CN110204589B

CN110204589B - 青葙子有效成分、提取方法及其在制备神经保护药物方面的应用

Info

Publication number: CN110204589B
Application number: CN201910572816.4A
Authority: CN
Inventors: 丛悦; 郭敬功; 沈姗; 师冰洋
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110204589A

Abstract

本发明涉及青葙子有效成分，其特征在于，包括齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和/或苯乙腈苷类化合物，齐墩果酸型三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

；苯乙腈苷类化合物的结构式如下所示：

Description

青葙子有效成分、提取方法及其在制备神经保护药物方面的应用

技术领域

本发明属于药学技术领域，具体涉及青葙子有效成分（齐墩果酸型三萜皂苷类和/或苯乙腈苷类化合物）、提取方法及其在制备神经保护药物或者保健品方面的应用。

背景技术

神经退行性疾病的特征是神经细胞的进行性损伤和神经元的丢失，随着时间的推移而恶化，导致运动或认知功能受损，属于一类进行性发展的致残，严重可致死的复杂疾病。常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩性锁骨硬化症（ALS）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、和脊髓小脑共济失调（SCA）。尽管神经退行性疾病的病理学仍然不清楚，很多报道已经揭示氧化应激起到了关键作用，导致活性氧自由基（ROS）大量产生和DNA氧化。在神经退行性疾病患者中常常由于年老和线粒体功能障碍产生过量的活性氧，这些活性氧进一步损害蛋白和DNA，并且在细胞凋亡损伤其他细胞之后，ROS被大量释放，从而引发细胞毒性多米诺骨牌效应，并且ROS会引起神经传递紊乱，并逐渐增加患神经退行性疾病的风险。积累的证据表明，具有神经保护作用的中药可通过抑制氧化应激降低患神经退行性疾病的风险。

青葙子(Celosiae semen)为苋科（Amaranthaceae）植物青葙属（Celosia）的青葙（Ce losia argentea L.）的干燥成熟种子，为药典收载品种。青葙子味苦，性微寒，归肝经，主要功能明目退翳，清肝泻火，《本草纲目》记载青葙子具有“益脑髓”。青葙的茎叶、苗皆可食用，是品质很好的可食性野菜。现代药理研究表明，青葙子具有抗氧化、保肝、抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗感染、治疗白内障、有丝分裂等作用。其主要的化学成分有皂苷、环肽、生物碱、酚类等，青葙子资源分布于我国大部分地区，同时在其他热带、亚热带国家或地区分布也很广。对于开发高效、低价的保护神经药物或者保健品，解决“看病难，看病贵”具有重要意义。目前，未有青葙子在保护神经方面应用的相关报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供了一种由齐墩果酸型三萜皂苷类和/或苯乙腈苷类化合物组成的青葙子有效成分，提取方法及其在制备神经保护药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

青葙子有效成分，其包括齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和/或苯乙腈苷类化合物，齐墩果酸型三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

；

苯乙腈苷类化合物的结构式如下所示：

。

上述青葙子有效成分的制备方法，其包括如下步骤：

1）将粉碎过的青葙子或炒青葙子用20－50%乙醇进行闪式提取，提取液浓缩得到提取物浸膏；将提取物浸膏分散在水中，用大孔吸附树脂吸附，然后依次用水、20%乙醇和60%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到20%乙醇浸膏A；收集60%乙醇洗脱液, 减压回收溶剂，得到60%乙醇浸膏B；

2）将20%乙醇浸膏A经薄层色谱硅胶柱层析，选用体积比8：1的二氯甲烷和甲醇溶剂进行洗脱，回收溶剂，得到流分；再经半制备HPLC色谱方法，用20%甲醇-水洗脱，保留时间为24min，得到苯乙腈苷类化合物；

3）将60%乙醇浸膏B经MCIGELCHP20开放柱，选用甲醇-水溶剂系统，依次分别用15%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇梯度洗脱，得到的组分依次记为：B-1、B-2、B-3、B-4、B-5；将组分B-5经薄层色谱硅胶柱层析，选用体积比5：1的二氯甲烷和甲醇溶剂进行洗脱，即得齐墩果酸型三萜皂苷类化合物。

