CN101879158B

CN101879158B - 青蒿素衍生物的新应用

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Publication number: CN101879158B
Application number: CN2010102166200A
Authority: CN
Inventors: 吴东海; 朱强; 杨松; 刘兰英; 彭长兰
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2010-07-01
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2030-07-01
Also published as: CN101879158A

Abstract

本发明公开了具有以下式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ结构的青蒿素衍生物在制备防治肥胖的药物中的应用，其中：n＝0～1；R₁选自C₁～C₃烷基；R₂选自芳基或含氮原子取代的芳香杂环。由所述青蒿素类生物制备的药物作为抗脂肪分化的药物，将会在这些疾病的治疗中发挥重要作用。

Description

青蒿素衍生物的新应用

技术领域

本发明涉及青蒿素衍生物在制药中的新应用，属于化学生物学和细胞生物学领域。

背景技术

青蒿素是从黄花蒿中提取的含有过氧基团的倍半萜内酯药物。青蒿素类抗疟药物的发现是全球抗疟药物发展史上继奎宁之后的又一里程碑，它是我国发现的第一个植物化学药品，也是中国唯一被世界卫生组织认可的、可按合成药研究标准开发的中药。30多年来，青蒿素独特的分子结构和突出的生物活性深深吸引着科学家们的眼球。随着医药科技的发展，经过药理作用和临床应用证明，青蒿素衍生物被广泛应用于治疗疟疾，癌症，急性感染及高热病和皮肤病等疾病中。其中临床研究较多的青蒿素衍生物有二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等。目前尚未见有关青蒿素衍生物抑制脂肪细胞分化的文献报道。

肥胖是指机体进食热量多于身体消耗量，造成脂肪的过渡积累与脂肪组织的过量扩增，使体重超过标准体重的20％以上，并伴有头昏乏力、神疲气短的一类病症，是高血压病、糖尿病、高血脂、冠心病、脑血管病的危险因素。当今，肥胖已成为全球蔓延速度最快、最严重的公共卫生问题之一。近年来，随着我国人民生活水平的提高，在城市人口中肥胖人数增加了，而且不仅发生在老年人，还发生在儿童、妇女，各个年龄组身体肥胖的人数都在增加，减肥已经成为人们的热点话题。引起肥胖症的病因有很多，其中主要与遗传和环境因素有密切关系。环境因素是指长期食入高脂、高热量食物，再加上体力活动减少，心理障碍等因素的作用下，引起体脂调控网络的神经内分泌调节紊乱。

因此，预防和控制肥胖病的发生已成为医学上十分关注的问题。目前，常用的减肥药物大致分为三类：一、控制食欲的药物，此类药物有诸多不良反应，如失眠、口干、便秘、心悸和高血压；二、增加能量消耗的药物；三、抑制肠道吸收的药物。尽管现在有许多研究已深入到基因药物水平，但目前仍然没有找到一种真正有效的、能长期使用的减肥药物，研究出更为理想的有效的方法和制剂用于肥胖病的诊断和治疗仍然具有深远的意义。

3T3-L1是一个衍生自3T3细胞(一个建立于1962年的标准成纤维细胞的细胞系)的，在生物研究中被应用于研究脂肪组织的细胞系。3T3-L1细胞拥有类似成纤维细胞的形态，但是在适当条件的诱导下，能够分化并形成脂肪细胞的表型。3T3-L1细胞分化成熟后的脂肪细胞形态，胞内甘油三酯的合成和积累相对于分化前的成纤维细胞状态都大大提高，这时候的3T3-L1细胞呈现一种图章戒指的脂肪细胞形态。这些细胞对调节脂肪生成和脂肪降解的激素和药物都敏感，例如肾上腺素，去甲肾上腺素，胰岛素等。

因为3T3-L1细胞的这些特性，该细胞系被广泛应用于脂肪分化和代谢疾病机理的研究，是国际公认的体外脂肪分化的细胞系模型。对该模型的研究已经帮助阐明了一个在脂肪细胞末端分化中最为主要的调控脂肪分化的转录级联信号转导，包括了一系列转录因子、调控蛋白和效应蛋白。

