CN101821406A - 用于微阵列制备的基于3′的测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了获得用于制备核酸微阵列的设计序列的方法。本发明的方法使用组织样品或疾病状态中转录本的高通量3′-测序来设计用于核酸微阵列的探针。本发明还描述了具有针对组织中转录本3′-最末端的探针的核酸微阵列。这些微阵列优选代表了特异于获得所述转录本的组织的可变聚腺苷酸化序列。本发明还描述了使用针对转录本3′-最末端的微阵列来评价组织中基因表达的方法，此方法中的假阳性和假阴性结果减少。

Description

用于微阵列制备的基于3′的测序方法

优先权声明和相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年8月13日递交的美国临时专利申请第60/964,470号的优先权，该临时专利申请通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及使用核苷酸的3′-测序来设计核酸微阵列的方法。本发明还涉及使用3′-测序来鉴定组织转录组的方法。

背景技术

由Affymetrix和其它微阵列公司制备的常用DNA微阵列是由公开数据产生的。虽然大部分阵列经设计具有3′-偏好，但是探针设计所用的序列数据仍取自主要通过5′-测序得到的公共数据库。这些序列在序列的3′-末端几乎是完整的，但并不包括(account for)序列的3′-末端的可变聚腺苷酸化，因为它们在不同组织和疾病背景中表达。

例如，据估计超过29％的人基因具有可变聚腺苷酸化[poly(A)]位点(Beaudoing，E(2001)Genome Res.，11，1520-1526)。可变poly(A)位点的选择被认为与生物学状况，如细胞类型和疾病状态有关(Edwalds-Gilbert，G et al.(1997)Nucleic Acids Res.，25，2547-2561)。当3′-末端外显子被可变剪接时，涉及可变聚腺苷酸化。根据组织或疾病状态，可变聚腺苷酸化会产生具有可变3′-末端的mRNA或具有不同C-末端的蛋白质。已经发现越来越多的基因受这种机制的调节。虽然正在努力构建可变聚腺苷酸化位点的数据库，但是目前尚不了解所有此类位点(Zhang et al.Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，Database issue D116-D120)。此外，在设计组织特异性或疾病特异性微阵列时，对可变聚腺苷酸化缺乏关注会导致次优的基因表达谱以及最终使用时的假阴性和假阳性结果。源自公共数据库的微阵列并不包括可变聚腺苷酸化。在公共数据库中没有大量的3′-测序，也没有很好地代表主要的可变3′-聚腺苷酸化。

另有文献报道组织特异性聚腺苷酸化经常出现，因此这也进一步强调了建立在目标疾病或组织中表达的真实3′-末端的重要性。超过三分之一的人前体mRNA经历可变RNA加工修饰，这使其成为普遍的生物学过程。所产生的蛋白同种型具有不同的且有时相反的功能，更强调了此过程的重要性。哺乳动物物种中的大量基因可能经历可变聚腺苷酸化，从而产生具有可变3′-末端的mRNA。由于mRNA的3′-末端常包含对mRNA稳定性、mRNA定位和翻译重要的顺式元件，所以聚腺苷酸化调节的意义可能是多方面的。可变聚腺苷酸化由顺式元件和反式因子控制，且被认为以组织或疾病特异性的方式发生。考虑到在mRNA代谢的其它方面(如转录起始和剪接)有许多可以利用的数据库，而关于聚腺苷酸化(包括可变聚腺苷酸化及其调控)的系统信息则显著缺乏。

因此，获得与特定组织和疾病状态对应的序列的真实3′-末端对于微阵列检测的改进非常重要。

发明内容

本文提供了使用设计序列制备微阵列的方法，所述设计序列来自通过3′-测序进行测序的RNA转录本。这些方法可产生组织特异性和疾病特异性微阵列，所述微阵列包含在常规阵列上不存在的针对可变聚腺苷酸化的转录本形式的探针。这些方法提供了当最终用于表达谱分析(expression profiling)或诊断或预后方法时具有使假阳性和假阴性结果减少的阵列。

此外，本领域的普通技术人员可以理解，存在大量与组织类型和疾病状态有关的可变3′-聚腺苷酸化的转录本形式。针对这种可变性，本发明提供了转录本的高通量3′-测序方法，以从所研究组织或疾病中鉴定转录本的真实3′-末端。

