用对猪大肠杆菌的MPC和MPC/MIC值见表2-2。
表2-2AMO单用及与COS联用对猪大肠杆菌的MPC和MPC/MIC值(mg/L)
注：AMO与COS联用的MPC/MIC与其单用的MPC/MIC比较，差异均有显著性(P＜0.05)
3.3阿莫西林与硫酸粘菌素联合使用对猪大肠杆菌的耐药频率见表2-3。
表2-3AMO与COS联合使用对猪大肠杆菌的耐药频率
注：AMO与COS联用时耐药频率较其单用时差异有显著性(P＜0.05)
4结论
上述实验结果表明，阿莫西林与硫酸粘菌素联合用药的MPC/MIC较阿莫西林单独用药的MPC/MIC下降2～16倍，联合用药后，阿莫西林的耐药频率较其单用时明显下降(P＜0.05)。由于AMO和COS的抗菌机制不同，有不同的作用靶点，因此细菌需对两种药同时耐药才能生存，两者联用后，缩小了耐药选择窗，提高了细菌突变的阈值，降低MPC/MIC比值，使MPC/MIC和耐药频率大大下降。因此，与硫酸粘菌素合用后，阿莫西林抗耐药能力增强，减少了耐药菌株的产生，因此可以延缓耐药性的产生。
实验三、阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液药效实验
1.试验材料和方法
1.1受试药物
①本发明所述含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，按实例3配制，称为A-C-P。
②注射用阿莫西林钠，商品名为莫萨，山东鲁抗医药股份有限公司；I
③硫酸粘菌素水溶性注射液，商品名为泻痢停，北京中农大动物保健品集团湘潭兽药厂；
④氨苄西林-硫酸粘菌素-地塞米松混悬液，商品名为Multibio d，法国维克公司制药厂；
⑤阿莫西林、硫酸粘菌素混悬液，按实例3制备而得，不含有泼尼松龙，称为A-C。
1.2细菌接种
胸膜肺炎放线杆菌购自于中国兽医药品监察所，为血清I型，编号为259。经PPLO琼脂培养24小时后，经计数稀释为1.0×106CFU/ml备用。猪接种程序简述如下，将每头猪采取背位方式绑缚于特制的支架上，接种部位涂以1％普鲁卡因局麻，用35毫米，18号针头通过气管两软骨环之间刺入，以0.05ml/kg(1.0×106CFU/ml)体重的剂量接种胸膜肺炎放线杆菌，阴性对照组以相同剂量注射无菌生理盐水。在接种4小时后给药。
1.3试验动物及处理
86头体重为20-25千克的杜洛克长白二元杂交猪，饲喂无抗生素添加剂的常规饲料，猪自由饮水。经一周的静养期后，随机分为9组。除空白对照组外，其余各组每头猪按0.05ml/kg(1.0×106CFU/ml)体重的剂量气管注射接种胸膜肺炎放线杆菌，阴性对照组以相同剂量注射无菌生理盐水。在接种4小时后，按表3-1的试验设计方法给药。所有猪在实验前经鼻腔采集分泌物进行细菌分离培养，结果未能在鼻腔分泌物中检测出胸膜肺炎放线杆菌。各组动物在同一条件下饲养，日粮组成和营养水平完全一样，试验周期为2周。
表3-1试验设计
| 组别 | 动物数(头) | 药物 | 剂量与方法 |
| 高剂量组 | 10 | A-C-P | 肌内注射，AMO 20mg/kg、COS 50,000IU/kg和PRE 0.1mg/kg体重，一日1次，连用5日。 |
| 中剂量组 | 10 | A-C-P | 肌内注射，AMO 10mg/kg和COS 25,000IU/kg和PRE 0.05mg/kg体重，一日1次，连用5日。 |
| 低剂量组 | 10 | A-C-P | 肌内注射，AMO 5mg/kg和COS 12,500IU/kg和PRE 0.025mg/kg体重，一日1次，连用5日。 |
| 药物对照组I | 10 | 莫萨 | 肌内注射，AMO 10mg/kg体重，一日2次，连用5日。 |
| 药物对照组II | 10 | 泻痢停 | 肌内注射，COS 25,000IU/kg体重，一日2次，连用5日。 |
| 药物对照组III | 10 | A-C | 肌内注射，AMO 10mg/kg和COS 25,000IU/kg体重，一日1次，连用5日。 |
