CN105111773B - 一类氨基菁类荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类连接环肽cyclo(RGD)的氨基菁类荧光染料及其制备方法和应用，该化合物结构通式如Ⅰ；其由结构单元Ⅱ和III构成；结构单元Ⅱ为衍生的菁染料结构，属于水溶性荧光分子，其光谱具有较大的斯托克斯位移，且对正常细胞毒性较小；结构单元III为αvβ3整合素受体的特定配体的环肽结构，可用于靶向定位。所述的荧光染料具有肿瘤影像诊断与靶向治疗的双功能特性。

Description

一类氨基菁类荧光染料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一类连接环肽cyclo(GD)的氨基菁类荧光染料及其制备方法和应用，该化合物同时具有肿瘤的影像诊断与靶向治疗的双功能。

技术背景

癌症是最迫切的公共卫生问题，并且其统计数字是非常惊人的。未来肿瘤个性化治疗的巨大挑战是探索改进用于病人体内局部的和分散的肿瘤细胞的早期检测方法，这对于癌症的成功治疗以及提高肿瘤病人的生存率是至关重要的。目前，癌症的临床检测和诊断方法主要有磁共振影像，正电子发射断层扫描，计算机断层扫描，X射线，超声等，但它们缺乏特异性和敏感性，也可能造成放射性风险。光学影像方法是一种新兴的用于肿瘤检测的非侵入性的、实时的、高分辨的方法。光信号可以提供生物组织与肿瘤的解剖结构以及与肿瘤代谢和生物化学相关的分子信息。在光学影像技术中，近红外荧光影像的波长范围在700-1000nm，并且生物组织和器官在近红外光谱区的吸收和自发荧光比较低，从而使背景干扰降到最低，改善组织的穿透深度。因此，近红外荧光影像吸引了越来越广泛的关注。

具有良好效果的肿瘤近红外荧光影像需要化学和光物理性质优异的近红外荧光染料。一个理想的近红外影像荧光染料必须满足下面的条件：发射光谱在近红外光谱范围内，具有大斯托克斯位移，摩尔消光系数及量子产率高，在溶剂中、缓冲液及生理条件下的物理化学性质稳定，以及水溶性良好。此外，一个合格的近红外荧光影像染料还应该具有合适的化学官能团允许与其他特异性配体的结合。

目前为止，几种标记RGD环肽的近红外荧光染料如Cy5.5(λ_ex：675nm，λ_em：694nm)，ICG(λ_ex：783nm，λ_em：810nm)，cypate(λ_ex：790nm，λ_em：810nm)已报道用于体内诊断和治疗。这些荧光荧光染料具有改进的受体结合亲和力，增加了对肿瘤靶向的敏感性和特异性，也阐明了构效关系及相关反应机理。但是，它们都是小斯托克斯位移的荧光染料，无法避免诊断影像时因为发生荧光自淬灭和激发光散射引起的荧光检测误差。文献中至今从未报道过具有大斯托克斯位移并且处于近红外区的用于肿瘤诊断影像的荧光染料。

虽然近些年来人们对肿瘤的产生、转移等机理的研究取得了许多进展，但因为早期诊断不够灵敏、特异性好的靶向药物的缺乏以及无法进行实时有效的治疗监测，恶性肿瘤仍然严重威胁着人类的健康与生命。肿瘤诊断治疗学(Tumor theranostics)是最近提出来的一种用于肿瘤诊断与治疗的新方法，其核心是将肿瘤治疗与实时显影有效结合，指导医生不断选择合适的治疗方案，提高肿瘤患者的生存率和生活质量，为肿瘤个体化治疗提供一种新思路。因此合成既具有肿瘤特异显影又能用于靶向治疗作用的诊断治疗剂具有十分重要的意义，目前这种双功能荧光染料还比较少见。

