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CN104685071A - 制备靶rna消除组合物的方法和试剂盒 - Google Patents

制备靶rna消除组合物的方法和试剂盒 Download PDF

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CN104685071A CN201380048680.8A CN201380048680A CN104685071A CN 104685071 A CN104685071 A CN 104685071A CN 201380048680 A CN201380048680 A CN 201380048680A CN 104685071 A CN104685071 A CN 104685071A
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M·斯伦贝榭
D·洛菲勒
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Qiagen GmbH
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Abstract

本发明提供从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法，包括a)使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：i)该组包括长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA中的靶区域互补；iii)当与所述靶区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中处于彼此邻近的位置；b)利用结合双链杂交体的结合剂捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂复合物；c)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供靶RNA消除的组合物。通过组合杂交体捕获与独特的探针设计，提供了改进的消除方法，该方法有效和特异性地去除总RNA中不需要的靶RNA，如核糖体RNA(rRNA)，同时确保从包括人、小鼠和大鼠在内的不同物种回收mRNA和非编码RNA。通过改进有用数据之比、减少偏差并保留非编码RNA种类，该方法提供了尤其适用于下一代测序(NGS)应用的高质量RNA。通过在共同的测序应用，特别是NGS的应用，如转录组测序积分所述耗尽方法中，提供了改进的方法，用于测序的RNA分子。通过将所述消除方法整合入常规的测序应用，特别是NGS应用，例如转录组测序，为测序RNA分子提供了改进的方法。

Description

制备靶RNA消除组合物的方法和试剂盒
发明领域
本发明提供了从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法。本文公开的方法能够从分离的总RNA中有效地消除不需要的靶RNA，如rRNA。该方法特别适合于制备用于下一代测序应用，特别是转录组测序的RNA。此外，提供了适合实施本发明方法的试剂盒。
发明背景
转录组学是表征从所研究的特定基因组转录的RNA的科研领域。现已开发了几种方法来分析转录的RNA，例如基因表达系列分析(SAGE)、Cap分析基因表达(cap analysis gene expression，CAGE)和大规模平行签名测序。另一种方法是转录组测序。传统上，测序由Sanger测序进行。
在最近几年，出现了根本性的转变，从利用Sanger法进行测序转为所谓的“下一代测序”(NGS)技术。在此，存在不同的NGS技术和方法，例如焦磷酸测序，合成测序或连接测序。然而，大多数NGS平台共享一个技术特征，即，克隆扩增的或单个DNA分子的大规模平行测序，所述DNA分子是在流动室中或通过产生油-水乳液而在空间上分离的。在NGS中，测序是通过聚合酶介导的核苷酸延伸的重复循环，或以一种格式，通过寡核苷酸连接的迭代循环进行。作为大规模平行处理，NGS在一次仪器运行中根据平台的不同产生数百个百万碱基到十亿碱基的核苷酸序列输出。廉价地生产大量序列数据是其相比于传统方法的主要优点。因此，NGS技术已经成为遗传学研究的主要驱动力。