| 药物对照组IV | 10 | Multibio d | 肌内注射，氨苄西林10mg/kg和COS25,000IU/kg和地塞米松0.025mg/kg体重，一日1次，连用5日。 |
| 阳性对照组 | 10 | 感染不给药 | - |
| 阴性对照组 | 6 | 不感染不给药 | - |
注：表中AMO代表阿莫西林、COS代表硫酸粘菌素、PRE代表泼尼松龙。
1.4饲养管理与观察
各试验组分别于试验开始和试验结束时称量每头猪的体重。人工感染后每天早、晚观察一次呼吸、食欲、精神状态等临床人工感染后每天密切观察每头猪的临床表现，如呼吸，食欲及精神状态等表现，测量直肠体温。记录各组猪的发病数及死亡数。对死亡猪进行剖检，观察肺、肝脾、心脏、肠系膜等的变化。对所有死亡猪及试验结束后部分猪宰杀，取肝、脾涂胰蛋白胨大豆琼脂平皿培养基，37℃培养20～48，检查是否有细菌生长，对检出的细菌，进行一系列实验室检测以检查是否为胸膜肺炎放线杆菌。
1.5疗效判断标准
治愈：试验期间，用药猪临床症状消失，精神、食欲、体温、呼吸等恢复正常，增重接近或超过空白对照组；剖检后可见肺部有陈旧性病灶，细菌分离无胸膜肺炎放线杆菌。根据治愈头数占该组试验头数的比例计算治愈率。
显效：试验期间，症状明显减轻或消失，体重在试验前后无明显变化或略有增加。剖检后可见肺部有一定的病变，细菌分离后可见携带胸膜肺炎放线杆菌。根据显效数占该组试验头数的比例计算显效率。
有效：试验期间，精神状态有明显好转、食欲增加、有轻度腹式呼吸或咳嗽。根据有效头数占该组试验头数的比例计算有效率，计算有效率时有效头数包括显效头数与治愈头数。
无效：试验期间，试验猪精神、食欲、呼吸、体温等症状仍不好转甚至恶化死亡者。根据无效头数占该组试验头数的比例计算无效率。
1.6增重
于试验开始和试验结束时称量每头猪的体重，计算平均增重量。
1.7数据统计分析
采用卡方检验(SPSS10.0统计分析软件)进行统计分析。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05表示差异不显著。
2试验结果及小结
2.1空白对照组猪只在试验期间精神良好、饮食欲正常，体温38℃～40℃，属正常范围。
2.2阳性感染对照组猪群于接种后2～3h，开始出现短暂性呕吐、呼吸急促、体温升高0.5～1℃。4～6h后，呼吸急促并呈明显的腹式呼吸，体温升高1.5-2.5℃。最终出现呼吸困难，呈犬坐姿势，很快死亡，最急性型死亡多发生在4-24h，阳性感染对照组有7头猪在24h内死亡，另有3头猪在感染24～48h内死亡。
2.3病猪死后于口腔和鼻孔流出大量的血色分泌物。尸检可见胸腔积有淡红色血样液体，肺脏暗红色、充血肿大，流出大量血色液体。气管和支气管内充满带血色的黏液性泡沫样渗出物，病程稍长的猪可发现肺脏表面有白色纤维素性渗出物，乃至与胸腔粘连，病程较长的猪，脾脏、肝脏暗黑色。
2.4经气管接种胸膜肺炎放线杆菌菌液后，所有接种猪均出现典型的胸膜肺炎临床症状。与阳性对照组比较，各组药物经用药治疗后，临床症状有不同程度的改善，即发病猪的咳嗽、呼吸困难、精神沉郁等症状得到明显减缓，食欲逐步恢复；各用药组猪的存活数均显著高于阳性对照组(P＜0.05)，表明各用药对猪胸膜肺炎均有一定的保护作用。A-C-P高、中剂量组的治愈率、有效率、平均增重率均明显高于A-C-P低剂量组、莫萨组和泻痢停组(P＜0.05)，表明A-C-P高、中剂量组的疗效优于A-C-P低剂量组、莫萨组和泻痢停组；A-C-P高、中剂量组间的治愈率、有效率、平均增重率相比无显著差异(P＞0.05)，表明在临床治疗猪传染性胸膜肺炎感染过程中，A-C-P以中剂量做为临床推荐用药剂量是合理的；A-C-P中剂量组与市售药物Multibio d组相比，其治愈率、显效率和有效率无显著差异(P＞0.05)，但A-C-P中剂量组的治愈率、显效率均高出10％，有效率高出20％，市售药物Multibio d有20％的无效率，表明A-C-P在等剂量条件下总体疗效优于市售药物Multibio d。具体试验数据见表3-2。