油红O染色技术是一种常用的脂类染色法，其优点是染色步骤简便，染色结果肯定。染色后脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。油红O染出的红色与脂肪细胞内积累形成的油滴的量成正比，而后者与脂肪细胞分化程度的高低成正比，所以通过该技术，既可以定性观察判断，亦可以定量检测比较脂肪细胞分化程度的高低。

黄花蒿广泛存在于世界各地，但青蒿素含量较高的黄花蒿仅存在于我国重庆东部、福建、广西、海南部分地区，属于我国独有的药物资源。近几十年，青蒿素衍生物的研究主要集中在抗疟疾和抗肿瘤方面，将其应用到减肥药的研究却很罕见。

发明内容

本发明的目的是为了完善青蒿素衍生物在新领域里的应用，即提供一种蒿素衍生物的新应用。

具体技术方案如下：

具有以下式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ结构的青蒿素衍生物在制备防治肥胖的药物中的应用，

其中：

n＝0～1；R₁选自C₁～C₃烷基；R₂选自芳基或含氮原子取代的芳香杂环。

优选地，所述青蒿素衍生物为具有以下结构式中的任一种

其中，二氢青蒿素、青蒿素苯甲酸酯具有所有检测过的青蒿素衍生物中最强的抑制3T3-L1细胞分化的效果。其次是青蒿琥酯，拥有仅次于前两者的抑制3T3-L1细胞分化的效果。这3个化合物都能够在10μM的水平完全抑制3T3-L1细胞的分化。

本发明的目的是开发青蒿素衍生物在减肥药物中的作用，对其抑制细胞脂肪分化进行了详细研究。

本发明具有以下优点：

(1)青蒿素及其衍生物是传统的抗疟疾药物，一直以来用于治疗疟疾，本发明的特点是首次提出青蒿素的部分衍生物具有抑制脂肪细胞分化的作用，首次将它们与代谢类的疾病联系起来，并首次提出它们作为应用于肥胖及肥胖相关疾病如心血管疾病的药物的潜在可能性。与肥胖相关的代谢类疾病在当今社会是人类健康的重大威胁，由所述青蒿素类生物制备的药物作为抗脂肪分化的药物，将会在这些疾病的治疗中发挥重要作用。

(2)本发明比较了不同青蒿素衍生物之间抑制脂肪细胞分化能力的强弱，得出了初步的构效关系，为进一步优化获得活性更好的青蒿素衍生物提供了依据。

附图说明

图1.为青蒿素系列衍生物对脂肪细胞分化的抑制作用，横坐标为药物使用剂量(浓度，以μM表示)，纵坐标为相对分化率(加药处理实验组油红染色OD值/完全分化对照组油红染色OD值)；

图2.为选取的抑制3T3-L1细胞分化效果最具有代表性的5个化合物的油红染色总体效果；其中，图2.1为化合物2浓度梯度影响3T3-L1细胞分化的油红染色总体效果；

图2.2为化合物4浓度梯度影响3T3-L1细胞分化的油红染色总体效果；

图2.3为化合物3浓度梯度影响3T3-L1细胞分化的油红染色总体效果；

图2.4为化合物5浓度梯度影响3T3-L1细胞分化的油红染色总体效果；

图2.5为化合物9浓度梯度影响3T3-L1细胞分化的油红染色总体效果；

图3为诱导3T3-L1细胞分化的流程阶段示意图。

具体实施方式

本发明所述具有以下式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ结构的青蒿素衍生物，主要为具有以下结构式的化合物：

(a)所述具有式Ⅰ结构的化合物为：

(b)所述具有式Ⅱ结构的化合物为：

(c)所述具有式Ⅲ结构的化合物为：

(d)所述具有式Ⅳ结构的化合物为：

(e)所述具有式Ⅴ结构的化合物为：

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

本领域的技术人员，可以从以下描述或现有技术，得到所述具有所述式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ结构的青蒿素衍生物。

实施例1：脱氧青蒿素的合成

200mg(0.7087mmol)青蒿素溶于10mL THF，原料溶解后，加入547mg(20.2688mmol)Al粉和7.23g(30.4032mmol)NiCl₂·6H₂O，4小时后反应完毕，旋干溶剂，用乙酸乙酯溶解旋干物，抽滤，用乙酸乙酯淋洗滤渣。滤液经无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(PE∶EA＝16∶1)得到72mg目标产物，收率38％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.68(s，1H)，3.19-3.16(m，1H)，2.02-1.58(m，6H)，1.51(s，3H)，1.28-1.03(m，11H).