现已发现几个NGS技术平台可广泛使用，包括，例如，以下NGS平台：罗氏(Roche)/454，Illumina Solexa基因组分析仪，应用生物系统公司的SOLiDTM系统，Ion TorrentTM半导体序列分析仪，实时测序和HelicosTM单分子测序(SMS)。NGS技术、NGS平台和NGS技术的常规应用/领域总结于，例如Voelkerding等(Clinical Chemistry 55:4641-658,2009)和Metzker(Nature Reviews/Genetics第11卷,2010年1月,第31-46页)。除了NGS技术中的测序是以大规模平行方式进行的特征，NGS技术平台的共同之处在于它们需要制备适于大规模平行测序的测序文库。此类测序文库例子包括片段文库，末端配对文库(mate-paired library)或条形码片段文库(barcoded fragment library)。在仪器上“运行”前，大多数平台采取略作修改的常规文库制备过程。此过程包括将可从cDNA获得的DNA片段化(例如，通过机械剪切，如声波处理(sonification)、水力剪切、超声波、雾化或酶促片段化)，随后进行DNA修复和末端抛光(end polishing，平端或A突出端)，和，最后的，往往是平台特异性适配体连接。此类测序文库的制备和设计也描述于Voelkerding，2009和Metzker，2010。
这些新的高通量、下一代测序技术已经在许多研究领域获得了快速和全面的结果，包括但不限于诊断、癌症、干细胞研究、宏基因组学、群体遗传学和医学。当今的NGS研究越来越依赖于从复杂样品和有限的起始原料中获得高质量测序数据的能力。NGS也已用于转录组测序。转录组测序也称为“RNA-seq”和用于，例如生物学样品的作图和定量记录中。该技术已迅速用于癌症等疾病的研究中。凭借深覆盖和基准水平分辨率，下一代测序提供基因的差异表达信息，包括等位基因和不同剪接转录物；非编码RNA；转录后突变或编辑；和基因融合。可采用上述的各种平台进行转录组测序(RNA-seq)。进行下一代测序所必需的测序文库的产生可能会在平台之间有所不同，但各技术中也有共同性内。转录组测序的一个主要问题是存在干扰性RNA分子。例如，核糖体RNA(rRNA)是总RNA中最丰富的分子，其中通常超过90％的总RNA为rRNA。然而，核糖体RNA提供的关于转录的信息很少。在应用中，如RNA测序(RNA-seq)时，最大程度提高从测序运行接收到的信息量是极其令人感兴趣的。如果文库构建涉及丰富的rRNA，大部分的测序能力将用于测序这些无所不在的分子，从而减少研究其余转录组可用的能力。因此，宝贵的测序资源被浪费。此外，存在核糖体RNA可能会导致低信噪比，从而难以检测感兴趣的RNA种类。因此，除去rRNA和/或其它不需要的RNA提高了下游测序的价值。为了提供不含rRNA或其它不需要的RNA种类的测序文库，现有技术中开发了几种方法。
根据该基于polyA富集的常用方法，polyA+RNA从总RNA获得。PolyA RNA可采用普通方法分离，例如利用以poly(T)寡核苷酸作官能化，从而可相应捕获PolyA RNA的磁性珠。从polyA RNA制备测序文库的优点在于，不携带polyA尾的RNA，例如rRNA不会从总RNA中回收，并且相应地不会被带入测序反应。因此，从利用polyA RNA产生的测序文库中获得的大多数序列对应于确实携带polyA尾的蛋白编码mRNA。然而，利用纯化的polyA RNA制备测序文库也有缺点。有几种类型的RNA不带有polyA尾，并因此在polyA富集中丢失，但仍是转录组测序所感兴趣的。例如，polyA富集导致作为转录组重要组成部分的非聚腺苷酸化mRNA序列损失。某些真核mRNA，例如那些编码组蛋白的，也不携带polyA尾，其它携带polyA尾太短，从而无法通过寡聚dT有效捕获。此外，该方法不能用于原核mRNA，因为它们未聚腺苷酸化。再一缺点是，polyA富集需要高品质的完整的总RNA作为输入材料。PolyA富集对于降解的RNA样本不可行，因为只有携带polyA尾的片段才能被捕获。
