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CN101932311B - 微粒及其药物组合物 - Google Patents

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CN101932311B CN200980103776.3A CN200980103776A CN101932311B CN 101932311 B CN101932311 B CN 101932311B CN 200980103776 A CN200980103776 A CN 200980103776A CN 101932311 B CN101932311 B CN 101932311B
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Abstract

本发明涉及一种由含有两亲性聚合物及亲水性活性物质的亲水性活性物质含有粒子附聚而成的微粒，其中，所述两亲性聚合物由聚(羟基酸)的疏水性片段和多糖或聚乙二醇的亲水性片段组成，所述微粒能有效地封入亲水性活性物质，并能在生物体内以合适的速度释放亲水性活性物质，因此作为DDS制剂是有用的。

Description

微粒及其药物组合物
技术领域
本发明涉及一种由含有亲水性活性物质的粒子附聚而成的微粒及其药物组合物。详细而言，本发明涉及一种作为所谓的给药系统(Drug Delivery System)的微粒及其药物组合物。更详细而言，本发明涉及一种有效地包封例如亲水性且大分子量的蛋白质·肽药物、核酸药物等的微粒及其药物组合物。
背景技术
人们已经开发了一种将药物封入被称为纳米粒，微粒，纳米球，微球或微胶囊等的微粒中的微粒制剂，并研究将其用作药物的缓释制剂。
作为以聚合物化合物为基材的微粒制剂，可以举出使用生物降解性聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)的微粒。上述微粒制剂中，很难在保持生理活性的状态下封入亲水性且大分子量的蛋白质·肽药物。并且，已知在对生物体进行给药时，能引起药物在短时间内大量释放的现象被称为突释(initial burst)。
作为由糖类和聚(羟基酸)以共价键形成的聚合物组成的微粒，专利文献1中公开了由多元醇和聚乳酸的反应产物组成的，用作药理学活性物质的微胶囊。在此技术中，没有使用多糖，也没有提到关于肽·蛋白质的封入。使用喷雾干燥法制备的微胶囊在24小时内释放了62％的封入药物。上述释放速度过快，妨碍该微胶囊作为药物缓释制剂的用途。
专利文献2、非专利文献1中公开了由下述材料组成的纳米粒或微粒，所述材料是在多糖上接枝生物降解性聚合物而形成的，但上述文献中没有提到关于纳米粒附聚形成的微粒。专利文献2中公开了例如以“双乳”法等已经在文献中记载的方法作为用于包封亲水性活性成分的微粒制备方法，但没有具体描述，没有实现将药物封入粒子或从粒子中释放药物。非专利文献1中公开了使用“双乳”法制备的封入有白蛋白的微粒，但相对于投入量白蛋白的封入率在53％以下，亲水性活性物质的低封入率存在制备成本提高的问题。
专利文献3公开了一种微粒，含有由多糖和脂肪族聚酯组成的两亲性聚合物，该微粒由下述物质形成：由多糖组成的内核、由脂肪族聚酯组成的疏水性外层、与疏水性外层键合的表面改性剂。上述粒子不具有微粒附聚的结构，并且没有关于粒径为微米尺寸的粒子的具体例子。另外，亲水性活性物质的封入率为50％以下，存在与上述相同的低封入率的问题。
专利文献4中公开了一种由葡聚糖的天然衍生聚合物组成的、平均粒径小于300nm的纳米粒，但没有举出具体例子。另外，不具有微粒附聚的结构，平均粒径为几百纳米，这些情况使药物易于从给药部位扩散，作为缓释制剂不理想。
另外，作为形成粒子的聚合物，专利文献5、专利文献6中探讨并公开了使用具有聚乙二醇等的亲水性片段和聚(乳酸-羟基乙酸)等的疏水性片段的两亲性嵌段聚合物。上述使用两亲性嵌段聚合物的胶束粒子，通常具有内部为疏水性、外层部为亲水性的结构，因此适合包封疏水性低分子药物，但难于包封蛋白、多肽等亲水性活性物质。
另外，专利文献7、非专利文献2中公开了尝试在使用两亲性嵌段聚合物的粒子中包封蛋白，但具有可包封的药物量少、或者突释大的缺点，因此，具有适合作为亲水性药物缓释注射剂的性质的粒子的制备技术尚未确立。
专利文献1：日本特公平8-19226号公报
专利文献2：日本特表2004-521152号公报
专利文献3：WO2006/095668
专利文献4：日本特表平10-511957号公报
专利文献5：日本特表2004-513154号公报
专利文献6：日本特表2004-514734号公报
专利文献7：日本特表2000-501084号公报
非专利文献1：大矢裕一及其他3人，“接枝聚乳酸的葡聚糖微球对牛血清白蛋白的封入及/或释放行为(Encapsulation and/orRelease Behavior of Bovine Serum Albumin within and fromPolylactide-Grafted Dextran Microspheres)”，MacromolecularBioscience，2004年，第4卷，p.458-463。
非专利文献2：AnshuYang及其他5人，“包封有阻断TNF-α的肽的PEG-PLGA粒子的制备及体外评价(Tumor necrosis factoralpha blocking peptide loaded PEG-PLGA nanoparticles：Preparationand in vitro evaluation)”，Intemational Joumal of Pharmaceutics，2007年，第331卷，p.123-132。
发明内容
如上所述，目前正在开发使用聚合物的微粒，本发明的课题在于提供一种微粒，该微粒能高效地封入亲水性活性物质，不发生明显的突释，并且能以合适的速度释放所封入的药物。
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明涉及一种微粒、其制备方法及其药物组合物，所述微粒由亲水性活性物质含有粒子附聚(agglomerate)而成，所述粒子含有两亲性聚合物及亲水性活性物质，所述两亲性聚合物由聚(羟基酸)的疏水性片段和多糖或聚乙二醇的亲水性片段组成，详细而言，所述微粒由下述亲水性活性物质含有粒子附聚而成，该粒子在内部具有两亲性聚合物的亲水性片段，并具有两亲性聚合物的疏水性片段的外层。
由于本发明的微粒能高效地封入亲水性活性物质，并能在生物体内以合适的速度释放亲水性活性物质，所以可以用作新型DDS制剂。
附图说明
[图1]从包封人生长激素的微粒中的药物释放。
[图2]从包封人胰岛素葡聚糖-PLGA的微粒中的药物释放。
[图3]葡聚糖-PLGA微粒的SEM图像。
[图4]聚乙二醇-聚(ε-己内酯)微粒的SEM图像。
[图5]皮下给与包封人生长激素的粒子的小鼠的血中药物浓度的经时变化。
[图6]皮下给与包封人生长激素的微粒的小鼠的血中药物浓度的经时变化。
[图7]皮下给与包封人生长激素的微粒的小鼠的体重变化。
[图8]皮下给与包封人生长激素的微粒的小鼠的血中IGF-1浓度的经时变化。
[图9]包封毒蜥外泌肽4(Exendin-4)的微粒在缓冲液中的药物释放。
[图10]皮下给与包封毒蜥外泌肽4的微粒的小鼠的血中药物浓度的经时变化。
[图11]从包封人生长激素的附聚粒子中的药物释放。
[图12]制备S/O/W型乳液时添加的碳酸二甲酯的量与粒径的关系。
[图13]包封FD40的微粒的包封率的结果。
[图14]由PEG-PLGA聚合物(5k-10k)制备的微粒粉末的SEM图像。
[图15]由PEG-PLGA聚合物(5k-61k)制备的微粒粉末的SEM图像。
[图16]从包封FD40的微粒中FD40的释放行为。
[图17]从包封人胰岛素的微粒中的药物的释放行为。
[图18]皮下给与包封人生长激素的微粒的小鼠的血中药物浓度的经时变化。
[图19]皮下给与包封人生长激素的微粒的小鼠的血中药物浓度的经时变化。
[图20]皮下给与包封人生长激素的微粒的小鼠的血中IGF-1浓度的经时变化。
[图21]皮下给与包封毒蜥外泌肽4的微粒的小鼠的血中药物动态的经时变化。
[图22]制备S/O/W型乳液时添加的碳酸二甲酯的量与粒径的关系。
具体实施方式
本发明的特征在于，含有两亲性聚合物及亲水性活性物质的亲水性活性物质含有粒子附聚，形成微粒。此处所谓的附聚，是指2个以上的粒子通过粒子间力或其他物质相结合，形成聚集体。对于粒子间力没有特殊限定，可以举出疏水性相互作用、氢键、范德华力。附聚不限于粒子间相互接触的状态，可以在粒子间存在与粒子具有亲和性的物质，也可以使粒子分散于基质中。作为与粒子具有亲和性的物质、基质，优选聚合物。本发明中，通过该亲水性活性物质含有粒子附聚，可以得到与为单独粒子的情况相比亲水性活性物质的包封率更高的效果。需要说明的是，附聚的该亲水性活性物质含有粒子的粒径可以不同。
微粒是指具有亚微米至亚毫米粒径的粒子。本发明微粒的平均粒径没有特殊限制，但是例如通过注射将该微粒给与生物体时，由于平均粒径越大需要使用的针头越粗，对患者来说负担越大，因此从减轻患者负担的观点考虑，优选1μm到50μm的范围。微粒的平均粒径可以使用扫描电子显微镜通过图像分析法求出。
构成微粒的亲水性活性物质含有粒子的附聚数，优选为10至107的范围，较优选为105至107的范围。附聚数可以由亲水性活性物质含有粒子的平均粒径和微粒的平均粒径计算。
本发明的特征在于，两亲性聚合物由聚(羟基酸)的疏水性片段与多糖或聚乙二醇的亲水性片段组成。此处所谓的两亲性是指，既具亲水性又具有疏水性的性质，亲水性是指，任意部位对水的溶解度高于其他片段时，称该部位为亲水性。亲水性片段优选可溶于水，即使是难溶的，只要与其他部位相比，对水的溶解度较高即可。另外，疏水性是指，任意部位对水的溶解度低于其他片段时，称该部位为疏水性。疏水性片段优选不溶于水，即使是可溶的，只要与其他片段相比，对水的溶解度较低即可。
作为两亲性聚合物的聚(羟基酸)链，具体而言，可以举出聚羟基乙酸、聚乳酸、聚(2-羟基丁酸)、聚(2-羟基戊酸)、聚(2-羟基己酸)、聚(2-羟基癸酸)、聚(苹果酸)或上述高分子化合物的衍生物及共聚物，但由于本发明的微粒优选为在对生物体给药时不产生显著不良影响的微粒，所以两亲性聚合物的聚(羟基酸)优选为生物适合性高分子。需要说明的是，此处所谓的生物适合性高分子，是指给与生物体时不产生显著不良影响的高分子，更具体而言，是指经口给与大鼠该高分子时LD50为2,000mg/kg以上的高分子。
作为生物适合性高分子即聚(羟基酸)，优选聚乳酸、聚羟基乙酸或聚(乳酸-羟基乙酸)的共聚物。聚(羟基酸)为聚(乳酸-羟基乙酸)时，对于聚(乳酸-羟基乙酸)的组成比(乳酸/羟基乙酸)(摩尔/摩尔％)没有特殊限定，只要能达到本发明的目的即可，但优选组成比为100/0～30/70，特别优选为60/40～40/60。
两亲性聚合物的亲水性片段为多糖时，作为多糖，可以举出纤维素、甲壳质、脱乙酰壳聚糖、吉兰糖胶(Gellan Gum)、藻酸、透明质酸、茁酶多糖或葡聚糖，优选葡聚糖。
上述两亲性聚合物优选在多糖主链上接枝聚合聚(羟基酸)的接枝链而形成。此处，多糖主链的平均分子量优选为1,000到100,000，较优选为2,000到50,000，聚(羟基酸)的平均分子量优选为500到100,000，较优选为1,000到10,000。另外，作为聚(羟基酸)平均分子量相对于多糖平均分子量的值，优选为0.01倍到100倍，较优选为0.02倍到10倍，更优选为0.02倍到1倍。
与多糖主链键合的聚(羟基酸)接枝链的数目优选为2到50。接枝链数目可以由接枝型两亲性聚合物、多糖主链、聚(羟基酸)接枝链的平均分子量求出。