发明内容

本发明的目的在于提供一类用于肿瘤影像诊断与靶向治疗的双功能氨基菁类荧光染料及其制备方法和应用。

本发明所述的氨基菁类荧光染料，其通式如结构式Ⅰ

结构式Ⅰ中包含衍生的菁染料结构单元Ⅱ和αvβ3整合素受体的特定配体的环肽结构单元III；

当n为0时，结构单元Ⅱ和结构单元III直接相连；代表性的例子是氨基菁类染料Cy7-RGD；

当n为1时，结构单元Ⅱ和结构单元III通过连接基团R相连；R为氨基酸结构单元，结构式从上向下-NH(CH₂)_mCO-，m取1～18之间的整数(优选情况下m取5,6)；可以得到不同碳链长度的氨基菁类染料，由于连接链较小，对于两个关键部分结构单元Ⅱ和III的性能几乎没有影响，所以在肿瘤荧光影像诊断和靶向治疗的双功能性能上预计不会有明显差异。代表性的例子是染料Cy7-hex-RGD；

结构单元Ⅱ为衍生的菁染料结构，属于水溶性荧光分子，其光谱具有较大的斯托克斯位移，且对正常细胞毒性较小；结构单元III为αvβ3整合素受体的特定配体的环肽结构，可用于靶向定位。所述的荧光染料由结构单元Ⅱ和III两部分相连后，具有肿瘤影像诊断与靶向治疗的双功能特性。

X为C(CH₃)₂、O、S或Se；

R₁为H或OH；

R₂选自C1-18烷基、苄基或(CH₂)₄SO₃H,(CH₂)₅CO₂H。

荧光染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在冰浴条件下将三氯氧磷用二氯甲烷溶剂稀释0.5-1.5倍的混合液逐滴加入用二氯甲烷溶剂稀释0.5-1.5倍的N,N-二甲基甲酰胺混合液中，三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：1～3，然后再向上述混合液中逐滴加入环已酮，三氯氧磷与环己酮的摩尔比为1：0.2～0.7；反应液加热到回流，反应3-5h，反应液倒入用大量碎冰沉淀，过滤，获得中间体A；

优选的情况下：三氯氧磷和二氯甲烷的体积比1：1；二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺以体积比1:1混合；三氯氧磷,N,N-二甲基甲酰胺与环己酮的摩尔比为1：1.28:0.25。

2)按摩尔比1:1～2加入原料化合物苯并杂环磺酸化合物和氢氧化钾，再加入以体积比1:1～2混合的甲醇：异丙醇混合液；然后进行回流反应，将反应液过滤得黄色固体并干燥，将所得干燥产物和过量含R₂基团的烷基化试剂在加热条件下回流5～20h，冷却后析出中间体B；

优选的情况下：原料化合物苯并杂环磺酸化合物和氢氧化钾按摩尔比1:1.5加入；甲醇：异丙醇以体积比1:1混合；优选的回流时间为12h；

3)反应瓶中按照摩尔比1:2～3加入中间体A和季铵盐中间体B，再加入以体积比1:2～3混合的甲苯：正丁醇混合液，经甲苯分水，在氮气保护下回流后，去除反应溶剂、溶解、析出、过滤、重结晶后得到Cy7；

优选的情况下：中间体A和季铵盐中间体B以摩尔比1:2加入；甲苯：正丁醇以摩尔比3:7混合；

4)按1:0.5～3:1～10的摩尔比向反应瓶中依次加入Cy7、环肽cyclo(RGD)、Na₂CO₃，再加入无水DMF，于50℃、氮气保护下反应后，反应液经析出、过滤和提纯后获得通式I中n＝0时的化合物；

优选的情况下：Cy7、环肽cyclo(RGD)、Na₂CO₃的摩尔比为1:1:1；

5)反应瓶中以摩尔比1:1～10加入Cy7和过量的氨基化合物RNH₂，再加入无水DMF、氮气保护下反应结束后，反应液经析出、过滤、提纯得到Cy7-NH-R；

优选的情况下：以摩尔比1:3加入Cy7和过量的氨基化合物RNH₂；

6)按摩尔比1:1～2称取Cy7-NH-R和1,1'-羰基二咪唑，再加入无水DMF，于40℃、氮气保护下，搅拌3～45分钟后，降至室温加入环肽cyclo(RGD)，Cy7-NH-R与环肽cyclo(RGD)摩尔比1:0.5～3，继续搅拌反应1～5小时后，将反应液经析出、过滤、提纯后获得通式I中n＝1时的化合物；