实施例2：脱氧二氢青蒿素的合成

500mg(1.7596mmol)二氢青蒿素溶于5mL DCM，加入45mg 10％Pd/C，氢气保护下，40℃过夜反应完毕，过滤除去Pd/C，旋干溶剂，浓缩后柱层析(PE∶EA＝8∶1)得到202mg目标产物，收率43％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.34(s，1H)，4.78(t，J＝6.8Hz，1H)，2.83(d，J＝7.2Hz，1H)，2.40-0.79(m，21H).

实施例3：二氢青蒿素的合成

10g(35.4321mmol)青蒿素溶于500mL甲醇，搅拌降温至0-5℃，1小时内分批加入10g(265.7408mmol)NaBH₄。保持该温度继续搅拌1.5小时后，往反应瓶中缓慢滴加15.5mLHAc调节pH＝7，逐渐析出大量白色固体。旋干大部分溶剂，加入10mL冷水，室温下搅拌15分钟，抽滤，用冷H₂O∶MeOH＝2∶1洗涤滤饼，收集滤饼，干燥后得到8.0g目标产物，收率80％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.60(s，1H)，5.28(s，1H)，2.85(s，1H)，2.61(s，1H)，2.41-0.89(m，20H).

实施例4：β-蒿甲醚的合成

150mg(0.5275mmol)二氢青蒿素溶于1.0mL MeOH和2mL DCM混合溶剂中，加热至45℃，氩气保护下，迅速注入0.01mL(0.0559mmol)BF₃·Et₂O，在此温度下反应1小时，反应结束后，用醋酸钠水溶液洗涤反应液，有机层经无水MgSO₄干燥后，浓缩即得到β-蒿甲醚和α-蒿甲醚的混合物，将混合物溶解在适量正己烷中，在-20℃保存36小时，收集白色晶体，并用冷正己烷淋洗，干燥后得到107mg纯β-蒿甲醚，收率65％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.38(s，1H)，4.68(d，J＝3.2Hz，1H)，3.42(s，3H)，2.64-0.85(m，21H).

实施例5：青蒿素苯甲酸酯的合成

氩气保护下，3.386g(11.9158mmol)二氢青蒿素溶于40mL DCM，加入6.1mL(76.2613mmol)吡啶，搅拌降温至0℃，加入2.2mL(19.0653mmol)苯甲酰氯，保持该温度下反应15分钟，撤去冰浴升至室温，继续反应16小时完毕，加入7％柠檬酸水溶液终止反应，旋干DCM，加入乙酸乙酯溶解旋干物，依次用7％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤有机层，有机层经无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(PE∶EA＝16∶1)得到4.07g目标产物，收率88％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝8.12(d，J＝7.2Hz，2H)，7.59-7.55(m，1H)，7.44(t，J＝8.0Hz，2H)，6.01(d，J＝9.6Hz，1H)，5.53(s，1H)，2.76-0.92(m，21H).

实施例6：β-烯丙基青蒿素的合成

反应瓶中加入少量4

MS、105mg(0.7790mmol)无水ZnCl₂，Ar保护下，注入3mL无水DCM和0.5mL(3.1160mmol)烯丙基三甲基硅烷，搅拌降温至0℃。

称252mg(0.6492mmol)青蒿素苯甲酸酯溶解在3mL无水二氯乙烷中，将溶液滴入上述反应液中，保持0℃反应1小时，撤去冰浴，升至室温反应3小时，加入适量乙酸乙酯稀释反应体系，依次用7％柠檬酸水溶液、饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤有机层，有机层经无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(PE∶EA＝30∶1)，得到114mg目标产物，收率66％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.92(m，1H)，5.32(s，1H)，5.14-5.04(m，2H)，4.30(m，1H)，2.69-0.87(m，23H).

