CN101848734B - 用于成像的经标记的iigf结合肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适合于体内光学成像的经标记的cMet结合肽。所述肽用适合于在红色至近红外区域进行成像的光学报道基团进行标记。还公开了药物组合物和药盒以及体内成像方法，它们尤其可用于对结肠直肠癌(CRC)的疾病进展进行检测、分期、诊断和监测，或者对该疾病的治疗进行监测。
Description
发明领域
本发明涉及适合体内光学成像的经标记的cMet结合肽。肽是用适合在红色至近红外区域中成像的光学报道基团进行标记。还公开了特别可用于结肠直肠癌(CRC)的诊断的体内成像方法。
发明背景
WO 2005/030266公开了存在着对早期诊断结肠直肠癌(CRC)的医学需求。WO 2005/030266公开了对CRC中异常表达的生物靶标具有亲和力的光学成像造影剂。生物靶标选自：COX-2、β-联蛋白、E-钙黏着蛋白、P-钙黏着蛋白、各种激酶、Her-2、基质金属蛋白酶(MMP)、细胞周期蛋白、P53、胸苷酸合成酶、VEGF受体、EGF受体、K-ras、结肠腺瘤性息肉蛋白、组织蛋白酶B、uPAR、cMet、黏蛋白和胃泌素受体。这些靶标中优选的据说(第7页第11-12行)是：cMet、MMP-14、COX-2、β-联蛋白和组织蛋白酶B。WO 2005/030266的载体可以是：肽、拟肽部分(peptoid moiety)、寡核苷酸、寡糖、脂质相关化合物或者传统的有机药物样小分子。报道部分优选是能与电磁波频谱紫外部分到红外部分的波长区域中的光发生相互作用的染料。
肝细胞生长因子(HGF)，也称扩散因子(scatter factor，SF)，是一种参与各种生理过程如创伤愈合和血管发生的生长因子。HGF与其高亲和力受体(cMet)的相互作用牵涉到肿瘤生长、侵入和转移。
Knudsen等人综述了HGF和cMet在前列腺癌中的作用，这对成像和治疗可能具有意义[Adv.Cancer Res.，91，31-67(2004)]。诊断和治疗用的经标记的抗met抗体在WO 03/057155有描述。
WO 2004/078778公开了能结合cMet或者包含cMet和HGF的复合物的多肽或多聚肽构建物。大约10种不同结构类别的肽已被描述。WO 2004/078778的公开中，肽可用供体外和体内应用的可检测标记物进行标记，或者用供治疗应用的药物进行标记。可检测标记物可以是：酶、荧光化合物、光学染料、顺磁性金属离子、超声造影剂或放射性核素。WO 2004/078778的优选标记据称是放射性的或顺磁性的，且最优选包含被金属螯合剂螯合的金属。
发明内容
本发明提供适合体内光学成像的成像剂，其包含cMet结合环肽和光学报道成像部分，该光学报道成像部分适合于用绿色至近红外波长500-1200nm的光对哺乳动物身体进行体内成像。cMet结合环肽与WO 2004/078778的肽结构类别之一有关，对cMet具有最佳结合亲和力。如WO 2004/078778中所述，这些肽衍自噬菌体展示，并通过它们对cMet的亲和力和与HGF的竞争的缺乏进行选择。本发明的cMet结合肽优选其至少一个末端受到代谢抑制基团(MIG)的保护。这对体内应用来说是一个重要的考虑，因为体内内源酶类和肽酶会将肽快速代谢，结果造成cMet结合亲和力的丧失，从而导致体内选择性靶向性的丧失。
根据本发明教导，体内使用cMet结合肽的最佳方式涉及到使用光学报道分子而不是其他成像模式(例如核成像、MRI成像或超声成像)，且还提供了优选的光学成像报道分子。优选绿色至近红外区域(波长500-1200nm的光)，因为该区域与内源组织和材料如血红蛋白、卟啉、黑色素和胶原的光谱重叠最小[Licha，Topics Curr.Chem.，222，1-29(2002)]。自身荧光的其他重要促进因素是NADH、FAD和弹性蛋白。
发明详述
在第一方面，本发明提供包含式I的缀合物的成像剂：
(I)
其中：
Z1连接到cMBP的N末端，且为H或MIG；
Z2连接到cMBP的C末端，且为OH、OBc或MIG，
其中Bc为生物相容性阳离子；
cMBP为包含以下氨基酸序列(SEQ-1)的17-30个氨基酸的cMet结合环肽：
Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6；
其中X1为Asn、His或Tyr；
X2为Gly、Ser、Thr或Asn；
X3为Thr或Arg；
X4为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；
X5为Ser或Thr；
X6为Asp或Glu；
而Cysa-d各自为半胱氨酸残基，使得残基a与b和c与d环化形成两个独立的二硫键；
MIG为代谢抑制基团，其为能抑制或阻碍cMet肽的体内代谢的生物相容性基团；
L为式-(A)m-的合成接头基团，其中每个A独立为-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基基团、C4-8环亚烷基基团、C5-12亚芳基基团或C3-12杂亚芳基基团、氨基酸、糖或单分散性聚乙二醇(PEG)结构单元；
每个R独立选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m为1-20的整数；
n为0或1的整数；
IM为适合于用绿色至近红外波长600-1200nm的光对哺乳动物身体进行体内成像的光学报道成像部分。
术语“成像剂”是指适合于对哺乳动物身体进行体内成像的化合物。优选地，哺乳动物是人受试对象。成像可以是侵入式的(例如手术中的或内窥镜检查的)，或者是非侵入式的。优选的成像方法是内窥镜检查法。虽然式I的缀合物适用于体内成像，但它也可具有体外应用(例如生物样品中的cMet定量测定或者组织样品中的cMet的显示)。优选地，成像剂用于体内成像。
Z1基团取代最后一个氨基酸残基的胺基团。因此，当Z1为H时，cMBP的氨基末端终止于最后一个氨基酸残基的游离NH2基团。Z2基团取代最后一个氨基酸残基的羰基基团。因此，当Z2为OH时，cMBP的羧基末端终止于最后一个氨基酸残基的游离CO2H基团，当Z2为OBc时，该末端羧基基团被电离为CO2Bc基团。
术语“代谢抑制基团”(MIG)是指能抑制或阻碍cMBP肽在氨基末端(Z1)或羧基末端(Z2)处的体内代谢的生物相容性基团。这种基团是本领域技术人员公知的，对于肽胺末端而言适宜选自：N-乙酰化基团-NH(C＝O)RG，其中酰基基团-(C＝O)RG具有选自：C1-6烷基基团、C3-10芳基基团的RG，或者包含聚乙二醇(PEG)结构单元。下文描述到接头基团(L)的合适PEG基团。优选的这种PEG基团是式IA或IB的生物修饰物(biomodifier)。优选的这种氨基末端MIG基团是乙酰基、苄氧羰基或三氟乙酰基，最优选乙酰基。
对于肽羧基末端而言合适的代谢抑制基团包括：甲酰胺、叔丁酯、苄酯、环己酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)结构单元。cMBP肽的羧基末端氨基酸残基的合适MIG基团，是其中氨基酸残基的末端胺被C1-4烷基基团、优选甲基基团进行N-烷基化。优选的这种MIG基团是甲酰胺或PEG，最优选这种基团是甲酰胺。
式I表示-(L)n[IM]部分可在Z1、Z2或cMBP的任何合适位置连接。对于Z1或Z2，当Z1/Z2任一者为MIG时，-(L)n[IM]部分可连接到所述MIG基团。当Z1为H或者Z2为OH时，-(L)n[IM]部分在Z1或Z2位置的连接分别产生出式[IM]-(L)n-[cMBP]-Z2或Z1-[cMBP]-(L)n-[IM]的化合物。对cMBP在任一肽末端处的代谢的抑制，也可通过以这种方式连接-(L)n[IM]部分来实现，但-(L)n[IM]超出了本发明的MIG的定义。
式I的-(L)n-部分可在IM的任何合适位置处连接。-(L)n-部分或者代替IM的现有取代基，或者共价连接到IM的现有取代基。-(L)n-部分优选通过IM的羧基烷基取代基连接。
术语“cMet结合环肽”(cMBP)是指能结合肝细胞生长因子(HGF)高亲和力受体(也称cMet(c-Met或肝细胞生长因子受体))的肽。本发明的合适的cMBP肽对cMet/HGF复合物的cMet的表观KD小于约20nM。cMBP肽包含脯氨酸残基，已知这种残基能抑制主链酰胺键的顺式/反式异构化。本发明的cMBP肽包括任何这种异构体。
术语“生物相容性阳离子”(Bc)是指能与电离的、带负电荷的基团形成盐的带正电荷的反荷离子，其中所述带正电荷的反荷离子也是无毒的，因此适合给予哺乳动物身体，特别是人身体。合适的生物相容性阳离子的实例包括：碱金属钠或钾离子；碱土金属钙和镁离子；以及铝离子。优选的生物相容性阳离子是钠和钾，最优选钠。