优选的情况下：按摩尔比1:1.6称取Cy7-NH-R和1,1'-羰基二咪唑；搅拌时间优选为5分钟；加入环肽cyclo(RGD)与Cy7-NH-R摩尔比1：1；

本发明的另一方面在于保护上述的氨基菁类荧光染料在制备肿瘤细胞诊断或治疗药物中的应用，尤其是具有对神经胶质瘤细胞的特异靶向诊断和特异性毒性方面的应用。

本发明的氨基菁类荧光染料的具有以下三点独特表现。一是在分子结构上，环肽cyclo(RGD)连接在近红外菁染料的甲川链的中间位置，并且连接位点是独特的亚胺结构，这种结构赋予分子一定的水溶性。二是光谱性能上，中间亚胺结构赋予染料在光谱上有独特的大斯托克斯位移性能，具体说，代表性染料Cy7-RGD在PBS缓冲溶液中的斯托克斯位移到达137nm。这个大斯托克斯位移性能，使得染料应用性能大幅提升，表现为荧光信号有效避开激发光干扰，更少的生物样品自发荧光信号的背景干扰等。三是生物性能上，这类结构和光谱独特的氨基菁类染料，一方面仍然具有单纯环肽cyclo(RGD)一样的结合特异性，可以靶标结合αvβ3整合素受体，从而实现对于神经胶质瘤细胞的特异性诊断。另一方面，这种中间位点连接方式，增加了染料对αvβ3整合素受体过度表达的肿瘤细胞(如神经胶质瘤细胞)的毒性。例如代表性染料Cy7-RGD对神经胶质瘤细胞U87MG的IC50值为8.0μM。这个结果说明这种新型染料具有对神经胶质瘤细胞的特异靶向诊断和特异性毒性的双重功能。

附图说明

图1为实施例1合成的Cy7-RGD的质谱表征图。

图2、图3、图4、图5为实施例3中Cy7-RGD与参比化合物Cy7-hex的在乙醇和在PBS缓冲溶液中的吸收和发射光谱图。

图6、图7为实施例4中αvβ3整合素受体结合实验的细胞图。其中图6为Cy7-RGD(4μM)对U87MG和MCF-7细胞染色时的荧光共聚焦图像，a,b,c为U87MG细胞，d,e,f为MCF-7细胞。而图7为Cy7-Hex(4μM)对U87MG和MCF-7细胞染色时的荧光共聚焦图像，a,b,c为U87MG细胞，d,e,f为MCF-7细胞；

图8是实施例4中αvβ3整合素受体阻断实验的细胞图。其中a,b,c为Cy7-RGD(4μM)与RGD(2μM)共同培养U87MG细胞时的荧光共聚焦图像，d,e,f为Cy7-Hex(4μM)与RGD(2μM)共同培养U87MG细胞时的荧光共聚焦图像；

图9、图10、图11为实施例5中细胞毒性实验结果，分别做了对人恶性胶质瘤细胞U87MG、人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞系L-O2的毒性实验。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下述实施例中，如无特殊说明，所用试剂和生物材料均可由常规方法制备或由商业途径购买；人恶性胶质瘤细胞U87MG、人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞系L-O2以及其他生物材料均可以由商业途径获得。cyclo(RGD)可以商业途径购买。