上述青葙子有效成分的制备方法，具体的，步骤1）中，闪式提取2－3次，闪式提取时每1 g 青葙子或炒青葙子添加5－10mL的20－50%乙醇，每次闪式提取的时间为3－10min。

本发明提供了上述青葙子有效成分在制备神经保护药物或者保健品方面的应用。

本发明还提供了上述青葙子有效成分在制备治疗神经退行性疾病药物或者保健品方面的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1）本发明这两类化合物结构稳定，分别属于齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和苯乙腈苷类化合物，且其提取原料来自生长于平原或山坡岸的青葙。青葙泛分布于我国大部分地区，资源十分丰富。本发明生产条件温和，实验步骤少，技术难度小，生产成本低，环境污染小；同时其原料丰富、属于天然可再生资源；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，分离填料可以反复使用，不会造成生态环境污染；

2）经试验发现：本发明包含齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和/或苯乙腈苷类化合物的青葙子有效成分对t-BHP诱导神经细胞NSC34损伤模型，具有很好的保护作用，表现为无细胞毒毒性，提高细胞活力，降低细胞内ROS水平，降低凋亡率。

附图说明

图 1 为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物 1 的¹³C NMR谱；

图 2 为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物 1 的¹H NMR谱；

图 3 为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物 1 的 HSQC谱；

图 4 为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物 1 的 HMBC谱；

图 5 为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物 1 的 NOESY谱；

图 6 为齐墩果酸型三萜皂苷类化合物 1 的 HR-TOF-MS谱；

图 7 为苯乙腈苷类化合物 2 的¹³C NMR谱；

图 8 为苯乙腈苷类化合物 2 的¹H NMR谱；

图 9 为苯乙腈苷类化合物 2 的 HSQC谱；

图 10 为苯乙腈苷类化合物 2 的 HMBC谱；

图 11 为苯乙腈苷类化合物 2 的 HR-TOF-MS谱；

图 12 为苯乙腈苷类化合物 2 的红外谱；

图 13 为 NSC34细胞内的ROS成像结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，如无特殊说明，甲醇、乙醇均指的是体积百分比浓度。

本发明齐墩果酸型三萜皂苷类化合物、苯乙腈苷类化合物的提取原料为青葙子(Celosiae semen)，2015 年 10 月采购于河南禹州药材市场，由河南大学袁王俊教授鉴定，标本储存在河南大学药学院标本馆。

实施例1

青葙子有效成分，其包括齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和/或苯乙腈苷类化合物，齐墩果酸型三萜皂苷类化合物1的结构式如下所示：

；

苯乙腈苷类化合物2的结构式如下所示：

。

上述青葙子有效成分的制备方法，其具体包括如下步骤：

1）将粉碎后的青葙子或者炒青葙子9.5kg用50%乙醇50L进行闪式提取3次（第一次闪式提取3 min，第二次闪式提取5 min，第三次闪式提取5 min），闪式提取结束后，过滤，提取液浓缩得到提取物浸膏；将提取物浸膏分散在水中，用HPD100大孔吸附树脂吸附，然后依次用水、20%乙醇、60%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到20%乙醇浸膏A；收集60%乙醇洗脱液, 减压回收溶剂，得到60%乙醇浸膏B；

2）将20%乙醇浸膏A用20mL甲醇溶解，硅胶拌样，经薄层色谱硅胶柱层析，选用体积比8：1的二氯甲烷-甲醇溶剂进行洗脱，回收溶剂，得到流分；再经半制备HPLC色谱方法，用20%甲醇-水洗脱，流速 8 ml/min，保留时间为24min，得到苯乙腈苷类化合物，记为化合物2（35mg）；

3）将60%乙醇浸膏B悬浮于150mL水中，经MCIGELCHP20开放柱，选用甲醇-水溶剂系统，依次分别用15%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、100%甲醇梯度洗脱，按照洗脱顺序得到5个组分，依次记为：B-1、B-2、B-3、B-4、B-5。将组分B-5用15mL甲醇溶解，硅胶拌样，经薄层色谱硅胶柱层析，选用体积比5：1的二氯甲烷和甲醇溶剂进行洗脱，得到单一组分，即齐墩果酸型三萜皂苷类化合物（56mg），记为化合物 1。