在一个实施方式中，从3′-最末端(extreme 3’end)起对转录本测序，以得到考虑了可变聚腺苷酸化位点的该组织或疾病状态特异的3′-末端序列。随后，将得到的最末端3′-序列(extreme 3’sequence)作为用于设计探针和产生阵列的设计序列。

在另一个实施方式中，对分离RNA样品中的转录本进行高通量3′-测序，直到对RNA样品中的基本上所有转录本都进行了测序。随后将这些最末端3′-序列作为用于设计探针和产生阵列的设计序列。与标准的商购阵列相比，本文所述的方法使阵列具有更多的最末端3′-偏好。用于微阵列的探针设计中的3′-偏好涉及最后的300个碱基。然而，重要的区别在于设计序列的产生。在3′-测序中获得转录本的实际3′-末端，并根据确定为在目标组织或疾病状态中表达的转录本的真实和正确3′-末端的实际序列来设计阵列。

使用这些方法的优点包括：鉴定组织特异性或疾病特异性3′-变体；利用新鲜冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋组织鉴定疾病/组织类型中的多种3′-变体，并获得可使用的更正确的序列。

因此，本发明的目的在于提供获得用于设计微阵列探针的输入序列组的方法。

本发明的另一个目的在于提供用于探针设计的组织和疾病特异性序列。

本发明的再一个目的在于通过使用由组织和疾病特异性探针设计的微阵列来提高特定转录组检测的准确性。

具体实施方式

I.阵列的制备方法

本文提供的方法涉及由从转录本3′-末端测序的转录本库制备微阵列，由此提供组织或疾病状态组织的聚腺苷酸化位点的准确代表。这些方法产生的微阵列设计具有的最末端3′-偏好大于标准的商购微阵列中存在的3′偏好。对于处理以不同方式收集和保存的患者组织样品，以及鉴定用于探针设计的特定组织类型或疾病状态的特异性转录本库，这些方法也很有价值。这种对现有微阵列技术的改进允许对患者组织样品进行更准确且靶向性更强的分析。

本文所用微阵列的“3′-偏好”是指在阵列的设计中，探针选自代表性转录本或设计序列的3′-区域。核酸微阵列通常具有3′-偏好，且微阵列的主要制造商普遍使用3′-偏好的探针。例如，在大多数Affymetrix表达阵列中，探针选自最后的600个碱基。

在本文中，对用于探针设计的转录本所用的术语“3′-最末端”通常是指最靠近转录本3′-端的约300bp。探针设计使用从聚腺苷酸化位点计算的序列的最靠近3′-末端(most 3’)部分。在其它实施方式中，将最后的500bp、400bp、250bp或最后的200bp作为用于探针设计的3′-最末端。

FFPE样品对微阵列分析提出了特别的挑战，包括RNA分子的潜在片段化和化学修饰。通常只能检验新鲜冷冻组织，这是因为其RNA保存较好且降解明显较少。遗憾的是许多FFPE组织样品无法使用这些微阵列进行回顾性(retrospectively)检查。使用3′-偏好的设计消除了因RNA的5′-3′降解(例如，通过5′-3′外切酶活性)而引发的问题。另已表明，最末端3′-偏好引起微阵列实验中的检测率显著增加，信号强度更高。通过根据转录本的3′-最末端设计微阵列探针，本发明的方法制备的微阵列可以对从FFPE和新鲜冷冻组织提取的RNA进行研究，这是因为以转录本的3′-最末端设计的探针具有更高的转录本检测效率，能够构建部分降解的RNA(例如从FFPE组织提取的RNA)的谱图。此外，与简单地使用公共数据库中已知序列的3′-最末端相反，使用3′-测序提供用于探针设计的组织特异性或疾病特异性转录本的真实3′-最末端序列。