术语“氨基酸”是指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘丙氨酸)或氨基酸模拟物，它们可以是天然的或者纯粹是合成的，且可以是光学纯的，也即为单一对映异构体并因此具有手性，或者是对映异构体的混合物。本文使用常规的氨基酸三字母或单字母缩写。优选地，本发明的氨基酸是光学纯的。术语“氨基酸模拟物”是指天然氨基酸的合成类似物，其为电子等排体，即已被设计来模拟天然化合物的立体和电子结构。这种电子等排体是本领域技术人员公知的，包括但不限于缩肽(depsipeptide)、逆-反肽(retro-inverso peptide)、硫代酰胺、环烷或1，5-二取代四唑[参见M.Goodman，Biopolymers，24，137，(1985)]。
术语“肽”是指包含两个或多个如上定义的通过肽键(将一个氨基酸的胺连接到另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的氨基酸的化合物。术语“肽模拟物”或“模拟物”是指这样的生物活性化合物，它们模拟肽或蛋白质的生物活性，但在化学性质上不再属于肽，也就是说，它们不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)。因此，术语肽模拟物以更广的含义使用，以包括在性质上不再完全属于肽的分子，如假肽、半肽和拟肽。
术语“光学报道分子成像部分”(IM)是指能够在光学成像程序中用绿色至近红外波长(500-1200nm，优选600-1000nm)的光直接或间接检测的荧光染料或发色团。优选地，IM具有荧光性质。
设想到，式I的接头基团-(A)m-的一个作用是使IM与cMBP肽的活性位点隔开。这在成像部分体积相对较大时是特别重要的，使得与酶的相互作用不受削弱。这可通过柔性(例如简单的烷基链)和/或刚性(例如环烷基或芳基间隔基)的组合来实现，所述柔性使得体积大的基团具有自身进行定位以避开活性位点的自由度，所述刚性则将IM定向成避开活性位点。还可用接头基团的性质来修饰成像剂的生物分布。因此例如在接头中引入醚基团将有助于使血浆蛋白结合减至最低。当-(A)m-包含聚乙二醇(PEG)结构单元或者1-10个氨基酸残基的肽链时，接头基团可起到修饰成像剂的体内药代动力学和血液清除速率的作用。这种“生物修饰性”接头基团可加速成像剂从背景组织(如肌肉或肝脏)和/或从血液的清除，从而因为背景干扰较少而得到较好的诊断影像。生物修饰性接头基团还可用来促进特定的排泄途径，例如通过肾脏排泄而不是通过肝脏排泄。
术语“糖”是指单糖、二糖或三糖。合适的糖包括：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和乳糖。任选地，糖可进行官能化以便容易与氨基酸偶联。因此例如，氨基酸的葡糖胺衍生物可通过肽键与其他氨基酸缀合。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(可从NovaBiochem市售获得)是其中一个实例：
优选的特征
成像剂的分子量适宜最高为8000道尔顿。优选地，分子量在2800-6000道尔顿的范围，最优选3000-4500道尔顿，尤其优选的是3200-4000道尔顿。
本发明的优选成像剂其两个肽末端都被MIG基团保护，即优选Z1和Z2都是MIG，而这两个MIG通常会是不同的。如上所述，Z1/Z2任一者可任选等于-(L)n[IM]。两个肽末端以这种方式进行保护对于体内成像应用是重要的，因为否则就会发生快速代谢，结果造成对cMet的选择性结合亲和力的丧失。当Z1和Z2均为MIG时，优选Z1为乙酰基，Z2为伯酰胺。最优选地，Z1为乙酰基，Z2为伯酰胺，-(L)n[IM]部分连接到cMBP的赖氨酸残基的ε胺侧链。
本发明的优选的cMBP肽对cMet/HGF复合物的cMet的结合的KD小于约10nM(基于荧光偏振测定的测量值)，最优选在1-5nM的范围，理想的是小于3nM。
式I的cMBP的肽序列(SEQ-1)
Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6
(SEQ-1)
是17-mer肽序列，其主要负责与cMet的选择性结合。当本发明的cMBP肽包含超过17个氨基酸残基时，其余的氨基酸可以是半胱氨酸之外的任何氨基酸。额外的未受保护的半胱氨酸残基会造成已确定的Cysa-Cysb二硫键和Cysc-Cysd二硫键出现不合需要的搅乱(scrambling)。额外的肽优选包含至少一个具有适于使-(L)n[IM]部分容易缀合的侧链的氨基酸残基。合适的这种残基包括供与胺官能化的-(L)n[IM]基团缀合的Asp残基或Glu残基，或者供与羧基官能化的或活性酯官能化的-(L)n[IM]基团缀合的Lys残基。供与-(L)n[IM]缀合的氨基酸残基适宜位于远离cMBP肽(SEQ-1)的17-mer结合区域的位置，优选位于C末端或N末端。优选地，供缀合的氨基酸残基是Lys残基。
用已知的氨基酸置换物苯丙氨酸和萘丙氨酸，评估SEQ-1的色氨酸残基的置换。不管怎样都发现cMet亲和力的丧失，这提示色氨酸残基对活性是重要的。
优选的是cMBP肽还包含N末端丝氨酸残基，从而得到18-mer(SEQ-2)：
Ser-Cysa X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6。
(SEQ-2)
除了SEQ-1或优选地SEQ-2外，cMBP最优选还包含：
(i)C或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基以内的Asp残基或Glu残基，且-(L)nIM用胺基团官能化，该胺基团缀合到所述Asp残基或Glu残基的羧基侧链而产生酰胺键；
(ii)C或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基以内的Lys残基，且-(L)nIM用羧基基团官能化，该羧基基团缀合到所述Lys残基的ε胺侧链而产生酰胺键。
优选的cMBP肽包含22-mer氨基酸序列(SEQ-3)：
Ala-Gly-Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr。(SEQ-3)
本发明的cMBP肽优选其中X3等于Arg。
cMBP肽优选除了包含SEQ-1、SEQ-2或SEQ-3外，还在N末端或C末端包含选自以下的接头肽：
-Gly-Gly-Gly-Lys-(SEQ-4)、-Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5)或
-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys-(SEQ-6)。
接头肽的Lys残基是缀合-(L)n[IM]部分的最优选位置。尤其优选的cMBP肽包含SEQ-3以及SEQ-4接头肽，从而具有26-mer氨基酸序列(SEQ-7)：
Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。(SEQ-7)
SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3和SEQ-7的cMBP肽优选Z1＝Z2＝MIG，最优选Z1＝乙酰基和Z2＝伯酰胺。
-(L)n[IM]部分适宜连接到Z1基团或Z2基团任一者，或者连接到cMBP肽的异于SEQ-1的cMet结合序列的氨基酸残基。优选的氨基酸残基和缀合位点如上所述。当-(L)n[IM]部分连接到Z1或Z2时，它可通过缀合到N末端或C末端而代替Z1或Z2，这样就阻断体内代谢。
优选的IM基团具有广泛的离域电子体系，例如花菁、部花菁、吲哚花菁、酞花菁、萘花菁、三苯基次甲(triphenylmethine)、卟啉、pyrilium染料、thiapyrilium染料、squarylium染料、croconium染料、azulenium染料、靛苯胺、benzophenoxazinium染料、benzothiaphenothiazinium染料、蒽醌、萘醌、阴丹士林(indathrene)、phthaloylacridone、三苯酚合苯醌(trisphenoquinone)、偶氮染料、分子内和分子键电荷转移染料和染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、bis(dithiolene)复合物、bis(benzene-dithiolate)复合物、碘苯胺染料、bis(S，O-dithiolene)复合物。也可使用荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)和具有不同的吸收/发射特性的GFP修饰物。某些稀土金属(例如铕、钐、铽或镝)的复合物在某些情形中使用，如荧光纳米晶体(量子点)。
可使用的发色团的具体实例包括荧光素、磺酰罗丹明101(TexasRed)、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明19、吲哚花菁绿、Cy2、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Marina Blue、Pacific Blue、OregonGreen 488、Oregon Green 514、四甲基罗丹明以及Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750。特别优选花菁染料。Licha等人综述了用于体内光学成像的染料和染料缀合物[Topics Curr.Chem.，222，1-29(2002)；Adv.Drug Deliv.Rev.，57，1087-1108(2005)]。