因为polyA富集相关的这些缺点，开发了替代方法。相比于基于polyA富集的方法，这些方法的目的不是富集感兴趣的RNA，而是着眼于消除和因此去除后续转录组分析不感兴趣的RNA类型，例如rRNA。相比于polyA富集，基于rRNA消除的方法保留了非腺苷酸化、非编码和调控RNA的信息，从而能研究RNA调节、新生转录、RNA编辑和增加我们对转录组复杂性理解的其它现象。在此，再次开发了不同的方法以消除不需要的靶RNA，以便制备用于NGS的总RNA。一种方法是借助杂交在靶RNA全长上的长探针来消除不需要的靶RNA，如核糖体RNA。市售可得的产品是RiboZero(Epicentre)，它使用rRNA的生物素化长转录物作为探针与初始RNA组合物中存在的rRNA杂交。得到的杂交体利用链霉亲和素珠除去。藉此获得rRNA消除组合物。所用的探针是RNA探针，因此必须贮存于不便于处理的-70至-80℃。相应的技术描述于WO 2011/019993。所述方法的优点是它即便在降解RNA的情况下，也有效地去除了核糖体RNA。然而，所述方法对于不同生物的效率有所不同。此外，在片段化rRNA的情况下，有效去除rRNA所必需的长探针也有缺点，即，它们可以与非靶RNA交叉杂交，从而产生信息性RNA的非特异性消除。因此，该方法的缺点在于特异性。另一种市售可得的rRNA消除方法/试剂盒是英杰公司(Invitrogen)的RIiboMinus技术。在此，生物素化锁定核酸探针用于杂交不需要的靶RNA，利用链霉亲和素珠结合并除去标记的杂交体。该方法使用较短的探针，因此效率明显低于RiboZero方法，特别是在片段化RNA的情况下消除rRNA的效率较低(也参见实施例)。此外，该现有技术带来的风险也在于rRNA消除期间，因为rRNA探针和，例如mRNA序列之间的非特异性相互作用导致信息RNA的非特异性消除。因此，需要这样一种靶RNA消除方法，该方法在片段化的情况下的特异性改善，而且能有效地消除不需要的靶RNA。
无论是通过消除不需要的靶RNA或是富集想要的RNA类型，制备RNA组合物后，制备得到的RNA以供NGS测序的典型方法涉及产生第一链cDNA，例如通过随机六聚体引发的逆转录，和随后利用RNA酶H和DNA聚合酶产生第二链cDNA。例如，该cDNA可以片段化并连接到NGS适配体。对于小RNA，例如微小RNA(miRNA)和短干扰RNA，通常采用经由小RNA富集方法的优先分离、在电泳凝胶上作尺寸选择，或这些方法的组合。RNA连接酶可用于连接适配体序列与RNA；该步骤后常是PCR扩增步骤，然后进行NGS处理。测序后，获得的读取值可与参比基因组比对，与已知的转录物序列比较，或从头组装头，以构建基因组规模的转录图谱。
从总RNA中消除不需要的RNA分子(如rRNA)的另一种方法描述于WO01/32672。将RNA与诱饵分子接触，所述诱饵分子能够与不需要的靶序列，例如rRNA形成复合物，由此形成诱饵:靶复合物，从而可自初始组合物中除去。可用信号部分标记得到的rRNA消除组合物，将之用于制备mRNA文库，或者利用阵列杂交技术将之用于表达研究。公开了几种方法用于除去诱饵:靶复合物，多种其他方法也是基于杂交体捕获的方法。
本发明的目的是提供适合于从总RNA中消除不需要的靶RNA，如rRNA，并能避免现有技术方法中至少一个缺点的方法。具体地，该目的是提供用于制备总RNA以供下一代测序应用，特别是转录组测序的方法，该方法是有效的，特异性的，也可以用来从不同的样品，包括源自不同物种的样品和降解样品中消除不需要的靶RNA。
发明概述
本发明是基于以下发现，即，将与待消除的靶RNA杂交的专门设计的探针分子与杂交体捕获联用，提供从含有RNA的组合物中除去和由此消除不需要的靶RNA的显著改进方法。可利用该方法特异性且高效地从总RNA中消除rRNA，从而提供可用于NGS应用，如转录组测序的rRNA消除的RNA。
根据第一方面，提供了从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法，包括：
a)使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：
i)该组包括长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA中存在的靶区域互补；
iii)当与所述靶区域杂交时，所述两种或更多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中处于彼此邻近定位；
b)利用结合双链杂交体的结合剂捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂复合物；
c)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供靶RNA消除的组合物。