实施例1 Cy7-RGD与Cy7-hex-RGD的合成

1)缩合剂2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯的合成，在冰浴(0-5℃)下，向250mL的圆底烧瓶中加入40mL DMF和40mL二氯甲烷，将37mL的三氯氧磷溶解于37mL二氯甲烷中，用恒压滴液漏斗逐滴滴入反应烧瓶中，大约用时1小时。然后在常温下搅拌1小时，最后加入10g环己酮，回流反应3小时。反应完全后，将得到的反应混合物倒入大量的冰水中，保存在冰箱(4℃)中。静置过夜后，析出大量固体，将其进行抽滤得黄色粗产品15g，粗收率为85.7％。该产品无需进行提纯就可用于下一个中间体的合成。

2)N-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸季铵盐的合成，依次向250mL单口烧瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐30g(0.13mol)，KOH 10.5g(0.19mol)，甲醇30mL，异丙醇30mL，回流进行反应，反应结束后，将反应液过滤后得到的固体产物为黄色，将此黄色固体真空干燥可得中间体2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾34.2g，收率为95％。

将2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾16.5g(0.06mol)和60mL碘乙烷在加热条件下进行反应，反应液回流12小时后停止反应。反应液冷却后析出固体，用吸管吸走上层液体，得到的产物为淡紫色。将此产物用丙酮研磨以除去残余的溶剂，产品经真空干燥后称得质量为18g，收率为84.9％。

3)母体染料Cy7的合成，在250mL两口烧瓶中加入9g磺酸吲哚季铵盐和2.95g2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯，再加入甲苯：正丁醇(3:7)混合液180mL，加上含有适量甲苯的分水器，反应在氮气保护条件下回流，反应液颜色逐渐变绿。反应结束后，将反应溶剂减压蒸馏除去，然后用少量甲醇溶解剩余固体并将其加入大量冰乙醚中，析出大量的绿色固体，用G6砂芯漏斗过滤得到大量绿色固体。将此绿色固体干燥后用水进行两次重结晶，得到纯的母体染料Cy7。

4)荧光染料Cy7-RGD的合成，称取Cy7 33.5mg(0.05mmol)，cyclo(RGD)31.0mg(0.05mmol)，Na₂CO₃5.3mg(0.05mmol)加入到25mL的两口烧瓶中，再加入1mL的无水DMF，设置温度为50℃，氮气保护条件下进行反应。点板监测反应，反应结束后，将反应液加入冰冷的乙醚中，有大量蓝色固体析出，用G6砂芯漏斗进行过滤，得到粗产品。将得到的粗产品用高效液相色谱进行提纯。

5)参比化合物Cy7-hex的合成，称取Cy7 67.0mg(0.1mmol)和6-氨基己酸39.35mg(0.3mmol)加入到25mL两口烧瓶中后再加入3mL无水DMF，N2保护条件下反应，设置温度为50℃。点板监测反应。反应结束后，将反应液加入冰冷的乙醚中，有大量蓝色固体产生。用G6砂芯漏斗进行过滤，得到粗产品。将得到的粗产品用高效液相色谱进行提纯。

6)Cy7-hex-RGD的合成，称取Cy7-hex 76.6mg(0.1mmol)和1,1'-羰基二咪唑25.9mg(0.16mmol)(投料摩尔比1:1.6)加入到反应瓶中后，再加入2mL无水DMF，氮气保护条件下反应，设置温度为40℃，搅拌反应5分钟后，降温至室温加入环肽cyclo(RGD)62.0mg(0.1mmol)，继续搅拌反应2小时。反应结束后，将反应液加入冰冷的乙醚中，有大量蓝色固体产生。用G6砂芯漏斗进行过滤，得到粗产品。将得到的粗产品用高效液相色谱进行提纯。

实施例2 Cy7-RGD、Cy7-hex-RGD以及参比化合物Cy7-hex的提纯

由于合成的荧光染料Cy7-RGD、Cy7-hex-RGD及其参比化合物Cy7-hex的极性都比较大，并具有较好的水溶性，用普通的正相硅胶色谱无法达到分离提纯的目的，因此选用反向C18硅胶柱对荧光染料及其参比化合物的纯化条件进行优化进行提纯，选用的洗脱剂为水与甲醇。本实施例中给出代表性染料Cy7-RGD提纯时洗脱剂组分甲醇的线性梯度表，如下表1所示。