优选的属荧光团的花菁染料为式II：
(II)
其中：
每个X′独立选自：-C(CH3)2、-S-、-O-或
-C[(CH2)aCH3][(CH2)bM]-，其中a为0-5的整数，b为1-5的整数，M为基团G或者选自SO3M1或H；
每个Y′独立代表1-4个选自以下的基团：H、-CH2NH2、-SO3M1、-CH2COOM1、-NCS和F，且其中Y′基团被置于芳环的任何位置；
Q′独立选自：H、SO3M1、NH2、COOM1、铵、酯基团、苄基和基团G；
M1为H或Bc；
1为1-3的整数；
m为1-5的整数；
其中X′、Y′和Q′中至少一个包含基团G；
G为适合于连接到cMBP肽的活性基团或官能团。
G基团与cMBP肽的互补基团反应，从而在花菁染料荧光团和cMBP肽之间形成共价键。G可以是可与肽的互补官能团反应的活性基团，或者可包括可与cMBP肽的活性基团反应的官能团。活性基团和官能团的实例包括：活性酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰基卤、酰肼、乙烯砜、二氯三嗪、亚磷酰胺、羟基、氨基、巯基、羰基、羧酸和硫代磷酸酯。优选G是活性酯。
术语“活化酯”或“活性酯”是指相关羧酸的酯衍生物，它被设计成为更好的离去基团，从而使得更容易与亲核体如胺反应。合适的活性酯的实例有：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、硫代琥珀酰亚胺酯、五氟苯酚、五氟苯硫酚、对硝基苯酚、羟基苯并三氮唑和PyBOP(即苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐)。优选的活性酯是N-羟基琥珀酰亚胺酯或五氟苯酚酯，尤其是N-羟基琥珀酰亚胺酯。
在式II的一个优选实施方案中：
每个X′选自-C(CH3)2-和-C(CH3)[(CH2)4M]-，
其中M为G基团或-SO3M1；
每个Y′代表SO3M1、H或1-4个F原子；
每个Q′选自G基团和SO3M1；
1优选为2，m优选为3、4或5；
其中当X′或Q′为G基团时，它最优选为琥珀酰亚胺酯。
特别优选的花菁染料为式III：
(III)
其中：
R1和R2独立为H或SO3M1，且R1和R2中至少一个为SO3M1，其中M1为H或Bc；
R3和R4独立为C1-4烷基或C1-6羧基烷基；
R5、R6、R7和R8独立为Ra基团；
其中Ra为C1-4烷基、C1-6羧基烷基或-(CH2)kSO3M1，其中k为数值为3或4整数。
条件是该花菁染料在R1基团、R2基团和Ra基团中具有总共1-4个SO3M1取代基。
选择优选的式III染料，从而使至少一个C1-6羧基烷基基团得以存在，以利于与cMBP的缀合。
各个优选的式III染料在表1中总结：
表1：各个花菁染料的化学结构
其中Rf＝-(CH2)5COOH。
尤其优选的式II染料是Cy5**和Alexa647，最理想是Cy5**。
当合成的接头基团(L)存在时，它优选包含利于与[IM]和Z1-[cMBP]-Z2的缀合的末端官能团。当L包含1-10个氨基酸残基的肽链时，氨基酸残基优选选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。当L包含PEG部分时，它优选包含衍自式IA或IB的单分散性PEG样结构的寡聚化的单元：
(IA)
式IA的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸
其中p为1-10的整数。或者，可使用基于式IB的丙酸衍生物的PEG样结构：
(IB)
其中p如对式IA所定义，q为3-15的整数。
在式IB中，p优选为1或2，q优选为5-12。
当接头基团不包含PEG或肽链时，优选的L基团具有这样的主链，其由2-10个原子、最优选2-5个原子、尤其优选2或3个原子连接在一起而构成-(A)m-部分。2个原子的最小接头基团主链带来的优点是，成像部分得到很好的隔开，使得任何不合需要的相互作用减至最低。
在式I中，n优选为0或1，最优选0，即不存在接头基团。
本发明的优选的成像剂为式IV：
其中(L)n[IM]基团连接到Lys残基的ε氨基基团。优选的式IV的成像剂为MIG(N末端Ala)等于乙酰基和MIG(C末端Lys)等于伯酰胺。在式IV中，n优选为0，IM优选为花菁染料，最优选式II的花菁染料。特别优选的式IV成像剂为IM＝Cy5**或Alexa647，理想的是Cy5**。
本发明的式Z1-[cMBP]-Z2的肽可通过包括以下步骤的制备方法获得：
(i)固相肽合成法合成出这样的线性肽：其肽序列与所需的cMBP肽相同，且其中Cysa和Cysb未受保护，Cysc残基和Cysd残基具有硫醇保护基；
(ii)用碱的水溶液处理步骤(i)得到的肽，产生具有连接Cysa和Cysb的第一二硫键的单环肽；
(iii)除去Cysc和Cysd硫醇保护基并环化，产生连接Cysc和Cysd的第二二硫键，即为所需的双环肽产物Z1-[cMBP]-Z2。
术语“保护基”是指这样的基团，它能抑制或阻碍不需要的化学反应，但它被设计成具有足够的反应性，使得它可在不会改变分子的其余部分的足够温和的条件下从它所涉及的官能团上切割下来。脱保护后，就获得所需的产物。胺保护基是本领域技术人员公知的，适宜选自：Boc(其中Boc为叔丁氧基羰基)、Fmoc(其中Fmoc为芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己亚基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。合适的硫醇保护基有Trt(三苯甲基)、Acm(乙酰胺基甲基)、t-Bu(叔丁基)、叔丁基硫、甲氧基苄基、甲基苄基或Npys(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。更多的保护基的使用在‘Protective Groups in Organic Synthesis’，Theorodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，(John Wiley&Sons，1991)中有描述。优选的胺保护基是Boc和Fmoc，最优选Boc。优选的胺保护基是Trt和Acm。
实施例1和2提供更多的具体细节。固相肽合成的更多细节在P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Girald；Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，CRC Press，1997中有描述。cMBP肽最好在惰性气体下保存并放在冰箱中。当在溶液中使用时，最好避免7以上的pH，因为这会有二硫键发生搅乱(scrambling)的风险。
成像剂可如第三方面(下文)中所述进行制备。
在第二方面，本发明提供包含第一方面的成像剂以及生物相容性载体的药物组合物，所述药物组合物为适合于哺乳动物给药的形式。
“生物相容性载体”是使得组合物生理上可耐受，即组合物能给予哺乳动物身体而不造成毒性或过度不舒服的流体，尤其是液体，成像剂可悬浮或溶解于其中。生物相容性载体适宜是可注射载体液体，如无菌无热原注射用水；水溶液如盐水(有利的是可对其进行平衡处理，使得注射用的最终产品是等渗的)；一种或多种张力调节物质(血浆阳离子与生物相容性反荷离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、甘醇(例如甘油)或者其他非离子型多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选地，生物相容性载体是无热原注射用水或者等渗盐水。
成像剂和生物相容性载体各自在合适的瓶或罐中供应，所述瓶或罐包括密封容器，其能使无菌完整性和/或放射性安全性得以保持，任选还含有惰性顶空气体(例如氮气或氩气)，同时便于通过注射器或套管注入或提取溶液。优选的这种容器是隔膜密封小瓶，其有不透气密封件卷边套口，密封件上还加顶封(通常为铝材)。密封件适合于用皮下注射器针头进行单次或多次穿刺(例如为卷边套口的隔膜密封件)，同时保持无菌完整性。这种容器具有如下的额外优点：密封件如需要的话能承受真空(例如改变顶空气体或者使溶液脱气)，且能承受压力变化如压力下降而不让外部大气气体如氧气或水蒸气进入。
优选的多剂量容器包括装有患者多次用剂量的单个大瓶(例如10-30cm3体积)，据此可在制品有效期内的不同时间将患者各次剂量抽取到临床级注射器中，以适应临床情况。预充注射器被设计成装有单次人用剂量或者“单位剂量”，因此优选是适合临床使用的一次性注射器或其他注射器。本发明的药物组合物优选具有适合单个患者的剂量，且如上所述在合适的注射器或容器中提供。