两亲性聚合物的亲水性片段为聚乙二醇时，该两亲性聚合物优选为聚乙二醇与聚(羟基酸)的嵌段聚合物。本发明中，术语“嵌段”是指为聚合物分子的一部分，由至少5个以上的单体单元组成，与同其相邻的其他片段在化学结构上或立体构型上不同，将至少2个以上的嵌段以线状连接的聚合物称为嵌段聚合物。构成嵌段聚合物的各嵌段自身可以为由两种以上的单体单元组成的、随机、交替、梯度聚合物。需要说明的是，两亲性聚合物的亲水性片段为聚乙二醇时，该两亲性聚合物优选为分别连接有聚乙二醇和聚羟基酸各1个的嵌段聚合物。
两亲性聚合物的亲水性片段为聚乙二醇时，作为使用的聚乙二醇，可以举出直链或支链的聚乙二醇或其衍生物，优选直链聚乙二醇的衍生物。作为聚乙二醇衍生物的优选例子，可以举出聚乙二醇单烷基醚。作为聚乙二醇单烷基醚的烷基，可以举出碳原子数为1～10的直链状或支链状烷基，优选碳原子数为1～4的直链状或支链状烷基，较优选甲基、乙基、丙基、异丙基。
对于聚乙二醇的平均分子量没有特殊限制，优选为2,000～15,000，较优选为2,000～12,000，更优选为4,000～12,000，特别优选为5,000～12,000。
对于两亲性聚合物的亲水性片段为聚乙二醇时的聚(羟基酸)的平均分子量没有特殊限定，优选为5,000～200,000，较优选为15,000～150,000，更优选为20,000～100,000。另外，作为聚(羟基酸)的平均分子量相对于聚乙二醇的平均分子量的值，优选为1倍以上，较优选为2倍以上，更优选为4倍以上，特别优选为4倍以上25倍以下。
需要说明的是，本说明书中的平均分子量只要没有特殊说明则是指数均分子量，数均分子量是采用不考虑分子大小的重量的方法算出的平均分子量，两亲性聚合物、多糖及聚乙二醇的平均分子量可以作为使用凝胶渗透色谱(GPC)测定的聚苯乙烯或茁酶多糖换算的分子量而求出。另外，聚(羟基酸)的平均分子量可以通过核磁共振(1H-NMR)测定，由末端残基的峰积分值和末端残基之外的峰积分值的比求出。
本发明中使用的由多糖及聚(羟基酸)组成的两亲性聚合物，可以使用已知的方法合成，只要能形成反相乳液即可，对于合成方法没有限制，例如可以按照以下(1)、(2)或(3)方法进行制备。
(1)方法，在锡催化剂存在下，在多糖中加入羟基酸活性单体进行聚合反应，通过导入聚(羟基酸)，制备接枝型两亲性聚合物[Macromolecules，31，1032-1039(1998年)]。
(2)方法，在大部分羟基用取代基保护的多糖中将一部分未被保护的羟基用碱活化后，加入羟基酸活化单体，导入由聚(羟基酸)形成的接枝链，最后除去保护基团，由此制备接枝型两亲性聚合物[Polymer，44，3927-3933，(2003年)]。
(3)方法，使用脱水剂及/或官能团的活化剂使聚(羟基酸)的共聚物与多糖发生缩合反应，由此制备接枝型两亲性聚合物[Macromolecules，33，3680-3685(2000年)]。
本发明中使用的由聚乙二醇及聚(羟基酸)组成的两亲性聚合物，可以使用已知的方法合成，只要能够形成反相乳液即可，对于合成方法没有限制，例如，可以通过下述方法制备，即，在锡催化剂存在下，将羟基酸活性单体加到聚乙二醇中进行聚合反应，导入聚(羟基酸)，由此制备两亲性嵌段聚合物[Joumal of ControlledRelease，71，203-211(2001年)]。
对于上述含有两亲性聚合物和亲水性生理活性物质的亲水性活性物质含有粒子的结构没有特别限定，但是亲水性活性物质含有粒子在内部具有两亲性聚合物的亲水性片段，并具有两亲性聚合物的疏水性片段的外层时，由于被包封的亲水性活性物质能够被更稳定地保持，故优选。
亲水性活性物质含有粒子为在内部具有两亲性聚合物的亲水性片段、且具有两亲性聚合物的疏水性片段的外层的粒子时，在聚(羟基酸)外层键合表面改性剂也为优选方案之一。此处所说的键可以为非共价键也可以为共价键。非共价键优选疏水性相互作用，但也可以为静电相互作用、氢键、范德华力，也可以为上述作用复合形成的键。非共价键中，优选含有两亲性聚合物的微粒的疏水性外层与下述表面改性剂的疏水部分通过疏水性相互作用而键合。在这种情况下，微粒的分散介质特别优选为水、缓冲液、生理盐水、表面改性剂水溶液或作为亲水性溶剂的微粒分散介质。
表面改性剂优选能稳定S/O/W型乳液水-油界面或S/O1/O2型乳液油-油乳液界面的化合物，另外优选具有提高微粒的胶体稳定性的性质的化合物。表面改性剂可以为1种也可以为多种的混合物。此处，所谓提高胶体稳定性，是指防止或延迟微粒在溶剂中凝集。
本发明中，表面改性剂优选两亲性化合物或亲水性聚合物。
作为本发明中表面改性剂的亲水性聚合物，优选聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚-1，3-二氧戊环、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱聚合物、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、聚氨基酸、肽、蛋白质、糖类或上述物质中任一种的类似物。
作为上述亲水性聚合物的类似物，可以举出用长链烷基等疏水基团部分地修饰亲水性聚合物而得到的表面活性剂，但并不限定于此。
作为本发明中表面改性剂的聚乙二醇类似物，优选BASF出售的Pluronic(BASF的注册商标)或其同类产品。
作为本发明中表面改性剂的聚氨基酸，优选聚天冬氨酸或聚谷氨酸或它们的类似物。特别优选聚天冬氨酸或聚谷氨酸的一部分导入了长链烷基的类似物。
作为本发明中表面改性剂的肽，可以举出碱性肽。
作为本发明中表面改性剂的蛋白质，为了提高粒子的分散性，优选明胶、酪蛋白或白蛋白。作为蛋白质，作为一个优选例子也可以举出抗体。
作为本发明中的表面改性剂的糖类，优选单糖类、寡糖类、多糖类。作为多糖类，优选纤维素、甲壳质、脱乙酰壳聚糖、吉兰糖胶、藻酸、透明质酸、茁酶多糖或葡聚糖，胆固醇化茁酶多糖可以提高粒子的分散性故特别优选，优选纤维素、甲壳质、脱乙酰壳聚糖、吉兰糖胶、藻酸、透明质酸、茁酶多糖或葡聚糖中任一种的类似物。
作为表面改性剂的上述肽、蛋白质、糖类，特别优选部分地修饰有长链烷基等疏水基团等得到的类似物或对上述亲水性聚合物或两亲性化合物进行了修饰得到的类似物。
本发明的表面改性剂中，两亲性化合物为脂质，也是优选例之一。
本发明的表面改性剂中，两亲性化合物为表面活性剂，也是优选例之一。作为表面活性剂，优选聚氧乙烯聚丙二醇共聚物、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇二脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油单脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油二脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油等非离子性活性剂，或十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、十八烷基硫酸钠等烷基硫酸盐或卵磷脂。
本发明中所谓亲水性活性物质，可以举出低分子化合物、蛋白质、肽、DNA、RNA或修饰核酸。另外，即使为疏水性药物，也可以通过使用增溶剂等使其成为亲水性，包含在本发明的微粒中。此处所谓的增溶剂，优选环糊精及其类似物。
本发明中作为亲水性活性物质使用的蛋白质或肽，没有特殊限定，但优选生理活性蛋白质或生理活性肽。作为生理活性蛋白质或生理活性肽，可以举出肽激素、细胞因子、酶蛋白、抗体等，作为具体例子，可以举出副甲状腺激素(PTH)、降钙素、胰岛素、胰岛素样生长因子、血管紧张素、高血糖素、GLP-1或以毒蜥外泌肽4为代表的GLP-1受体抑制肽、铃蟾肽、促胃动素、促胃液激素、生长激素(growth hormone)、催乳素(黄体刺激激素)、促性腺激素(性腺刺激激素)、促甲状腺激素(thyrotropic hormone)、肾上腺皮质刺激激素(ACTH)、ACTH衍生物(依比拉肽等)、黑色素细胞刺激激素、促卵泡激素(FSH)、舍莫瑞林(sermorelin)、加压素(vasopressin)、催产素(oxytocin)、促甲状腺激素释放激素(protirelin)、黄体生成激素(LH)、促皮质素、促胰液素、生长激素(Somatotropin)、促甲状腺激素(thyrotropin)(甲状腺刺激激素)、生长激素抑制素、促性腺激素释放激素(GnRH)、G-CSF、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、巨核细胞增效剂、HGF、EGF、VEGF、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素类、FGF(纤维芽细胞增殖因子)类、BMP(骨形成蛋白)类、胸腺液性因子(THF)、血中胸腺因子(FTS)、超氧化物岐化酶(SOD)、尿激酶、溶菌酶、组织纤溶酶原激活物、天冬酰胺酶、激肽释放酶、生长素释放肽、脂连蛋白、瘦蛋白、心房钠利尿肽、心房钠利尿因子、脑型钠利尿肽(BNP)、芋螺抑制肽G、强啡肽、内啡肽、京都啡肽(Kyotorphin)、脑啡肽、神经降压肽、制管张素、缓激肽、P物质、胰激肽、血红蛋白、蛋白质C、VIIa因子、葡糖脑苷脂酶(glycocerebrosidase)、链球菌激酶、葡萄球菌激酶(staphylokinase)、胸腺素、肠促胰酶素、缩胆囊素、人胎盘催乳素、肿瘤坏死因子(TNF)、多粘菌素B、粘菌素、短杆菌肽、杆菌肽、胸腺生成素、铃蟾肽(bombecin)、蛙皮肽(cerulein)、胸腺刺激素、胰泌素(secretin)、抵抗素、抗菌肽(hepcidin)、神经肽Y、神经肽S、缩胆囊素-肠促胰酶素(CCK-PZ)、脑源神经营养因子(BDNF)、疫苗等。上述生理活性蛋白质或生理活性肽可以为天然蛋白或肽，可以为改变了其部分序列的的衍生物，也可以为用聚乙二醇或糖链等修饰的化合物。
亲水性活性物质为DNA、RNA或修饰核酸时，可以为与阳离子性表面活性剂、阳离子性脂质、阳离子性聚合物及它们的类似物复合得到的物质。
本发明中作为亲水性活性物质使用的糖类，可以举出透明质酸、肝素、硫酸葡聚糖、葡聚糖或FITC标记葡聚糖(例如FD40)等。
另外本发明涉及一种微粒的制备方法，所述制备方法是上述亲水性活性物质含有粒子附聚而成的微粒的制备方法，包括以下工序：
(a)工序，通过将含有亲水性活性物质的水性溶剂和溶解有两亲性聚合物的水非混合性有机溶剂混合，形成反相乳液；
(b)工序，从反相乳液中除去溶剂，得到含有亲水性活性成分的固态成分；
(c)工序，将含有亲水性活性成分的固态成分或含有亲水性活性成分的固态成分的分散液导入含有表面改性剂的液相中。
本发明的亲水性活性物质含有粒子附聚而成的微粒的制备方法中，反相乳液是通过将含有亲水性活性物质的水性溶剂添加到溶解有两亲性聚合物的水非混合性有机溶剂中进行混合而形成的。必要时，例如可以使用磁力搅拌器等搅拌装置、涡轮型搅拌机、均化器、装有多孔膜的膜乳化装置等。需要说明的是，本发明中水非混合性有机溶剂是指对水的溶解度在30g(水非混合性有机溶剂)/100ml(水)以下的有机溶剂，超过上述对水的溶解度的有机溶剂被作为水混合性有机溶剂。
工序(a)中的水性溶剂，使用水或含有水溶性成分的水溶液。作为上述水溶性成分，可以举出例如无机盐类、糖类、有机盐类、氨基酸等。
对于工序(a)中水非混合性有机溶剂的性质没有特殊限定，但优选能溶解该两亲性聚合物疏水性片段即聚(羟基酸)、且难溶或不溶亲水性片段。另外，该水非混合性有机溶剂优选能够通过冷冻干燥等挥发除去，较优选为0.1g(水非混合性有机溶剂)/100ml(水)以下。作为该水非混合性有机溶剂的具体例子，可以举出乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、二氯甲烷、氯仿。需要说明的是，水性溶剂相对于该水非混合性有机溶剂的比，优选为1,000∶1～1∶1，较优选为100∶1～3∶1。该水非混合性有机溶剂中的两亲性聚合物的浓度根据水非混合性有机溶剂、两亲性聚合物种类的不同而不同，优选为0.01～90％(w/w)，较优选为0.1～50％(w/w)，更优选为1～20％(w/w)。