实施例7：β-乙酸青蒿素的合成

100mg(0.3245mmol)β-烯丙基青蒿素溶于4mL CCl₄-CH₃CN-H₂O(V∶V∶V＝1∶1∶2)混合溶剂中，依次加入347mg(1.6225mmol)NaIO₄和2mg(0.0097mmol)RuCl₃，室温过夜反应。旋干溶剂，加入乙酸乙酯溶解旋干物，依次用饱和NaHSO₃、饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤有机层，有机层经无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(DCM∶MeOH＝30∶1)，得到92mg目标产物，收率87％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.37(s，1H)，4.86(m，1H)，2.71-0.88(m，24H).

实施例8：D-Biotin修饰青蒿素的合成

Reagents and conditions：(a)Boc₂O，Et3N，THF，R.T.，15h；(b)D-biotin，EDCI，HOBt，(i-Pr)₂NEt，DMF，R.T.，10h；(c)TFA/CH₂Cl₂，0℃～R.T.，9h；(d)EDCI，HOBt，(i-Pr)₂NEt，DMF，R.T.，11h.

2的合成：

2.035g(13.7360mmol)溶于18mL THF中，加人0.63mL(4.5767mmol)NEt₃，搅拌降温至0℃。

1g(4.5767mmol)Boc₂O溶于9mL THF中，混合均匀后，逐滴滴入上述反应液中，滴加完毕后，自然升至室温反应15小时。反应完毕后，旋干溶剂，加水稀释后，用DCM萃取，有机层用饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(DCM∶MeOH＝5∶1)，得到906mg目标产物，收率80％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.18(s，1H)，3.56(s，4H)，3.50-3.45(m，4H)，3.30-3.25(m，2H)，2.82(t，J＝5.6Hz，2H)，1.53(s，2H)，1.38(s，9H).

3的合成：

氩气保护下，318mg(1.3mmol)D-Biotin、249mg (1.3mmol，1.3equiv.)EDCI、176mg(1.3mmol，1.3equiv.)HOBt溶于4mL干燥DMF，加入0.23mL(1.4mmol，1.4equiv.)DIPEA，室温搅拌。

248mg(1.0mmol)2溶于3mL干燥DMF中，将溶液注入上述反应瓶中，室温反应10小时。反应完毕后，往反应瓶中加入NH₄Cl饱和溶液，氯仿萃取，有机层经NH₄Cl饱和溶液、水、饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(DCM∶MeOH＝20∶1)，得到358mg目标产物，收率76％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝6.67(s，1H)，6.15(s，1H)，5.52(s，1H)，5.15(s，1H)，4.45-4.40(m，1H)，4.25-4.20(m，1H)，3.52(s，4H)，3.49-3.45(m，4H)，3.37-3.34(m，2H)，3.23-3.21(m，2H)，3.10-3.04(m，1H)，2.14(t，J＝7.6Hz，2H)，1.70-1.50(4H)，1.36(s，12H).

4的合成：

将118mg 3溶于3mL二氯甲烷中，搅拌降温至0℃，缓慢滴加1.0mL TFA，加完后撤去冰浴，自然升至室温反应9小时，反应完毕后，直接减压蒸馏除去溶剂，真空干燥得到粗产物(按100％计算，应得到93mg粗产物)4，未经分离直接用于下一步反应。

¹H NMR(MeOD，400MHz)：δ＝4.52-4.49(m，1H)，4.32-4.29(m，1H)，3.72-3.65(m，6H)，3.56(t，J＝5.6Hz，2H)，3.39-3.35(m，2H)，3.22-3.20(m，1H)，3.14-3.11(m，2H)，2.95-2.91(dd，J＝12.8Hz，4.8Hz，1H)，2.71(d，J＝12.8Hz，1H)，2.22(t，J＝7.6Hz，2H)，1.71-1.60(m，4H)，1.47-1.43(m，2H).

