CN101857589B

CN101857589B - 吡唑-苯并咪唑类衍生物及其应用

Info

Publication number: CN101857589B
Application number: CN 201010194593
Authority: CN
Inventors: 吉民; 郑友广; 郑明�
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2010-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2030-06-08
Also published as: CN101857589A

Abstract

本发明公开了一类吡唑-苯并咪唑类衍生物及其应用，吡唑-苯并咪唑类衍生物具有式(I)结构。药理实验表明，此类化合物或其药学上可接受的盐对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。

其中：A环为取代或非取代的嘧啶或吡嗪，所述取代基为卤素、硝基、氰基、巯基或氨基；R₁为烷基、卤代烷基、烷氧基、烷硫基、烷砜基、苯硫基、环烷基酰胺取代的苯硫基、环烷基酰胺取代的苯氧基、酰基或酯基；R₂为氢、卤素或-NR₃R₄，R₄或R₃独立地选自氢、烷基、环烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基为烷基或羟烷基。

Description

吡唑-苯并咪唑类衍生物及其应用

技术领域

本发明本发明属于药物化学领域，具体涉及一种Aurora激酶抑制剂的合成制备技术，即吡唑苯并咪唑类衍生物及其用途。

背景技术

蛋白激酶(Protein Kinases)包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)和蛋白酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinase，PTK)。其中，一种参与有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸激酶新家族-Aurora家族被逐渐认识，它们分为3类：Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C，主要调节中心体和微管的功能，确保中心体的正确分离和胞浆的完整分裂。

Aurora激酶的功能涉及有丝分裂的各项重要事件，包括中心粒周期、纺锤体变化、染色体分离以及胞质分裂等等。在正常细胞中，Aurora激酶依靠各种形式的调控手段在特异的时间、空间表达和活化，作用于各种底物分子，从而实现不同的生物学功能。近年来，人们在大量的实验中发现很多参与Aurora激酶调控作用的分子，主要包括三类：(1)Aurora激酶的上游调控分子，如TPX2、P53、PP1等，它们或者影响Aurora的激酶活性，或指导Aurora的定位；(2)Aurora激酶的伙伴分子，如INCENP、survivin等，它们既是磷酸化的底物，也是具有反馈性激活作用，Aurora激酶的亚细胞定位依赖其伙伴分子，反之亦然，只有完整的复合物才能执行正常功能；(3)Aurora激酶的下游底物分子，如Eg5、TACC、Damlp、H3、MgcRacGAP、vimentin等，它们可以被Aurora激酶磷酸化，分别调节中心体、纺锤体、染色体或者细胞骨架的变化。

有丝分裂出错是基因组不稳定的原因，和肿瘤发生密切相关。肿瘤细胞中许多有丝分裂调控因子出现了遗传表达，因此这些蛋白家族可以作为药物治疗靶点。其中，Aurora激酶是这类靶点中的一个蛋白家族。Aurora激酶家族是有丝分裂的关键调控因子，用于维持基因组的稳定。在肿瘤中，这种苏氨酸/丝氨酸激酶经常发生过量表达。例如，肿瘤中AuroraA经常发生扩增，表明这种蛋白在肿瘤形成或恶化中具有重要作用。Aurora蛋白激酶调控有丝分裂的多个步骤，包括中心体复制、两极有丝分裂纺锤体的形成、有丝分裂纺锤体染色体排列、和最重要的是精确监控纺锤体检查点本身。

Aurora A基因定位于染色体20q13.2部位内，在人类肿瘤中经常检测出这一染色体部位。实际上，一些研究表明，在许多肿瘤中，均发现Aurora A位点的扩增及伴随AuroraA蛋白的过表达。在小鼠异种移植研究中发现，肿瘤细胞中Aurora A的过表达促进集落形成、中心体扩增及肿瘤生长。然而，在普通细胞中Aurora A的过表达并不能诱导细胞转变，这表明Aurora A还需要额外的致癌因素，例如活化Ras-信号以促进转变。Meraldi等研究表明，紧随着Aurora A过表达的中心体扩增是完成胞质分裂的失败的间接因素，产生有两个中心体的四倍体细胞。目前，还不清楚Aurora A的激酶活化如何在这些过表达效应起着关键作用，因为Aurora A激酶死亡的过表达引起相似数量的四倍体化。在一些研究中也发现四倍体化紧随着野生型Aurora A的过表达，但是，引人侧目的是四倍体化并未发现紧随着Aurora A激酶死亡的过表达。这表示集落形成和肿瘤生长需要Aurora A激酶活化，以及在含有Aurora A扩增的肿瘤中Aurora A的序列分析没有鉴定出任何激酶非活化突变。核苷酸位点19(Phe31Ile)可能调控Aurora A蛋白稳定的多态性并肿瘤敏感性相关。

AuroraB定位于17p13.1基因区域，这一区域在人类细胞中是易变的。AuroraA信使RNA及其自身蛋白在肿瘤中频繁过表达，同时也有报道一些肿瘤类型中蛋白表达和病重之间的相互关系。除了Aurora B与肿瘤之间有直接的联系外，还应注意到CPC蛋白，它与Aurora A相互协调且受Aurora B的调控，此蛋白在肿瘤中也过表达或上调。尽管Aurora B与肿瘤有着较强的联系且在有丝分裂过程中起着十分重要的作用，但是体外研究并未发现其转化且体内也并非广泛致肿瘤。另一重要的例外是在表达p53突变细胞中，当Aurora B过表达时，将增加致肿瘤行为。此研究表明，Aurora B自身不可能成为正式的癌基因，但是可与其他致癌突变协同作用促进致癌过程。于此观念相一致的，AuroraA增强Ras介导转化，当除去Aurora B将抑制Ras转化。Aurora B可作为抗癌靶点可以通过以下研究进一步加强，即除去Aurora B的癌细胞对烷化剂和电离辐射等治疗的细胞毒效应更加敏感。