在工序(a)中，通过含有亲水性活性物质的水性溶剂、溶解两亲性聚合物的水非混合性有机溶剂，形成反相乳液的工序中，根据药剂学目的，可以通过溶解有2种以上两亲性聚合物的水非混合性有机溶剂形成反相乳液。
在工序(a)中，通过含有亲水性活性物质的水性溶剂、溶解有两亲性聚合物的水非混合性有机溶剂，形成反相乳液的工序中，为了辅助形成反相乳液并形成均匀且微小的反相乳液，可以添加助剂。作为助剂，优选选自碳原子数3～6的烷基醇、碳原子数3～6的烷基胺、碳原子数3～6的烷基羧酸中的化合物。上述助剂的烷基链的结构没有特殊限定，可以为直链结构或支链结构，可以为饱和烷基或不饱和烷基。本发明中，作为助剂，特别优选叔丁醇、异丙醇、戊醇。
工序(a)中反相乳液的平均粒径，随所期望的本发明的微粒粒径而改变，没有特殊限定，但制备作为本发明微粒的用途之一的用于药物的微粒时，平均粒径的上限优选为50μm，较优选为5μm，更优选为500nm，更优选为150nm，最优选为100nm。反相乳液的平均粒径的下限优选为10nm，较优选为50nm。
其次，在微粒的制备方法中，重要的是包括(b)工序，即，从工序(a)中得到的反相乳液中除去溶剂，得到含有亲水性活性成分的固态成分。
工序(b)中，从反相乳液中除去溶剂的方法没有特殊限定，可以举出例如加热、减压干燥、透析、冷冻干燥、离心操作、过滤、再沉淀及它们的组合。
上述从反相乳液中除去溶剂的方法中，特别优选冷冻干燥，其原因在于，由反相乳液中粒子的合并等引起的结构变化少，另外，可以避免由高温引起的亲水性活性物质的变性。作为冷冻干燥的条件、装置，包括冷冻过程和在减压下的干燥工序，特别优选下述工序：经过冷冻干燥的常用方法即预冷冻、在减压·低温下的一次干燥、在减压下的二次干燥。例如在构成反相乳液的水性溶剂和水非混合性有机溶剂的熔点以下冷却·冷冻，然后进行减压干燥，由此得到冷冻干燥的含有亲水性活性物质的固态成分。作为预冷冻的温度，可以从溶剂组成方面考虑通过实验适当确定，但优选-20℃以下。另外，干燥过程中的减压程度，也可以从溶剂组成方面考虑通过实验适当确定，但优选3,000Pa以下，较优选500Pa以下，由于缩短了干燥时间，故较理想。冷冻干燥中，优选使用装有冷阱(cold trap)并能与真空泵连接的实验室用冷冻干燥机或用于药物制备等的盘架式真空冷冻干燥机，可以通过液氮、冷冻剂等预冷冻后，在冷却下或室温下使用真空泵等减压装置进行减压干燥。
工序(b)中得到的含有亲水性活性成分的固态成分，是以亲水性活性物质含有粒子的聚集体形式得到的，所述亲水性活性物质含有粒子反映出反相乳液的结构、是通过含有两亲性聚合物而形成的。需要说明的是，此处所谓的聚集体，是指微粒通过粒子间力聚集而成的不规则块状物，与本发明的微粒在形状上有明显区别。构成该聚集体的亲水性活性物质含有粒子的平均粒径，随所期望的本发明的微粒粒径而改变，没有特殊限定，但制备作为本发明微粒的用途之一的用于药物的微粒时，平均粒径的上限优选为50μm，较优选为5μm，更优选为500nm，更优选为150nm，最优选为100nm。亲水性活性物质含有微粒的平均粒径的下限，优选为10nm，较优选为50nm。
在本发明的微粒的制备方法中，重要的是包括(c)工序，即，将含有亲水性活性成分的固态成分或含有亲水性活性成分的固态成分的分散液导入含有表面改性剂的液相中。
工序(c)中，将含有亲水性活性成分的固态成分或含有亲水性活性成分的固态成分的分散液导入含有表面改性剂的液相中的方法，例如可以举出下述方法：将含有亲水性活性成分的固态成分添加到含有表面改性剂的液相中的方法，和使含有亲水性活性成分的固态成分暂时分散于分散介质中，将所得的分散液(油包固(S/O)悬浊液)添加到含有表面改性剂的液相中的方法。
使含有亲水性活性成分的固态成分暂时分散于分散介质中时，对于分散介质没有特殊限定，但是鉴于由两亲性聚合物组成的亲水性活性物质含有粒子构成了含有亲水性活性成分的固态成分、且反映出反相乳液的结构，所以为了保持上述亲水性活性物质含有粒子的结构，优选分散介质为能溶解聚(羟基酸)、且实质上不溶解构成两亲性聚合物的亲水性片段的溶剂。需要说明的是，能溶解聚(羟基酸)、且实质上不溶解亲水性片段的溶剂，是指在溶剂中的亲水性片段的溶解度为50mg/ml以下，优选10mg/mL以下的溶剂。
另外，分散介质具有上述特征即可，可以为水非混合性有机溶剂或水混合性有机溶剂，但优选水非混合性有机溶剂。需要说明的是，作为能溶解两亲性聚合物的聚(羟基酸)、且实质上不溶解亲水性片段的水非混合性有机溶剂的具体例子，可以举出乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、二氯甲烷、氯仿、二氧杂环己烷、甲苯、二甲苯等。
在使含有亲水性活性物质的固态成分分散的分散介质中，为了控制由亲水性活性物质含有粒子的分解或崩解引起的亲水性活性物质的释放速度，分散介质中可以含有可溶的各种添加剂，例如酸性化合物、碱性化合物、两亲性聚合物或生物降解性聚合物等。
工序(c)中的液相，优选可溶解上述表面改性剂、且沸点高于含有亲水性活性成分的固态成分的分散介质沸点，可以为水性溶剂、水非混合性有机溶剂、水混合性有机溶剂中的任一种。作为此处所谓的水性溶剂，优选水或含有水溶性成分的水溶液，作为该水溶性成分，例如可以举出无机盐类、糖类、有机盐类、氨基酸等；作为水非混合性有机溶剂，例如可以举出硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉子油、椰子油、亚麻籽油、矿物油、蓖麻油、氢化蓖麻油、液体石蜡、正己烷、正庚烷、甘油、油酸等；作为水混合性有机溶剂，例如可以举出甘油、丙酮、乙醇、乙酸、双丙甘醇、三乙醇胺、三甘醇等。本发明中，工序(c)中的液相优选水性溶剂或水混合性有机溶剂。液相为水性溶剂、且分散介质为水非混合性有机溶剂时，工序(c)中得到的悬浊液为被称为所谓的水包油包固(S/O/W)型乳液，液相为水非混合性有机溶剂或水混合性有机溶剂、且与分散介质不混合时，为油包油包固(S/O1/O2)型乳液。
相对于使含有亲水性活性物质的固态成分分散的分散介质，液相的容积比一般为1,000∶1～1∶1,000，较优选为100∶1～1∶100。
本发明液相中的表面改性剂浓度根据表面改性剂种类的不同而不同，优选为0.01～90％(w/v)，较优选为0.1～50％(w/v)，更优选为5～10％(w/v)。
表面改性剂可以与本发明微粒的两亲性聚合物的聚(羟基酸)外层键合，此时的键合量优选相对于微粒重量为0.0001％～1％。
工序(c)的液相中除了含有表面改性剂之外，根据制剂学目的，还可以含有各种添加物，例如缓冲剂、抗氧化剂、盐、聚合物或糖等。
工序(c)中，还优选在液相中添加无机盐类。无机盐类优选为碱金属盐或碱土类金属盐，较优选氯化钠。液相中的无机盐类的浓度优选为0～1M，较优选为10mM～1M，更优选为10mM～100mM。
工序(c)中，为了制备更细小的微粒，可以对形成的水包油包固(S/O/W)型乳液或油包油包固(S/O1/O2)型乳液进行乳化操作。对于乳化方法没有特殊限定，只要能制备出稳定的乳液即可。例如可以举出通过搅拌进行的方法、使用高压均化器、高速均相混合机等的方法等。
工序(c)中，将使含有亲水性活性成分的固态成分暂时分散于分散介质中，将得到的分散液添加到含有表面改性剂的液相中时，通过除去分散介质，可以得到所期望的亲水性活性物质含有微粒附聚而成的微粒的悬浊液。对于除去分散介质的方法没有特殊限定，例如可以举出液中干燥、透析、冷冻干燥、离心操作、过滤、再沉淀，特别优选液中干燥、冷冻干燥。工序(c)中，使用水性溶剂作为液相时，通过该工序能够得到微粒的水性分散体。
通过从如上所述得到的微粒分散体中除去液相，可以得到本发明的微粒。对于除去液相的方法没有特殊限定，优选利用蒸发的馏去、透析、冷冻干燥、离心操作、过滤。
由本发明得到的微粒的应用领域广泛，可以用于多方面，优选用作药物组合物。将本发明的微粒用作药物组合物时，除微粒之外还可以含有药剂学中各种有用的添加剂，可以添加的添加物优选为缓冲剂、抗氧化剂、盐、聚合物或糖。
作为将本发明的微粒用作药物组合物时的给药方法，例如可以举出经口给药或非经口给药，优选非经口给药。作为非经口给药，可以使用皮下给药、肌肉内给药、经肠道给药、经肺给药、局部给药(鼻、皮肤、眼)及腹腔内给药等，作为特别优选的给药方法，可以举出皮下或肌肉内注射。另外，将本发明的药物组合物给与生物体时的给药量和给药次数，可以根据亲水性活性物质、给药方式、患者年龄、体重、症状的严重程度适宜选择，但通常情况下成人按照每1天0.1μg～100mg、优选1μg～10mg的范围进行给药。
实施例
以下给出实施例，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1葡聚糖-聚乳酸(PLA)的合成
1-1.TMS-葡聚糖(化合物(1))的合成
将葡聚糖(NACALAI TESQUE，INC.；NAKARAI标准特级合格品，数均分子量13000，5.0g)加入甲酰胺(100ml)中，加热至80℃。经20分钟将1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(100ml)滴加到上述溶液中。滴加结束后，在80℃下搅拌2小时。反应结束后，使反应溶液恢复至室温，使用分液漏斗使溶液分为2层。在减压下浓缩上层后，加入甲醇(300ml)，过滤所得的固体，干燥，得到为白色固体的TMS-葡聚糖(11.4g)。
1-2.TMS-葡聚糖-PLA(化合物(2))的合成
在减压下将化合物(1)(0.5g)和叔丁醇钾(35mg)干燥1小时后，加入四氢呋喃(20ml)，在室温下搅拌1小时。在上述溶液中滴加(L)-丙交酯(4.49g)的四氢呋喃(20ml)溶液，搅拌5分钟。反应结束后，在减压下浓缩溶剂，使用氯仿-甲醇系统进行再沉淀纯化，由此得到为白色固体的TMS-葡聚糖-PLA(1.9g)。
1-3.葡聚糖-PLA(化合物(3))的合成
在化合物(2)(1.9g)的氯仿(24ml)溶液中加入甲醇(10.8ml)和12N盐酸(1.2ml)，在室温下搅拌30分钟。在减压下馏去溶剂后，将残渣溶解于氯仿(10ml)，滴加到冷却至0℃的乙醚中，由此使产物析出。滤出析出物后，在减压下浓缩，得到葡聚糖-PLA(1.6g)。该聚合物的重均分子量为48720，数均分子量为43530。(GPC测定：柱Toso-TSK-gel α-5000×2；DMF系溶剂；检测器RI；标准品茁酶多糖)。通过1H-NMR测定确定该聚合物接枝链的平均分子量为2300。接枝链数目为10～12。
实施例2葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)的合成
2-1.TMS-葡聚糖-PLGA(化合物(4)、化合物(5)、化合物(6))的合成
在减压下将化合物(1)(0.5g)和叔丁醇钾(35mg)干燥1小时后，加入四氢呋喃(10ml)，在室温下搅拌1小时。将(DL)-丙交酯(1.12g)和乙交酯(0.9g)的四氢呋喃(15ml)溶液滴加至上述溶液中，搅拌5分钟。反应结束后，在减压下浓缩溶剂，使用氯仿-甲醇系统进行再沉淀纯化，由此得到为白色固体的TMS-葡聚糖-PLGA(1.96g)(化合物(4))。使用同样的方法，以(DL)-丙交酯(0.784g)和乙交酯(0.63g)的加入量合成化合物(5)，以(DL)-丙交酯(1.12g)和乙交酯(0.9g)的加入量合成化合物(6)。
2-2.葡聚糖-PLGA(化合物(7)、化合物(8)、化合物(9))的合成