D-Biotin修饰青蒿素的合成：

氩气保护下，74mg(0.2269mmol)羧酸青蒿素、57mg(0.2949mmol)EDCI、40mg(0.2949mmol)HOBt溶于3mL无水DMF，注入0.24mL(1.4293mmol)DIPEA，室温搅拌。

称93mg(0.2496mmol)4溶于2mL干燥DMF，将溶液注入上述反应液中，室温过夜反应。反应完毕后，加入DCM稀释反应液，依次用NH₄Cl饱和溶液、水、饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)，得到89mg目标产物，收率57％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝7.24(s，1H)，δ6.85(s，1H)，δ6.30(s，1H)，δ5.41(s，1H)，δ5.35(s，1H)，δ4.75-4.71(m，1H)，δ4.52-4.50(m，1H)，δ4.32-4.29(m，1H)，δ3.61-3.40(m，12H)，δ3.15-3.16(m，1H)，δ2.90-0.88(m，33H).

实施例9：

称50mg(0.1288mmol)青蒿素苯甲酸酯和适量4

MS于反应瓶中，氩气保护下，注入2mL重蒸DCM溶解，降温至0℃，注入0.02mL(0.1546mmol)TMSCl，保持该温度反应1小时后升至室温过夜反应完毕。旋干溶剂，加入乙酸乙酯溶解旋干物，依次用饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤，有机层经无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析(PE∶EA＝8∶1)，得到33mg目标产物，收率96％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝6.19(s，1H)，5.54(s，1H)，2.44-0.99(m，20H).

实施例10：

氩气保护下，50mg(0.1865mmol)脱氧二氢青蒿素溶于3mL DCM中，降温至0℃，注入0.03mL(0.3729mmol)乙酰氯，逐渐升至室温过夜反应完毕。反应液经水洗涤，有机层经无水Na₂SO₄干燥，浓缩柱层析(PE∶EA＝16∶1)，得到作为副产物的消旋脱氧二氢青蒿素30mg，收率64％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝6.04(s，1H)，5.47(s，1H)，2.04-1.21(m，20H).

实施例11：

100mg(0.3517mmol)二氢青蒿素溶于5mL DCE，加人73mg(0.4220mmol)2-喹喔啉羧酸搅拌片刻后，加入5mL(0.0422mmol)DMAP，搅拌降温至0℃，加入80mg(0.3868mmol)DCC，搅拌5分钟后升至室温，16小时后停止反应，过滤反应液，滤液经水、饱和NaCl溶液洗涤，有机层经无水Na₂SO₄干燥后，浓缩柱层析，得到120mg目标产物，收率78％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝9.57(s，1H)，8.31(d，J＝8.0Hz，1H)，8.17(d，J＝8.0Hz，1H)，7.91-7.86(m，2H)，6.03-6.00(m，2H)，5.64(s，1H)，2.90-0.95(m，21H).

实施例12：

按照如实例12所述，100mg(0.3517mmol)二氢青蒿素与63mg(0.4220mmol)对醛基苯甲酸反应，柱层析得到116mg目标产物，收率79％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝10.10(s，1H)，8.27(d，J＝8.0Hz，2H)，7.96(d，J＝8.0Hz，2H)，6.03-6.00(m，1H)，5.54(s，1H)，2.90-0.95(m，21H).

实施例13：

按照如实例12所述，100mg(0.3517mmol)二氢青蒿素与133mg(0.4220mmol)Boc-3-(2-萘基)-L-丙氨酸反应，柱层析得到151mg目标产物，收率76％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝7.86-7.83(m，1H)，7.80-7.74(m，3H)，7.47-7.38(m，1H)，6.05-6.00(m，1H)，5.54(s，1H)，2.83-0.85(m，34H).

实施例14：

按照如实例12所述，100mg(0.3517mmol)二氢青蒿素与76mg(0.4220mmol)对硝基苯乙酸反应，柱层析得到123mg目标产物，收率78％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝8.18(d，J＝8.0Hz，2H)，7.48(d，J＝12.0Hz，2H)，6.03-6.00(m，1H)，5.44(s，1H)，3.82(s，2H)，3.82(s，2H)，2.65-0.68(m，23H).