Aurora激酶抑制剂从结构上可以大致分为以下几大类：嘧啶类(如VX-680)、喹唑啉类(AZD1152)、吡唑-苯并咪唑类(AT-9283)、四氢吡咯并吡唑类(PHA-739358)、苯并氮杂卓类(MLN5237)等。这些抑制剂的结构中都具有一个或多个杂原子氮，并且母核大多为含氮原子杂环以模拟ATP中的腺嘌呤部分。这些化合物中，有些对特异性的Aurora激酶具有专一的抑制作用，而有些则对两个或多个Aurora激酶靶点具有选择性抑制作用。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种对肿瘤细胞的增殖具有抑制能力的吡唑-苯并咪唑类衍生物，

本发明的另一目的是提供一种含有上述吡唑苯并咪唑类衍生物的组合物。

本发明还有一个目的是提供上述吡唑苯并咪唑类衍生物的在医药学上的用途。

技术方案：本发明的吡唑-苯并咪唑类衍生物为式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

A环为取代或非取代的嘧啶或吡嗪，所述取代基为卤素、硝基、氰基、巯基或氨基；R₁为烷基、卤代烷基、烷氧基、烷硫基、烷砜基、苯硫基、环烷基酰胺取代的苯硫基、环烷基酰胺取代的苯氧基、酰基或酯基；

R₂为氢、卤素或-NR₃R₄，R₄或R₃独立地选自氢、烷基、环烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基为烷基或羟烷基。

所述化合物或其药学上可接受的盐中，

A环为取代或非取代的嘧啶，所述取代基为卤素、硝基、氰基、巯基或氨基；

R₁为烷基、烷硫基、烷砜基、环丙酰胺取代的苯硫基、环丙酰胺取代的苯氧基；

R₂为氢、卤素或-NR₄R₃，R₄或R₃独立地选自C1-4烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基为C1-4烷基或C1-4羟烷基。

所述化合物或其药学上可接受的盐中，

A环为嘧啶或卤代嘧啶；

R₁为C_1-4烷基、C_1-4烷硫基、C_1-4烷砜基、环丙酰胺取代的苯硫基；

R₂为氢或-NR₄R₃，R₄或R₃独立地选自C1-4烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基为甲基、乙基、羟甲基或羟乙基。

所述化合物或其药学上可接受的盐中，

A环为卤代嘧啶；

R₁为C_1-2烷基、C_1-2烷硫基、C_1-2烷砜基、

R₂为氢或-NR₄R₃，R₄或R₃独立地选自C1-4烷基，或者R₄和R₃合起来形成杂脂环基。

所述化合物或其药学上可接受的盐中，

A环为氯代嘧啶；

R₁为甲基、乙基、甲硫基、乙硫基、甲砜基、乙砜基、

R₂为氢、二乙胺基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基或吡咯烷基。

所述化合物或其药学上可接受的盐中，所述的化合物为选自下组的一个或多个：

6-氯-2-甲基-N-{3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

6-氯-2-(甲硫基)-N-{3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫]苯基}环丙甲酰胺；

6-氯-2-甲基-N-{3-[5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

6-氯-2-(甲硫基)-N-{3-[5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫]苯基}环丙甲酰胺；

6-氯-2-甲基-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶4-胺；

6-氯-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺；

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫基]苯}环丙甲酰胺；

6-氯-2-甲基-N-{3-[5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

6-氯-2-(甲硫基)-N-{3-[5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫]苯基}环丙甲酰胺；

6-氯-2-(甲砜基)-N-{3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺；

6-氯-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]-2-(甲砜基)嘧啶-4-胺；

或6-氯-2-(甲砜基)-N-{3-[5-(二乙胺基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺。

吡唑-苯并咪唑类衍生物的应用，所述化合物或其药学上可接受的盐应用于药物组合物，以及药学上可接受的稀释剂或载体，或应用在制备抗癌药物中。

所述的癌为白血病、结肠癌、宫颈癌或乳腺癌。

有益效果：本发明提供了一类表现出对肿瘤细胞的增殖具有抑制能力的吡唑-苯并咪唑类衍生物，提供一种含有上述吡唑苯并咪唑类衍生物的组合物。提供上述吡唑苯并咪唑类衍生物的在医药学上的用途。

对慢性髓细胞白血病(K562)、人急性单核细胞白血病细胞株(U937)的增殖具有显著的抑制作用。上述这些化合物可应用于抗肿瘤药物的制备。

具体实施方式

式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

A环为取代或非取代的嘧啶或吡嗪，所述取代基为卤素、硝基、氰基、巯基或氨基；A环优选为取代或非取代的嘧啶，所述取代基为卤素、硝基、氰基、巯基或氨基；A环更优选为嘧啶或卤代嘧啶；A环进一步优选为卤代嘧啶；A环最优选为氯代嘧啶。

R₁为烷基、卤代烷基、烷氧基、烷硫基、烷砜基、苯硫基、环烷基酰胺取代的苯硫基、环烷基酰胺取代的苯氧基、酰基或酯基；R₁优选为烷基、烷硫基、烷砜基、环丙酰胺取代的苯硫基、环丙酰胺取代的苯氧基；R₁更优选为C_1-4烷基、C_1-4烷硫基、C_1-4烷砜基、环丙酰胺取代的苯硫基；R₁进一步优选为C_1-2烷基、C_1-2烷硫基、C_1-2烷砜基、

R₁最优选为甲基、乙基、甲硫基、乙硫基、甲砜基、乙砜基、

R₂为氢、卤素或-NR₃R₄，R₄或R₃独立地选自氢、烷基、环烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基为烷基或羟烷基；R₂优选为氢、卤素或-NR₄R₃，R₄或R₃优选独立地选自C1-4烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基优选为C1-4烷基或C1-4羟烷基；进一步的，R₂为氢或-NR₄R₃，R₄或R₃独立地选自C1-4烷基，或者R₄和R₃合起来形成取代或非取代的杂脂环基，其中取代基为甲基、乙基、羟甲基或羟乙基；R₂更优选为氢或-NR₄R₃，R₄或R₃独立地选自C1-4烷基，或者R₄和R₃合起来形成杂脂环基；R₂最优选为氢、二乙胺基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基或吡咯烷基。