表3-2各组治疗试验结果(X±SD)
*：与A-C-P高、中剂量组、药物对照组IV相比差异显著(p＜0.05)；
★：与健康对照组相比差异显著(p＜0.05)
2.5在进行呼吸、食欲及精神状态等的观察过程中，发现A-C-P高、中剂量组和市售药物Multibio d组分别有7、6、5头猪在感染后7天即能恢复到健康状态，而A-C组、莫萨组和泻痢停组仅分别为2、1、0头。A-C组、莫萨组和泻痢停组恢复到健康状态的时间大多集中在感染后的第9-14天，恢复时间远长A-C-P高、中剂量组和市售药物Multibio d组，原因是A-C-P组和市售药物Multibio d组的药物配方中均含有糖皮质激素类抗炎成分(A-C-P和Multibio d配方中分别含有泼尼松龙和地塞米松)，糖皮质激素类药物具有抗炎、抗内毒素、增强机体免疫力等作用，因此在抗感染治疗中起到辅助治疗的作用，利于病畜健康体质的恢复。从15天增重的结果中也可看出，含有糖皮质激素类药物的治疗组在合适的给药剂量情况下，增重的程度与健康对照组无显著的差别，这与治疗后机体恢复到健康水平的时间长短有一定的相关性。
2.6本试验选择了Multibio d作为其中的一种对照药物，主要考虑到该药的主要成分与本发明的混悬液成分较为相似，该药物为法国维克公司生产，在欧美地区用于奶牛乳房炎的治疗(目前该产品尚未在中国注册)。试验结果表明，本发明的混悬液产品从治愈率、有效率和机体恢复正常状态的时间等疗效判断指标方面均优于Multibiod，表明在防治猪传染性胸膜肺炎的药物选择上，本发明的产品是首选药物。两者与对照的A-C产品(无泼尼松龙)相比较，在恢复正常状态的时间和增重方面有显著差异(p＜0.05)，从而表明抗炎成分在治疗过程中起到了重要作用。
实验四阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液对猪传染性胸膜肺炎与大肠杆菌病混合感染的疗效实验
实验目的：考察本发明的混悬液产品与市售的产品对猪传染性胸膜肺炎与大肠杆菌病混合感染的疗效。
1.试验材料和方法
1.1受试药物
①本发明所述含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，按实例3配制，称为A-C-P。
②氨苄西林-硫酸粘菌素-地塞米松混悬液，商品名为Multibio d，法国维克公司制药厂(在中国未注册)；
③阿莫西林、硫酸粘菌素混悬液，按实例3制备而得，不含有泼尼松龙，称为A-C。
1.2试验动物：选择广西、湖南、北京、山东等猪场2-3月龄的仔猪，品种为杜洛克×长白×大约克三元杂、杜洛克×长白二元杂等。自然感染猪肺大肠杆菌和传染性胸膜肺炎。
1.3诊断依据
1.3.1临诊症状：患猪突然发病，精神沉郁，食欲减少或废食，高烧40.5～42℃，可视性粘膜潮红；咳嗽、喷嚏，呼吸加快，喘气，犬坐势张口腹式呼吸；有的病猪连续性咳嗽，严重者呼吸极度困难，鼻流浆液或粘液性鼻液，走路摇摆，共济失调，或卧地不起，驱赶四肢呈鸭泳状；头、颈、颌下、腹下、四肢末端皮肤出现紫红色病猪最后衰竭而窒息死亡。
1.3.2病理变化：病死猪全身苍白色，口鼻流出淡红色或红色泡沫样液体。气管、支气管充满泡沫液，胸膜腔有淡黄色的积液，胸膜腔浆膜与内脏被膜有纤维素性薄膜，常与胸膜腔粘连；肺、心脏、肝脏肿大、充血、出血；胃底部的胃壁增厚、有胶冻样液体、条状出血斑和出血点，肠粘膜水肿，有点状和条状出血，有的肠粘膜有出血性炎症。
1.3.3病原分离鉴别
1.3.3.1采集的小肠前段内容物、肝、脾、心、病变部位淋巴结组织接种普通琼脂、麦康凯琼脂，培养后观察：①普通琼脂平板长出中等大小、圆形、半透明、灰白色、露珠状的菌落；麦康凯琼脂平板长出红色菌落。②染色镜检：革兰氏染色镜检为阴性短小杆菌。③生化特性：该菌能发酵麦牙糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇，产生靛基质，M-R试验阳性，不产生硫化氢，不分解尿素。判定该菌为大肠杆菌。