表1 分离提纯Cy7-RGD时的线性梯度

这类染料较好的水溶性，提升了其生物学应用性能，为静脉给药方式提供了可能。

实施例3 荧光染料及其参比化合物的光谱测试

本发明中所用的所有染料在使用前均经过真空干燥箱过夜烘干，在冷却过程中使用真空油泵保证染料在真空状态下冷却，避免了冷却过程中染料接触到空气中的水蒸气。需要保持干燥的玻璃容器在使用前使用烘箱烘干过夜。

本发明中所用染料母液的配置方法如下(以Cy7-RGD为例)：将12.54mg荧光染料Cy7-RGD加入到10mL的棕色容量瓶中，并将其用少量无水DMSO超声溶解，使荧光染料均匀混合，然后用无水DMSO将溶液定容至标线。母液配置完成后，将装有母液的容量瓶密封并放在冰箱中4℃冷藏保存。本发明中使用的母液浓度均为1mM。光谱及光稳定性测试中使用石英材质的比色皿。

Cy7-RGD的光谱测试方法：使用微量进样器准确量取完全融化后的Cy7-RGD的母液5μL，加入到含有2mL乙醇的比色皿中，配成浓度为2.5μM的测试溶液测定其紫外光谱。利用吸收光谱的最大吸收波长作为发射光谱的激发波长，测定其发射光谱。为了使测到的数据更符合细胞测试时的环境，将乙醇换成PBS(pH＝7.4)用上面相同的方法测得Cy7-RGD在PBS中的荧光及发射光谱。Cy7-hex-RGD以及参比化合物Cy7-hex的测试方法与Cy7-RGD的相同。

图2，图3，图4，图5为实施例1合成的Cy7-RGD与参比化合物Cy7-hex的在乙醇和PBS溶液中的吸收和发射光谱图。

Cy7-RGD在乙醇中的最大吸收波长与最大发射波长分别为630nm和741nm，斯托克斯位移达到111nm；在PBS(PH＝7.4)中的最大吸收波长与最大发射波长分别为617nm和754nm，斯托克斯位移达到137nm。而其参比化合物Cy7-hex在乙醇中的最大吸收波长与最大发射波长分别为625nm和743nm，斯托克斯位移达到118nm；在PBS(PH＝7.4)中的最大吸收波长与最大发射波长分别为608nm和756nm，斯托克斯位移达到148nm。Cy7-RGD与Cy7-hex在乙醇和PBS的光谱性质基本相似。

上述光谱数据结构表明，氨基菁类染料只要分子结构的中间连接位置保留亚胺结构，染料就具有独特的大斯托克斯位移性能。即具有通式I结构的染料都会具有这种大斯托克斯位移的光谱性能，从而获得更好的应用性能。

实施例4 细胞影像实验——肿瘤细胞的荧光检测

1)αvβ3整合素受体结合实验

为了证明Cy7-RGD可以作为一个αvβ3整合素受体的特定配体，本发明使用U87MG与MCF-7细胞进行荧光影像。首先将U87MG与MCF-7细胞在细胞完全培养基中培养。传代时，将细胞被种植在直径为35mm的共聚焦激光皿上，培养24h，培养基的体积为1mL。准确移取4μL1mmol的Cy7-RGD分子母液加入到共聚焦培养皿中，使培养液中Cy7-RGD浓度为4μM。然后轻轻晃动培养皿使Cy7-RGD分散均匀，将培养皿放入培养箱中继续培养10h，然后将细胞用PBS(pH＝7.4)漂洗3次，并加入1mL新鲜培养液，使用OLYMPUS FV-1000共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行荧光影像。用635nm通道激发，收集650～750nm的荧光，得到明场图和荧光图，用油镜(60×)观察。Cy7-hex-RGD以及参比化合物Cy7-hex的影像方法与Cy7-RGD完全相同。

