CN101863953B - 从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禾叶山麦冬皂苷A；还公开了其制备方法，包括以下步骤：1)、将禾叶山麦冬块状根粉碎后作为原料，采用乙醇回流浸提；2)、将所得的浸膏用正丁醇萃取，然后真空浓缩；3)、将所得的正丁醇相萃取物采用D101型大孔树脂分离，分别用水以及不同质量浓度的乙醇溶液洗脱不同极性的组分；4)、将75％乙醇溶液所得的皂苷洗脱液真空浓缩、冷冻干燥；5)、采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物；6)、皂苷组分进行真空浓缩，再冷冻干燥，得禾叶山麦冬皂苷A。禾叶山麦冬皂苷A对人宫颈癌Hela细胞及人肝癌SMMC-7721细胞均具有较好的体外增殖抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于轻工技术领域，涉及禾叶山麦冬活性成分的提取分离和制备，特别是从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法。
背景技术
禾叶山麦冬的块根做山麦冬入药，属于民间地方用药；其药用功能：能清心润肺，养胃生津，除烦，止血；用于急、慢性支气管炎，肺热咳嗽，吐血，咯血，热病烦渴，口腔溃疡等。进一步的药理研究证实甾体皂苷类成分是能代表山麦冬活性的一类成分，国内外研究表明很多甾体皂苷具有防治心血管疾病、抗肿瘤，提高免疫等活性。从禾叶山麦冬中提取皂苷，至今未有相关文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、成本低廉的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，包括以下步骤：
1)、将禾叶山麦冬块状根粉碎后作为原料，采用乙醇回流浸提，所得浸提液浓缩后得浸膏；
2)、将浸膏用正丁醇萃取，浸膏与正丁醇的体积比为1∶1，得皂苷萃取液；将皂苷萃取液真空浓缩后，得正丁醇相萃取物；
3)、将正丁醇相萃取物采用D101型大孔树脂分离，分别用水以及质量浓度分别为25％、50％、75％和95％的乙醇溶液洗脱不同极性的组分，得到初步纯化的皂苷洗脱液；
4)、将75％乙醇溶液所得的皂苷洗脱液真空浓缩至糊状，再冷冻干燥，得皂苷粗提物；
5)、采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物，得皂苷组分；
6)、皂苷组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到60％以上，再采用冷冻干燥，得粉末状的禾叶山麦冬皂苷A。
作为本发明的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法的改进：步骤5)的逆流色谱方法为：采用逆流色谱仪为分离设备，由体积比为1～3∶4∶3∶1～3的正丁醇、水、正己烷和甲醇组成溶剂系统，溶剂系统上相作固定相，下相作流动相；将固定相注入逆流色谱仪的色谱柱，以流动相作为溶剂溶解步骤4)所得的皂苷粗提物作为逆流色谱样品溶液；开启逆流色谱仪和流动相输液泵，将样品溶液和流动相输入逆流色谱分离柱，用紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，根据所得的色谱图收集皂苷组分。
作为本发明的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法的进一步改进：步骤1)中的浸提为：乙醇与原料的液料体积比为5～10ml/1g，浸提时间为2.5～3.5小时；浸提次数为2～3次。
作为本发明的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法的进一步改进：步骤2)、步骤4)和步骤6)的真空浓缩均为：真空度低于0.09Mpa，温度为60～70℃。
作为本发明的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法的进一步改进：步骤4)和步骤6)的冷冻干燥均为：真空度低于50Pa，温度-38℃～-35℃。
作为本发明的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法的进一步改进：逆流色谱仪为高速逆流色谱仪(HSCCC)。
在本发明的方法中，采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物，溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、水、正己烷和甲醇溶液组成；并且取用该溶剂系统的部分下相来溶解皂苷粗提物从而制备皂苷组分。
本发明所得的禾叶山麦冬皂苷A特征和性能如下：
白色粉末，mp255～256℃，微溶于甲醇，易溶于吡啶等，Liebermann-Burchard反应阳性(墨绿色)，molish反应呈阳性(界面出现紫色环)。分子量为1002，分子式为C49H78O21，结构式如下：
禾叶山麦冬皂苷A的质谱及核磁谱图分别如图2～图9所示，具体为：MS谱如图2所示；1H-NMR谱如图3所示；13C-NMR谱如图4所示，DEPT 90图如图5所示，DEPT 135图如图6所示，1H-1H COSY谱如图7所示，HSQC谱如图8所示，HMBC谱如图9所示。