在所述的化合物或这些化合物与药学上可以接受的酸所成的盐中，这些化合物选自下面所列特定化合物中的一个或多个：

6-氯-2-甲基-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-4-胺；

本发明化合物可应用于制备抗癌药物方面，其中所述的癌如白血病、结肠癌或乳腺癌等实体瘤癌症。

“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：

(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸例如(但不限于)盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸例如(但不限于)乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等，优选对甲苯磺酸或盐酸。

(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。

所述的化合物或它们与药学上可以接受的酸所成的盐为原料，制备成临床上可使用的用于治疗白血病等肿瘤的药物。

本发明的又一目的在于提供一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。

将本发明的化合物以前药的形式给药。前药是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。可使用前药改变本发明化合物的物理化学性质或药物动力学方面性质。当本发明的化合物含有可连接改变性质基团的适当基团或取代基团时，形成前药。

1.化学

除非另外说明，在说明书和权力要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：

“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。含1-4个碳原子的烷基称为低级烷基。当低级烷基没有取代基时，称其为无取代的低级烷基。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当时取代烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基，它们独立地优选自以下的基团：卤素、羟基、低级烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳环、杂脂环基和酯基。

“环烷基”表示全部为碳的单环或稠合的环(“稠合”环意味着系统中的每个环与系统中的其他环共享毗邻的一对碳原子)基团，含有3-12个碳原子，进一步含有3-9个碳原子，优选5、6或7个碳原子，更优选5或6个碳原子，其中一个或多个环不具有完全连接的π电子系统，任选包含一个或多个双键和/或三键形式的不饱和状态。环烷基的实例(不局限于)为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、金刚烷、环己二烯、环庚烷和环庚三烯。环烷基可为取代的和未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个各自选自以下的基团，包括：烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基和氨基。

“杂脂环基”表示单环或稠合环基团，在环中具有5-18个、优选5-12个，更优选5-9个环原子，其中一个或两个环原子选自N、O或S(O)_m(其中m是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。这些环可以具有一条或多条双键，但这些环不具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂脂环基的非限制性实例有吡咯烷基、哌啶子基、吗啉子基、哌嗪子基、硫代吗啉子基、高哌嗪子基等。杂脂环基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选为一个、两个或三个，进而更优选为一个或两个，独立地选自以下基团，包括：烷基、三卤烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、烷基硫基、氰基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基。优选的杂芳基任选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、氰基、酯基或硝基。

“羟基”表示-OH基团。

“羟烷基”表示具有-OH基取代基的烷基，其中烷基的概念如上述所。

“烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)，其中烷基和环烷基定义如上。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

“巯基”表示-SH基团

“酰基”表示-C(O)-R’基团，其中R’是选自以下基团：氢，未取代的低级烷基、三卤甲基、未取代的环烷基、任选地被一或多个、优选被1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤甲基、未取代的低级烷氧基和卤素取代的芳基。

“硫代酰基”表示-C(S)-R’，其中R’定义同上。

“酯基”表示-C(O)O-R’基团，其中R’定义同上，但是R’不能是氢。

“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴。

“三卤甲基”表示-CX₃基团，其中X是如上所定义的卤素。

“氰基”表示-CN基团。

“氨基”表示-NH₂基团。

“硝基”表示-NO₂基团。

“卤代烷基”表示烷基被一个或多个相同或不同的卤原子取代，优选如上所定义的低级烷基被一个或多个相同或不同的卤原子取代，其中烷基定义如上，例如-CH₂Cl、-CF₃、-CH₂CF₃、-CH₂CCl₃等。“卤代烷氧基”表示烷氧基被一个或多个相同或不同的卤原子取代，其中烷氧基定义如上，例如-OCH₂Cl、-OCF₃、-OCH₂CF₃、-OCH₂CCl₃等。

“N-甲基哌嗪基”指的是具有以下化学结构的基团。

“哌啶基”指的是具有以下化学结构的基团。

“吗啉基”指的是具有以下化学结构的基团。

“吡咯烷基”指的是具有以下化学结构的基团。

“二乙胺基”指的是具有以下化学结构的基团。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生和不发生的场合。例如，“杂芳基任选地被一个或两个取代基取代”意味着杂芳基的取代基可以但不必是一个，该说明包括杂芳基被一个取代基取代的情形和杂芳基被两个取代基取代的情形。

2.一般合成方法

本发明中所提到的化合物总体制备方法为：

以3，4-二硝基苯甲酸为起始原料，经二氯亚砜氯代制得酰氯，然后与仲胺反应得其酰胺产物3，化合物3经硼氢化钠和三氟化硼-乙醚还原得中间体4，然后在钯碳和常压氢气条件下，硝基还原为氨基化合物5，化合物5与4-硝基吡唑3-甲酸在EDCI条件下成酰胺，然后在冰醋酸回流关环，得重要中间体6，化合物6经钯碳常压氢气还原得中间体7，最后于氯代嘧啶衍生物反应得目标产物。

3.生物评价方法

抑制细胞增殖测定方法采取常用的MTT法：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)还原为难溶的蓝紫色结晶物甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。甲臜的多少可通过酶联免疫检测仪在570nm波长处检测其光吸收值(OD值)，因而为甲臜生成量在通常情况下与活细胞成正比，因此可根据OD值推算出活细胞数量，了解药物抑制或杀伤细胞的能力。

该测定方法可用于测定不同的本发明目标化合物对一种或多种癌细胞增殖的抑制能力，利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。

给出下列制备和实施例，使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。它们不应解释为限制本发明的范围，仅仅是其例证和代表。

合成实施例

实施例1

中间体7的合成

(3，4-二硝基苯)吗啉-4-基甲酮(3a)

在1L三口烧瓶中，加入3，4-二硝基苯甲酸(50g，235mmol)，以500mLTHF溶解，滴加0.5mLDMF，然后加入22.5mL二氯亚砜，机械搅拌，回流反应6h。反应结束后，将反应液降至0℃，在此条件下，0.5h内，滴加50mL三乙胺。滴加完毕，在0-5℃条件下，滴加36mL吗啉，然后升至室温，过夜反应。反应结束后，将反应液倒入1250mL冰水中，有固体析出，室温搅拌0.5h。过滤，水洗涤滤饼，直至滤液为中性，烘干得土黄色固体62.3g，收率94.4％，mp 163-165℃.