下述给出了化合物1和化合物2的相关试验数据（具体可见图1至12）。

化合物1

白色粉末，易溶于甲醇，TOF-MS: m/z 826.4575[M+NH₄]⁺，831.4112[M+Na]⁺，847.3884 [M+K]⁺。UV(MeOH)显示在203nm处有明显的紫外吸收峰。¹H NMR和 ¹³C NMR数据参见表1。

表1 化合物1的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据归属

化合物2

白色粉末，易溶于甲醇。HR-TOF-MS: m/z 440.1546[M-H]^-，476.1310[M+Cl]^-，486.1600 [M+HCOOH-H]^-。IR(KBr)νmax: 3425，2923，2254，1591，1512，1236；UV (MeOH) 显示在220nm处有明显的紫外吸收峰。¹H NMR和 ¹³C NMR数据参见表2。

表2 化合物2的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据

化合物 1 结构解析。

白色粉末，易溶于甲醇，HR-TOF-MS: m/z 826.4575[M+NH₄]⁺，831.4112[M+Na]⁺，847.3884[M+K]⁺，如图6所示。UV(MeOH)显示在203nm处有明显的紫外吸收。¹H-NMR(CD₃OD)谱中给出，一个醛基氢信号δ 9.44（1H，s，H-23）；两个糖的端基氢信号δ 4.50（1H，d，J=7.5Hz，H-Xyl-1），4.38（1H，d，J=8.0Hz，H-GlcA-1）；一个烯烃氢信号δ 5.24（1H，s，H-12）；六个甲基质子信号δ 0.81（3H，s，H-29），0.89（3H，s，H-30），0.93（3H，s，H-26），1.16（3H，s，H-27），1.28（3H，s，H-25），1.32（3H，s，H-24）。¹³C-NMR(CD₃OD)谱中，低场区给出三个羰基碳信号δ 208.8（C-23），181.8（C-28），171.1（C-GlcA-6）；烯烃碳信号δ145.3（C-13），123.4（C-12）和两个糖端基碳信号δ105.7（C-Xyl-1），104.6（C-GlcA-1）。通过HSQC和HMBC谱，将碳和氢信号进行了归属，在HMBC谱中给出，母核中δ2.83（H-18）与181.8（C-28）、145.3（C-13）、123.4（C-12）远程相关，δ1.16（H-27）与145.3（C-13）远程相关，δ5.24（H-12）与δ24（C-11）远程相关，推测C-28为羰基碳，C-12、13为烯烃双键，δ4.24（H-2）与37（C-10）、55（C-4）远程相关，推测C-2被羟基取代，δ9.44（H-23）与55（C-4）、11.7（C-24）远程相关，δ3.85(H-3)与208.8（C-23）远程相关，所以推测C-23被醛基取代，δ3.85(H-3)与104.6（C-GlcA-6）远程相关，所以葡萄糖与C-3形成苷键，δ3.50（H-GlcA-3）与105.7（C-Xyl-1）远程相关，所以木糖连接在葡萄糖的C-3。通过与已知化合物对比碳谱和氢谱数据，推测该化合物与青葙苷L的结构相似，从质谱数据分析，该化合物比青葙苷L多一个CH₂，在 HMBC谱中，δ171.1（C-GlcA-6）与-OCH3的氢信号3.75（s）远程相关，所以推测葡萄糖上的羧酸结构甲酯化，主要的HMBC相关信号，如图1至4所示。从NOESY中可以看到，H-C(2)与H-C(3)、Me（24）和Me（25）存在NOE效应，H-C(3)与Me（24）和Me（25）存在NOE效应，H-C(5)与CHO(23)存在NOE效应，Me（25）与Me（26）存在NOE效应，CH2（19）与Me（27）和Me（29）存在NOE效应，由此可以推断出H-C(2)、H-C(3)、Me（24）、Me（25）和Me（26）处于β键，CH₂（19）、Me（27）和Me（29）处于α键。主要的NOESY相关信号见图5。经scifinder数据库查询，推测化合物1为新化合物，结构为2α-羟基-23-醛基-3α-O- [β-D-吡喃木糖基-(1→ 3)-β-D-吡喃葡萄糖甲酯]-齐墩果酸。核磁数据见表1。