实施例15：

氩气保护下，100mg(0.3517mmol)二氢青蒿素与0.08mL(0.5627mmol)对甲氧基苯甲酰氯溶于5mL DCM中，降温至0℃，注入0.2mL(2.2509mmol)吡啶，搅拌15分钟后，升至室温过夜反应完毕，用7％柠檬酸水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，再经饱和NaHCO₃、饱和NaCl溶液洗涤，有机层经无水Na₂SO₄干燥，浓缩后柱层析，得到119mg目标产物，收率81％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝8.06(d，J＝12Hz，2H)，6.91(d，J＝12Hz，2H)，5.98(m，1H)，5.51(s，1H)，3.864(s，3H)，2.81-0.85(m，21H).

实施例16：

按照实例15所述，100mg(0.3517mmol)二氢青蒿素与104mg(0.5627mmol)对硝基苯甲酰氯反应，柱层析得到81mg目标产物，收率53％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝8.28(s，4H)，6.05-6.00(m，1H)，5.55(s，1H)，2.83-0.85(m，22H).

实施例17：青蒿琥酯的合成

室温条件下，250mg(0.9mmol)二氢青蒿素溶于25mL干燥DCM中，加入202mg(2mmol)丁二酸酐，降温至0～5℃，加入107mg(0.9mmol)DMAP，保持该温度反应0.5小时，自然升至室温反应1小时。反应结束后，加入5mL水，用10％稀盐酸调至pH＝3，有机层经水洗后，用无水MgSO₄干燥，减压除去溶剂，得到317mg目标产物，收率94％。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝5.74(d，J＝8.0Hz，1H)，5.39(s，1H)，2.72-2.59(m，4H)，2.53-2.48(m，1H)，2.36-2.28.(m，1H)，2.01-1.96(m，1H)，1.87-1.82(m，1H)，1.76-1.66(m，2H)，1.60-1.55(m，1H)，1.45-1.21(m，8H)，1.01-0.95(m，1H)，0.92(d，J＝8.0Hz，3H)，0.80(d，J＝4.0Hz，3H).

实施例18：青蒿素衍生物对3T3-L1细胞分化的影响

3T3-L1细胞的培养

3T3-L1细胞在37℃，5％CO₂培养环境中贴壁生长，使用加入10％FBS(Hyclone胎牛血清)的DMEM高糖培养基(HyClone)。可根据细胞生长状况，2～3天换一次液。如果需要持续多次传代，并需要在多次传代之后细胞仍然具有良好的分化能力，那么就要避免让细胞长的太满(＜70％)，一般长到60％～70％就要传代分细胞了。细胞可以以稀到1∶15的比例传代分盘，但是通常以1∶10或者更高的比例传代分盘，以实验需要为准。

3T3-L1细胞诱导分化的培养基的配制

诱导培养基分为两种，MDI诱导培养基和胰岛素培养基，分别用于分化不同阶段，是由DMEM培养基加上适当量的FBS、地塞米松、胰岛素和IBMX配成。

IBMX溶液：将IBMX溶于0.5N的KOH溶液中，IBMX终浓度为0.0115g/ml，0.22μm针头过滤器过滤除菌，-20℃保存。

胰岛素储存溶液：将胰岛素溶于0.02M的HCl中至终浓度167uM(1mg/ml)，0.22μm针头过滤器过滤除菌，-20℃长期保存，4℃短期保存。

地塞米松储存溶液：冷冻储存液：10mM地塞米松溶于无水乙醇，-20℃保存；工作储存液：将冷冻储存液用PBS稀释至1mM，过滤除菌，储存于4℃。

MDI诱导培养基(现配现用，10ml/10cm培养皿，5ml/6cm培养皿)：含有10％FBS的DMEM高糖培养基再加入：1∶100的IBMX溶液，1∶1000胰岛素储存液，1∶1000地塞米松工作储存液。