本文所使用的术语“3′-测序”是指从包括poly(A)尾的3′-末端开始对转录本进行测序。常规测序方法可以用于测定转录本3′-末端的真实序列。

术语“部分”、“片段”或“DNA片段”是指较大DNA多核苷酸或DNA的一部分。例如，多核苷酸可以被断裂或片段化为多个片段。本领域公知对核酸进行片段化的多种方法。例如，这些方法可以是化学性或物理性的方法。化学的片段化可以包括使用DNAse部分降解；使用酸部分脱嘌呤；使用限制性酶；由内含子编码的核酸内切酶；基于DNA的裂解方法，例如形成三链和杂合体方法，其依赖于核酸片段的特异性杂交以将裂解剂定位至核酸分子的特定位置；或在已知或未知位置裂解DNA的其它酶或化合物。物理的片段化方法可以包括使DNA经受高剪切速率处理。例如，可以通过使DNA通过具有凹陷或刺突(spike)的室或通道，或驱使DNA样品通过大小受限的流动通道，例如具有微米或亚微米级截面尺寸的孔。其它物理方法包括超声处理和雾化。也可以组合使用物理和化学断裂方法，如通过热和离子介导的水解进行片段化。参见如Sambrook et al.，″Molecular Cloning：ALaboratory Manual，″3rd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001)(″Sambrook et al.″)，其通过引用全文并入本文。可以对这些方法进行优化以将核酸消化成所选大小范围的片段。有用的大小范围可以为20、50、100、200或400个碱基对。

使用与转录本3′-区域结合的探针是有利的，特别地是在用于基因表达分析的患者组织是从石蜡包埋组织提取的RNA的情况下。每个探针将能够与相应转录本中的互补序列杂交，所述杂交发生在转录本3′-末端的500bp、400bp、300bp、200bp或100bp内。

与常规方法不同，为了设计其上具有60,000个转录本的阵列，本领域普通技术人员利用本发明的方法无须获取60,000个登录号或Gene ID并根据这些序列设计探针，而实际上只需从组织样品中获取60,000个转录本。使用3′-测序以产生这些序列(即“输入序列组”或设计序列)是特别相关的。

本文所用术语“输入序列组”或“设计序列”是指用于微阵列设计的序列。

在第一个实施方式中，本发明提供了通过从组织样品中分离RNA，对分离RNA中的转录本进行测序和在微阵列上设计针对测序转录本3′-最末端的核酸探针来设计核酸微阵列的方法。探针优选结合转录本的3′-最末端，从而包括了对分离出此RNA的组织或疾病状态特异的任何可变聚腺苷酸化位点。所述探针优选与转录本3′-最末端互补并在严谨杂交条件下与其特异地结合。

RNA提取方法为本领域公知，也可以使用例如RNeasy(QiagenCorporation，Valencia，CA)、

总RNA提取的小试剂盒(TelechemInternational，Sunnyvale，CA)和ToTALLY RNA^TM(Ambion，Foster City，CA)等的商购RNA提取试剂盒从组织样品中分离RNA。(Sambrook et al)。制备cDNA文库的方法也为本领域公知，包括逆转录、克隆和平板接种的方法(Sambrook et al)。针对转录本3′-最末端的引物对于确保从分离的RNA正确地逆转录出序列的3′-最末端特别有用。例如，锚定的寡聚dT引物或寡聚dT引物对于确保正确地转录出转录本的3′-最末端以用于生成文库特别有用。

在测序反应中用作引物的寡核苷酸还可以包含标记物。这些标记物包括但不限于放射性核苷酸、荧光标记物、生物素、化学发光标记物。本领域已知的不同测序技术，例如双脱氧测序、循环测序、微测序、通过杂交测序、基于MS的测序、通过合成方法(SBS)的DNA测序如焦磷酸测序、单个DNA分子的测序、聚合酶克隆及其任何变型，都可以用于转录本3′-最末端的测序。

在一个实施方式中，可以使用高通量3′-测序产生阵列的设计序列。通过对特定组织或疾病状态中全部或基本上全部转录本进行高通量测序，从而获得输入序列组。使用高通量测序方法产生的探针可以比其它通用微阵列中所含探针更靠近转录本的3′-末端。

在获得设计序列后，设计特异地结合靶样品中转录本3′-最末端的探针或探针组。现有商业软件可从给定序列设计探针和探针组，所述给定序列经优化从而降低了寡核苷酸和靶标间的交叉杂交。此类软件程序的实例包括但不限于Visual OMP、OligoWiz 2.0和ArrayDesigner。