在化合物(4)(1.96g)的氯仿(14ml)溶液中加入甲醇(6.3ml)和12N盐酸(0.7ml)，在室温下搅拌30分钟。在减压下馏去溶剂后，将残渣溶解于氯仿(10ml)中，滴加到冷却至0℃的乙醚中，由此使产物析出。滤出析出物后，在减压下浓缩，得到葡聚糖-PLGA(1.25g)(化合物(7))。除了使用三氟乙酸外使用相同的方法由化合物(5)、(6)得到葡聚糖-PLGA(化合物(8)、化合物(9))。化合物(7)～(9)聚合物的重均分子量、数均分子量通过GPC测定(柱Toso-TSK-gel α-5000×2；DMF系溶剂；检测器RI；标准品茁酶多糖)进行确定。接枝链的平均分子量、接枝链数目通过1H-NMR测定进行确定。
化合物(7)的重均分子量为43,820，数均分子量为33,422，接枝链分子量为1,900，接枝链数目为7～10。
化合物(8)的重均分子量为94,088，数均分子量为81,250，接枝链分子量为3,250，接枝链数目为21。
化合物(9)的重均分子量为137,695，数均分子量为109,630，接枝链分子量为6,442，接枝链数目为15。
实施例3包封人生长激素(hGH)的微粒的制备方法
将5mg实施例1的葡聚糖-聚乳酸(PLA)(葡聚糖平均分子量为13,000，PLA平均分子量为2,300，PLA接枝链数目为10～12，化合物(3))或实施例2的葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)(葡聚糖平均分子量为13,000，PLGA平均分子量为1,900，PLGA接枝链数目为7～10，化合物(7))溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml的聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl叔丁醇后，滴加2mg/ml的hGH水溶液20μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。使所得的固态成分分散于200μl碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加至2ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。使用液氮对该微粒分散液进行预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封hGH的微粒粉末。通过用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，由此计算平均粒径，结果微粒的平均粒径为4.0μm。
实施例4包封人生长激素(hGH)的微粒的药物包封率的测定称量使用葡聚糖-PLA(化合物(3))或葡聚糖-PLGA(化合物(7))聚合物采用实施例3的方法制备出的包封人生长激素的微粒20mg，置于1.5ml的离心管中，使其溶解在1ml的缓冲液A(含有0.1％牛血清白蛋白、0.1％Pluronic F-68(BASF的注册商标)及0.02％叠氮化钠的PBS)中，通过在18,000×g下离心10分钟分离粒子(沉淀)和上清液。将上清液回收至其他管中后，使粒子再次悬浊于1ml的缓冲液中，通过在上述条件下离心再次将粒子和上清液进行分离。再一次重复上述清洗操作(共3次离心)，使用ELISA试剂盒(R＆D Systems公司制)测定通过各次离心收集的上清液中人生长激素浓度。从制备粒子时hGH的加入量(20mg粒子重量)中减去3次离心上清液中的hGH总量，按照下式计算包封率。
葡聚糖-PLA微粒或葡聚糖-PLGA微粒中的hGH包封率，在葡聚糖-PLA微粒中为92.6％，在葡聚糖-PLGA微粒中为85.7％，表明两种粒子均能高效地包封蛋白药物。
实施例5药物从包封人生长激素(hGH)的微粒中的体外释放速度的解析
使在实施例4中进行了3次清洗的微粒悬浊分散于1.2ml的缓冲液A中。将上述溶液中的一部分(40μl)移到其他管中，通过在18,000×g下离心10分钟使粒子沉淀，将30μl上清液收集到其他管中(0小时样品)。将残余的粒子悬浊液装入1.5ml离心管中，在37℃恒温箱内使用旋转器以6rpm的速度使其缓慢翻转混合。以特定的时间间隔分别从上述溶液中取出少量(40μl)，通过与上述相同的离心分离上清液。用ELISA试剂盒测定在各时间点收集的上清液样品中的hGH浓度，按照下式计算释放量(％)。
从使用葡聚糖-PLA或葡聚糖-PLGA聚合物制备的微粒中的药物释放的经时变化如图1所示。两种粒子几乎均未发生突释，显示出良好的曲线，即，药物释放呈直线状且与时间变化成正比。对于释放50％药物所需时间，葡聚糖-PLA微粒为约1个月，葡聚糖-PLGA微粒为约1周，表明通过选择聚(羟基酸)的种类可以调节释放速度。
实施例6包封人胰岛素的微粒的制备方法
将5mg葡聚糖-PLA(葡聚糖平均分子量13,000，PLA平均分子量2,300，PLA接枝链数目10～12，化合物(3))或葡聚糖-PLGA(葡聚糖平均分子量13,000，PLGA平均分子量1,900，PLGA接枝链数目7～10，化合物(7))溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml的聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl叔丁醇后，滴加2mg/ml的人胰岛素水溶液20μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散于200μl碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加至2ml含有10％PluronicF-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。使用液氮预冷冻该微粒分散液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYERFD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，得到包封人胰岛素的粒子粉末。通过扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察微粒，由此计算平均粒径，结果由化合物(3)得到的微粒的平均粒径为6.4μm，由化合物(7)得到的微粒的平均粒径为5.3μm。
实施例7包封人胰岛素的微粒的药物包封率的测定
称量使用葡聚糖-PLGA(化合物(7))聚合物采用实施例6的方法制备的包封人胰岛素的微粒20mg，置于1.5ml离心管中，使其溶解于1ml的缓冲液A(含有0.1％牛血清白蛋白、0.1％Pluronic F-68(BASF的注册商标)及0.02％叠氮化钠的PBS)中，通过在18,800×g下离心10分钟将粒子(沉淀)和上清液分离。回收上清液置于其他管中后，使粒子悬浊于1ml的缓冲液中，通过在上述条件下进行离心，再次将粒子和上清液分离。再一次重复上述清洗操作(共3次离心)，使用夹心ELISA法测定通过每次离心收集的上清液中的人胰岛素浓度。从制备粒子时加入的人胰岛素量(20mg粒子重量)中减去3次离心的上清液中的人胰岛素总量，按照下式计算包封率。
葡聚糖-PLGA微粒中人胰岛素的包封率为75.7％，表明其可以高效包封。
实施例8药物从包封人胰岛素的微粒中的体外释放速度的解析
将在实施例7中进行3次清洗的粒子悬浊分散于1.2ml的缓冲液A中。从上述溶液中取出一部分(40μl)移到其他管中，通过在18,800×g下离心10分钟使粒子沉淀，回收30μl上清液置于其他管中(0小时样品)。进行测定之前将回收后的样品冷冻保存。将残余的粒子悬浊液装入1.5ml离心管中，在37℃恒温箱内使用旋转器以6rpm的速度使其缓慢翻转混合。以特定的时间间隔分别从上述溶液中取出少量(40μl)，通过与上述同样地进行离心，分离上清液。使用夹心ELISA法测定在各时间点回收的上清液样品中的人胰岛素浓度，按照下式计算释放量(％)。
人胰岛素释放的经时变化示于图2。结果表明几乎未发生突释，显示出良好的曲线，即，药物释放呈直线状且与时间变化成正比。释放50％药物所需时间为约6天。
实施例9微粒形态的经时变化
称量5mg实施例3中制备的包封hGH的微粒粉末置于离心管中，将其分散在1ml的Milli-Q中后，在13,000rpm下离心分离30分钟，除去上清液后再次分散在1ml的Milli-Q中，离心分离，由此对微粒进行清洗。另外，在温育规定时间的微粒悬浊溶液中加入1ml的Milli-Q，在13,000rpm下离心分离30分钟，除去上清液后将其再次分散在1ml的Milli中，进行相同的离心分离，由此对微粒进行清洗。使得到的清洗后的微粒分散在100μl的Milli-Q中，将5μl微粒分散溶液滴加在硅基板上，室温放置约10分钟后，在干燥器内干燥3小时。然后，使用离子溅射仪(HITACHI；E-1030)在样品表面蒸镀铂(蒸镀时间为15秒)，使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)在设定加速电压为1kV、探测电流为high的条件下对微粒形状、表面状态进行观察。
如图3所示，刚制备后为球形且表面光滑的粒子，在37℃下温育13天后，形状显著变形，形成了许多孔，表明随药物的释放粒子逐渐分解。
比较例1
将5mg聚乙二醇-聚(ε-己内酯)(聚乙二醇的平均分子量为5,000，聚(ε-己内酯)的平均分子量为37,000)溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml的聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl的叔丁醇后，滴加2mg/ml的hGH水溶液20μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。将该反相乳液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将得到的固体分散于200μl碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到2ml含有10％PluronicF-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。使用液氮预冷冻该微粒分散液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，得到包封hGH的粒子粉末。用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察微粒，由此算出平均粒径，结果所得微粒的平均粒径为8.0μm。
称量5mg制备的包封hGH的微粒粉末置于离心管中，将其分散在1ml的Milli-Q后，在13,000rpm下离心分离30分钟，除去上清液后再次分散在1ml的Milli-Q中，离心分离，由此对微粒进行清洗。另外，在温育规定时间的微粒悬浊溶液中加入1ml的Milli-Q，在13,000rpm下离心分离30分钟，除去上清液后将其再次分散在1ml的Milli中，进行相同的离心分离，由此对微粒进行清洗。将得到的清洗后的微粒分散在100μl的Milli-Q中，将5μl微粒分散溶液滴加到硅基板上，室温放置约10分钟后，在干燥器内干燥3小时。然后，使用离子溅射仪(HITACHI；E-1030)在样品表面蒸镀铂(蒸镀时间为15秒)，使用SEM(HITACHI；S-4800)在设定加速电压为1kV、探测电流为high的条件下对微粒形状和表面状态进行观察。
如图4所示，与实施例9的葡聚糖-PLGA微粒不同，即使在37℃下温育21天后粒子的形态也几乎不变化，在亲水性活性物质的释放性上存在问题。
实施例10小鼠皮下给与包封人生长激素(hGH)的微粒