胰岛素培养基(现配现用，10ml/10cm培养皿，5ml/6cm培养皿)：含有10％FBS的DMEM高糖培养基再加入：1∶1000胰岛素储存液。

诱导未分化的3T3-L1细胞(成纤维细胞状态)向成熟脂肪细胞分化：

如图3所示：

1.在含有10％FBS的DMEM高糖培养基中将3T3-L1前脂肪细胞培养至接合状态。

2.接合之后再养2天(此时为分化第0天)以MDI诱导培养基刺激细胞(换去原有的完全培养基，加入新配制的MDI诱导培养基)。在未来2天中会注意到细胞形态发生显著的变化(变得更加纺锤形)。

3.加入MDI诱导2天之后(分化第2天)，换去原有的MDI诱导培养基，加入新配制的胰岛素培养基。培养基会开始变得更加粘稠，因为细胞合成的游离脂肪酸被大量的分泌到培养基中。

4.两天之后(分化第4天)，将培养基换成普通的完全培养基(含有10％FBS的DMEM高糖培养基)，之后每2天换一次液(含有10％FBS的DMEM高糖培养基)。通常在分化第8天的时候达到分化完全的状态。

药物编号1至9分别代表的化合物结构式依次为：

油红O染色数据的分析和处理

油红O染色所用试剂的配制：

油红O储存液：油红O(AMRESCO，FW 408.51，Em(513nm))0.7g溶于200ml异丙醇，过夜颠倒振荡混匀，0.2μm滤膜过滤后储存在4℃。

油红O工作液：6份油红O储存液加上4份dH₂O，混匀后室温静置20分钟，0.2μm滤膜过滤。

油红O染色：

1.吸去绝大部分培养基。

2.加入10％福尔马林(溶于PBS中)，室温孵育5分钟。

3.吸去10％福尔马林，加入同样体积的新鲜福尔马林(未稀释的37％甲醛溶液)，孵育至少1小时，甚至更久。注：细胞在福尔马林中可以保持好几天，然后再染色。将培养板四周用封口膜密封以防止甲醛挥发蒸干，并以铝箔纸包裹以避光。

4.用小枪头吸去所有福尔马林。

5.以60％异丙醇(溶于dH₂O中)清洗培养孔。

6.让细胞培养孔彻底干燥。

7.加入油红O工作液，染色10分钟(加入时不要碰到孔壁)。

8.移去所有油红染液，立即加入dH₂O，用水洗4遍(可直接在自来水龙头下冲洗)。

9.根据实验需要拍照。

10.移去所有的水，让培养孔完全干燥。

11.加入100％异丙醇洗脱油红O，孵育10分钟(可以更久)。

12.反复吹吸含有油红的异丙醇几次，保证所以油红都溶进溶液中。

13.将含有油红的异丙醇转移至EP管或者ELISA板的孔中。

14.在500nm波长处测量OD值，读数时间为0.5秒。

15.空白对照使用100％异丙醇，染色本底对照使用来自按照上述步骤染色的没养细胞的空培养孔的异丙醇。

表1.油红O染色中各种试剂的用量

细胞培养板	福尔马林	60％异丙醇	油红O	100％异丙醇
					24孔板	500μl	500μl	200μl	750μl
12孔板	1ml	1ml	400μl	1.5ml
					6孔板	2.4ml	2.4ml	1ml	3.6ml

青蒿素衍生物对3T3-L1细胞的分化的影响

将固体青蒿素(图1.1、3-7号化合物)溶解于DMSO中，配制成一系列梯度浓度的溶液，本实验中该浓度梯度包括5个水平：1mM、5mM、10mM、30mM、50mM。二氢青蒿素(化合物2)浓度梯度为：0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、30mM、50mM；青蒿琥酯(化合物9)的浓度梯度为：0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、30mM、50mM。