使用本文所述的3′-测序方法获得的多核苷酸序列可以用于核苷酸阵列的设计和构建。在获得序列后，可以选择对应于转录本3′-最末端的探针组。在探针设计中要考虑的最重要因素之一包括探针长度、解链温度(Tm)和GC含量、特异性、互补探针序列和3′-末端序列。在一个实施方式中，最佳探针的长度通常为17～30碱基，且包含约20～80％，如约50～60％的G+C碱基。Tm通常优选为50℃～80℃，例如约50℃～70℃。

在设计探针和探针组后，制备包含这些经特异设计用于与组织或疾病状态中的RNA结合的探针的微阵列。微阵列可以使用多种技术制备，包括使用细针在载玻片上印制、使用预制掩膜进行光刻、使用动态微镜装置进行光刻、喷墨印制或在微电极阵列上的电化学方法。长寡核苷酸阵列由60-mers或50-mers构成，并且通过在二氧化硅基材上进行喷墨印制(Agilent)而产生。短寡核苷酸阵列由25-mers或30-mers构成，且通过在二氧化硅基材上进行光刻合成(Affymetrix)而制备，或通过在丙烯酰胺基质上进行压电沉积(Applied Microarrays)而制备。另一种方法，即来自NimbleGen Systems的无掩模阵列合成法(Maskless Array Synthesis，使用微镜)组合了灵活性和具有大量探针的特点。

特别地，相关疾病特异性的内容物和基于3′的探针设计的组合提供了能够对来自新鲜冷冻组织和FFPE组织的RNA谱图进行强效分析的独特方法和产品。

这些方法也可以用于产生代表来自组织的基本上全部转录组的阵列。例如，在一个实施方式中，在限定肺癌转录组时，使用基于3′的测序方法有助于针对每个转录本3′-最末端设计引物组。

此方法确保了高得多的检测率，因此对其进行优化设计以检测来自新鲜冷冻组织样品和FFPE组织样品的RNA转录本。Almac Diagnostics LungCancer DSA^TM是能够利用从FFPE组织提取的RNA产生有生物学意义的可重复数据的研究工具的实例。

II微阵列

为了制备改进的微阵列，将经设计与转录本3′-最末端杂交的核酸探针排列在固相支持物上以制备阵列。所述阵列可以代表对应于一个或多个组织或一种或多种疾病的多个组织转录本。疾病特异性阵列包含在一种给定疾病背景下表达的转录本。使用本领域已知的适合技术构建本文所提供的用于诊断、预后和预前分析的阵列。参见，例如美国专利第5,486,452号；第5,830,645号；第5,807,552号；第5,800,992号和第5,445,934号。在每个阵列中，单条核酸探针可以仅出现一次或可以出现多次。所述阵列也可以任选地包含对照核酸探针，例如在阳性对照的情况下包含针对管家基因的对照核酸探针，或将已知在组织中不表达的基因作为阴性对照。

在一个实施方式中，使用本领域公知的核酸固定或结合技术，将代表转录本和/或转录本片段的组织特异性核酸探针固定在阵列的多个物理独立位点上。在多个物理独立位点上的片段可以一起组成完整的转录本或完整转录本的单独(discreet)部分。所述片段可以与转录本的连续部分或转录本的不连续部分互补。来自靶样品的核酸分子与阵列上片段的杂交表示样品中存在目标转录本。杂交和杂交的检测通过本领域技术人员公知的常规检测方法进行，并在下文进行更详细的描述。

在一个实施方式中，使用多个探针序列以区分患病组织样品中的目标序列和其它核酸序列。在一些实施方式中，阵列上的探针组合代表了至少2％的设计序列。在其它实施方式中，阵列上的探针代表了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的目标序列。

在一个实施方式中，转录本与至少50％的探针序列互补。在其它实施方式中，转录本与至少60％、70％、80％、90％或100％的探针序列互补。

在另一个实施方式中，将对应于转录本完整3′-最末端或转录本完整3′-最末端的片段的核酸探针以“点阵列”形式固定在阵列的仅一个物理独立位点上。可以将特异核酸探针的多个拷贝结合在阵列基材的单独位点上。优选地，此类“点阵列”包含本文新鉴定的一个或多个核酸分子。