1.3.3.2采集的肺、心、脾、肾等组织接种PPLO琼脂平板，培养后观察：①菌落为针尖大小，圆形，边缘整齐，表面光滑，灰白色露珠状；②染色镜检：革兰氏染色镜检为阴性红色小球杆菌；③生化特性：该菌可发酵果糖、乳糖，不发酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖及甘露糖。靛基质、甲基红、V-P试验为阴性。可水解尿素酶。判定为胸膜肺炎放线杆菌。
1.4试验动物及处理
采用多个中心、多个养殖场、随机控制分组的方法将6个不同养殖场的112头仔猪，做为本实验的病例选择。饲喂无抗生素添加剂的常规饲料，猪自由饮水。所有猪只随机分为4组。按表4-1的试验设计方法给药。
表4-1试验设计
| 药物 | 动物数(头) | 剂量与方法 |
| A-C-P | 35 | 肌内注射，AMO 10mg/kg、COS 25,000IU/kg和PRE 0.05mg/kg体重，一日1次，连用4日。 |
| Multibio d | 32 | 肌内注射，AMP 10mg/kg和COS 25,000IU/kg和DEX 0.025mg/kg体重，一日1次，连用4日。 |
| A-C | 30 | 肌内注射，AMO 10mg/kg和COS 25,000IU/kg体重，一日1次，连用4日。 |
| 患病不给药组 | 15 | - |
注：表中AMO代表阿莫西林、AMP代表氨苄西林、COS代表硫酸粘菌素、DEX代表地塞米松、PRE代表泼尼松龙。
1.5药效观察：从开始给药到观察结束共12天，观察各组试验猪的呼吸、食欲、精神状态等临床症状，并作好详细记录。
1.6疗效判断标准
治愈：给药4天后试验猪精神状态、食欲呼吸、体温各方面均恢复正常，不再出现跛行、下痢等临床症状，停药后无复发。分别在停药后第3、6和试验结束时统计治愈率。根据治愈头数占该组头数的比例计算治愈率。
有效：给药4天后试验猪精神状态有明显好转、食欲增加、有轻度腹式呼吸或咳嗽，有跛行、下痢现象。有效头数与治愈头数之和为总有效头数，根据总有效头数占该组试验头数的比例计算总有效率。
无效：给药4天后试验猪精神、食欲、呼吸体温、跛行、下痢等症状仍不好转甚至恶化死亡者。根据无效头数占该组试验头数的比例计算无效率。
1.6数据统计分析
采用卡方检验(SPSS10.0统计分析软件)进行统计分析。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05表示差异不显著。
2试验结果及小结
2.1患病不给药对照组的猪经观察，在5天内症状均无明显变化或加重甚至死亡，为减少损失即采取治疗处理。
2.2A-C-P组、Multibio d组和A-C组对猪传染性胸膜肺炎与大肠杆菌病混合感染的治愈率分别为82.9％、75.0％和73.3％，总有效率分别为91.4％、81.3％、80.0％；具体试验数据见表4-2。
表4-2各组治疗试验结果(X±SD)
*：与A-C-P组相比差异显著(p＜0.05)；★：表示自愈率。
2.3统计分析表明：A-C-P组、Multibio d组和A-C组与患病不给药组相比较，其治愈率、总有效率差异极为显著(P＜0.01)，表明三种药物对猪传染性胸膜肺炎与大肠杆菌病混合感染均有良好的疗效。A-C-P组与A-C组、市售药物Multibio d组相比较，其总有效率差异不显著(P＞0.05)，但A-C-P组的总有效率比A-C组、市售药物Multibiod组分别高出11.4％和10.1％，表明A-C-P的总体疗效优于A-C和市售药物Multibio d。