IR(KBr，cm^-1)：2861.60，1633.08，1526.82，1442.61，1368.42，1282.21，1113.78，1025.56，919.30，869.17.

(3，4-二硝基苯)哌啶-4-基甲酮(3b)

具体实验操作同化合物7a的合成，投入3，4-二硝基苯甲酸(50g，235mmol)，得土黄色固体60.5g，收率92.3％，mp 128-130℃.

IR(KBr，cm^-1)：3025.90，2941.74，1633.08，1530.83，1442.61，1364.41，1284.21，911.28，843.11.

(3，4-二硝基苯)二乙胺-4-基甲酮(3d)

具体实验操作同化合物7a的合成，投入3，4-二硝基苯甲酸(50g，235mmol)，得土黄色固体57.5g，收率91.6％，mp 70℃.

IR(KBr，cm^-1)：3094.03，2973.80，1629.07，1532.83，1490.73，1360.40，1105.76，899.25，843.11.

4-(3，4-二硝基苄基)吗啉(4a)

在1L三口烧瓶中，加入NaHB₄(16.8g，445mmol)，然后加入600mL THF，将温度降至0℃，Ar气保护条件下，滴加三氟化硼-乙醚溶液(55.6mL，445mmol)。滴加完毕后，加入化合物3a(59.55g，210mmol)，升至室温，反应5h。反应结束后，将温度降至0℃，滴加500mL甲醇。滴加完毕后，室温搅拌过夜。然后蒸干溶剂，将残余物溶于500mL乙酸乙酯和500mL饱和NaHCO₃溶液中，萃取，水层以250mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，依次水洗，饱和食盐水洗涤，无水MgSO₄干燥。过滤，真空蒸干溶剂，残余物以200mL甲醇重结晶，得黄色固体47.7g，收率85.1％，mp 109-110℃.

IR(KBr，cm^-1)：2961.78，1861.60，1526.82，1368.42，1348.37，1111.78，863.16；¹H-NMR(CDCl₃-d₆，300MHz)δ(ppm)：2.48(t，J＝4.59Hz，4H，2×morpholine-CH₂)，3.62(s，2H，CH₂)，3.75(t，J＝4.5Hz，4H，2×morpholine-CH₂)，7.73(d，J＝8.22Hz，1H，Ar-H)，6.92(d，J＝8.37Hz，1H，Ar-H).

4-(3，4-二硝基苄基)哌啶(4b)

具体实验操作同化合物4a的合成，投入化合物3b(58.6g，210mmol)，得黄色固体45.7g，收率82.1％。

4-(3，4-二硝基苄基)哌啶(4d)

具体实验操作同化合物4a的合成，投入化合物3d(56.1g，210mmol)，得黄色固体46.1g，收率86.7％。

4-(吗啉甲基)苯-1，2-二胺(5a)

在1L圆底烧瓶中，投入化合物4a(26.9g，101mmol)，800mL乙醇溶解，然后加入10％钯碳(2.1g)，将烧瓶中的气体排空，通入氢气，室温条件下，常压氢气还原36h。反应结束后，过滤钯碳，真空蒸干滤液，得红棕色固体19.8g，收率93.3％，，mp 124-125℃.

IR(KBr，cm^-1)：3394.58，3306.42，2925.71，2865.60，2801.48，1625.06，1590.98，1516.79，1288.22，1105.78，1001.50，863.16，825.06；¹H-NMR(CDCl₃-d₆，500MHz)δ(ppm)：2.27(s，4H，2×morpholine-CH₂)，3.28(s，2H，CH₂)，3.55(t，J＝4.5Hz，4H，2×morpholine-CH₂)，4.35(d，J＝26.5Hz，4H，2×NH₂)，6.27-6.29(dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝2.0Hz，1H，Ar-H)，6.42(d，J＝8.0Hz，1H，Ar-H)，6.47(d，J＝2.0Hz，1H，Ar-H)；ESI-MS m/z：208.0[M+H]⁺，230.0[M+Na]^-.

4-(哌啶甲基)苯-1，2-二胺(5b)

具体实验操作同化合物5a的合成，投入化合物4b(26.7g，101mmol)，得红棕色固体19.2g，收率92.3％。

4-甲苯基-1，2-二胺(5c)

具体实验操作同化合物5a的合成，投入4-甲基-1，2-二硝基苯(18.4g，101mmol)，得红棕色固体11.6g，收率94.3％。¹H-NMR(CDCl₃-d₆，500MHz)δ(ppm)：2.05(s，3H，CH₃)，4.26(d，J＝48.1Hz，4H，2×NH₂)，6.16-6.18(dd，J₁＝1.25Hz，J₂＝1.25Hz，1H，Ar-H)，6.32(d，J＝1.7Hz，1H，Ar-H)，6.37(d，J＝7.65Hz，1H，Ar-H)；ESI-MS m/z：123.3[M+H]⁺.

4-(二乙胺甲基)苯-1，2-二胺(5d)

具体实验操作同化合物5a的合成，投入化合物4d(25.5g，101mmol)，得红棕色固体18.8g，收率96.6％。

5-(吗啉甲基)-2-(4-硝基-1H-吡唑-3-基)-1H-苯并咪唑(6a)

在250mL圆底烧瓶中，投入化合物5a(11.5g，55.5mmol)，4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸(7.85g，50.0mmol)、EDCI(10.65g，55.5mmol)及HOBt(7.5g，55.5mmol)，用125mL干燥DMF溶解，室温条件下反应24h。真空蒸干溶剂，残余物以200mL冰醋酸溶解，回流反应3h。真空蒸干溶剂，将残余物倒入饱和NaHCO₃溶液中，过滤所得固体，水洗滤饼，直至中性。真空烘干，得淡黄色固体8.36g，收率52.1％，mp 238-240℃.