对于给定的阵列，每个核酸探针可以为完整序列或片段化为不同长度的序列。构成完整转录本的全部片段不必均呈现在阵列上。转录本与阵列上代表完整转录本的一部分的探针的杂交可以表示该转录本在分离出该转录本的组织中的存在或表达水平。

本领域技术人员可以理解，在给定阵列上的核酸探针与给定组织样品中的转录本特异性的靶标互补。也可以设计含天然序列的阵列以鉴定目标样品中反义分子的存在。由于近期文献提出癌症和其它疾病中涉及内源的反义分子，而使内源的反义RNA转录本引人关注。

如上所述，可将特异于某些疾病(例如特定癌症)的阵列设计成包括针对特定聚腺苷酸化位点的探针。

可以将任何适合的基材用作固定或结合核酸探针的固相。例如，所述基材可以是玻璃、塑料、金属、金属包被的基材或任何材料的滤膜(filter)。基材表面可以是任何合适的结构。例如，表面可为平面，或具有隆起或凹槽以分离固定在基材上的核酸探针。在可选的实施方式中，核酸连接到可单独识别的小球上。将核酸探针以使其可用于杂交的任何合适方式连接到基材上，包括共价或非共价结合。

III.阵列的使用方法

本文提供的阵列可以用于任何合适的目的，例如但不限于表达谱图分析、诊断、预后、药物治疗和药物筛选等。

通常，将RNA从组织样品中分离并与阵列接触，并使其在严谨条件下杂交，以允许来自组织样品的靶序列和微阵列上的互补探针之间发生特异性结合。固定在基材上的探针适于在严谨条件下与来自核酸样品的转录本杂交。可以通过将从目标组织提取的RNA逆转录而掺入荧光核苷酸，从而生成荧光标记的核苷酸探针。用于阵列的标记探针与阵列上的各个核苷酸特异性杂交。在严谨洗脱以去除非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜或其它检测方法如CCD照相机扫描阵列。对每个阵列化元件的杂交进行定量可以评价相应转录本的丰度。

如本领域技术人员所理解的，术语“基本上”相同或同源或相似根据情况而改变，通常是指至少70％的同一性，优选是指至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％的同一性。

本领域普通技术人员可以很容易地确定杂交反应的“严谨性”，且其通常为取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高温度以进行正确退火，而较短的探针则需要较低温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA再退火的能力。探针和可杂交序列之间所需的同源程度越高，所用相关温度就越高。因此，较高的相关温度使反应条件更严谨，而较低的温度下反应条件严谨性较低。对于杂交反应严谨性的其它细节和解释，参见Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。

如本文所定义，“严谨条件”或“高严谨性条件”通常为：(1)洗涤采用低离子强度和高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)杂交期间采用变性剂，例如甲酰胺，如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)和750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt′s溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下采用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)洗涤以及在55℃下采用甲酰胺洗涤，随后为在55℃下由含EDTA的0.1×SSC组成的高严谨洗涤。

可以通过Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，NewYork：Cold Spring Harbor Press，1989的描述确定“中等严谨条件”，且包括使用洗涤液和严谨性(例如温度、离子强度和％SDS)低于上述条件的杂交条件。中等严谨条件的实例为于37℃下在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的断裂鲑鱼精子DNA的溶液中温育过夜，随后在约37～50℃下用1×SSC洗涤滤膜(filter)。本领域技术人员知晓如何调节温度、离子强度等以适应如探针长度等因素。

本发明的微阵列可以用于研究不同的疾病状态。术语“疾病”和“疾病状态”包含能够导致或潜在引起患病生物体中细胞的小分子图谱、细胞区室、或细胞器变化的所有疾病。这些疾病可以分成三个主要的类别：肿瘤病、炎症性疾病和退行性疾病。