药物组合物可任选含有另外的赋形剂，如抗微生物防腐剂、pH调节剂、填充剂、稳定剂或重量摩尔渗透压浓度(osmolality)调节剂。术语“抗微生物防腐剂”是指能抑制潜在有害的微生物如细菌、酵母或霉菌的生长的物质。视所采用的剂量而定，抗微生物防腐剂还可显示一定的杀细菌性质。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用是抑制任何这种微生物在药物组合物中的生长。但是，抗微生物防腐剂还可任选用于抑制潜在有害的微生物在药盒的一种或多种用来在临用时制备所述组合物的成分中的生长。合适的抗微生物防腐剂包括：尼泊金酯类，即尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯或尼泊金丁酯或者它们的混合物；苄醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵(cetrimide)和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂是尼泊金酯类。
术语“pH调节剂”是指可用于确保组合物的pH在人或哺乳动物给药的可接受范围内(大约pH 4.0-10.5)的化合物或者化合物的混合物。合适的这种pH调节剂包括药物可接受的缓冲剂如三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、磷酸盐或TRIS[即三(羟甲基)氨基甲烷]，和药物可接受的碱如碳酸钠、碳酸氢钠或它们的混合物。当组合物以药盒形式应用时，pH调节剂可任选在单独的瓶或容器中提供，使得药盒使用者可进行pH调节，作为多步骤程序的一部分。
术语“填充剂”是指在生产和冻干过程中可促进物料处理的药物可接受的增量剂。合适的填充剂包括无机盐如氯化钠，和水溶性糖或糖醇如蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇或海藻糖。
第二方面的药物组合物可在无菌制造(即清洁室)条件下进行制备，以得到所需的无菌非热原产品。优选的是，关键成分尤其是相关试剂加器械与成像剂接触的那些部分(例如瓶)是无菌的。各成分和试剂可通过本领域公知的方法进行灭菌，包括：无菌过滤，使用例如γ辐照、高压灭菌、干热或化学处理(例如用环氧乙烷)进行终末灭菌。优选预先对一些成分进行灭菌，使得需要进行的操作数目达致最小。但是，作为预防措施，优选包括至少无菌过滤步骤作为药物组合物的制备中的最终步骤。
第二方面的药物组合物可任选从药盒制备，如下文对第四方面所述。
在第三方面，本发明提供制备第一方面的成像剂的方法，所述方法包括步骤(i)-(iv)之一：
(i)使其中Z1为H，Z2为MIG的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，与式Y1-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在Z1位置缀合的式I成像剂；
(ii)使其中Z1＝Z2＝MIG，cMBP包含C或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基以内的Asp残基或Glu残基，且cMBP肽的所有其他Asp/Glu残基受到保护的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，与式Y2-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在cMBP肽的所述Asp残基或Glu残基缀合的式I成像剂；
(iii)使其中Z1为MIG，Z3为Z2基团或活化酯，且cMBP肽的所有其他Asp/Glu残基受到保护的式Z1-[cMBP]-Z3的cMBP肽，与式Y2-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在Z2位置缀合的式I成像剂；
(iv)使其中Z1＝Z2＝MIG，且cMBP包含C或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基以内的Lys残基的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，与式Y1-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在cMBP肽的Lys残基缀合的式I成像剂；
其中Z1、cMBP、Z2、MIG、L、n和IM如第一方面(上文)中所定义，和
Z3为Z2基团或活化酯；
Y1为羧酸基团、活化酯基团、异硫氰酸酯基团或硫氰酸酯基团；
Y2为胺基团。
术语“活化酯”或“活性酯”及其优选的实施方案如上所述。Y2优选为伯胺基团或仲胺基团，最优选伯胺基团。
化合物Z1-[cMBP]-Z2优选Z1和Z2都等于MIG。优选的cMBP肽和Z1/Z2基团如第一方面中所描述。具体的说，如对第一方面的优选cMBP肽所述，优选的是cMBP肽包含Asp、Glu或Lys残基以促进缀合。尤其优选的是cMBP肽包含Lys残基，如在步骤(iv)中所描述。
Z1-[cMBP]-Z2的制备在第一实施方案(上文)中作了描述。其中Z3为活性酯的Z1-[cMBP]-Z3肽可通过常规方法从其中Z2为OH或生物相容性阳离子(Bc)的Z1-[cMBP]-Z2制备。
经官能化的适合与肽缀合的光学报道染料(IM)，可从GEHealthcare Limited、Atto-Tec、Dyomics、Molecular Probes和其他厂商市售获得。这种染料大多是作为NHS酯提供。
Licha(见上)以及Flanagan等人[Bioconj.Chem.，8，751-756(1997)]；Lin等人[同上，13，605-610(2002)]和Zaheer[Mol.Imaging，1(4)，354-364(2002)]描述了将合适的光学报道分子(IM)特别是染料与氨基酸和肽缀合的方法。将接头基团(L)缀合到cMBP肽的方法使用的是与单独的染料(见上)相似的化学，且是本领域公知的。
在第四方面，本发明提供用于制备第二方面的药物组合物的药盒，所述药盒包含无菌、固体形式的第一方面的成像剂，使得当用第二方面的生物相容性载体的无菌供应品(sterile supply)进行复溶时，发生溶解而得到所需的药物组合物。
在该情况中，成像剂以及上文所述的其他任选赋形剂，可作为冻干粉在合适的瓶或容器中提供。于是成像剂被设计成可用所需的生物相容性载体复溶成无菌、无热原形式的药物组合物，以备给予哺乳动物。
成像剂的优选的无菌固体形式是冻干固体。如对药物组合物所述(上文)，无菌固体形式优选在药物级容器中供应。若药盒进行冻干，制剂可任选包含选自糖类(优选甘露糖醇、麦芽糖)或三(羟甲基)甲基甘氨酸的冷冻保护剂。
在第五方面，本发明提供对哺乳动物身体进行体内光学成像的方法，所述方法包括使用第一方面的成像剂或第二方面的药物组合物来获得体内cMet过量表达或定位(localisation)的部位的图像。
术语“光学成像”是指任何基于与红色至近红外区域中的光(波长600-1200nm)的相互作用，而形成供进行疾病的检测、分期(staging)或诊断、进行疾病发展的跟踪或者进行疾病治疗的跟踪的图像的方法。光学成像还包括所有不使用任何器械和涉及使用诸如各种观察仪器、导管和光学成像设备(例如断层扫描显示用的计算机辅助硬件)的器械的直接显现方法。模式和测量技术包括但不限于：发光成像；内窥镜检查法；荧光内窥镜检查法；光学相干断层扫描；透射成像；时间分辨透射成像；共焦成像；非线性显微镜检；光声成像；声光学成像；光谱术；反射光谱术；干涉测量术；相干干涉测量术；扩散光学断层扫描和荧光介导扩散光学断层扫描(连续波、时域和频域系统)；以及光散射、吸收、偏振、发光、荧光寿命、量子产额和猝灭的测量。这些技术的更多细节由以下文献提供：(Tuan Vo-Dinh(编辑)：“Biomedical Photonics Handbook”(2003)，CRC Press LCC；Mycek和Pogue(编辑)：“Handbook of Biomedical Fluorescence”(2003)，MarcelDekker，Inc.；Splinter和Hopper：“An Introduction to Biomedical Optics”(2007)，CRC Press LCC。
绿色至近红外区域中的光优选波长为600-1000nm。光学成像方法优选是荧光内窥镜检查法。第五方面的哺乳动物身体优选是人身体。成像剂的优选实施方案如对第一方面(上文)所述。具体的说，优选的是采用荧光染料。
在第五方面的方法中，成像剂或药物组合物优选地预先给予了所述哺乳动物身体。所谓“预先给予”是指在成像前已经进行了涉及临床医生的步骤，其中成像剂被例如作为静脉注射剂给予患者。这个实施方案包括使用第一实施方案的成像剂来制造用于对涉及cMet的哺乳动物身体疾病状态进行体内诊断成像的诊断剂。