IR(KBr，cm^-1)：3384.51，2877.32，1496.51，1419.37，1392.38，1311.38，1108.89，863.97；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ(ppm)：2.39(s，4H，2×morpholine-CH₂)，3.57-3.60(m，6H，2×morpholine-CH₂and CH₂)，7.25(s，1H，Ar-H)，7.59(s，2H，Ar-H)，8.78(s，1H，Ar-H)，12.78(s，1H，imidazole-NH)，14.47(s，1H，pyrazole-NH)；ESI-MS m/z：329.2[M+H]⁺，327.0[M-H]^-.

5-(哌啶甲基)-2-(4-硝基-1H-吡唑-3-基)-1H-苯并咪唑(6b)

具体实验操作同化合物6a的合成，投入化合物5b(11.4g，55.5mmol)，得淡黄色固体8.97g，收率49.6％，mp 168-170℃.

IR(KBr，cm^-1)：2937.74，1663.16，1478.70，1450.63，1386.47，1282.21，1149.87，1093.73，821.05.

5-甲基-2-(4-硝基-1H-吡唑-3-基)-1H-苯并咪唑(6c)

具体实验操作同化合物6a的合成，投入化合物5c(6.77g，55.5mmol)，得淡黄色固体6.96g，收率57.3％。

5-(哌啶甲基)-2-(4-硝基-1H-吡唑-3-基)-1H-苯并咪唑(6d)

具体实验操作同化合物6a的合成，投入化合物5d(10.7g，55.5mmol)，得淡黄色固体10.1g，收率57.8％。

3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-胺(7a)

500mL圆底烧瓶中，加入化合物6a(8.36g，25.5mmol)，0.86g 10％钯碳，以300mL乙醇溶解，将烧瓶中的气体排空，通入氢气，室温条件下，常压氢气还原24h。反应结束后，过滤钯碳，真空蒸干滤液，得浅红色固体7.31g，收率96.2％，直接投入下一步。

3-[5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-胺(7b)

具体实验操作同化合物7a的合成，投入化合物6b(8.97g，27.5mmol)，得淡黄色固体7.98g，收率97.2％，直接投入下一步。

3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-胺(7c)

具体实验操作同化合物7a的合成，投入化合物6c(6.77g，27.8mmol)，得淡黄色固体5.71g，收率96.3％，直接投入下一步。

3-[5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-胺(7d)

具体实验操作同化合物7a的合成，投入化合物6d(8.63g，27.5mmol)，得淡黄色固体7.51g，收率96.2％，直接投入下一步。

实施例2

6-氯-2-甲基-N-{3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AM-001)

在50mL圆底烧瓶中，投入化合物7a(0.894g，3mmol)、4，6-二氯-2-甲基嘧啶(0.41g，2.5mmol)、碘化钠(0.45g，3mmol)及N，N-二异丙基乙胺(0.52mL，3mmol)，以10mL DMF溶解，Ar气保护，90℃条件下反应4h。反应结束后，将反应液倒入100mL冰水中，搅拌0.5h。过滤析出的固体，用硅胶层析分离(展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)，得类白色固体0.55g，收率43.1％，mp 244℃.

IR(KBr，cm^-1)：2933.24，1735.65，1610.30，1438.66，1400.09，1284.38，1132.03，1112.74，1068.39，981.61，941.11，889.04，792.61，688.47；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：2.51(s，7H，2×morpholine-CH₂and CH₃)，3.69(s，6H，2×morpholine-CH₂and-CH₂-)，7.05(s，1H，Ar-H)，7.47(t，3H，Ar-H)，8.47(s，1H，Ar-H)，10.17(s，1H，-NH-)，13.06(s，1H，imidazole-NH)，13.44(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：28.93，45.48，52.45，53.19，61.77，62.26，63.80，65.57，102.17，111.13，118.12，120.50，121.24，123.74，130.91，132.04，133.62，142.85，147.73，158.00，159.63，167.89；ESI-MS m/z：425.2[M+H]⁺，423.2[M-H]^-.

实施例3

6-氯-2-(甲硫基)-N-{3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AM-002)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7a(0.894g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲硫基嘧啶(0.48g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.56g，收率73.3％，mp 225℃.

IR(KBr，cm^-1)：2972.46，1610.30，1556.30，1432.78，1356.07，1276.67，1207.24，1058.74，970.03，852.40，680.76；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ(ppm)：2.55(t，6H，3×morpholine-CH₂)，3.81-3.91(d，5H，morpholine-CH₂and-CH₃)，4.44(s，2H，-CH₂-)，6.93(s，1H，Ar-H)，7.48-7.77(m，3H，Ar-H)，8.35(s，1H，Ar-H)，10.21(s，1H，-NH-)，11.23(s，1H，imidazole-NH)，13.46(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ(ppm)：13.69，50.53，54.86，59.57，63.15，111.50，118.47，120.82，171，97；ESI-MS m/z：457.27[M+H]⁺.

实施例4

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫]苯基}环丙甲酰胺(AM-003)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7a(0.894g，3mmol)和N-[4-(4，6-二氯嘧啶-2-硫)苯基]环丙甲酰胺(0.85g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.55g，收率36.5％，mp 198℃.

IR(KBr，cm^-1)：3257.23，2956.39，2813.68，1668.15，1554.73，1402.02，1353.81，1274.74，1201.45，1114.67，960.39，850.47，819.61，678.83；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：0.87(s，4H，2×cyclopropyl-CH₂)，1.86(s，1H，cyclopropyl-CH)，2.37(s，4H，2×morpholine-CH₂)，3.55(s，6H，2×morpholine-CH₂and-CH₂-)，7.01(s，1H，Ar-H)，7.16(s，2H，Ar-H)，7.41(s，1H，Ar-H)，7.58-7.66(m，3H，Ar-H)，7.76(d，J＝8.13Hz，2H，Ar-H)，10.34(d，2H，2×-NH-)，12.99(d，2H，imidazole-NH and pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：7.47，14.78，53.10，54.83，62.77，62.89，66.12，101.75，110.93，111.59，117.98，118.96，119.95，120.26，120.81，121.77，123.13，124.09，130.61，131.06，132.69，133.56，136.54，140.64，142.03，142.73，147.13，157.40，158.83，172.21；ESI-MS m/z：602.47[M+H]⁺.