疾病的实例包含但不限于代谢性疾病(例如肥胖症、恶病质、糖尿病、厌食症等)；心血管疾病(例如动脉粥样硬化、缺血/再灌注、高血压、心肌梗死、再狭窄、心肌病、动脉炎等)；免疫性病症(例如慢性炎症性疾病和病症，如克罗恩氏病，炎症性肠病，反应性关节炎，类风湿性关节炎，骨关节炎，包括莱姆病(Lyme disease)，胰岛素依赖性糖尿病，器官特异性自身免疫，包括多发性硬化症、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)和格雷夫斯病，接触性皮炎，银屑病，移植排斥，移植物抗宿主疾病，结节病，特应性病症，如哮喘和变态反应，包括过敏性鼻炎，胃肠过敏，包括食物过敏，嗜曙红细胞增多，结膜炎，肾小球性肾炎，对某些病原体易感，如肠虫(例如利什曼病)和某些病毒感染，包括HIV，和细菌传染、包括结核病和瘤型麻风等)，肌病(例如多肌炎、肌营养不良、中央轴空病、中央核(肌管)性肌病、先天性肌强直、线状体肌病、先天副肌强直、周期性麻痹、线粒体肌病等)；神经系统病症(例如神经病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、运动神经元病、外伤性神经损伤、多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑白质炎、髓鞘异常(dysmyelination)疾病、线粒体病、偏头痛症、细菌感染、真菌感染、中风、衰老、痴呆、周围神经系统疾病和精神紊乱如抑郁症和精神分裂症等)；肿瘤病症(例如白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌(colorectal cancer)、喉癌、乳癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、胶质瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌和肾癌等)；和眼科疾病(例如色素性视网膜炎和黄斑变性)。该术语还包括由已知和未知的氧化应激、遗传性癌综合征和代谢疾病引起的紊乱。

本发明的更多细节将在以下非限定性实例中进行描述。

实施例1：使用高通量3′-测序以鉴定微阵列设计序列

文库生成和cDNA测序

从组织中提取RNA

根据生产商说明书使用RNA STAT-60从冷冻肺组织块中提取RNA。对产品说明书的改进包括在开始提取之前使用Tissue Lyser(Qiagen)在RNA-STAT-60中以20Hz对每个组织块匀浆6分钟。使用Biophotometer(Eppendorf)测定RNA的产量，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer和RNA NanoLabChip试剂盒(Agilent Technologies；Palo Alto，CA)检验RNA的质量。将等量的优良RNA(带有明确28S和18S核糖体峰的RNA)混合以用于mRNA分离。

从总RNA中分离mRNA

根据生产商说明书使用μMACS mRNA分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从混合的肺总RNA中分离mRNA。从538μg混合的肺总RNA中分离mRNA，并洗脱到12μl无核酸酶的水中。使用Biophotometer(Eppendorf)测定mRNA的产量，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer和RNA Nano LabChip试剂盒(Agilent Technologies；Palo Alto，CA)检验mRNA的质量。使用mRNA Nano试验测定核糖体污染的百分比。

肺cDNA文库的构建

使用CloneMiner^TM cDNA文库构建试剂盒(Invitrogen)进行肺cDNA文库的构建。根据生产商说明书进行非放射性标记cDNA文库的构建。使用预先分离的3μg肺mRNA产生文库。将cDNA插入物重组到pDONR^TM 222载体并通过电穿孔进入DH10B^TM T1噬菌体抗性细胞(Invitrogen)。将1μl重组的pDONR^TM 222载体加入到40μl的电感受态细胞中。将管中的全部内容物转移至缝隙宽度为1mm的预冷小皿中，并插入设置为1660V和5ms时间常数(τ)的电穿孔仪2510(Eppendorf)。在电穿孔后，将1ml SOC培养基(Invitrogen)加入到细胞中，转移至15ml管中，并于37℃在Innova 4300型振荡培养箱(New Brunswick Scientific)中以225rpm振荡1小时。随后，向样品中加入等体积的无菌冷冻培养基(60％SOC培养基(Invitrogen)，40％甘油(Sigma))，然后等分至多个管中，并在-80℃储存。在含50ug/ml卡那霉素(Sigma)的3个预热LB平板上进行滴度测定。在每个平板上涂布1μl、5μl或10μl的转化细胞，并于37℃在BD115培养箱(Binder)中培养过夜。计算每个平板上菌落的数量以测定文库的平均滴度。用平均滴度乘以总体积来确定总菌落形成单位(cfu)。

cDNA文库的评价(qualify)