第五方面的优选光学成像方法是荧光反射成像(FRI)。在FRI中，将本发明的成像剂给予待诊断的受试对象，随后用激发光——通常是连续波(CW)激发——对受试对象的组织表面进行照射。光使报道分子(IM)激发。用荧光检测器检测来自成像剂的由激发光产生的荧光。优选将返回的光过滤，以分离出荧光分量(fluorescence component)(单独地或部分地)。从荧光形成图像。通常进行最小限度的处理(不用处理器来计算光学参数如寿命、量子产额等)，图像反映出荧光强度。成像剂被设计成在疾病区域聚集，从而产生更高的荧光强度。因此，疾病区域在荧光强度图像中产生正反差。图像优选用CCD相机或芯片获取，使得有可能进行实时成像。
激发用的波长随所用的染料类型而变。用于产生激发光的设备可以是常规的激发光源如：激光器(例如离子激光器、染料激光器或半导体激光器)；卤素光源或氙光源。可任选使用各种光学过滤器来获得最佳激发波长。
优选的FRI方法包括以下步骤：
(i)用激发光照射哺乳动物身体中的目的组织表面；
(ii)用荧光检测器检测通过成像部分(IM)的激发产生的、来自成像剂的荧光；
(iii)任选将荧光检测器检测到的光进行过滤，以分离出荧光分量；
(iv)从步骤(ii)或(iii)的荧光形成所述目的组织表面的图像。
在步骤(i)中，激发光优选性质上为连续波(CW)。在步骤(iii)中，检测到的光优选进行过滤。尤其优选的FRI方法是荧光内窥镜检查法。
第五方面的另选成像方法使用的是FDPM(频域光子迁移)。这在重要的是IM在组织当中的检测深度更深的情况中，比连续波(CW)方法更具优势[Sevick-Muraca等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，6，642-650(2002)]。对于这种频域/时域成像，如果IM具有能根据要成像的损害处的组织深度和所采用的仪器的类型进行调整的荧光性质，则是有利的。
FDPM方法如下：
(a)使所述哺乳动物身体的具有不均匀组成的光散射生物组织暴露于来自光源的具有预定时间变动强度(time varying intensity)的光以激发成像剂，组织将激发光多次散射；
(b)检测因响应所述暴露从组织发出的多次散射光发射；
(c)通过用处理器建立多个数值，从所述发射定量所述组织各处的荧光特性，所述数值各自对应于所述组织当中不同位置的荧光特性水平，而荧光特性水平随组织的不均匀组成而异；和
(d)通过根据步骤(c)的数值将组织的不均匀组成进行作图，产生出所述组织的图像。
步骤(c)的荧光特性优选对应于成像剂的吸收，且优选还包括在给予成像剂前先将多个对应于所述组织的吸附和散射系数的数量进行作图。步骤(c)的荧光特性优选对应于荧光寿命、荧光量子效率、荧光产额和成像剂吸收中的至少一个。荧光特性优选独立于发射强度和独立于成像剂浓度。
步骤(c)的定量优选包括：(i)建立所述数值的估计量，(ii)确定计算发射量作为估计量的函数，(iii)将计算发射量与所述检测的发射量进行比较，以确定误差，(iv)提供荧光特性的修正估计量作为误差的函数。定量优选包括从模拟组织的多次光散射行为的数学关系来确定所述数值。第一选项的方法优选还包括通过检测所述荧光特性的变化来监测所述组织的体内代谢性质。
第五方面的光学成像优选用来帮助促进结肠直肠癌(CRC)的管理。术语“CRC的管理”是指在以下方面的用途：疾病进展的检测、分期、诊断、监测或者治疗的监测。Sevick-Muraca等人[Curr.Opin.Chem.Biol.，6，642-650(2002)]综述了合适的光学成像方法的更多细节。
在第六方面，本发明提供对哺乳动物身体的结肠直肠癌(CRC)的疾病进展进行检测、分期、诊断、监测或者对疾病治疗进行监测的方法，所述方法包括第五方面的体内光学成像方法。
下文详述的非限制性实施例对本发明进行说明。实施例1提供本发明的cMBP肽(化合物1)的合成。实施例2提供作为阴性对照的相关肽的合成，在所述相关肽中化合物1的肽序列被搅乱(scrambled)。实施例3提供本发明的优选染料即花菁染料Cy5**的合成。实施例4提供Cy5**的活性酯的合成。实施例5提供本发明的花菁染料与肽(cMBP肽和对照)的缀合。化合物3-7以这种方式进行比较。实施例6提供体外测定肽与cMet的亲和力的方法。结果显示结合是选择性的，即使当连接有光学报道分子成像部分(花菁染料)时也是如此。实施例7提供化合物5和7在癌症的动物模型中的体内试验的数据。化合物5可见较高的肿瘤：背景比，而化合物7(阴性对照)不能区分肿瘤和背景。
缩写
使用常规的单字母或三字母氨基酸缩写。
Acm：乙酰胺基甲基
ACN(或MeCN)：乙腈
Boc：叔丁氧基羰基
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲亚砜
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
HBTU：O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HPLC：高效液相色谱法
HSPyU：O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四亚甲基脲鎓六氟磷酸盐
NHS：N-羟基-琥珀酰亚胺
NMM：N-甲基吗啉
NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS：磷酸缓冲盐水
tBu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
Trt：三苯甲基
表2：本发明的化合物的结构。
实施例1：化合物1的合成
步骤(a)：受保护的前体线性肽的合成
前体线性肽具有以下结构：
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2
在Applied Biosystems 433A肽合成仪上，采用Fmoc化学法从0.1mmol Rink Amide Novagel树脂出发，装配肽基树脂H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψMe，Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物。在各偶联步骤中应用过量的1mmol预活化氨基酸(使用HBTU)。将Glu-Thr假脯氨酸(Novabiochem 05-20-1122)掺入在序列中。将树脂转移到氮气鼓泡设备，用乙酸酐(1mmol)和NMM(1mmol)溶于DCM(5mL)的溶液处理60分钟。过滤去除酸酐溶液，将树脂用DCM洗涤，在氮气流下干燥。
在含有2.5％TIS、2.5％4-硫甲酚和2.5％水的TFA(10mL)中，同时进行侧链保护基的去除和肽从树脂的切割达2小时30分钟。过滤移取树脂，真空去除TFA，向残余物加入二乙醚。所形成的沉淀物用二乙醚洗涤，风干，得到264mg的粗肽。
用制备型HPLC纯化粗肽(梯度：20-30％B，40min，其中A＝H2O/0.1％TFA和B＝ACN/0.1％TFA，流速：10mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：30min)，得到100mg的纯化合物1线性前体。用分析型HPLC分析该纯产物(梯度：10-40％B，10min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱子：PhenomenexLuna 3μC18(2)50x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1464.6，MH2 2+实测值1465.1)。
步骤(b)：单环Cys4-16二硫键的形成
Cys4-16；
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。
将得自步骤(a)的线性前体(100mg)溶于5％DMSO/水(200mL)中，用氨将溶液调至pH 6。将反应混合物搅拌5天。然后用TFA将溶液调至pH 2，真空蒸发除去大部分的溶剂。将残余物(40mL)分批注射到制备型HPLC柱上，进行产物纯化。
用制备型HPLC纯化残余物(梯度：0％B，10min，然后0-40％B，40min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：10mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：44min)，得到72mg的纯化合物1单环前体。