实施例5

6-氯-2-甲基-N-{3-[5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AM-004)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7b(0.888g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲基嘧啶(0.45g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.56g，收率73.3％，mp198-200℃.

IR(KBr，cm^-1)：3190.20，2945.75，1576.94，1394.49，1368.42，1284.21，1129.82，977.44，933.33，887.22；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：1.21-1.74(t，6H，3×piperidine-CH₂)，2.87(d，2H，morpholine-CH₂)，4.32(s，2H，-CH₂-)，7.03(d，J＝21.6Hz，1H，Ar-H)，7.40(s，1H，Ar-H)，7.52(d，J＝7.83Hz，1H，Ar-H)，7.70-7.91(m，1H，Ar-H)，8.47(s，1H，Ar-H)，10.09(s，1H，-NH-)，13.16(s，1H，imidazole-NH)，13.42(s，1H，pyrazole-NH)；ESI-MSm/z：423.16[M+H]⁺.

实施例6

6-氯-2-(甲硫基)-N-{3-[5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AM-005)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7b(0.888g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲硫基嘧啶(0.48g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.28g，收率26.7％，mp 223℃.

IR(KBr，cm^-1)：2931.32，1606.44，1556.30，1432.87，1353.81，1274.74，1207.24，1118.53，970.03，850.47，809.97，682.69；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：1.40-1.51(d，6H，3×piperidine-CH₂)，2.39(s，4H，2×piperidine-CH₂)，2.56(s，2H，-CH₂-)，3.57(s，3H，-CH₃)，6.94(s，1H，Ar-H)，7.17(s，1H，Ar-H)，7.43(s，1H，Ar-H)，7.67(s，1H，Ar-H)，8.33(s，1H，Ar-H)，10.29(s，1H，-NH-)，12.94(s，1H，imidazole-NH)，13.35(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：13.68，21.09，23.85，25.30，53.68，63.00，101.12，110.86，111.51，117.93，118.92，120.77，123.10，124.10，131.40，132.70，133.59，142.07，142.79，146.99，157.35，159.06，171.96；ESI-MSm/z：455.3[M+H]⁺.

实施例7

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-(哌啶甲基)-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫]苯基}环丙甲酰胺(AM-006)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7b(0.888g，3mmol)和N-[4-(4，6-二氯嘧啶-2-硫)苯基]环丙甲酰胺(0.85g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.25g，收率13.1％。

IR(KBr，cm^-1)：3234.09，2942.88，1567.87，1554.37，1403.95，1357.66，1274.74，1201.45，1114.87，958.46，821.54；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：0.84-1.03(m，5H，2×cyclopropyl-CH₂and cyclopropyl-CH)，1.17(s，2H，-CH₂-)，1.69(s，4H，2×piperidine-CH₂)，1.88-1.98(t，2H，piperidine-CH₂)，2.72-2.88(d，2H，piperidine-CH₂)，4.33(s，2H，piperidine-CH₂)，6.98(s，1H，Ar-H)，7.24-7.34(d，2H，Ar-H)，7.50-7.85(m，6H，Ar-H)，10.26(s，1H，-NH-)，10.54(s，1H，-NH-)，13.13(s，2H，imidazole-NH and pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：7.45，14.74，51.82，111.44，118.38，120.37，120.93121.71，136.53，140.65，142.75，172.21；ESI-MS m/z：600.4[M+H]⁺.

实施例8

6-氯-2-甲基-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-4-胺(AM-007)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7c(0.639g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲基嘧啶(0.45g，2.5mmol)到10mLDMF中，得白色固体0.58g，收率69.2％，mp＞250℃.

IR(KBr，cm^-1)：3160.81，2921.67，2424.12，1579.44，1438.66，1400.09，1328.73，1132.03，985.46，889.04，796.47，686.55；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：2.50(s，3H，-CH₃)，2.51(s，3H，-CH₃)，7.05(d，J＝8.88Hz，2H，Ar-H)，7.36(t，J＝7.77Hz，1H，Ar-H)，7.62(t，J＝8.10Hz，1H，Ar-H)，8.47(s，1H，Ar-H)，10.22(s，1H，-NH-)，12.85(s，1H，imidazole-NH)，13.26(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：13.99，20.67，21.20，21.26，25.47，59.67，102.15，110.89，111.16，118.05，118.30，120.34，121.13，123.15，123.99，130.55，131.04，131.54，131.91，133.79，140.93，143.12，146.78，147.14，157.98，159.54，167.89；ESI-MS m/z：340.11[M+H]⁺.

实施例9

6-氯-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺(AM-008)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7c(0.639g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲硫基嘧啶(0.48g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.49g，收率52.7％，mp＞250℃.

IR(KB r，cm^-1)：3193.59，2925.53，1610.30，1556.30，1434.80，1371.16，1276.67，1209.17，1118.53，970.03，850.47，809.97，682.69；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：2.50(s，3H，-CH₃)，2.55(s，3H，-CH₃)，6.92-7.06(t，J＝8.28Hz，2H，Ar-H)，7.37(d，1H，Ar-H)，7.59(d，1H，Ar-H)，8.33(s，1H，Ar-H)，10.32(s，1H，-NH-)，12.86(s，1H，imidazole-NH)，13.27(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：13.69，21.29，101.04，110.94，111.19，118.11，118.35，120.59，123.21，124.06，130.60，131.55，131.98，133.81，140.92，143.11，146.63，146.98，157.43，158.98，171.97；ESI-MS m/z：372.08[M+H]⁺.

实施例10

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫基]苯}环丙甲酰胺(AM-009)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7c(0.639g，3mmol)和N-[4-(4，6-二氯嘧啶-2-硫)苯基]环丙甲酰胺(0.85g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.48g，收率37.5％，mp＞250℃.