本发明采用专门设计的探针分子组，所述探针分子杂交并标记不需要的靶RNA，例如不同的rRNA物质以便消除。各组探针分子靶向靶RNA中的特定区域，在此也称为靶区域，各组探针分子包括两种或更多种不同的与所述靶区域杂交的短探针分子。当杂交至其靶区域时，一组的短探针分子在所形成的双链杂交体中均位于彼此相邻的位置并由此非常接近。所形成的双链杂交体跨越并由此覆盖靶区域。然后包含一组短探针分子的所形成的双链杂交体与抗杂交体结合剂结合，从而形成杂交体/结合剂复合物。所述复合物可以从剩余的组合物中容易地分离，从而去除不需要的靶RNA，由此提供靶RNA消除的组合物。如实施例所示，与现有技术靶RNA消除方法相比，将专门设计的探针分子与杂交体捕获技术联用显著地提高了靶RNA去除的特异性和有效性。利用一种或多组包含与靶RNA内特定靶区域杂交的多个短探针分子，重要的优点在于特异性的增加，因为与较长的探针分子相比，短探针分子对错配的耐受较低。如此在探针水平降低了与非靶RNA的非特异性结合。使用短探针长度的额外优点是生物信息学设计的自由度。探针分子越短，可设计的探针的可能非重叠组合越多。如此能够提供与非靶序列很少或甚至不交叉杂交的探针分子。由于进行了杂交体捕获步骤，而使特异性得到第二级的提高。如果所述杂交体不包含或只含有很少的错配，抗杂交体结合剂，例如抗杂交抗体仅识别双链杂交体。这有利于捕获完美匹配，这通常发生在探针分子与其靶RNA结合的情况下。此外，如果本发明方法特别利用长度为35nt或更小，优选30nt或更小的短探针分子，这会对特异性有额外的提高。如果长度为35nt或更少的单个探针分子非特异性地杂交非靶RNA，抗杂交体结合剂通常不能很好地识别如此形成的短的双链杂交体。因此，非特异性地结合非靶RNA的相应单个探针分子不能提供足够长的双链杂交体，以便与抗杂交体结合剂有效结合，特别是在抗杂交体抗体的情况下。此外，如果一种以上的抗杂交体结合剂，例如抗杂交体抗体能够结合于待消除的杂交体，就像如果一组的探针分子杂交于靶标的情况下，捕获和由此的消除效率得以提高。基于上述理由，大多数非特异性结合事件将不会被抗杂交体结合剂捕获，因此，非特异性结合的非靶RNA不从含有RNA的组合物中消除。然而，如果一组的所有探针分子杂交到其靶区域，形成明显较长的双链杂交体。抗杂交体结合剂很好地识别不含错配的所形成的长双链杂交体，从而确保有效的捕获和去除。因此，当与其靶区域杂交时，短探针分子组基本上模拟了长探针分子的特征，改善了抗杂交体结合剂的捕获情况。当利用由此优选的抗杂交体抗体时，尤其能够实现特异性提高的这种有益效果。
实施例证明了本发明方法的优异效率和优良的特异性，这些实施例尤其显示了与现有技术的方法相比，将多种相邻的短探针分子与杂交体捕获联用显著提高了靶RNA去除的特异性，从而导致更少的感兴趣RNA被非特异性地去除(具体参见图6和7)。此外，即便在片段化RNA的情况中，该方法实现超过99％的消除率，是高效的。因此，当如本文所教导采用包含两种或更多种相邻短探针分子的一组或多组探针分子时，与较长探针相比，靶RNA的结合效率未受影响。然而，因为非特异性结合事件较少导致了特异性显著提高，以及由于抗杂交体结合剂(因此优选抗杂交体抗体)捕获正确形成的双链杂交体而导致的额外的特异性水平。因此，靶RNA消除组合物有利地保留了RNA种类的多样性，包括polyA mRNA、非腺苷酸化mRNA、非编码RNA和调节RNA。信噪比得到改善，并能够检测低丰度RNA。采用本发明方法可以同时消除多种不需要的靶RNA。因此，本发明提供的方法显著改善了现有的靶RNA消除方法。靶RNA消除组合物可以用于许多下游应用，包括但不限于微阵列分析、文库构建、逆转录、扩增、转录谱、表达分析和重要的测序应用。
根据第二方面，提供了对包含在样品中的感兴趣RNA分子进行测序方法，包括：
a)获得含RNA的组合物，优选从样品中分离总RNA；
b)采用第一方面的方法，从该含RNA的组合物，优选总RNA中消除不需要的靶RNA，从而提供靶RNA消除的组合物；
c)任选除去未结合的探针分子；
d)对包含在靶RNA消除组合物中的RNA分子进行测序。
如上文所释，第一方面的方法有效地从总RNA中除去不需要的靶RNA，如不同类型的核糖体RNA(rRNA)，同时确保回收不同物种，包括人、小鼠和大鼠的mRNA和非编码RNA。通过提高有用数据的比例，降低偏倚并保留非编码RNA，该方法提供了特别适用于下一代测序(NGS)应用的高质量RNA。通过将所述消除方法整合入常规的测序应用，特别是NGS应用，例如转录组测序，为测序RNA分子提供了改进的方法。
根据第三方面，提供一种试剂盒，适合于从含有RNA的组合物中消除靶RNA，包括