化合物2结构解析。

白色粉末，易溶于甲醇。HR-TOF-MS: m/z 440.1546[M-H]^-，476.1310[M+Cl]^-，486.1600 [M+HCOOH-H]^-，如图11所示。IR(KBr) νmax: 3425，2923，2254，1591，1512，1236；UV (MeOH)显示在220nm处有明显的紫外吸收。¹H-NMR(CD₃OD)谱中给出，两个糖的端基氢信号δ4.72（1H，br. d，J=1.2Hz，H-Rha-1），4.88（1H，d，J=7.6Hz，H-Glc-1）；四个芳香质子信号δ7.32（2H，d，J=8.4Hz，H-2、6），7.12（1H，d，J=8.4Hz，H-3、5），见图7。¹³C-NMR(CD₃OD) 谱中给出，六个芳香碳信号δ126.0（C-1），130.3（C-2、6），118.3（C-3、5），158.6（C-4）；两个糖的端基碳信号δ102.2（C-Glc-1），102.1（C-Rha-1）；一个腈基碳信号δppm：119.9（C-8）；一个仲碳信号δ22.7（C-7），见图8。通过HSQC和HMBC谱，将碳和氢信号进行了归属，在HMBC谱中给出，可以看到葡萄糖端基氢信号δ4.88（1H，d，J=7.6Hz，H-Glc-1）与δ158.6（C-4）远程相关，所以葡萄糖连在C-4位；鼠李糖的端基氢信号δ4.72（1H，br.d，J=1.2Hz，H-Rha-1）与δ67.8（C-Glc-6）远程相关，所以鼠李糖连在葡萄糖C-6位；C-7上的氢信号δ3.85（s）与δ126.0（C-1）、130.3（C-2）、119.9（C-8）远程相关，所以推测一个-CH₂CN结构连在C-1位，主要的HMBC相关信号，如图9、10。结合图12的红外光谱，吸收峰2254为氰基的特征峰。经scifinder数据库查询，推测化合物10为新化合物：结构为苯乙腈-4-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。核磁数据见表2。

青葙子有效成分（化合物1和化合物2）对t-BHP引起NSC34细胞损伤的保护作用实验。

1 .1 实验仪器及材料。

6、12、24、96孔细胞培养板（CoStar. Inc.），NSC34细胞购于美国ATCC细胞库，Biofuge stratos高速低温离心机（Thermo Inc.），CKX 41型显微镜（OLYMPUS Inc.），HEPAClass 100型二氧化碳培养箱（Thermo Inc.）YXQ-LS-50Ⅱ型全自动数显蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司），流式细胞仪BD LSR Fortessa X-20，共聚焦显微镜 Inverted ZeissLSM 880 Confocal，酶标仪PHERAstar FS，Li-Cor成像仪Odyssey CLx.，胎牛血清购自PAALaboratories GmbH，RPMI 1640 培养基购自Invitrogen Inc.，胰蛋白酶购自AmrescoInc。CKK-8、t-BPH、CellROX、Heochest33342购自SIGMA。

1.2 CCK-8法检测NSC34细胞毒实验

实验方法：

1）取处于指数生长期状态良好的NSC34细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液消化使贴壁细胞脱落，计数1×10⁵个/ml，制成细胞悬液；

2）取细胞悬液接种于96孔板上，100μl/孔，置恒温37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

3）加入不同浓度受试药物，10 μl/孔（终浓度为：2，5，10，25，50，100μM），培养24小时；

4）每孔加入10μl的CCK-8，在培养箱中孵育1h；

5）用酶标仪测定，测定波长为450nm，计算抑制率：

抑制率=[A(对照)-A(样品)] / [A(对照)-A(空白)] ×100%。

实验结果如下表。结果表明化合物1和化合物2对NSC34细胞是安全的。

1.2 CCK-8法检测细胞活力实验

实验方法：

3）给药组加入不同浓度受试药物，10 μl/孔（终浓度为：2，5，10μM），阳性组加入2μl/孔（终浓度为：200μM）维生素E；培养24小时；

4）对照组每孔加入10μl培养液，模型组、阳性组、给药组每孔分别加入10μl终浓度100μM的t-BHP，在培养箱中孵育6h；

5）每孔加入10μl的CCK-8，在培养箱中孵育1h；

6）用酶标仪测定，测定波长为450nm，计算活力：

活力=100%-[A(对照) -A(样品)] / [A(对照)-A(空白)] ×100%；

结果用每次实验平均值±S.D.表示（n=3）。

实验结果：

与对照组比较，^#P＜0.01具有显著性差异。与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，具有显著性差异。