采用MTT法对禾叶山麦冬皂苷A进行体外肿瘤细胞增殖抑制试验。具体为：取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μl/孔)，分别设细胞对照组以及4个浓度受试药物组。继续培养72h后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃孵育4h，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl)，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，以孙瑞元教授编写的NDST计算机程序计算受试药物对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC50)。
不同浓度受试物禾叶山麦冬皂苷A对人宫颈癌Hela细胞及人肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖抑制率见表1、2，受试物禾叶山麦冬皂苷A作用细胞72h的半数抑制浓度(IC50)见表3。
表1受试物禾叶山麦冬皂苷A对Hela细胞生长的抑制作用
表2受试物禾叶山麦冬皂苷A对SMMC-7721细胞生长的抑制作用
表3受试物禾叶山麦冬皂苷A抑制Hela和SMMC-7721细胞生长的IC50(72h)值
结果表明受试物禾叶山麦冬皂苷A对人宫颈癌Hela细胞及人肝癌SMMC-7721细胞均具有较好的体外增殖抑制作用，IC50分别为26.1±4.4μg/ml和76.4±20.6μg/ml。
上述禾叶山麦冬皂苷A实际使用时，其用法和用量如下：注射，5～15mg禾叶山麦冬皂苷A/kg(体重)。
本发明的优点是：使用基于液-液分配的逆流色谱技术，分离重现性好，是一种经济、高效的从禾叶山麦冬中分离制备高纯度禾叶山麦冬皂苷A的方法。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的工艺流程图；
图2为禾叶山麦冬皂苷A的MS谱；
图3为禾叶山麦冬皂苷A的1H-NMR谱；
图4为禾叶山麦冬皂苷A的13C-NMR谱；
图5为禾叶山麦冬皂苷A的DEPT 90图；
图6为禾叶山麦冬皂苷A的DEPT 135图；
图7为禾叶山麦冬皂苷A的1H-1H COSY谱；
图8为禾叶山麦冬皂苷A的HSQC谱；
图9为禾叶山麦冬皂苷A的HMBC谱；
图10是实施例1的HSCCC分离图谱；
图11为实施例1分离所得的禾叶山麦冬皂苷A的HPLC图谱；
图12为实施例2的HSCCC分离图谱；
图13为实施例2分离所得的禾叶山麦冬皂苷A的HPLC图谱；
图14为实施例3的HSCCC分离图谱；
图15为实施例3分离所得的禾叶山麦冬皂苷A的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1、一种从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，依次进行以下步骤：
1)、将禾叶山麦冬块状根粉碎后作为原料，以乙醇作为浸提溶剂，浸提3次，每次的浸提条件如下：乙醇与原料的液料体积比为8ml/1g，于80℃浸提3小时；
合并3次所得浸提液，于50℃浓缩后得浸膏。
2)、将浸膏用正丁醇萃取，浸膏与正丁醇的体积比为1∶1，得皂苷提取液；将该皂苷提取液真空浓缩(真空度低于0.09Mpa，温度为60～70℃)后，得正丁醇相萃取物。
3)、将正丁醇相萃取物采用D101型大孔树脂分离：在正丁醇相萃取物中加以适量去离子水(1g正丁醇相萃取物加入10ml的去离子水)，超声使其溶解完全，倒入活化好的D101型大孔树脂柱中，打开玻璃柱底端的旋塞，使溶液缓慢流出，这样有利于树脂对样品的充分吸附。第一次上样时下端流出的溶液颜色较深，说明样品没有吸附完全，反复上样3～4次，使样品被充分吸附。首先用大量的去离子水洗至无糖，然后依次用质量浓度分别为25％、50％、75％和95％的乙醇溶液洗脱，控制流速为2BV/h，每次洗脱至流出液没有颜色。75％的乙醇洗脱液洗脱得到的是初步纯化的皂苷洗脱液。
4)、将初步纯化的皂苷洗脱液真空浓缩(真空度低于0.09Mpa，温度为60～70℃)至糊状，再冷冻干燥(真空度低于50Pa，温度-36℃)，得皂苷粗提物。经HPLC检测，皂苷粗提物中禾叶山麦冬皂苷A约占30％。
5)、采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物，依次进行以下步骤：
采用逆流色谱仪为分离设备，该逆流色谱仪选用HSCCC-D1200高速逆流色谱仪。
溶剂系统由正丁醇∶水∶正己烷∶甲醇＝2∶4∶3∶2(体积比)组成；即量取正丁醇500ml、水1000ml、正己烷750ml，甲醇500ml，置于3000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。以该溶剂系统的上相作为固定相，下相作为流动相。
取1200ml上相以40ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。称取步骤4)所得的皂苷粗提物10.0g溶于150ml下相中制备逆流色谱样品溶液。开启逆流色谱仪至900转/min，然后以2.0ml/min的流速输入逆流色谱样品溶液，待进样结束后，再以5.0ml/min的流速输入流动相(剩余的下相)以洗脱柱内的组分，用紫外可见检测器在210nm下检测逆流色谱流出液，根据检测器采集的色谱图(如图10所示)收集禾叶山麦冬皂苷A组分。即，在360～430min时间段收集的是禾叶山麦冬皂苷A组分。
6)、禾叶山麦冬皂苷A组分进行真空浓缩(真空度低于0.09Mpa，温度为60～70℃)，直至固形物浓度达到60％以上，再采用冷冻干燥(真空度低于50Pa，温度-36℃)，得2.325
g粉末状的禾叶山麦冬皂苷A，经HPLC检测，其纯度达91％以上。
该禾叶山麦冬皂苷A的HPLC图谱如图11所示。
实施例2、一种从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，依次进行以下步骤：
1)～4)，同实施例1。