用分析型HPLC分析该纯产物(作为异构体P1至P3的混合物)(梯度：10-40％B，10min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱子：Phenomenex Luna 3μC18(2)50x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：5.37min(P1)；5.61min(P2)；6.05min(P3))。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1463.6，MH2 2+实测值：1464.1(P1)；1464.4(P2)；1464.3(P3))。
步骤(c)：第二Cys6-14二硫键的形成(化合物1)
将得自步骤(b)的单环前体(72mg)在氮气保护下溶于75％AcOH/水(72mL)。依次加入1M HCl(7.2mL)和0.05M I2的AcOH(4.8mL)溶液，将混合物搅拌45分钟。加入1M抗坏血酸(1mL)，产生无色混合物。真空蒸发掉大部分的溶剂，用水/0.1％TFA(4mL)稀释残余物(18mL)，用制备型HPLC纯化产物。
用制备型HPLC纯化残余物(梯度：0％B，10min，然后20-30％B，40min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：10mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：43-53min)，得到52mg的纯化合物1。用分析型HPLC分析该纯产物(梯度：10-40％B，10min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱子：Phenomenex Luna 3μC18(2)50x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1391.5，MH2 2+实测值：1392.5)。
实施例2：化合物2的合成
Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2
化合物2是阴性对照，其中化合物1的肽序列已被搅乱。
步骤(a)：受保护的前体线性肽的合成
在Applied Biosystems 433A肽合成仪上，采用Fmoc化学法从0.1mmol Rink Amide Novagel树脂出发，装配肽基树脂H-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Pro-Tyr(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(ψMe，Mepro)-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物。在各偶联步骤中应用过量的1mmol预活化氨基酸(使用HBTU)。将Tyr-Ser假脯氨酸(Novabiochem 05-20-1014)掺入在序列中。将树脂转移到氮气鼓泡设备，用乙酸酐(1mmol)和NMM(1mmol)溶于DCM(5mL)的溶液处理60分钟。过滤去除酸酐溶液，将树脂用DCM洗涤，在氮气流下干燥。
在含有2.5％TIS、2.5％4-硫甲酚和2.5％水的TFA(10mL)中，同时进行侧链保护基的去除和肽从树脂的切割达2小时10分钟。过滤移取树脂，真空去除TFA，向残余物加入二乙醚。所形成的沉淀物用二乙醚洗涤，风干，得到216mg的粗肽。
用制备型HPLC纯化粗肽(梯度：20-30％B，40min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：50mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 50mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：34.1min)，得到纯的DX-1662阴性对照线性前体，溶于200mL的ACN/水中。用分析型HPLC分析该纯产物(梯度：10-40％B，5min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.6mL/min，柱子：Phenomenex Luna 3μC18(2)20x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：3.52min)。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1464.6，MH2 2+实测值：1464.9)。
步骤(b)：单环Cys4-16二硫键的形成
Cys4-16；
Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2
将DMSO(10mL)加到得自步骤(a)的阴性对照线性前体溶液(200mL，参见4.3.1)，用氨将溶液调至pH7。将反应混合物在40℃下加热18小时，然后在60℃下加热60分钟。然后用TFA将溶液调至pH 2，真空蒸发除去ACN。将残余物进行制备型HPLC纯化。
用制备型HPLC纯化残余物(梯度：0％B，5min，然后20-30％B，60min，其中A＝H2O/0.1％TFA和B＝ACN/0.1％TFA，流速：50mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 50mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：29.6min)，得到纯的阴性对照单元前体在100mL的ACN/水中的溶液。用分析型HPLC分析该纯产物(梯度：10-40％B，5min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.6mL/min，柱子：Phenomenex Luna 3μC18(2)20x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：3.46min)。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1463.6，MH2 2+实测值：1463.7)。
步骤(c)：第二Cys6-14二硫键的形成(化合物2)
Cys4-16， 6-14；
Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。
用AcOH(100mL)稀释得自步骤(b)的阴性对照单环前体溶液(100mL)。在氩气保护下依次加入1M HCl(5mL)和0.05M I2的AcOH溶液(7mL)，将混合物搅拌20分钟。加入1M抗坏血酸(1mL)，产生无色混合物。真空蒸发掉大部分的溶剂，用水/0.1％TFA(100mL)稀释残余物(30mL)，用制备型HPLC纯化产物。
用制备型HPLC纯化残余物(梯度：0％B，10min，然后20-30％B，60min，其中A＝H2O/0.1％TFA和B＝ACN/0.1％TFA，流速：50mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 50mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：32.8min)，得到30mg的纯化合物2。用分析型HPLC分析该纯产物(梯度：10-40％B，10min，其中A＝H2O/0.1％TFA，B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱子：Phenomenex Luna 3μC18(2)50x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1391.5，MH2 2+实测值：1392.5)。
实施例3：花菁染料2-{[1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-磺
基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-1，3-双(4-磺基丁
基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(Cy5**)的合成
Cy5**
(3a)5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸
在冰浴冷却下，将2-甲基乙酰乙酸乙酯(50g)于DMF(25ml)的溶液在1小时内滴加到氢化钠(12.0g的60％NaH于矿物油中)于DMF(100ml)的悬浮液，(内部温度0-4℃)。将此混合物搅拌45分钟让其升温到环境温度，然后再次冷却。然后在15分钟内滴加1，4-丁烷磺内酯(45g)于DMF(25ml)的溶液。将最终混合物在60℃下加热18小时。旋转蒸发除去溶剂，残余物在水和二乙醚之间分配。收集含水层，用新鲜的二乙醚洗涤，旋转蒸发得到粘稠泡沫。将此中间体溶于水(100ml)中，搅拌下15分钟内加入氢氧化钠(17.8g)。将混合物在90℃下加热18小时。加入浓盐酸(～40ml)将冷却的反应混合物调至～pH2。将溶液在真空下旋转蒸发和干燥。用含有2％盐酸的乙醇(3x150ml)洗涤黄色固体。将乙醇溶液过滤，在真空下旋转蒸发和干燥，得到黄色固体。收率70g。