IR(KBr，cm^-1)：3249.52，3185.88，2923.60，1664.29，1556.30，1432.87，1403.95，1369.23，1272.81，1201.45，1116.60，962.32，850.47，813.83，680.76；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：0.82-0.89(m，5H，cyclopropyl-CH₂and CH)，2.50(s，3H，CH₃)，6.96-7.04(t，J＝8.19Hz，2H，Ar-H)，7.27(d，1H，Ar-H)，7.52-7.61(t，J＝8.55Hz，4H，Ar-H)，7.76(d，J＝8.55Hz，2H，Ar-H)，10.42(d，2H，2×-NH-)，12.82(s，1H，imidazole-NH)，12.97(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：7.44，13.86，14.01，14.76，20.67，21.19，21.27，21.98，59.67，101.67，110.91，111.16，118.06，118.30，119.92，120.23，121.76，123.20，124.03，130.60，131.49，131.95，133.74，136.52，140.63，140.79，143.00，146.60，146.96，157.42，158.80，172.20；ESI-MS m/z：517.12[M+H]⁺.

实施例11

6-氯-2-甲基-N-{3-[5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AM-010)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7d(0.852g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲基嘧啶(0.45g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.56g，收率73.3％，mp198-200℃.

IR(KBr，cm^-1)：3166.16，2965.79，1574.94，1434.59，1394.49，1370.43，1283.21，1129.82，977.44，887.22；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：0.98-1.03(t，6H，2×diethylamine-CH₃)，1.21-1.45(d，1H，diethylamine-CH₂)，1.90(s，1H，diethylamine-CH₂)，3.67(s，3H，-CH₃)，7.04(s，1H，Ar-H)，7.20(d，J＝8.16Hz，1H，Ar-H)，7.46-7.66(d，2H，Ar-H)，8.46(s，1H，Ar-H)，10.21(s，1H，-NH-)，12.91(s，1H，imidazole-NH)，13.29(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ(ppm)：16.38，25.50，28.95，45.98，57.12，68.61，68.83，69.74，102.42，110.89，111.18，117.91，118.63，120.62，121.24，122.84，123.82，130.71，132.62，134.06，141.97，142.86，147.18，158.01，159.61，169.91，172.08；ESI-MS m/z：460.05[M+Na]⁺.

实施例12

6-氯-2-(甲硫基)-N-{3-[5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AM-011)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7d(0.852g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲硫基嘧啶(0.48g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.28g，收率26.7％，mp 179-180℃.

IR(KBr，cm^-1)：3186.20，2969.80，1607.02，1552.88，1430.58，1368.42，1274.19，1204.01，1115.79，969.42，811.03；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：1.02-1.07(d，6H，J＝8.16Hz，2×diethylamine-CH₃)，2.50-2.57(m，4H，2×diethylamine-CH₂)，2.61(s，3H，-CH₃)，3.68(s，2H，-CH₂-)，6.99(s，1H，Ar-H)，7.24(s，1H，Ar-H)，7.48(s，1H，Ar-H)，7.73(s，1H，Ar-H)，8.39(s，1H，Ar-H)，10.36(s，1H，-NH-)，12.93(s，1H，imidazole-NH)，13.33(s，1H，pyrazole-NH)；ESI-MS m/z：443.3[M+H]⁺.

实施例13

N-{4-[4-氯-6-(3-(5-(二乙胺甲基)-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-氨基)嘧啶-2-硫]苯基}环丙甲酰胺(AM-012)

具体实验操作同化合物AM-001的合成，投入化合物7d(0.852g，3mmol)和N-[4-(4，6-二氯嘧啶-2-硫)苯基]环丙甲酰胺(0.85g，2.5mmol)到10mL DMF中，得白色固体0.25g，收率13.1％，mp 176-180℃.

IR(KBr，cm^-1)：3242.30，1663.16，1588.97，1552.88，1438.60，1400.50，1274.19，1200.00，1113.78，957.39，835.09；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：0.87(s，5H，2×cyclopropyl-CH₂and CH)，1.17(d，6H，J＝7.17Hz，2×diethylamine-CH₃)，1.90(s，2H，-CH₂-)，2.88(s，4H，2×diethylamine-CH₂)，6.98(s，1H，Ar-H)，7.31(s，2H，Ar-H)，7.52-7.60(t，3H，Ar-H)，7.76(d，J＝8.73Hz，3H，Ar-H)，10.28(s，1H，-NH-)，10.51(s，1H，-NH-)，13.10(s，2H，imidazole-NH and pyrazole-NH)；ESI-MS m/z：588.4[M+H]⁺.

实施例14

6-氯-2-(甲砜基)-N-{3-[5-(吗啉甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AN-001)

50mL圆底烧瓶中，投入化合物7a(0.894g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲砜基嘧啶(0.68g，3mmol)，以30mL叔丁醇溶解，Ar气保护下，回流反应1h。反应结束后，真空蒸干溶剂，残余物以50mL乙酸乙酯和50mL饱和NaCO₃溶液溶解，分层。有机层依次以水和饱和食盐水洗涤，无水MgSO₄干燥。真空蒸干溶剂，乙酸乙酯重结晶，得类白色固体0.38g，收率26.2％，mp＞250℃.

IR(KBr，cm^-1)：3315.09，2958.31，2859.96，1608.37，1581.37，1434.80，1317.16，1147.46，1116.60，968.11，852.40，763.68，680.76；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ(ppm)：2.39-2.51(d，4H，2×morpholine-CH₂)，3.44(s，3H，-CH₃)，3.58(s，6H，2×morpholine-CH₂and-CH₂-)，7.21(d，J＝7.65Hz，1H，Ar-H)，7.44(s，1H，Ar-H)，7.61-7.69(t，2H，Ar-H)，10.92(d，1H，-NH-)，13.00(d，1H，imidazole-NH)，13.38(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ(ppm)：13.69，50.53，54.86，59.57，63.15，102.17，111.50，118.47，120.82，171，97；ESI-MS m/z：487.35[M+H]⁺；Anal.Calcd for C₂₀H₂₁ClN₈O₃S·1/4H₂O(％)：C 48.72，H 4.41，N 22.73；Found：C 48.58，H 4.35，N 22.47.