5)、采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物，依次进行以下步骤：
采用逆流色谱仪为分离设备，该逆流色谱仪选用HSCCC-D1200高速逆流色谱仪。
溶剂系统由正丁醇∶水∶正己烷∶甲醇＝3∶4∶3∶1(体积比)组成；即量取正丁醇750ml、水1000ml、正己烷750ml，甲醇250ml，置于3000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。
取1200ml上相以40ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。称取皂苷粗提物10.0g溶于150ml下相中制备逆流色谱样品溶液，开启逆流色谱仪至900转/min，然后以2.0ml/min的流速输入样品溶液，待进样结束后，再以10.0ml/min的流速输入流动相(剩余的下相)以洗脱柱内的组分，用紫外可见检测器在210nm下检测逆流色谱流出液，根据检测器采集的色谱图(如图12所示)收集禾叶山麦冬皂苷A组分。即，在200～240min时间段收集的是禾叶山麦冬皂苷A组分。
6)、同实施例1，最终得2.576g粉末状的禾叶山麦冬皂苷A，经HPLC法检测，其纯度达87％以上。
该禾叶山麦冬皂苷A的HPLC图谱如图13所示。
实施例3、一种从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，依次进行以下步骤：
1)～4)，同实施例1。
5)、采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物，依次进行以下步骤：
采用逆流色谱仪为分离设备，该逆流色谱仪选用HSCCC-D400高速逆流色谱仪。
溶剂系统由正丁醇∶水∶正己烷∶甲醇＝2∶4∶3∶2.5(体积比)组成；量取正丁醇400ml、水800ml、正己烷600ml，甲醇500ml，置于3000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。
取400ml上相以20ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。称取皂苷粗提物2.0g溶于50ml下相中制备逆流色谱样品溶液，开启逆流色谱仪至800转/min，然后以1.0ml/min的流速输入样品溶液，待进样结束后，再以2.0ml/min的流速输入流动相(剩余的下相)以洗脱柱内的组分，用紫外可见检测器在210nm下检测逆流色谱流出液，根据检测器采集的色谱图(如图14所示)收集禾叶山麦冬皂苷A组分。即，在270～330min时间段收集的是禾叶山麦冬皂苷A组分。
6)、同实施例1，最终得495mg粉末状的禾叶山麦冬皂苷A，经HPLC法检测，其纯度达92％以上。
该禾叶山麦冬皂苷A的HPLC图谱如图15所示。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种禾叶山麦冬皂苷A，其特征是结构式如下：
2.一种从禾叶山麦冬中分离制备如权利要求1所述的禾叶山麦冬皂苷A的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、将禾叶山麦冬块状根粉碎后作为原料，采用乙醇回流浸提，所得浸提液浓缩后得浸膏；
2)、将所述浸膏用正丁醇萃取，浸膏与正丁醇的体积比为1∶1，得皂苷萃取液；将所述皂苷萃取液真空浓缩后，得正丁醇相萃取物；
3)、将正丁醇相萃取物采用D101型大孔树脂分离，分别用水以及质量浓度分别为25％、50％、75％和95％的乙醇溶液洗脱不同极性的组分，得到初步纯化的皂苷洗脱液；
4)、将75％乙醇溶液所得的皂苷洗脱液真空浓缩至糊状，再冷冻干燥，得皂苷粗提物；
5)、采用逆流色谱方法分离纯化皂苷粗提物，得皂苷组分；
6)、皂苷组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到60％以上，再采用冷冻干燥，得粉末状的禾叶山麦冬皂苷A。
3.根据权利要求2所述的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，其特征是所述步骤5)的逆流色谱方法为：采用逆流色谱仪为分离设备，由体积比为1～3∶4∶3∶1～3的正丁醇、水、正己烷和甲醇组成溶剂系统，所述溶剂系统上相作固定相，下相作流动相；将所述固定相注入逆流色谱仪的色谱柱，以流动相作为溶剂溶解步骤4)所得的皂苷粗提物为逆流色谱样品溶液；开启逆流色谱仪和流动相输液泵，将样品溶液和流动相输入逆流色谱分离柱，用紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，根据所得的色谱图收集皂苷组分。
4.根据权利要求3所述的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，其特征是所述步骤1)中的浸提为：乙醇与原料的液料体积比为5～10ml/1g，浸提时间为2.5～3.5小时；浸提次数为2～3次。
5.根据权利要求4所述的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，其特征是所述步骤2)、步骤4)和步骤6)的真空浓缩均为：真空度低于0.09Mpa，温度为60～70℃。
6.根据权利要求5所述的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，其特征是所述步骤4)和步骤6)的冷冻干燥均为：真空度低于50Pa，温度-38℃～-35℃。
7.根据权利要求6所述的从禾叶山麦冬中分离制备禾叶山麦冬皂苷A的方法，其特征是：所述逆流色谱仪为高速逆流色谱仪HSCCC。
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