将25mg葡聚糖-聚乳酸(PLA)(葡聚糖平均分子量为13,000，PLA平均分子量为2,300，PLA接枝链数目为10～12，化合物(3))或葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)(葡聚糖平均分子量为13000，PLGA平均分子量为1,900，PLGA接枝链数目为7～10，化合物(7))溶解于500μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml的聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加100μl的叔丁醇后，滴加10mg/ml的hGH水溶液250μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在1ml碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到10ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。使用液氮预冷冻该微粒分散液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封hGH的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察微粒，算出平均粒径，结果对于所得微粒的平均粒径，化合物(3)的微粒为4.9μm，化合物(7)的微粒为4.2μm。
将300mg上述制备的微粒悬浊分散于3ml磷酸生理缓冲液(PBS)中，通过在80×g下离心5分钟使微粒沉淀，将上清液移至其他管中。再次将上清液在80×g下离心5分钟使残存的粒子沉淀，除去上清液。合并第1次的离心沉淀与第2次的离心沉淀，将其再次分散在1ml的PBS中，将相同的离心清洗操作重复3次，由此除去未被包封在微粒中的生长激素。最后将沉淀再次分散在200μl的PBS中，得到给药溶液。需要说明的是，分别被葡聚糖-PLA微粒及葡聚糖-PLGA微粒包封的生长激素量如下求出：使用ELISA试剂盒测定清洗液中的浓度，而后从加入量中减去该测定值进行计算，结果以每1只小鼠给与的300mg粒子中所包封的量计，葡聚糖-PLA微粒中包封的生长激素量为590μg，葡聚糖-PLGA微粒中包封的生长激素量为536μg。
对10周龄雄性Balb/C小鼠在背部皮下的2处注射给与该溶液，经时地从尾静脉进行采血。在所采的血液中添加肝素，使其最终浓度为3.3IU/ml，在5,000rpm下离心5分钟，收集血浆，使用ELISA试剂盒测定血浆中生长激素的浓度。
作为比较，对皮下给与未粒子化的人生长激素蛋白溶液(700μg/0.2ml)的小鼠，进行相同的采血。
需要说明的是，为了抑制因给与对小鼠而言为异种蛋白质的人生长激素而导致的抗体生成，在给与粒子3天前以26μg/小鼠的剂量皮下给与免疫抑制剂他克莫司水合物(Astellas公司)，然后，在给药时、给药3天后、给药7天后以13μg/小鼠的剂量皮下给与。
血浆中人生长激素浓度的经时变化示于图5。给与未微粒化药物的小鼠，在给药1小时后血中浓度显示为5,000ng/ml以上的非常高的值，之后急速下降，1天后下降到给药前的水平。另一方面，给与使用葡聚糖-PLA聚合物制备的微粒化药物的小鼠，刚给药后的一过性的血中浓度的上升被抑制在200ng/ml以下，直至给药7天后，血中浓度维持在高水平。另外，对于葡聚糖-PLGA微粒，完全没有出现给药后的一过性的浓度上升，并且直至给药7天后几乎维持在固定的血中浓度，表现出非常良好的缓释性能。
实施例11小鼠皮下给与包封人生长激素(hGH)的微粒(药理活性评价)
将25mg实施例2的葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)(葡聚糖平均分子量为13,000，PLGA平均分子量为1,900，PLGA接枝链数目为7～10，化合物(7))溶解于500μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml的聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加100μl叔丁醇后，滴加10mg/ml的hGH水溶液250μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在1ml碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到10ml含有10％PluronicF-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，得到包封hGH的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察微粒，算出平均粒径，结果所得微粒的平均粒径为4.1μm。
将300mg上述制备的微粒悬浊分散于3ml磷酸生理缓冲液(PBS)中，通过在80×g下离心5分钟使微粒沉淀，将上清液移至其他管中。再次将上清液在80×g下离心5分钟使残存的粒子沉淀，除去上清液。合并第1次的离心沉淀与第2次的离心沉淀，将其再次分散在1ml的PBS中，将相同的离心清洗操作重复3次，由此除去未被包封在粒子中的生长激素。最后将沉淀再次分散在200μl的PBS中，得到给药溶液。
对8周龄的脑下垂体摘除ICR小鼠(日本SLC公司)在背部皮下注射给与该溶液，经时地从尾静脉进行采血。在所采的血液中添加肝素，使其最终浓度为3.3IU/ml，在5,000rpm下离心5分钟，收集血浆，使用ELISA法测定血浆中生长激素浓度及小鼠IGF-1浓度。
作为比较，对皮下给与未粒子化的人生长激素蛋白溶液(700μg/0.2ml)的小鼠，进行相同的采血。
需要说明的是，为了抑制因给与对小鼠而言为异种蛋白质的人生长激素而导致的抗体生生，在给与粒子3天前以26μg/小鼠的剂量皮下给与免疫抑制剂他克莫司水合物(Astellas公司)，然后，在给药时、给药3天后、给药7天后以13μg/小鼠的剂量皮下给与。
血浆中人生长激素浓度的经时变化示于图6。给与未微粒化药物的小鼠，在给药1小时后血中浓度显示出非常高的值，之后急速下降，2天后下降到给药前的水平。另一方面，对于葡聚糖-PLGA微粒，给药后的一过性的浓度上升被抑制在低水平，并且直至给药10天后血浆中浓度维持在高水平。另外，此时小鼠的体重变化如图7所示。虽然单独给与生长激素的小鼠的体重增加被抑制在5％左右，但可确认给与葡聚糖-PLGA微粒的小鼠的体重增加为20％左右。
血浆中IGF-1的浓度如图8所示。血浆中IGF-1的浓度与血中人生长激素的浓度相关，可以确认对于给与葡聚糖-PLGA微粒的小鼠，直到给药后第10天仍维持在高水平。
实施例12缓冲液中药物从包封毒蜥外泌肽4(GLP-1受体激动剂)的微粒中的释放速度的解析
将25mg葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)(葡聚糖平均分子量为13,000，PLGA平均分子量为3,250(化合物(8))或6,442(化合物(9))，PLGA接枝链数为21(化合物(8))或15(化合物(9)))溶解于500μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加100μl叔丁醇后，滴加10mg/ml的毒蜥外泌肽4(委托Sigma Genosys公司合成)水溶液250μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在1ml碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到10ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封毒蜥外泌肽4的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察微粒，算出平均粒径，结果所得化合物(8)的微粒的平均粒径为4.3μm，化合物(9)的微粒的平均粒径为4.5μm。
将上述微粒按照实施例4的方法清洗3次后，使其悬浊分散于1.2ml的缓冲液A中。从上述溶液中取出一部分(40μl)移到其他管中，通过在18,000×g下离心10分钟使粒子沉淀，收集30μl上清液置于其他管中(0小时样品)。将残余的微粒悬浊液装入1.5ml离心管中，在37℃恒温箱内使用旋转器以6rpm的速度使其缓慢翻转混合。经时地从上述溶液中取出少量(40μl)，与上述相同地进行离心，由此分离上清液。使用ELISA法测定在各时间点收集的上清液样品中的毒蜥外泌肽4浓度，按照下式计算释放量(％)。
药物从使用各葡聚糖-PLGA聚合物制备的微粒中的释放的经时变化如图9所示。所有微粒几乎均未发生突释，显示出良好的曲线，即，药物释放呈直线状且与时间变化成正比。
实施例13小鼠皮下给与包封毒蜥外泌肽4(GLP-1受体激动剂)的微粒
将300mg实施例12的微粒悬浊分散于3ml的磷酸生理缓冲液(PBS)中，通过在80×g下离心5分钟使微粒沉淀，将上清液移至其他管中。再次将上清液在80×g下离心5分钟使残存的粒子沉淀，除去上清液。合并第1次的离心沉淀与第2次的离心沉淀，将其再次分散在1ml的PBS中，将相同的离心清洗操作重复3次，由此除去未包封在粒子中的毒蜥外泌肽4。最后将沉淀再次分散在200μl的PBS中，得到给药溶液。
对8周龄的SCID小鼠(CB 17/lcr-Prkdcsid/CrlCrlk)(日本SLC公司)在背部皮下注射给与该溶液，经时地从尾静脉进行采血。在所采的血液中添加肝素，使其最终浓度为3.3IU/ml，在5,000rpm下离心5分钟，收集血浆，使用ELISA法测定血浆中毒蜥外泌肽4浓度。作为比较，对皮下给与未粒子化的毒蜥外泌肽4溶液(700μg/0.2ml)的小鼠，进行相同的采血。
血浆中毒蜥外泌肽4浓度的经时变化如图10所示。给与未微粒化药物的小鼠，在给药1小时后血中浓度显示出非常高的值，之后急速下降到给药前的水平。另一方面，对于葡聚糖-PLGA微粒，给药后的一过性的浓度上升被抑制在低水平，并且直至给药5周，血浆中浓度均维持在高水平。
实施例14葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)的合成
14-1.TMS-葡聚糖-PLGA(化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13))的合成
将化合物(1)(0.5g)和叔丁醇钾(35mg)在减压下干燥1小时后，加入四氢呋喃(10ml)，在室温下搅拌1小时。在上述溶液中滴加(DL)-丙交酯(0.558g)和乙交酯(0.45g)的四氢呋喃(15ml)溶液，搅拌5分钟。反应结束后，在减压下浓缩溶剂，使用氯仿-甲醇系统进行再沉淀纯化，由此得到为白色固体的TMS-葡聚糖-PLGA(1.96g)(化合物(10))。
使用同样的方法，按照(DL)-丙交酯(0.67g)和乙交酯(0.54g)的加入量，合成化合物(11)。
使用同样的方法，按照(DL)-丙交酯(0.781g)和乙交酯(0.629g)的加入量，合成化合物(12)。
使用同样的方法，按照(DL)-丙交酯(1.123g)和乙交酯(0.9g)的加入量，合成化合物(13)。
14-2.葡聚糖-PLGA(化合物(14)、化合物(15)、化合物(16)、化合物(17))的合成
在化合物(10)的氯仿溶液(10mL)中加入三氟乙酸(1mL)，在室温下搅拌30分钟。在减压下馏去溶剂后，将残渣溶解于氯仿(10ml)中，滴加到冷却至0℃的乙醚中，由此使产物析出。滤出析出物后，在减压下浓缩，得到葡聚糖-PLGA(0.44g)(化合物(14))。
使用类似的方法由化合物(11)、(12)、(13)得到葡聚糖-PLGA(化合物(15)、化合物(16)、化合物(17))。化合物(14)～(17)的聚合物的重均分子量、数均分子量通过GPC测定(柱Toso-TSK-gel α-5000×2，DMF系溶剂，检测器RI，标准品茁酶多糖)进行确定。接枝链的平均分子量、接枝链数目通过1H-NMR测定进行确定。