a)一组或多组消除靶RNA的探针分子，其中，探针分子组具有以下特征：
i)该组包含长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含在所述组中的探针分子与靶RNA的靶区域互补；
iii)与所述靶区域杂交时，所述两种或更多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中彼此邻近定位；
和
b)适合与探针分子和靶RNA之间形成的双链杂交体结合的结合剂。
可利用相应的试剂盒实施本发明第一方面的方法。可将试剂盒中所用的各组探针分子设计成与多种不需要的靶RNA，如大(18S，28S)，小(5S，5.8S)，与线粒体(12S，16S)rRNA特异性地杂交。每种靶RNA利用多种短寡核苷酸以确保，即使有降解靶RNA或突变的存在，所述靶RNA也会被完全从样品中除去。由于它们的长度短，可以仔细设计探针以确保与非靶RNA分子的交叉反应性最小。进一步的优点如上所述。可将此试剂盒中的探针设计成能够除去不同物种，例如人、小鼠和大鼠的靶RNA。如实施例所示，本发明的试剂盒能够从总RNA中除去>99.9％的靶RNA分子。因此，该试剂盒可用于高选择性地有效除去不需要的靶RNA，如不同类型的rRNA，以便用于下一代测序应用。
本领域技术人员从以下描述和所附权利要求会明白本申请的其它目的、特征、优点和各方面。然而，应当理解，虽然以下描述、所附的权利要求和具体的实施例显示了本申请的优选实施方式，但这些仅是通过举例说明的方式给出。本领域技术人员从阅读下文不难明白所公开的本发明构思和范围内的各种变化和修改。
发明详述
在第一方面，提供了从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法，包括：
a)使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：
i)该组包括长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA的靶区域互补；
iii)当与所述靶区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中处于彼此邻近定位；
b)利用结合双链杂交体的结合剂捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂复合物；
c)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供靶RNA消除的组合物。
本发明提供了用于从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法。以上发明概述描述了主要优点。各方法步骤和优选的实施方式将在下文描述。
根据一实施方式，初始的含RNA组合物是总RNA。可以采用任何常用的RNA纯化方法从各种样品中分离总RNA。合适的方法是现有技术中熟知的，因此不需要在此详细描述。合适的方法包括但不限于采用基于苯酚/氯仿的方法分离RNA，利用离液剂、醇和固相，例如特别是含有硅的固相(例如二氧化硅、玻璃纤维、碳化硅)、醇沉淀、其它有机溶剂、聚合物或阳离子洗涤剂沉淀等分离RNA。对于少量和大量的RNA输入材料，本发明的方法显示了良好的消除性能。如实施例所示，含量低至10ng的总RNA可以用作输入材料。可以用作初始的含RNA组合物的总RNA的合适范围包括但不限于：0.005μg至15μg、0.01μg至10μg、0.025μg至7.5μg和0.5μg至5μg。这种广泛的范围对于NGS应用是有利的，在这种情况中，制备测序文库通常只有少量的RNA输入材料可用。
根据一实施方式，采用DNA消除的裂解物作为初始的含RNA组合物。可以从裂解物中除去DNA，例如通过进行DNA酶消化或通过选择性分离，由此从裂解物中除去DNA。用于选择性结合并由此除去DNA的合适方法举例描述于，例如EP 0880537和WO 95/21849，它们通过引用并入本文。例如，如果在没有短链醇，如乙醇或异丙醇存在下使用离液剂，如离液盐裂解样品，可以建立对DNA具有选择性的结合条件，特别是如果使用含有硅的固相的话。如果需要，可以进一步利用结合的DNA，例如作进一步加工、例如测序，由此可以，例如任选进行洗涤并从核酸结合固相洗脱，从而提供基本上不含RNA的DNA部分。然而，如果DNA不是感兴趣的而仅对RNA感兴趣的话，也可以简单弃去结合的DNA。此外，可以净化含有RNA的裂解物以除去，例如细胞碎片和其它污染物。