实施例15

6-氯-N-[3-(5-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基]-2-(甲砜基)嘧啶-4-胺(AN-002)

具体实验操作同化合物AN-001的合成，投入化合物7c(0.639g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲砜基嘧啶(0.68g，3mmol)，)到30mL叔丁醇中，得类白色固体0.34g，收率28.1％，mp＞250℃.

IR(KBr，cm^-1)：3345.94，2925.53，1608.73，1583.30，1434.80，1396.23，1334.52，1299.81，1141.67，1116.60，1141.67，966.18，854.32，761.76，678.83；¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ(ppm)：2.50(s，3H，-CH₃)，3.40(s，3H，-CH₃)，7.06(s，1H，Ar-H)，7.30-7.40(t，J＝8.13Hz，1H，Ar-H)，7.55-7.64(t，2H，Ar-H)，8.46(s，1H，Ar-H)，10.84(s，1H，-NH-)，12.91(s，1H，imidazole-NH)，13.37(s，1H，pyrazole-NH)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，125MHz)δ(ppm)：21.25，108.51，111.00，111.24，118.14，120.14，121.13，123.29，124.15，130.66，131.50，132.08，140.89，143.06，146.42，157.71，159.65，165.14；ESI-MSm/z：404.06[M+H]⁺.

实施例16

6-氯-2-(甲砜基)-N-{3-[5-(二乙胺基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-4-胺(AN-004)

具体实验操作同化合物AN-001的合成，投入化合物7d(0.87g，3mmol)和4，6-二氯-2-甲砜基嘧啶(0.68g，3mmol)，)到30mL叔丁醇中，得类白色固体0.34g，收率22.1％。1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ(ppm)：3.07(s，5H，2×cyclopropyl-CH2and CH)，3.31(s，3H，-CH3)，3.36-3.61(m，5H，2×cyclopropyl-CH2and CH)，7.46-7.56(m，3H，Ar-H)，7.76-7.94(m，2H，Ar-H)，13.33(d，1H，imidazole-NH)，13.54(s，1H，pyrazole-NH)；ESI-MS m/z：475.3[M+H]⁺.

生物学实施例

采用下列实验甑别具有最佳程度的所需活性的那些化合物。

抑制肿瘤细胞增殖测定方法(MTT法)

测定胺常规采用溴化四氮唑蓝(MTT)法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化四氮唑蓝还原为难溶的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。三联裂解液能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处检测其光吸收值，可间接反映活细胞数量。因而，采用MTT法可测定目标化合物抑制细胞的增殖能力，同时利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。1试剂和仪器

RPMI 1640培养基(RPMI 1640+10％小牛血清或胎牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO₃2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)；MTT(Sigma)；胰蛋白酶(Invitrogen)；三联溶解试剂。

CO₂培养箱、无菌操作台、酶标仪、离心机、移液枪、移液管、离心管、96孔板等。

2细胞株

慢性髓细胞白血病(K562)、人急性单核细胞白血病细胞株(U937)

3实验方法

3.1细胞培养

人非小细胞肺癌细胞株(A549)用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。人急性单核细胞白血病细胞株(U937)用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

3.2细胞接种

取处于指数生长期，状态良好的细胞，收集细胞离心，弃上清。用含10％小牛血清的RPMI 1640(或DMEM)培养液配成细胞悬液，然后计数。取细胞悬液接种于96孔板上，100μl/孔(每孔含5000个肿瘤细胞)。将培养板转入恒温CO₂培养箱中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

3.3化合物配制

待测化合物先用DMSO配制成20mmol/L浓度，加入待测化合物，使其终浓度为10^-5mol/L用于初筛，每组设3个复孔，培养基补足至200ul。阴性对照为等体积培养基，同时设相应浓度的DMSO溶媒对照，空白对照不含细胞和药物。共同于37℃，5％CO₂的培养箱中培养72小时。

3.4染色

将5mg/ml的MTT加入96孔板中，20μL/孔，置于培养箱中孵育4小时，再加入含20％SDS的三联裂解液50μL/孔，置于培养箱中过夜。

3.5测定

酶标仪设定波长为570nm，参考波长为630nm，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞生长抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。

3.6复筛

在初筛浓度为10^-5mol/L时，3次细胞抑制率≥50％的化合物用于复筛，将20mmol/L再做5个稀释度，孔中终浓度依次为5×10^-5mol/L、2×10^-5mol/L、10^-5mol/L、5×10^-6mol/L和2×10^-6mol/L。培养72小时，同样每组设3个复孔，并按照初筛方法，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞生长抑制率。

3.7细胞生长抑制率以及IC50的计算

同时根据各浓度的生长抑制率，采用GraphPad Prism 5.0软件计算IC₅₀值。

4实验结果

4.1细胞生长抑制率

在浓度为10^-5mol/L时，AM系列目标化合物对不同肿瘤细胞的生长抑制率分别见表1。

表1AM和AN系列目标化合物对不同肿瘤细胞的生长抑制率(10μM)

a：浓度＝10μM

4.2细胞生长半数抑制浓度(IC₅₀μmol/L)

AM系列目标化合物对不同肿瘤细胞生长的半数抑制浓度(IC₅₀μmol/L)见表2。

表2AM和系列目标化合物对不同肿瘤细胞生长的半数抑制浓度(IC₅₀μmol/L)

A-IC₅₀＜1.0μmol/L；

B-1.0＜IC₅₀＜5.0μmol/L；

C-5.0＜IC₅₀＜10.0μmol/L；

5.实验结论

本发明实施例中制备的具有式(I)结构的化合物对慢性髓细胞白血病(K562)、人急性单核细胞白血病细胞株(U937)的增殖具有显著的抑制作用。上述这些化合物可应用于抗肿瘤药物的制备。