化合物(14)的重均分子量为99,462，数均分子量为85,101，接枝链数均分子量为2,167，接枝链数目为33。
化合物(15)的重均分子量为107,779，数均分子量为92,134，接枝链数均分子量为3,127，接枝链数目为25。
化合物(16)的重均分子量为121,281，数均分子量为101,873，接枝链数均分子量为3,000，接枝链数目为30。
化合物(17)的重均分子量为144,838，数均分子量为122,151，接枝链数均分子量为4,864，接枝链数目为22。
实施例15包封人生长激素(hGH)的微粒的制备方法
将5mg实施例14的各种葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(葡聚糖-PLGA聚合物，化合物(14)～(17))溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl叔丁醇后，滴加1mg/ml的hGH水溶液50μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散于200μl碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加至2ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。使用液氮对该微粒分散液进行预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYERFD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封hGH的微粒粉末。用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，结果粒径在1.0～10μm的范围内。
实施例16包封人生长激素(hGH)的微粒的药物包封率的测定
将使用各葡聚糖-PLGA聚合物(化合物(14)～(17))采用
实施例15的方法制备的包封生长激素的微粒称量20mg，置于1.5ml离心管中，并溶解在1ml缓冲液A(含有0.1％牛血清白蛋白、0.1％Pluronic F-68(BASF的注册商标)及0.02％叠氮化钠的PBS)中，通过在18,000×g下离心10分钟，分离粒子(沉淀)和上清液。收集上清液置于其他管中后，使粒子再悬浊于1ml缓冲液中，再次在上述条件下进行离心进行粒子和上清液的分离。再一次重复上述清洗操作(共3次离心)，使用ELISA试剂盒(R&D Systems公司制)测定通过每次离心收集的上清液中的人生长激素浓度。从制备粒子时hGH的加入量(粒子重量20mg)中减去3次离心上清液中的hGH总量，按照下式计算包封率。
对于各葡聚糖-PLGA微粒中hGH的包封率，化合物(14)的微粒为87.5％，化合物(15)的微粒为94.2％，化合物(16)的微粒为95.7％，化合物(17)的微粒为97.5％，表明每种微粒均能高效地包封蛋白药物。
比较例2包封生长激素粒子的制备及药物包封率的测定
将10mg葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)(化合物(14)或化合物(17))溶解于2mL乙酸乙酯中，制备聚合物溶液。在该聚合物溶液中滴加0.5mg/mL生长激素溶液100μL，并进行搅拌。搅拌后，添加到20mL二氧杂环己烷中。使溶剂蒸发浓缩至约2mL，然后将该粒子分散液添加至含有500mg的Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水中。冷冻干燥样品后，在50mg样品中添加1mL水使粒子再分散，得到未附聚的亲水性活性物质含有粒子。使用装置ELS-Z(大塚电子)采用动态光散射法测定该粒子的平均粒径，药物包封率的测定与实施例16相同。
结果，化合物(14)的粒子的平均粒径为190.5nm，包封率为73％，化合物(17)的粒子的平均粒径为197.0nm，包封率为70％，与实施例16的微粒相比包封率低。
实施例17从包封人生长激素(hGH)的微粒中的体外药物释放速度的解析
将在实施例16中进行3次清洗的粒子悬浊分散于1.2ml缓冲液A中。从上述溶液中取出一部分(40μl)移到其他管中，在18,000×g下离心10分钟使粒子沉淀，收集30μl上清液置于其他管中(0小时样品)。将残余的粒子悬浊液装入1.5ml离心管中，在37℃恒温箱内使用旋转器以6rpm的速度使其缓慢翻转混合。经时地从上述溶液中取出少量(40μl)，与上述相同地进行离心，由此分离上清液。用ELISA试剂盒测定在各时间点收集的上清液样品中的hGH浓度，按照下式计算释放量(％)。
从实施例15制备的微粒中的药物释放的经时变化如图11所示。各粒子几乎均未发生突释，显示出良好的曲线，即，药物释放呈直线状且与时间变化成正比。对于释放50％药物所需的时间，化合物(14)的微粒约为6天，化合物(15)的微粒约为9天，化合物(16)的微粒约为16天，化合物(17)的微粒约为1个月，表明通过改变TMS-葡聚糖-PLGA合成时的丙交酯及乙交酯的加入量可以调节药物的释放速度。
实施例18粒径不同的包封荧光素标记葡聚糖(FD40)的微粒的制备
将5mg实施例2的葡聚糖-聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)(化合物(7))溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl叔丁醇后，滴加1mg/ml的FD40水溶液20μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在50μl、100μl、200μl、350μl、500μl、1ml、2ml、6ml的碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到2ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封FD40的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，算出平均粒径。
平均粒径与制备S/O/W型乳液时添加的碳酸二甲酯量的相关性如图12所示。可见从50μl到500μl范围内，平均粒径随碳酸二甲酯量的增加而降低。在500μl至6ml的范围内几乎未观察到平均粒径的差别。
实施例19PEG-PLGA聚合物的合成(PEG2k系列)
按照下述表1的加入量混合聚乙二醇单甲醚(日本油脂制；SUNBRIGHT MEH-20H；数均分子量：1,862，Mw/Mn＝1.03)、(DL)-丙交酯和乙交酯，加热至140℃。搅拌20分钟后，加入辛酸锡(II)(相对于聚乙二醇单甲醚为0.05重量％)，在180℃下搅拌3小时。使反应液恢复至室温后，溶解在氯仿(使浓度约为100mg/ml)中，使用冷却至0℃的乙醚进行再沉淀纯化，滤出所得的固体，减压干燥，由此得到为白色、或浅棕色固体的PEG-PLGA聚合物。
该聚合物的数均分子量由1H-NMR求出(表1)。
[表1]
表1PEG-PLGA聚合物(PEG2k系列)合成的原料加入量和反应结果
实施例20PEG-PLGA聚合物的合成(PEG5k系列)
按照下述表2的加入量混合聚乙二醇单甲醚(日本油脂制；SUNBRIGHT MEH-20H；数均分子量：5,128，Mw/Mn＝1.02)、(DL)-丙交酯和乙交酯，加热至140℃。搅拌20分钟后，加入辛酸锡(II)(相对于聚乙二醇单甲醚为0.05重量％)，在180℃下搅拌3小时。使反应液恢复至室温后，溶解在氯仿(使浓度约为100mg/ml)中，使用冷却至0℃的乙醚进行再沉淀纯化，滤出所得的固体，减压干燥，由此得到为白色或浅棕色固体的PEG-PLGA聚合物。该聚合物的数均分子量由1H-NMR求出(表2)。
[表2]
表2PEG-PLGA聚合物(PEG5k系列)合成的原料加入量和反应结果
实施例21PEG-PLGA聚合物的合成(PEG 10k系列)
按照下述表3的比例混合聚乙二醇单甲醚(日本油脂制；SUNBRIGHT MEH-10T，数均分子量：9,975，Mw/Mn＝1.02)、(DL)-丙交酯和乙交酯，加热至140℃。搅拌20分钟后，加入辛酸锡(II)(相对于聚乙二醇单甲醚为0.05重量％)，在180℃下搅拌3小时。使反应液恢复至室温后，溶解在氯仿(使浓度约为100mg/ml)中，使用冷却至0℃的乙醚进行再沉淀纯化，滤出所得的固体，减压干燥，由此得到为白色或浅棕色固体的PEG-PLGA聚合物。该聚合物的数均分子量由1H-NMR求出(表3)。
[表3]
表3PEG-PLGA聚合物(PEG10k系列)合成的原料加入量和反应结果
实施例22包封FD40微粒的制备方法
将5mg实施例19～21制备的PEG-PLGA聚合物溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl叔丁醇后，加入下述表4所示的规定量的10mg/ml FD40水溶液，进行搅拌，由此制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散于200μl碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加至2ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。使用液氮对该微粒分散液进行预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，得到包封FD40的微粒粉末。将其一部分用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)进行观察，算出平均粒径(表4)。由5k-10k的PEG-PLGA聚合物制备的粉末的SEM图像如图14所示，由5k-61k的PEG-PLGA聚合物制备的粉末的SEM图像如图15所示。
[表4]
表4添加到各聚合物中的FD40水溶液量及所得微粒的平均粒径
  PEG-PLGA组成   FD40水溶液量(μL)   平均粒径(μm)
  2k-11.5k   13   -
  2k-21.5k   12   -
  2k-50.7k   12   -
  5k-10k   20   -
  5k-23k   20   4.6
  5k-32.5k   20   4.3
  5k-39.4k   20   -
  5k-47k   20   4.2
  5k-61k   20   3.9
  5k-65k   20   3.2
  10k-39k   18   4.8
  10k-95k   15   4.5
实施例23包封FD40的微粒的包封率的测定
称量使用PEG-PLGA聚合物采用实施例22的方法制备的包封FD40的微粒(5mg)置于1.5ml离心管，将其分散在1ml的Milli-Q后，离心分离30分钟，由此将含有未被包封的FD40的上清液和包封FD40的粒子分离，并进行收集。将收集的包封FD40的微粒溶解于N，N-二甲基甲酰胺(250μl)中，使粒子崩解。将含有未被包封的FD40的上清液和含有被包封的FD40的N，N-二甲基甲酰胺溶液(50μl)分别添加到Milli-Q(3ml)中，充分搅拌后，使用荧光分光光度计(HORIBA；FluoroMAX-3，激发波长495nm，荧光波长520nm)对FD40进行定量，算出相对于总回收量的包封率。
在由PEG-PLGA聚合物制备的微粒中FD40的包封率如图13所示。确认了在PEG的分子量为2k、5k、10k的所有系列中，具有PLGA的分子量高时封入率变高的趋势。特别是为PEG5k系列的情况下，在5k-65k中为约90％的高封入率。10k-95k(PLGA/PEG＝9.5)与高封入率(约80％)的5k-47k(PLGA/PEG＝9.4)具有几乎相同的分子量比，其封入率为约55％。