(3b)2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸，二钾盐
将4-肼基苯磺酸(40g)、5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸(得自3a；60g)和乙酸(500ml)混合并回流加热6小时。将溶剂过滤，在真空下旋转蒸发和干燥。固体溶于甲醇(1L)中。向其中加入2M氢氧化钾的甲醇溶液(300ml)。将所得混合物搅拌3小时，然后用旋转蒸发将溶剂体积减少50％。将所得的沉淀物过滤，用甲醇洗涤，真空干燥。收率60g。MS(LCMS)：MH+362。实测准确质量：362.0729。MH+＝C14H20NO6S2要求m/z 362.0732(-0.8ppm)。
(3c)2，3-二甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐，二钾盐
将2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸(得自3b；60g)与1，4丁烷磺内酯(180g)和四亚甲基砜(146ml)一起在140℃下加热16小时。将所得的红色固体用二乙醚洗涤，研磨成粉末，真空干燥。收率60g。
(3d)Cy5**，作为TFA盐
将1-(5′-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-吲哚鎓溴(indolenium bromide)-5-磺酸K+盐(2.7g)、丙二醛双苯亚胺单盐酸盐(960mg)、乙酸酐(36ml)和乙酸(18ml)在120℃下加热1小时，产生深棕红色溶液。将此反应混合物冷却至环境温度。向混合物加入2，3-二甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(得自3c；8.1g)和乙酸钾(4.5g)，在环境温度下搅拌18小时。所得的蓝色溶液用乙酸乙酯沉淀，真空干燥。粗染料用液相色谱纯化(RPC18.水+0.1％TFA/MeCN+0.1％TFA梯度)。收集含有主要染料峰的流份，合并在一起，真空干燥，得到标题染料2g。UV/Vis(水+0.1％TFA)：650nm。MS(MALDI-TOF)：MH+887.1。MH+＝C38H50N2O14S4要求m/z 887.1。
实施例4：2-[(1E，3E，5E)-5-(1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧
代己基}-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯
基]-3-甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐，二异丙基乙胺盐
(Cy5＊＊的NHS酯)的合成
将Cy5**(实施例3；10mg)溶于无水DMSO(3ml)中，向其中加入HSPyU(20mg)和N，N′-二异丙基乙胺(80μl)。将所得的溶液混合3小时，此时TLC(RPC18.水/MeCN)揭示反应完成。所得染料在乙酸乙酯/二乙醚中进行沉淀分离，过滤，用乙酸乙酯洗涤，真空干燥。UV/Vis(水)650nm。MS(MALDI-TOF)MH+983.5。MH+＝C42H53N3O16S4要求m/z 984.16。
实施例5：染料的缀合，化合物3-7的合成
Cys4-16， 6-14；
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(Cy5)-NH2(化合物3)。
将化合物1(10mg)、NMM(4μL)和Cy5NHS酯(5.7mg；GEHealthcare PA15104)溶于NMP(1mL)中，搅拌此反应混合物7小时。然后用5％ACN/水(8mL)稀释反应混合物，用制备型HPLC纯化产物。
用制备型HPLC纯化粗肽(梯度：5-50％B，40min，其中A＝H2O/0.1％HCOOH，B＝ACN/0.1％HCOOH，流速：10mL/min，柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2)250x 21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：35.5min)，得到8.1mg的纯化合物3。用分析型HPLC分析该纯产物(梯度：5-50％B，10min，其中A＝H2O/0.1％HCOOH和B＝ACN/0.1％HCOOH，流速：0.3mL/min，柱子：Phenomenex Luna3μC18(2)50x 2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：8.15min)。用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 2+计算值：1710.6，MH2 2+实测值：1711.0)。
化合物4按相似方式制备——电喷雾质谱(MH2 2+计算值：1710.6，MH2 2+实测值：1710.9)。
其他的染料-肽缀合物(化合物5-7)通过类似的方法制备。Alexa647购自Molecular Probes(A20106)：
化合物5(MH2 2+计算值：1825.7，MH2 2+实测值：1825.9)，
化合物6(MH2 2+计算值：1811.7，MH2 2+实测值：1812.0)，
化合物7(MH2 2+计算值：1825.7，MH2 2+实测值：1826.2)。
实施例6：体外荧光偏振测定
荧光偏振方法的原理可简单描述如下：
单色光通过水平偏振滤光器，激发样品中的荧光分子。只有那些正确取向在垂直偏振平面的分子会吸收光而受到激发，并随后发射光线。发射光在水平平面和垂直平面上都进行测量。各向异性值(A)是根据以下方程所得的光强度之间的比例。
荧光各向异性测量是在384孔微量滴定板中，在结合缓冲液(PBS，0.01％Tween-20，pH 7.5)中，以10μL的体积，用Tecan Safire荧光偏振读板器(Tecan，美国)在激发646nm/发射678nm下进行。染料标记的肽的浓度保持恒定(20nM)，人或小鼠c-Met/Fc嵌合体(R&D Systems)或脑信号蛋白6A(R&D Systems)的浓度在0-150nM的范围变化。将结合混合物在微量培养板中30℃下平衡10分钟。将所观察到的各向异性的变化拟合于以下方程
其中robs为所观察到的各向异性，rfree为游离肽的各向异性，rbound为结合的肽的各向异性，KD为解离常数，cMet为总c-Met浓度，P为总染料标记肽浓度。该方程假定合成的肽和受体以1∶1化学计量在溶液中形成可逆复合物。数据拟合用GraphPad Prism软件通过非线性回归进行，以获得KD值(一位点结合)。
测试化合物3和4结合人和小鼠c-Met(Fc嵌合体)的情况。结果显示化合物3与人c-Met结合的KD为3+/-1nM。化合物4与人c-Met无结合。此外，化合物3和4显示在试验范围内没有结合小鼠c-Met。使用相同的方法，发现化合物5对人cMet的KD为1.1nM。
实施例7：化合物5和7的体内试验
(a)动物模型
本研究中用到54只雌性BALB c/A裸(Bom)小鼠。动物的使用得到地方伦理委员会的批准。BALB c/A裸鼠为近交无免疫应答的小鼠品系，与其他裸鼠品系相比对人肿瘤有高接受率。小鼠到来时为4周龄，在研究开始时体重大约20克。将动物关在用HEPA过滤空气单独通风的笼子(IVC，Scanbur BK)中。动物能随意获取“Rat and Mousenr.3Breeding”食物(Scanbur BK)和自来水，自来水通过加HCL至1mM的摩尔浓度酸化(pH 3.0)。结肠癌细胞HCT-15衍自人结肠癌，根据Zeng等人[Clin.Exp.Metastasis，21，409-417.(2004)]的报道能表达c-Met。该细胞系当皮下接种到裸鼠中时证明具有致瘤性[Flatmark等人，Eur.J.Cancer 40，1593-1598(2004)]。
生长和制备HCT-15细胞，以供在含有10％血清和青霉素/链霉素的RPMI(Sigma目录号R0883)中进行皮下接种。在传代数为四时(P4)制备原种(stock)，在含有5％DMSO的培养基中以3x107个细胞/小瓶的密度在液氮中冷冻保存。在移植的当天，将细胞在37℃水浴中快速解冻(大约2分钟)，洗涤并重悬于PBS/2％血清中(在1200rpm下离心10分钟)。每次细胞被吸入到给药注射器中时，就确保了小瓶中的细胞的彻底混合。在动物处于轻度气体麻醉下，用细孔针(25G)将0.1ml体积的细胞悬浮液皮下注射在肩部和背部。然后将动物送回笼子中，让肿瘤生长13-17天。在进行接种程序前，让动物有至少5天的适应期。
(b)程序