实验结果表明化合物1和化合物2高、中、低剂量组均可以提高NSC34细胞活力，对NSC34细胞具有保护作用。

1.3流式法检测细胞ROS水平

实验方法：

1）取处于指数生长期状态良好的NSC34细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液消化使贴壁细胞脱落，计数10⁶个/ml，制成细胞悬液；

2）取细胞悬液接种于24孔板上，500μl/孔，置恒温37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

3）给药组加入不同浓度受试药物，100 μl/孔（终浓度为：2，5，10μM）培养24小时；阳性组加入10μl/孔维生素E（终浓度为：200μM）培养24小时；

4）对照组每孔加入10μl培养液，模型组、阳性组、给药组每孔分别加入10μl终浓度200μM的t-BHP，在培养箱中孵育0.5h；

5）每孔加入CellROX试剂，终浓度为5μM，在培养箱中孵育0.5h；之后用PBS清洗2遍；

6）加入0.25%胰蛋白酶消化液，收集细胞，加入500 μl PBS，制成细胞悬液；

7）用流式细胞仪测定10⁵个细胞，检测波长为670nm；

ROS荧光强度的实验结果如下表：

与对照组比较，# P<0.01；与模型组比较，*P<0.01

结果表明：化合物1和化合物2均能显著降低NSC34细胞内ROS荧光强度，对NSC34细胞具有抗氧化保护作用。

1.4细胞内ROS成像

实验方法：

步骤1）- 5）同上述1.3的步骤1）- 5）；

6）加入4%多聚甲醛固定15min，吸走多聚甲醛，用PBS清洗2次，再加入300 μl终浓度为10μg/ml Heochest33342，培养10min，之后吸走，用PBS清洗2次；

7）制片，用共聚焦显微镜观察拍片。

实验结果：

结果见图13，蓝色代表细胞核，红色代表胞内ROS。与模型组对比，给药组细胞内ROS红色荧光强度显著降低，表明化合物1和化合物2抑制t-BHP诱导NSC34细胞产生ROS，证明具有抗氧化作用。

1.5 凋亡率

方法：细胞培养方法同“1.2”, 检测方法采用Annexin V-FITC 凋亡染色与检测试剂盒（abcam，USA）检测凋亡率；具体实验操作参考试剂盒说明书。实验结果见下表。

与对照组比较，^# P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

结果表明：化合物1和化合物2均能显著降低NSC34凋亡率。

综上可以看出：本发明包含齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和/或苯乙腈苷类化合物的青葙子有效成分对t-BHP诱导神经细胞NSC34损伤模型具有很好的保护作用，具体表现为无细胞毒毒性，提高细胞活力，降低细胞内ROS水平，降低凋亡率。

Claims

1.青葙子有效成分，其特征在于，包括齐墩果酸型三萜皂苷类化合物和/或苯乙腈苷类化合物，齐墩果酸型三萜皂苷类化合物的结构式如下所示：

；

苯乙腈苷类化合物的结构式如下所示：

。

2.权利要求1所述青葙子有效成分的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将粉碎过的青葙子或炒青葙子用20－50%乙醇进行闪式提取，提取液浓缩得到提取物浸膏；将提取物浸膏分散在水中，用大孔吸附树脂吸附，然后依次用水、20%乙醇和60%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到20%乙醇浸膏A；收集60%乙醇洗脱液,减压回收溶剂，得到60%乙醇浸膏B；

3.如权利要求2所述青葙子有效成分的制备方法，其特征在于，步骤1）中，闪式提取2－3次，闪式提取时每1 g 青葙子或炒青葙子添加5－10mL的20－50%乙醇，每次闪式提取的时间为3－10min。

4.权利要求1所述青葙子有效成分在制备神经保护药物方面的应用。

5.权利要求1所述青葙子有效成分在制备治疗神经退行性疾病药物方面的应用。