比较例3包封FD40的粒子的制备
将10mg PEG-PLGA聚合物(5k-61k)溶解于2mL乙酸乙酯中，制备聚合物溶液。在该聚合物溶液中滴加2mg/mL生长激素溶液100μL。搅拌后，添加至20mL二氧杂环己烷中。使溶剂蒸发浓缩至约2mL后，将该粒子分散液添加至含有500mg PluronicF-68(BASF的注册商标)的水中。冷冻干燥样品后，在50mg样品中添加1mL水使粒子再分散，得到未附聚的亲水性活性物质含有粒子。使用装置ELS-Z(大塚电子)采用动态光散射法对该粒子的平均粒径进行测定，药物包封率的测定与实施例23相同。
结果FD40的包封率为48％，平均粒径为203.8nm，与实施例23的微粒相比包封率较低。
实施例24从包封FD40的微粒中的体外FD40释放速度的解析
为了评价构成PEG-PLGA聚合物粒子的PLGA链的长度与缓释行为的关系，对实施例22中制备的包封FD40的微粒中的5k-23k、5k-32.5k、5k-47k、5k-61k粒子的释放行为进行评价。
微粒制备后，以冷冻干燥状态在-30℃下进行保存，在使用前将其恢复至常温。称取20mg粒子粉末装入1.5ml管(离心管)中后，添加1ml检定缓冲液(含有0.02％叠氮化钠、0.1％Pluronic F-68(BASF的注册商标)、0.1％牛血清白蛋白的PBS溶液)，使用涡旋混合器剧烈搅拌、悬浊。然后，使用日立高速离心机(CF16RX)在18,900×g下离心10分钟，去除950μl含有未被包封的FD40的上清液部分，然后，再次加入950μl检定缓冲液，悬浊后进行离心，反复进行此清洗粒子操作，共清洗3次。
在经3次清洗的粒子中再次加入950μl检定缓冲液，使粒子悬浊后，分装在1.5ml管中每管100μl。向各管中加入900μl检定缓冲液使总体积为1ml，在37℃恒温箱内使用旋转器在10rpm下边旋转边温育。温育的各管经时地在18900×g下离心10分钟，分取950μl上清液，进行荧光强度测定前于4℃下保存。
使用3ml配置比色杯(disposal cuvette)(KARTELL)和HORIBAFluoro MAX-3在激发波长494nm、荧光波长512nm下测定样品溶液的荧光强度，根据与制备粒子时所使FD40的量的比，确定缓释比率。
通过释放评价确定的FD40从各微粒中的释放量如图16所示。横轴表示温育时间，纵轴表示相对于加入量的释放比率。PLGA链较短的5k-23k粒子，在温育初期的1天内释放了加入量的约40％，然后，在1个月内几乎释放了除突释部分之外的全部量。与此相比，随着PLGA链长度的变长，初期的释放量降低，5k-61k的微粒在初期的1天内的释放量在10％以下。
实施例25包封人胰岛素的微粒的药物包封率的测定
使用实施例20制备的PEG-PLGA聚合物(5k-61k)，采用与实施例22相同的方法制备包封人胰岛素的微粒。称量所得的微粒(20mg)置于1.5ml离心管中，将其溶解于1ml缓冲液A(含有0.1％牛血清白蛋白、0.1％Pluronic F-68(BASF的注册商标)及0.02％叠氮化钠的PBS)中，在18,800×g下离心10分钟，由此分离粒子(沉淀)和上清液。收集上清液至其他管中后，将粒子再次悬浊于1ml缓冲液A中，通过在上述条件下离心再次分离粒子和上清液。再次重复上述清洗操作(共离心3次)，使用夹心ELISA法测定在各次离心中收集的上清液中的胰岛素浓度。
夹心ELISA法通过以下方法进行。将抗人胰岛素单克隆抗体(Fitzgerald公司制；clone No.E6E5)以5μg/ml的浓度固相于ELISA培养板(Nunc公司Maxisorp)上，向此培养板中加入50uL ELISA缓冲液(含有0.25％BSA及0.05％Tween20的0.1M Tris盐酸缓冲液，pH8.0)及50uL用ELISA稀释液(含有0.25％BSA及0.05％Tween20的PBS)稀释的测定样品或标准胰岛素溶液，使其在室温下振荡反应1小时。使用清洗液(含有0.05％Tween20的PBS)清洗培养板3次，除去未反应的试剂后，加入0.5μg/ml生物素标记抗人胰岛素单克隆抗体(Fitzgerald公司制；clone No.D4B8)及链霉亲和素-HRP结合物(Zymed公司制)，使前者在室温下振荡反应1小时、后者在室温下振荡反应15分钟。在各反应后，使用清洗液(含有0.05％Tween20的PBS)清洗培养板3次，除去未反应的试剂。最后加入HRP底物，对结合于结合物的HRP酶活性进行比色定量，以由标准胰岛素的显色制成的标准曲线为基础，测定样品中的胰岛素浓度。
从制备粒子时的胰岛素加入量(粒子重量20mg)中减去3次离心上清液中的胰岛素总量，按照下式计算包封率。
所得微粒的平均粒径为4.7μm。另外，微粒中人胰岛素的包封率为86.7％，表明可以高效包封蛋白药物。
实施例26从包封人胰岛素的微粒中的体外药物释放速度的解析
将实施例25中进行了3次清洗的微粒悬浊分散于1.0ml缓冲液A中。将上述溶液分装于10个离心管(1.5ml容量)中每管0.1ml，分别加入0.9ml缓冲液A，稀释至10倍。刚刚稀释后，立即将1个管在18800×g下离心10分钟使粒子沉淀，收集上清液置于其他管中(0小时样品)。剩余的9个管在37℃恒温箱内用旋转器以6rpm的速度使其缓慢翻转混合。经时地对每一个管与上述相同地进行离心来分离上清液。使用夹心ELISA测定在各时间点收集的上清液样品中的胰岛素浓度，按照下式计算胰岛素释放量(％)。
胰岛素释放的经时变化如图17所示。药物随时间缓慢释放，30天以后释放速度上升，用约60天释放出大部分药物。
实施例27小鼠皮下给与包封人生长激素(hGH)的微粒
将25mg的PEG-PLGA聚合物(5k-61k)溶解于500μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加100μl叔丁醇后，滴加10mg/ml的hGH水溶液250μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在1ml碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到10ml含有10％PluronicF-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封hGH的微粒粉末。所得微粒的平均粒径为6.0μm。
将300mg上述制备的微粒悬浊分散于3ml磷酸生理缓冲液(PBS)中，通过在80×g下离心5分钟使微粒沉淀，将上清液移至其他管中。再次将上清液在80×g下离心5分钟使残存的粒子沉淀，除去上清液。合并第1次的离心沉淀与第2次的离心沉淀，将其再次分散在1ml的PBS中，将相同的离心清洗操作重复3次，由此除去未被包封在粒子中的生长激素。最后将沉淀再次分散在200μl的PBS中，得到给药溶液。需要说明的是，被包封在PEG-PLGA粒子中的生长激素的量如下计算：使用ELISA试剂盒测定清洗液中的浓度，并从加入量中减去该测定值进行计算，结果以给与每只小鼠的300mg粒子所包封的量计，PEG-PLGA微粒中的生长激素为700μg。
对10周龄的雄性Balb/C小鼠在背部皮下的2处注射给与该溶液，经时地从尾静脉进行采血。在所采的血液中添加肝素，使其最终浓度为3.3IU/ml，在5,000rpm下离心5分钟，收集血浆，使用ELISA试剂盒测定血浆中生长激素的浓度。
作为比较，对皮下给与未粒子化的人生长激素蛋白溶液(700μg/0.2ml)的小鼠，相同地进行采血。
需要说明的是，为了抑制因给与对小鼠而言为异种蛋白质的人生长激素所导致的抗体生成，在给与粒子3天前以26μg/小鼠的剂量皮下给与免疫抑制剂他克莫司水合物(Astellas公司)，然后，在给药时、给药3天后、给药7天后以13μg/小鼠的剂量皮下给与。
血浆中人生长激素浓度的经时变化如图18所示。给与未微粒化药物的小鼠在给药1小时后血中浓度显示为5,000ng/ml以上的非常高的值，之后急速下降，在1天后下降到给药前的水平。另一方面，给与使用PEG-PLGA聚合物制备的微粒化药物的小鼠，刚给药后的一过性的血中浓度的上升被抑制在100ng/ml以下，直至给药7天后血中浓度维持在高水平。
实施例28工序(c)中在液相中添加盐的微粒的制备
在50mg/ml的PEG-PLGA聚合物(5k-61k)/碳酸二甲酯溶液100μl中添加20μl叔丁醇，再加入10mg/ml的FD40水溶液20μl，通过搅拌制备反相胶束(W/O乳液)溶液。将所得的溶液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机冷冻干燥一夜，得到含有FD40的固态成分(Solid)。在所得的含有FD40的固态成分中加入200μl碳酸二甲酯，通过涡旋搅拌10秒钟得到S/O悬浊液，将其滴加到含有规定浓度的氯化钠(0M、10mM、50mM、1M)的含10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)水溶液2ml中，通过涡旋搅拌30秒使其乳化，制备S/O/W型乳液溶液。使用蒸发器从所得的S/O/W型乳液溶液中除去水非混合性有机溶剂(减压到30hPa后，减压馏去5分钟)，得到封入FD40的微粒的水分散体。使用液氮将封入FD40的微粒的分散水溶液预冷冻后，用冷冻干燥机冷冻干燥一夜，由此制备粉末状的封入FD40的微粒。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，算出平均粒径，结果在各氯化钠浓度的条件下，微粒的平均粒径均为6.5μm。
称量20mg所得的粉末状封入FD40的微粒，分散于1ml PBS缓冲液(含有0.1％Pluronic F-68(BASF的注册商标)、0.1％BSA、0.02％叠氮化钠)中后，离心分离(14,000rpm、10分钟)。收集上清液后，使微粒再次悬浊于1ml的PBS缓冲液中，通过离心分离再对微粒进行2次清洗。使清洗的微粒再次悬浊于1ml的PBS缓冲液中，分装于1.5ml离心管中每管100μl，加入900μl的PBS缓冲液，在37℃下温育，1天后收集样品。将收集的样品在14,000rpm下离心分离10分钟，使用荧光分光光度计(HORIBA；Fluoro MAX-3，激发波长495nm，荧光波长520nm)荧光测定包含在上清液中的FD40，算出释放量。另外，对清洗时收集的上清液中的FD40量也同样进行荧光测定，根据加入量值算出封入率。
在氯化钠浓度分别为0M、10mM、50mM、1M的条件下，封入率为73％、97％、84％、82％。另外，在氯化钠浓度分别为0M、10mM、50mM、1M的条件下，1天后的释放量为14％、7％、15％、11％，添加10mM氯化钠时，包封率最高，1天后的释放量(突释)最少。
实施例29小鼠皮下给与包封人生长激素(hGH)的微粒(药理活性评价)
将实施例20的PEG-PLGA聚合物(5k-55k)及PEG-PLGA聚合物(5k-105k)各25mg溶解于500μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加100μl叔丁醇后，滴加10mg/ml的hGH水溶液250μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYERFD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固体分散在1ml碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到10ml含有10％PluronicF-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封hGH的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，算出平均粒径，结果PEG-PLGA聚合物(5k-55k)的微粒(5k-55k微粒)的平均粒径为4.2μm，PEG-PLGA聚合物(5k-105k)的微粒(5k-105k微粒)的平均粒径为7.5μm。