如图3所示，依照上述所描述的诱导未分化的3T3-L1细胞(成纤维细胞状态)向成熟脂肪细胞分化的操作流程，在分化第0天的时候，向已经达到接合状态但尚未分化的3T3-L1细胞加入诱导分化的MDI培养基。加入青蒿素药物的处理操作为，在MDI培养基中按照1/1000的比例预先加入如上所述配置成的青蒿素系列梯度浓度的溶液，混匀之后再将培养基加入细胞培养孔。1/1000的比例，使得化合物1、3-7药物的终浓度变为1μM、5μM、10μM、30μM、50μM，也就是本实验实际使用的药物剂量。同时需要设计一个处理，在培养基中加入1/1000的DMSO作为溶剂对照，也就是药物浓度为0μM的处理。

依照上述所描述的细胞培养条件培养经过处理的3T3-L1细胞2天，依照上述所描述的诱导未分化的3T3-L1细胞(成纤维细胞状态)向成熟脂肪细胞分化的操作流程，在分化第2天加入胰岛素培养基，并用如上所述同样的方法和剂量，加入系列梯度浓度的青蒿素(同样的细胞培养孔加入同一个浓度的同一种药物)。

依照上述描述，对完成分化的3T3-L1细胞进行油红O染色，拍照，测吸光度，收集数据，整理，做图，比较，结果见图1。

图1中这9个化合物每个浓度的数据均来源于3次不同批次的重复实验得到的平均值，误差由3次重复实验之间的SE值表示。

药物加入之后，会抑制或是促进或是不显著影响3T3-L1细胞脂肪分化(对于青蒿素系列药物，本发明关注的是抑制)。本发明以细胞脂肪分化的程度来表示药效。细胞分化的程度可以在实验完成后用油红染色法染色后，测OD值得以定量检测。分化程度越高，油滴积累越多，油红染色越深，OD值越高。

本发明的分化实验使用24孔细胞培养板来做，每个24孔板会设计不加药的几个孔做对照，也就是可以完全分化的细胞的对照。

每个药物在特定浓度的药效，是通过相应的OD值比上同一个24孔细胞培养板上的完全分化的对照的OD值得到(相对分化程度)。这样，不同培养板得出的数据就可以相互比较。

如图1所示，如果是完全分化，得到的值(相对分化程度)就是1(100％)；分化受到抑制，值就小于1(0～1之间)。分化抑制程度越高，值越小，药效越好。

结果如图1所示，青蒿素本身(图1.1号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果很差，浓度在50μM的水平，3T3-L1细胞相对分化程度能达到93.3％；在10μM的水平，相对分化程度能达到94.8％。

结果见图1，图2.1，二氢青蒿素(图1.2号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果为所有已经被测试过的青蒿素衍生物中最好的之一，在10μM的水平已经能完全抑制3T3-L1细胞的分化，相对分化程度只有24.5％。

结果见图1，图2.3，该化合物(图1.3号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果一般，在10μM的水平，3T3-L1细胞的相对分化程度有62.5％。

结果见图1，图2.2，青蒿素苯甲酸酯(图1.4号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果为所有已经被测试过的青蒿素衍生物中最好的之一，在10μM的水平已经能完全抑制3T3-L1细胞的分化，相对分化程度只有27.3％。

结果见图1，图2.4，烯丙基青蒿素(图1.5号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果一般，在10μM的水平，3T3-L1细胞的相对分化程度有58.1％。

结果见图1，乙酸基青蒿素(图1.6号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果较差，在10μM的水平，3T3-L1细胞的相对分化程度有81.3％。

结果见图1，青蒿素-生物素(图1.7号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果很差，在10μM的水平，3T3-L1细胞的相对分化程度有91.6％。

结果见图1，去氧二氢青蒿素(图1.8号化合物)几乎没有抑制3T3-L1细胞分化的效果，在10μM的水平，3T3-L1细胞的相对分化程度能达到98.8％。

结果见图1，图2.5，青蒿琥酯(图1.9号化合物)抑制3T3-L1细胞分化的效果为所有已经被测试过的青蒿素衍生物中最好的之一，在10μM的水平已经能完全抑制3T3-L1细胞的分化，相对分化程度只有31.5％。

Claims

1.具有以下结构的青蒿素衍生物在制备防治肥胖的药物中的应用，