然而，优选使用纯化的总RNA为初始的含RNA组合物。
步骤a)
在步骤a)中，RNA含的初始组合物，例如总RNA与一组或多组探针分子接触。因此，可利用一组探针分子或可利用两种或多种探针分子。一组探针分子包括两种或多种不同的探针分子。具体设计包含在一组中的探针分子是本发明的重要特征，因为它有助于本发明实现优良的特异性。
所用的探针分子长度为100nt或更小。以上发明概述中描述了与长探针分子相比，利用短探针对于实现特异性的优点。探针分子的长度可以选自75nt或更少、70nt或更少、65nt或更少、60nt或更少、55nt或更少、50nt或更少、45nt或更少、40nt或更少、35nt或更少、30nt或更少、或25nt或更小。根据一实施方式，所述探针分子的最小长度为至少10nt，优选至少15nt，更优选至少20nt，因为这会提高消除性能。当使用非常短的探针分子，例如长度为15nt到10nt的探针分子时，必须提高杂交期间所述探针分子的浓度以确保探针分子与靶RNA的有效结合。根据一实施方式，所述探针分子的长度在65nt至10nt，优选15nt至55nt，更优选20nt至45nt，更优选20nt至35nt，最优选25nt至30nt。由此，实现了较小探针长度与消除性能之间的良好结合(如此降低了进一步过程中的非特异性结合风险和较低的干扰)。使用长度为35nt或更少，优选30nt或更少，更优选25nt或更小的探针分子具有的优点在于在杂交体捕获水平上特异性甚至有进一步的提高，因为抗杂交体结合剂与单个短探针分子和非靶RNA之间形成的短双链杂交体之间的结合减少，特别是如果形成的杂交体还包含错配的话。如果抗杂交体结合剂是抗杂交体抗体时尤其是这样。然而，如果短探针分子杂交到其靶区域，由此与它们的相邻组成员一起杂交，就形成了具有足够长度的双链杂交体，从而能被抗杂交体结合剂高效捕获，进而消除。此外，探针分子组与其靶区域杂交时形成的双链杂交体中通常不存在错配。如果利用抗杂交体抗体结合双链杂交体，长度为15nt至40nt、20nt至35nt、22nt至33nt、优选25nt至30nt的探针是特别合适的。最优选的是长度约为25nt的探针分子。
包含在一组中的探针分子与特定靶RNA，例如特定rRNA的靶区域互补。探针分子设计成与靶RNA的序列互补，从而能够序列特异性地结合其靶RNA。包含在一组中的各探针分子序列特异性地杂交于靶区域的不同部分。为了保证探针分子和靶区域之间的序列特异性配对，并避免探针分子与非靶RNA的非特异性杂交，优选的探针分子具有的序列与靶RNA100％互补，因而与靶RNA的靶区域的一部分100％互补。因此，如果一组的探针分子杂交到其靶区域，双链杂交体形成，其中不包含任何错配，除了靶RNA中的罕有突变事件外。
当杂交到所述靶区域时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中位于彼此邻近的位置。在所述杂交体中，邻近探针分子彼此间隔不大于20nt、15nt、10nt、7nt、5nt、4nt、3nt、2nt或1nt。当一组中的所有探针分子杂交到它们的靶区域时，所产生的双链杂交体基本上跨越并因此覆盖靶区域。如果各相邻的探针分子之间存在核苷酸缺口，它们比探针分子的长度要小。形成的双链杂交体中的探针分子越接近，消除性能更好。优选地，在所述杂交体中，相邻探针分子彼此间隔不大于3nt、2nt或1nt。如果在形成的双链杂交体中，相邻的短探针分子彼此非常接近，该双链杂交体因特定基团的效应而进一步稳定。优选地，一组中的两种或多种，更优选所有探针分子在形成的双链杂交体中是彼此毗连的，因此，一探针分子的第一核苷酸直接跟随，从而紧跟在前探针分子的末端核苷酸等。当杂交于靶RNA的靶区域时，在这样的毗连设置中毗连探针分子之间不存在核苷酸缺口。此类毗连的短探针分子非常类似于较长的探针分子，然而，邻近探针分子的毗连核苷酸之间不存在磷酸二酯键，也称为缺口。对于可实现的特异性和消除性能，此类毗连设计有很大的优势。如上所述，短探针分子不太可能错配结合于非靶RNA，因为它们的解链温度对于有效结合而言过低。因此，采用例如严格的杂交条件不难除去与非靶RNA非特异性退火的单个探针。此外，即使杂交于非靶RNA，抗杂交体结合剂对它们的识别也较差，如果错配存在的话，此外由于它们的长度短进一步造成识别较差。当使用抗杂交体抗体作为抗杂交结合剂时尤其是这样。如此降低了非特异性结合事件的捕获和消除。藉此显著改善特异性。然而，当与其靶区域杂交时，短探针分子由基团效应而稳定。一组的探针分子在所形成的双链杂交体中彼此相邻，因此非常接近。