所有试验物质都用PBS从冷冻干燥粉末复溶。对一小叠白色打印纸进行成像以获得平场图像(flat field image)，其用来校正照射不均匀性。在物理固定过程中将试验物质静脉内注射在侧尾静脉中。注射体积为0.1ml，对应于每只动物1nmol试验物质的剂量。注射后将动物送回笼子。在临成像前通过颈椎脱位将动物处死。每种试验物质的最佳成像时间点，根据在有限数目的动物(n＝1-6)中在皮肤和肌肉组织中的洗出速率的比较进行估计。化合物3和4的成像时间点为注射后120分钟。对于每只动物，在死后切取皮下生长的肿瘤。从其中一个肿瘤的边缘切下大约1.6mm厚和3-4mm直径的切片。然后对比来自同一动物的正常结肠区域对肿瘤切片进行成像。
(c)成像
通过临床腹腔镜进行成像，该腹腔镜经改装能使用光源来激发报道分子和使用滤光系统来提取荧光分量。用635nm激光器激发报道分子。用Hamamatsu ORCA ERG CCD相机作为检测器。该相机以0增益的2x2装仓模式(2x2binning mode with 0gain)操作。结肠成像的标准暴露时间为10秒。系统校准测量表明，动物成像系统的10秒暴露时间对应于临床上相关的光源、视野和距组织表面距离的40微秒暴露。通过系统校准数据对图像中的强度分布进行照射不均匀性的校正。从置于肿瘤和正常结肠背景上的目的区域，计算靶标与背景比。用应用于接收器运行特性分析的标准评分系统，对图像进行目测评分。
(d)结果
化合物5的肿瘤-正常结肠比为1.46∶1，而相应的具有相同染料的经搅乱对照肽(化合物7)该比为1.04∶1。化合物5具有容易鉴别的肿瘤，而用化合物7不能与背景进行区别。
Claims (23)
1.包含式I的缀合物的成像剂：
(I)
其中
Z1连接到cMBP的N末端，且为H或MIG；
Z2连接到cMBP的C末端，且为OH、OBc或MIG，
其中Bc为生物相容性阳离子；
cMBP为包含以下氨基酸序列(SEQ-1)的17-30个氨基酸的cMet结合环肽：
Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6；
其中X1为Asn、His或Tyr；
X2为Gly、Ser、Thr或Asn；
X3为Thr或Arg；
X4为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；
X5为Ser或Thr；
X6为Asp或Glu；
而Cysa-d各自为半胱氨酸残基，使得残基a与b和c与d环化形成两个独立的二硫键；
MIG为代谢抑制基团，其为能抑制或阻碍所述肽的体内代谢的生物相容性基团；
L为式-(A)m-的合成接头基团，其中每个A独立为-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基基团、C4-8环亚烷基基团、C5-12亚芳基基团或C3-12杂亚芳基基团、氨基酸、糖或单分散性聚乙二醇(PEG)结构单元；
每个R独立选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m为1-20的整数；
n为0或1的整数；
IM为适合于用绿色至近红外波长600-1200nm的光对哺乳动物身体进行体内成像的光学报道成像部分。
2.权利要求1的成像剂，其中cMBP除了包含SEQ-1外，还在cMBP肽C或N-末端的4个氨基酸残基内包含Asp残基或Glu残基，且-(L)nIM用胺基团官能化，该胺基团缀合到所述Asp残基或Glu残基的羧基侧链而产生酰胺键。
3.权利要求1或权利要求2的成像剂，其中cMBP除了包含SEQ-1外，还在cMBP肽C或N-末端的4个氨基酸残基内包含Lys残基，且-(L)nIM用羧基基团官能化，该羧基基团缀合到所述Lys残基的ε胺侧链而产生酰胺键。
4.权利要求1-3中任一项的成像剂，其中cMBP包含SEQ-2或SEQ-3的氨基酸序列：
Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6(SEQ-2)；
Ala-Gly-Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr(SEQ-3)。
5.权利要求1的成像剂，其中X3为Arg。
6.权利要求1的成像剂，其中cMBP除了包含SEQ-1、SEQ-2或SEQ-3外，还在N末端或C末端包含选自以下的接头肽：-Gly-Gly-Gly-Lys-(SEQ-4)、-Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5)或-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys-(SEQ-6)。
7.权利要求6的成像剂，其中cMBP具有以下氨基酸序列(SEQ-7)：
Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。
8.权利要求1的成像剂，其中Z1和Z2均独立为MIG。
9.权利要求8的成像剂，其中Z1为乙酰基，Z2为伯酰胺。
10.权利要求1的成像剂，其中n为0。
11.权利要求1的成像剂，其中IM为在600-1000nm范围内具有最大吸光度的染料。
12.权利要求11的成像剂，其中IM为花菁染料。
13.权利要求12的成像剂，其中花菁染料具式III：
其中：
R1和R2独立为H或SO3M1，且R1和R2中至少一个为SO3M1，其中M1为H或Bc；
R3和R4独立为C1-4烷基或C1-6羧基烷基；
R5、R6、R7和R8独立为Ra基团；
其中Ra为C1-4烷基、C1-6羧基烷基或-(CH2)kSO3M1，其中k为数值为3或4的整数；
条件是该花菁染料在R1基团、R2基团和Ra基团中具有总共1-4个SO3M1取代基。
14.权利要求1的成像剂，其中cMBP如权利要求7中所定义，Z1和Z2如权利要求9中所定义，IM如权利要求13中所定义。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-14中任一项的成像剂以及生物相容性载体，为适合于哺乳动物给药的形式。
16.权利要求15的药物组合物，所述药物组合物具有适合于单个患者的剂量，在合适的容器中提供。
17.权利要求16的药物组合物，所述容器为注射器。
18.一种制备权利要求1-14中任一项的成像剂的方法，所述方法包括步骤(i)-(iv)之一：
(i)使其中Z1为H和Z2为MIG的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，与式Y1-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在Z1位置缀合的式I成像剂；
(ii)使其中Z1＝Z2＝MIG，且cMBP在cMBP肽C或N-末端的4个氨基酸残基内包含Asp残基或Glu残基，且cMBP肽的所有其他Asp或Glu残基受到保护的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，与式Y2-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在cMBP肽的所述Asp残基或Glu残基缀合的式I成像剂；
(iii)使其中Z1为MIG，Z3为活化酯或选自OH或OBc的Z2基团，且cMBP肽的Asp或Glu残基受到保护的式Z1-[cMBP]-Z3的cMBP肽，与式Y2-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在Z2位置缀合的式I成像剂；
(iv)使其中Z1＝Z2＝MIG，且cMBP在cMBP肽C或N-末端的4个氨基酸残基内包含Lys残基的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，与式Y1-(L)n-[IM]的化合物反应，得到其中[IM]在cMBP肽的Lys残基缀合的式I成像剂；
其中Z1、cMBP、Z2、MIG、L、n和IM如权利要求1中所定义，和
Z3为Z2基团或活化酯；
Y1为羧酸基团、活化酯基团、异硫氰酸酯基团或硫氰酸酯基团；
Y2为胺基团。
19.权利要求18的方法，其中使用步骤(iv)的反应。
20.一种用于制备权利要求15-17中任一项的药物组合物的药盒，所述药盒包含无菌、固体形式的权利要求1-14中任一项的成像剂，使得当用权利要求15-17中任一项的生物相容性载体的无菌供应品进行复溶时，发生溶解而得到所需的药物组合物。
21.权利要求20的药盒，其中所述无菌、固体形式为冻干固体。
22.权利要求1-14中任一项的成像剂或权利要求15-17中任一项的药物组合物在制备用于获得哺乳动物体内cMet过量表达的部位或cMet定位的图像的体内光学成像剂中的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述体内光学成像剂用来帮助对结肠直肠癌(CRC)的疾病进展进行检测、分期、诊断、监测或者对该疾病的治疗进行监测。
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