图6，图7为实施例4中αvβ3整合素受体结合实验的细胞图。可以看出，Cy7-RGD能聚集到大量表达整合素αvβ3的人恶性胶质瘤细胞U87MG细胞中，而在MCF-7细胞却几乎不聚集。其参比化合物Cy7-hex在U87MG细胞和MCF-7细胞中都不聚集。分析原因是因为Cy7-RGD能与U87MG细胞上的整合素αvβ3结合，从而通过內吞作用进入到细胞内。

2)阻断实验

为了验证靶向过程的特异性，本发明进行了阻断试验。首先分别向U87MG和MCF-7细胞中加入2μL 1mmol的cyclo(RGD)母液与4μL 1mmol的Cy7-RGD母液共同培养10h。然后用预热过的PBS(pH＝7.4)漂洗细胞3次，再加入细胞培养基，使用OLYMPUS FV-1000共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态进行荧光影像。用635nm通道激发，收集650～750nm的荧光，得到白光和荧光图像，用油镜(60×)观察。

图8是实施例4中阻断实验的细胞图。只用Cy7-RGD对U87MG细胞进行培养时，细胞共聚焦图像显示出很强的荧光。而当Cy7-RGD与cyclo(RGD)共同培养U87MG细胞时，细胞共聚焦图像却基本不显示荧光。对于参比化合物Cy7-hex，是否加入cyclo(RGD)对其细胞共聚焦图像的结果不产生影响。由此进一步证明Cy7-RGD是通过其结构中的cyclo(RGD)部分与细胞表面的整合素αvβ3结合从而进入细胞内，而单纯的cyclo(RGD)的加入阻碍了其与整合素αvβ3的结合。

上述结合实验结果，有力说明了母体染料Cy7中间位置连接环肽cyclo(RGD)后，新染料Cy7-RGD具备了与环肽cyclo(RGD)一样的定位结合功能。而阻断实验进一步表明结合位点与cyclo(RGD)一样，都是整合素αvβ3。这个实验结果表明，本发明的中间位置连接环肽cyclo(RGD)的氨基菁类染料具有非常好的对神经胶质瘤细胞的特异性诊断功能。

实施例5 MTT检测——细胞毒性试验

将要检测的U87MG、HepG2和L-O2细胞制成浓度为5×10⁴个/mL单细胞悬浮液，以每孔100μL接种于96孔板中，周边孔加入100μL PBS缓冲液，37℃、5％CO₂及饱和湿度下培育24h后加样。实验组加入Cy7-RGD及cyclo(RGD)浓度分别为0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、1000nM、10000nM的培养液100μL，对照组加入等体积Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)溶解介质，空白组为不含细胞的培环肽cyclo(RGD)入Cy7-RGD及环肽cyclo(RGD)后将培养板放入37℃、5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养48h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，再将培养板放入细胞培养箱中培养4h。然后取出培养板，吸走上清液，加入100μLDMSO，在570nm波长下用酶标仪测定每孔的吸光度(OD值)，并用空白组调零，计算Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)对U87MG、HepG2和L-O2细胞的体外增殖抑制率，抑制率的公式如下：

其中，对照组OD值＝对照组OD值-空白组OD值，实验组OD值＝实验组OD值-空白组OD值。

图9，图10，图11为实施例5中细胞毒性实验结果，分别做了对人恶性胶质瘤细胞U87MG，人肝癌细胞HepG2，和人正常肝细胞系L-O2的毒性实验。

从图9可以看出，对于U87MG细胞，当Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)的浓度相同时，Cy7-RGD对U87MG细胞的抑制率要远远大于环肽cyclo(RGD)对U87MG细胞的抑制率。并且当Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)的浓度都为10000nM时，Cy7-RGD对U87MG细胞的抑制率达到了59.3％，而环肽cyclo(RGD)的仅有12.5％，通过计算得到此时Cy7-RGD的IC₅₀值为8.0μM。