通过使用BsrG 1消化24个阳性转化体来进行cDNA文库的进行评价。将12ul质粒DNA与3.0μl NE 2、0.3μl BSA、0.1μl BsrG 1和14μl无核酸酶的水在37℃下一起温育16小时。随后使用DNA 7500分析方法在Agilent 2100Bioanalyzer上分析经消化的样品。没有插入物的pDONR^TM 222载体应显示出具有以下2.5kb、1.4kb和790bp长度的消化谱，每个cDNA进入克隆(entryclone)都应该具有2.5kb的载体骨架和额外的插入物条带。将每个克隆的单个消化条带的大小相加在一起得到插入物总长度。随后计算24个转化体的平均插入物大小长度和转化的百分数。

以约2000cfu/皿的密度将单个cDNA文库的细菌菌苔平铺到生物分析皿(QTrays(Genetix))上。使用QPix 2^XT菌落挑取器挑取单个菌落，并于37℃在CircleGrow培养基(MP Biomedicals LLC)中振荡培养过夜。

使用改进的碱性裂解法(Millipore)进行质粒的制备。此方法使用

Plasmid384 Miniprep清除平板来替代真空过滤进行离心裂解物的清除。在Biomek NX工作台(Beckman Coulter)上进行所有的液体处理步骤。

准备384孔的序列反应平板，其包含约100ng模板DNA、5μM引物(M13反向通用引物、锚定的寡聚dT或寡聚dT)、Big Dye Terminator v.3.1(AppliedBiosystems Inc.)和测序缓冲液(Applied Biosystems Inc.)。循环测序条件为40个循环，95℃10秒，50℃5秒，60℃2分30秒。在Biomek NX液体处理器上使用CleanSEQ(Agencourt Biosciences)清除测序反应物。使用AppliedBiosystems序列分析软件在Appled Biosystems 3730/3730x1 DNA分析仪上分析序列平板。

实施例2：肺癌疾病特异性转录组的鉴定

通过基于3′的高通量测序方法生成用于设计肺癌疾病特异性阵列(DSA^TM)研究工具的转录本信息，以确定肺癌转录组。从每个经鉴定的转录本的3′-末端生成探针，并由Affymetrix(Affymterix Corporation，Santa Clara，CA)为用户设计肺癌DSA研究工具。这种相关疾病特异性内容物和基于3′的探针设计的组合可以对来自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的RNA谱图进行强效分析。

虽然已经参考具体实施方式对本发明进行了描述，但是应该理解本发明并不限于这些实施方式。相反，本发明旨在涵盖包含在所附权利要求书精神和范围内的各种修改和等价形式。

Claims (17)

1.设计核酸微阵列的方法，所述方法包括：

从组织样品中分离RNA；

从转录本的3′-末端对组织样品中的转录本测序，直到基本上所有转录本都进行了测序，从而获得所述转录本的3′-最末端序列；

使用所述序列设计用于微阵列的探针；和

制备微阵列，所述微阵列具有针对组织样品中转录本的3′-最末端的探针。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的300个碱基对。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的400个碱基对。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的500个碱基对。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的200个碱基对。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的100个碱基对。

7.组织特异性或疾病特异性微阵列，其包含针对转录本3′-最末端的探针。

8.如权利要求7所述的微阵列，其中所述探针针对特异于特定组织或疾病状态的聚腺苷酸化位点。

9.如权利要求7所述的微阵列，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的300个碱基对。

10.如权利要求7所述的微阵列，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的400个碱基对。

11.如权利要求7所述的微阵列，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的500个碱基对。

12.如权利要求7所述的微阵列，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的200个碱基对。

13.如权利要求7所述的微阵列，其中所述转录本的3′-最末端包含所述转录本最靠近3′-末端的100个碱基对。

14.使用权利要求7-13中任一项所述的微阵列分析组织表达谱的方法，所述方法包括：

在样品中的核酸靶标与所述阵列上的探针特异性杂交的条件下，使来自组织的核酸样品与所述阵列接触；

洗涤除去所述微阵列上的未结合核酸靶标；和

检测与所述微阵列结合的靶标，

其中与所述微阵列结合的靶标的存在表明基因在所述组织中表达。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述组织包括患病组织。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述患病组织为癌症组织。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症选自白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、喉癌、乳癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、胶质瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌或肾癌。