2.4本试验对治愈率这个主要考察指标进行了3个阶段的考察，试验结果表明，3种药物在停药后第3天都具有较高的治愈率，但效果有所不同，停药后第3天，A-C组的治愈率与A-C-P组相比较，差异显著(P＜0.05)，A-C组的治愈率与市售药物Multibiod组相比较无显著差异(P＞0.05)，但其治愈率比市售药物Multibio d低15.6％，其它阶段(停药后第6天和试验结束时)相比较无显著差异(P＞0.05)。表明A-C-P组、Multibio d组使病猪恢复到正常状态的时间要短于A-C组，原因是A-C-P组、Multibiod组配方中均含有抗炎成分，有助于病畜机体的恢复。
2.5从总有效率和机体恢复时间的长短综合考虑，本发明的混悬液产品的总体疗效均优于A-C和市售药物Multibio d，表明本发明的混悬液产品更适用于猪传染性胸膜肺炎与大肠杆菌病混合感染的治疗。
Claims (9)
1.一种含阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液，是以阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙为有效成分的兽用混悬液；所述兽用混悬液中各有效药物成分的含量为：阿莫西林10-20％，硫酸粘菌素0.5-2.5％，泼尼松龙0.02-0.05％；％含义为g/100mL。
2.根据权利要求1所述的兽用混悬液，其特征在于：所述兽用混悬液中还包括以下药物辅料：分散媒、助悬剂、润湿剂、抗氧剂和防腐剂。
3.根据权利要求2所述的兽用混悬液，其特征在于：所述分散媒选自注射用大豆油、油酸乙酯、三乙酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙脂和注射用蓖麻油中的一种或两种的复合。
4.根据权利要求2所述的兽用混悬液，其特征在于：所述助悬剂选自硬脂酸铝、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、胆固醇、凡士林、羧甲基纤维素钠和氢化蓖麻油中的一种或两种的复合；助悬剂含量为0.2-1.5％，％含义为g/100mL。
5.根据权利要求2所述的兽用混悬液，其特征在于：所述润湿剂选自吐温-80、司盘-60、司盘-80和环氧乙烯-40-氢化蓖麻油中的一种或两种；润湿剂含量为0.2-1.3％，％含义为ml/100mL。
6.根据权利要求2所述的兽用混悬液，其特征在于：所述抗氧剂选自维生素E、硫脲、叔丁基羟基茴香醚、偏重亚硫酸钠和没食子酸丙脂中的一种或两种；抗氧剂含量0.01-1％，％含义为g/100mL。
7.根据权利要求2所述的兽用混悬液，其特征在于：所述防腐剂选自苯甲醇、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯中的一种或两种；防腐剂含量0.005-1％，％含义为g/100mL。
8.根据权利要求2所述的兽用混悬液，其特征在于：所述兽用混悬液中各成分的含量为：阿莫西林10-20％，硫酸粘菌素0.5-2.5％，泼尼松龙0.02-0.05％，助悬剂0.1-2％，润湿剂0.2-2％，抗氧剂0.01-1％，防腐剂0.005-1％，其余为分散媒；其中，润湿剂％含义为ml/100mL，其它组分％含义为g/100mL。
9.一种制备权利要求2至8任一所述含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液的方法，包括以下步骤：
1)取助悬剂、抗氧化剂和防腐剂溶于或分散于热分散媒中，得到A液；
2)取配方量40-80％(V/V)的分散媒倒入胶体磨中，启动胶体磨，然后缓缓加入上述A液，待全部加入完全，边搅拌边加入润湿剂；
3)待全部辅料加入完全，依次加入阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙，然后采用循环研磨和非循环研磨相交替的方式进行研磨；
4)检查颗粒细度，符合要求后停止研磨，加分散媒至配方量，混匀，灌装，密封，灭菌，得到含有阿莫西林、硫酸粘菌素和泼尼松龙的兽用混悬液。
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