将300mg上述制备的微粒分别悬浊分散于3ml磷酸生理缓冲液(PBS)中，通过在80×g下离心5分钟使粒子沉淀，将上清液移至其他管中。再次将上清液在80×g下离心5分钟，使残存的粒子沉淀，除去上清液。合并第1次的离心沉淀与第2次的离心沉淀，将其再次分散在1ml的PBS中，将相同的离心清洗操作重复3次，由此除去未被包封在粒子中的生长激素。最后将沉淀再次分散在200μl的PBS中，得到给药溶液。
对8周龄的脑下垂体摘除ICR小鼠(日本SLC)从背部皮下注射给与该溶液，经时地从尾静脉进行采血。在所采的血液中添加肝素，使其最终浓度为3.3IU/ml，在5,000rpm下离心5分钟，收集血浆，使用ELISA法测定血浆中生长激素浓度及血浆中IGF-1浓度。
作为比较，对皮下给与未粒子化的人生长激素蛋白溶液(700μg/0.2ml)的小鼠，相同地进行采血。
需要说明的是，为了抑制因给与对小鼠而言为异种蛋白质的人生长激素所导致的抗体生成，在给与粒子3天前以26μg/小鼠的剂量皮下给与免疫抑制剂他克莫司水合物(Astellas公司)，然后，在给药时以13μg/小鼠的剂量皮下给与，之后以每周2次的间隔以13μg/小鼠的剂量皮下给与。
血浆中人生长激素浓度的经时变化如图19所示。给与未微粒化药物的小鼠，在给药1小时后显示出非常高的值，之后急速下降，1天后下降到给药前的水平。另一方面，给与使用PEG-PLGA聚合物制备的微粒化药物的小鼠，刚给药后的一过性的血中浓度的上升被抑制在约为给与未微粒化药物的小鼠的1％以下，给药9天以上血中浓度维持在高水平。
此时血浆中IGF-1浓度如图20所示。对于血浆中IGF-1浓度，在给与5k-55k微粒及5k-105k微粒后均上升，为5k-55k微粒时血浆中IGF-1浓度维持在高水平直到第7天，为5k-105k微粒时血浆中IGF-1浓度维持在高水平14天以上。
实施例30小鼠皮下给与包封毒蜥外泌肽4(GLP-1受体激动剂)的微粒
将25mg实施例20的PEG-PLGA聚合物(5k-61k)溶解于500μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加100μl叔丁醇后，滴加10mg/ml的毒蜥外泌肽4(委托SigmaGenosys公司合成)水溶液250μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZEDRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在1ml碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到10ml含有10％PluronicF-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封毒蜥外泌肽4的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，算出平均粒径，结果微粒的平均粒径为6.0μm。
将300mg上述制备的微粒悬浊分散于3ml磷酸生理缓冲液(PBS)中，通过在80×g下离心5分钟使微粒沉淀，将上清液移至其他管中。再次将上清液在80×g下离心5分钟使残存的粒子沉淀，除去上清液。合并第1次的离心沉淀与第2次的离心沉淀，将其再次分散在1ml的PBS中，将相同的离心清洗操作重复3次，由此除去未被包封在粒子中的毒蜥外泌肽4。最后将沉淀再次分散在200μl的PBS中，得到给药溶液。
对10周龄的雄性Balb/C小鼠(日本SLC公司)从背部皮下的2处注射给与该溶液，经时地从尾静脉进行采血。在所采的血液中添加肝素，使其最终浓度为3.3IU/ml，在5,000rpm下离心5分钟，收集血浆，使用ELISA法测定血浆中毒蜥外泌肽4的浓度。
作为比较，对皮下给与未粒子化的毒蜥外泌肽4溶液(700μg/0.2ml)的小鼠，相同地进行采血。
需要说明的是，为了抑制因给与对小鼠而言为异种蛋白质的毒蜥外泌肽4所导致的抗体生成，在给与粒子3天前以26μg/小鼠的剂量皮下给与免疫抑制剂他克莫司水合物(Astellas公司)，然后，在给药时以13μg/小鼠的剂量皮下给与、之后以每周2次的间隔以13μg/小鼠的剂量皮下给与。
血浆中毒蜥外泌肽4浓度的经时变化如图21所示。给与未微粒化药物的小鼠，在给药1小时后血中浓度显示出非常高的值，之后急速下降，1天后下降到给药前的水平。另一方面，给与使用PEG-PLGA聚合物制备的微粒化药物的小鼠，刚给药后的一过性的血中浓度的上升被抑制在约1％以下，血中浓度维持在高水平直至1个月。实施例31粒径不同的包封荧光素标记葡聚糖(FD40)的微粒的制备
将5mg实施例20的PEG-PLGA聚合物(5k-55k)溶解于100μl碳酸二甲酯中，制备50mg/ml聚合物溶液。在该聚合物溶液中添加20μl叔丁醇后，滴加1mg/ml的FD40水溶液20μl，通过涡旋搅拌制备反相乳液。使用液氮预冷冻该反相乳液后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将所得的固态成分分散在50μl、200μl、500μl碳酸二甲酯中，制备S/O悬浊液。将该S/O悬浊液滴加到2ml含有10％Pluronic F-68(BASF的注册商标)的水溶液中，使用涡旋混合器搅拌·使其乳化，制备S/O/W型乳液。通过液中干燥从该S/O/W型乳液中除去水非混合性有机溶剂，得到微粒分散液。将该微粒分散液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA；FREEZE DRYER FD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到包封FD40的微粒粉末。通过使用扫描电子显微镜(SEM：HITACHI；S-4800)观察所得的微粒，算出平均粒径。
平均粒径与制备S/O/W型乳液时添加的碳酸二甲酯量的相关性如图22所示。可以观察到在50μl到500μl之间平均粒径随碳酸二甲酯量的增加而降低。
产业上的可利用性
本发明的微粒在生物体内能以合适的速度释放亲水性活性物质，因此可以用作DDS制剂。

Claims (31)

1.一种微粒，所述微粒由含有两亲性聚合物及亲水性活性物质的粒子附聚而成，所述两亲性聚合物由聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)的疏水性片段和多糖或聚乙二醇的亲水性片段组成，所述多糖为葡聚糖，所述聚乙二醇的数均分子量为5,000～12,000，聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)相对于聚乙二醇的数均分子量的比为4以上。
2.如权利要求1所述的微粒，其特征在于，含有两亲性聚合物及亲水性活性物质的粒子在内部具有两亲性聚合物的亲水性片段，并且具有两亲性聚合物的疏水性片段的外层。
3.如权利要求1或2所述的微粒，其特征在于，两亲性聚合物为由多糖主链及聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)接枝链组成的接枝型两亲性聚合物。
4.如权利要求1或2所述的微粒，其特征在于，两亲性聚合物为由聚乙二醇及聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)组成的嵌段聚合物。
5.如权利要求1或2所述的微粒，其特征在于，所述聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)为聚(乳酸-羟基乙酸)。
6.如权利要求3所述的微粒，其特征在于，所述聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)为聚(乳酸-羟基乙酸)。
7.如权利要求4所述的微粒，其特征在于，所述聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)为聚(乳酸-羟基乙酸)。
8.如权利要求1或2所述的微粒，其特征在于，平均粒径为1～50μm。
9.如权利要求3中任一项所述的微粒，其特征在于，平均粒径为1～50μm。
10.如权利要求4中任一项所述的微粒，其特征在于，平均粒径为1～50μm。
11.如权利要求5中任一项所述的微粒，其特征在于，平均粒径为1～50μm。
12.如权利要求6中任一项所述的微粒，其特征在于，平均粒径为1～50μm。
13.如权利要求7中任一项所述的微粒，其特征在于，平均粒径为1～50μm。
14.如权利要求1或2所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
15.如权利要求3所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
16.如权利要求4所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
17.如权利要求5所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
18.如权利要求6所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
19.如权利要求7所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
20.如权利要求8所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
21.如权利要求9所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
22.如权利要求10所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
23.如权利要求11所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
24.如权利要求12所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
25.如权利要求13所述的微粒，其特征在于，亲水性活性物质为肽或蛋白质。
26.权利要求1所述的微粒的制备方法，其特征在于，包括以下工序：
(a)工序，通过将含有亲水性活性物质的水性溶剂和溶解有两亲性聚合物的水非混合性有机溶剂混合，形成反相乳液；
(b)工序，从反相乳液中除去溶剂，由此得到含有亲水性活性成分的固态成分；及
(c)工序，将含有亲水性活性成分的固态成分或含有亲水性活性成分的固态成分分散液导入含有表面改性剂的液相中。
27.如权利要求26所述的微粒的制备方法，其特征在于，从反相乳液中除去溶剂的方法为冷冻干燥法。
28.如权利要求26或27所述的微粒的制备方法，其特征在于，含有亲水性活性成分的固态成分分散液的分散介质为可溶解聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)、且对构成两亲性聚合物的亲水性片段的溶解度在10mg/mL以下的溶剂。
29.如权利要求26或27所述的微粒的制备方法，其特征在于，液相为水性溶剂或水混合性有机溶剂。
30.如权利要求28所述的微粒的制备方法，其特征在于，液相为水性溶剂或水混合性有机溶剂。
31.一种药物组合物，含有权利要求1～25中任一项所述微粒。
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