从图10可以看出，对于HepG2细胞，当Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)的浓度相同时，Cy7-RGD对HepG2细胞的抑制率要远远小于环肽cyclo(RGD)对HepG2细胞的抑制率。并且当Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)的浓度都为10000nM时，Cy7-RGD对HepG2细胞的抑制率为-7.5％，而环肽cyclo(RGD)的有5.1％。

从图11可以看出，当分别用10000nM的Cy7-RGD与环肽cyclo(RGD)培养L-O2细胞24h时，两者对L-O2细胞的抑制率基本相同，都是24.3％。

因此，环肽cyclo(RGD)对于三种细胞都有一定的抑制作用。而其与Cy7相连耦合后，Cy7-RGD对于U87MG细胞的抑制作用大大增强，对于L-O2细胞的抑制作用基本与环肽cyclo(RGD)相同，而对于HepG2细胞的抑制作用却大幅度减弱，几乎不影响HepG2细胞的体外繁殖。可能原因是U87MG细胞能大量地表达整合素αvβ3，而Cy7-RGD能拮抗整合素αvβ3的产生，从而影响U87MG细胞的生长和代谢而达到很好的抑制效果。

上述细胞毒性实验结果表明，本发明的中间位置连接环肽cyclo(RGD)的氨基菁类染料具有非常好的对神经胶质瘤细胞的特异性毒性功能，而这种毒性作用是单纯染料和环肽cyclo(RGD)不具有的。这说明毒性作用是由本发明的氨基菁类染料的独特结构引起的。

Claims (1)

1.氨基菁类荧光染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在冰浴条件下将三氯氧磷用二氯甲烷溶剂稀释0.5-1.5倍的混合液逐滴加入用二氯甲烷溶剂稀释0.5-1.5倍的N, N-二甲基甲酰胺混合液中，三氯氧磷与N, N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：1~3，然后再向上述混合液中逐滴加入环已酮，三氯氧磷与环己酮的摩尔比为1：0.2~0.7;反应液加热到回流，反应3-5 h，反应液倒入用大量碎冰沉淀，过滤，获得中间体A；

2）按摩尔比1:1~2加入苯并杂环磺酸化合物和氢氧化钾，再加入以体积比1:1~2混合的甲醇：异丙醇混合液；然后进行回流反应，将反应液过滤得黄色固体并干燥，将所得干燥产物和过量含R₂基团的烷基化试剂在加热条件下回流5~20 h，冷却后析出中间体B；

3）反应瓶中按照摩尔比1:2~3加入中间体A和季铵盐中间体B，再加入以体积比1:2~3混合的甲苯：正丁醇混合液，经甲苯分水，在氮气保护下回流后，去除反应溶剂、溶解、析出、过滤、重结晶后得到Cy7；

4）按1:0.5~3:1~10的摩尔比向反应瓶中依次加入Cy7、环肽cyclo(RGD)、Na₂CO₃，再加入无水DMF， 于50℃、氮气保护下反应后，反应液经析出、过滤和提纯后获得通式I中n=0时的化合物；

5）反应瓶中以摩尔比1:1~10加入Cy7和过量的氨基化合物RNH₂，再加入无水DMF、氮气保护下反应结束后，反应液经析出、过滤、提纯得到Cy7-NH-R；

6）按摩尔比1:1~2称取Cy7-NH-R和1,1'-羰基二咪唑，再加入无水DMF，于40℃、氮气保护下，搅拌3~45分钟后，降至室温加入环肽cyclo(RGD)，Cy7-NH-R与环肽cyclo(RGD)摩尔比1:0.5~3，继续搅拌反应1~5小时后，将反应液经析出、过滤、提纯后获得通式I中n=1时的化合物；

其中：

n为0或1；

当n = 0时，R的两端直接相连；

当n = 1时，R为-NH(CH₂)_mCO-，m取1~18之间的整数；

X 为C(CH₃)₂、O、S 或Se；

R₁为H或OH；

R₂选自C1-18 烷基、苄基或(CH₂)₄SO₃H, (CH₂)₅CO₂H。