由此稳定了杂交体。特别是，毗连探针分子的末端核苷酸碱基之间的堆积相互作用使得形成的杂交体中毗连的短探针分子的退火稳定。例如，缺口提供的稳定性的估计自由能为至少-1.4kcal/mol，最大可以为-2.4kcal/mol。因此，与各单独的探针分子，甚至邻近间隔的探针分子相比，毗连的探针分子更加难以从靶区域解离。因此，与各个单独的探针分子的解链温度相比，当毗连探针分子成组杂交于它们的靶区域时，探针分子的解链温度升高。如此能在使用较短的探针分子时进一步提高杂交特异性，并采用甚至更严格的杂交条件。因此，使用毗连探针分子的特别优势在于，一组中各探针分子的末端核苷酸碱基之间的堆积相互作用强力稳定了与靶RNA形成的双链杂交体。不希望束缚于理论，但据信利用本文所述的毗连短探针分子(例如长度为35nt或更小)支持靶RNA的松弛，从而支持双链杂交体的形成和抗杂交体结合剂，优选抗杂交体抗体的结合。此外，抗杂交体结合剂尤其良好地识别毗连探针分子形成的长双链杂交体，从而进一步提高特异性和有效性。例如，使用抗杂交体抗体时，更多的抗杂交体抗体可结合形成的杂交体，进而提高捕获效率。优选地，一组中的至少两种探针分子，优选至少三种，优选一组中的所有探针分子是毗连的。
一组的探针分子所靶向的靶区域可以对应于全长靶RNA。如果靶RNA相当短，例如在5S RNA或5.8S RNA的情况下，这是可行的。对于长度为，例如300nt或更少或200nt或更少的如此短的靶RNA，每种靶RNA探针分子用一组探针分子就足够了，如实施例所示。然而，如果需要，也可以用于多于一组的探针分子以便消除短的靶RNA。根据一实施方式，靶区域是包含在较大靶RNA中的较小区域。优选地，靶区域对应于靶RNA的保守区。例如，已知不同的rRNA类型包含在不同物种之间高度保守的区域。优选由特定组的探针分子靶向相应的保守靶区域。靶区域优选在不同的物种中是保守的，并且是这样一个区域，其描绘了在至少两个不同物种，优选至少两个不同真核物种中的高度同源性，优选在至少二个真核生物物种之间显示至少90％、更优选至少95％和最优选至少为100％的同源性。靶区域优选至少在人、小鼠和大鼠中是相应保守的。除了人、大鼠和小鼠，其它哺乳动物或甚至其它真核生物也可以用相同的探针分子靶向，特别是在rRNA作为靶RNA的情况下，因为真核生物，尤其是哺乳动物中存在高度同源性。探针分子优选靶向并由此杂交选自不同物种的靶RNA，优选杂交人、小鼠、大鼠、仓鼠、猪和兔所有物种的靶RNA，特别是rRNA。备选的设计可以靶向，例如不同的细菌物种，不同的植物物种或其它分类群。探针分子的设计应与非靶RNA的杂交最少或者不发生。
一组中的探针分子所杂交的靶区域的尺寸可以选自：50nt至500nt、50nt至350、50nt至250nt、75nt至225nt、100nt至200nt、100nt至175nt，优选100nt至150nt。靶区域的大小还取决于靶RNA的总长度及其序列，因为优选选择在靶RNA中保守的靶区域，还优选在不同物种之间保守的，但不存在于非靶RNA中的，以便最大程度降低非特异性消除。当一组中的探针分子与它们的靶区域杂交时，所形成的双链杂交体的大小对应于靶区域的大小，其优选范围选自：优选50nt至500nt、50nt至350、50nt至250nt、75nt至225nt、100nt至200nt、100nt至175nt，最好在100nt至150nt。此类杂交体的长度也能被抗杂交体抗体良好识别。
根据一实施方式，一组探针分子包含2至15、3至10、2至8、2至7、2至6、3至6或4至6种不同的探针分子。待使用的探针分子数量取决于它们的长度，并应能获得优选具有如上所述的50nt至500nt、优选75nt至225nt、优选100nt至150nt的所需尺寸的双链杂交体，如果一组邻近探针分子杂交于靶区域的话。当使用较短的探针分子时，在一组中最好包含更多种探针分子，例如6至15种，优选10至15种，以实现所需长度和稳定的杂交体。如上所述，用于本发明方法中用于消除靶RNA的邻近探针分子的至少一部分优选具有毗连的设计。优选地，一组内的至少两种，优选至少三种探针分子，优选一组中的所有探针分子具有毗连设计。优选地，用于靶向特定靶RNA的至少一个，优选至少两个，优选所有的探针分子组包括两种或多种毗连探针分子。优选地，一组中的所有探针分子是毗连的。
探针分子的GC含量可介于10％和95％之间。优选地，大多数使用的探针分子，优选至少50％、更优选至少70％的探针分子的GC含量在30％至70％，更优选40％至60％。具有相应GC含量的优点在于退火温度升高，从而再次提高了杂交反应的特异性。
特别是对于下一代测序应用，必须有效消除不需要的靶RNA，否则有太多对不需要的靶RNA，例如rRNA进行测序从而浪费测序能力的风险。例如，考虑到rRNA构成RNA中的大多数(约90％)，即使只有5％的相应rRNA未被捕获，也会严重降低后续测序反应的效率。因此，完全而有效地消除不需要的靶RNA非常重要。在靶RNA分子较长的情况下，这是具有挑战性的任务，因为靶RNA可以是或可以变得片段化。在此，同样重要的是要注意，各个靶RNA的尺寸可以有很大不同，例如在真核rRNA类型的情况中。5S rRNA的尺寸小于150nt，而28S RNA的尺寸大于4.500nt。因此，由于其尺寸较长，未完全消除28S RNA的风险也较高。为了确保有效除去靶RNA，特别是尺寸为至少250nt、至少300nt、至少400nt、或至少500nt的较长靶RNA，即便靶RNA被片段化，也优选使用探针集合。探针集合包括两组或多组探针分子，其中包含在探针集合中的各组探针分子靶向于特定靶RNA中不同的靶区域。优选地，所述靶区域存在于靶RNA中500nt或更小、450nt或更小、400nt或更小、350nt或更小、300nt或更小、250nt或更小、200nt或更小或150nt或更小的距离内。不同的靶区域之间的距离越小，靶RNA的消除越有效，即便在片段化RNA的情况下，因为靶RNA片段包含至少一个靶区域，因此可以被有效捕获并由此自初始RNA组合物中除去的可能性就有所增加。此外，利用更多的探针分子为抗杂交体结合剂提供更多的结合位点，因此增加了有效捕获靶RNA的机会，即便在片段化的情况下。因此，优选利用包括多组探针分子的探针集合，其中包含探针集合中的各组探针分子靶向同一靶RNA内的不同靶区域，并且其中所述不同靶区域分布在靶RNA的全长上。因此，根据一实施方式，利用探针集合消除特定的靶RNA，其中，探针集合包括两组或多组探针分子，并且其中各组探针分子靶向于靶RNA中的不同靶区域，并且其中所述靶区域分布在所述靶RNA的全长上。优选均匀分布。如上所述，优选毗连的探针分子设计，因为这可以提高性能。在探针集合中，用于靶向于特定靶RNA的至少一组、至少两组、更优选所有组的探针分子宜包括两种或多种毗连的探针分子。优选地，相应探针分子组内的所有探针分子与组成员毗连。然而，可能无法为所有的探针分子组和/或包含在探针集合的各组中的全部探针分子设计毗连的探针分子。然而，优选在所述探针集合中主要使用毗连的探针分子。根据一实施方式，包含在探针集合中的至少50％、至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％或至少98％的所有探针分子与它们的组成员毗连。
如本文所述，利用一组或多组探针分子靶向于靶RNA并由此将其从含RNA的组合物中除去。然而，除了上述的一组或多组的探针分子，利用单个探针分子也落在本发明的范围内。因此，这些单个探针分子不是设置成一组。例如，如果靶RNA的序列不允许为特定的靶区域专门设计多个邻近的短探针分子以及由此的一组探针分子，然而，又想要靶向该特定靶区域，以便获得，例如上述的均匀分布，这是可行的。如果额外利用此类额外的单个探针分子，它们的长度也优选小于100nt、优选小于50nt。最优选的，它们具有与包含在一组或多组探针分子中的探针分子大致相同的长度(+/-5nt，优选完全相同的长度)。
如实施例所示，本发明方法实现的靶RNA消除效率至少为95％、优选至少为98％、优选至少为99％。采用本文所述的策略和探针设计可以实现至少99.5％、甚至99.9％的效率。如实施例所示，即便对于片段化的RNA，也能实现这种优异的消除效率。
探针分子是多核苷酸探针。合适的探针尺寸如上所述。此外，可利用包含RNA和DNA核苷酸或包含经修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物的探针分子，只要能形成为所用的抗杂交体结合剂特异性识别的序列特异性双链杂交体。所述探针分子优选DNA多核苷酸，因此形成RNA/DNA杂交体。所使用的探针分子优选化学合成的DNA分子。可以任选地对探针分子进行修饰。例如，可对单链DNA探针分子进行修饰，以确保探针分子不带入测序文库，并相应地不在测序反应中出现。例如，可以对探针分子进行修饰，例如封闭，以防止文库构建过程中的适配体连接，或可掺入标签，例如生物素标签，以使未结合的探针分子降解或自溶液中分离。相应修饰的例子包括但不限于O-甲基或双脱氧核苷酸的存在。然而，根据一实施方式，未用亲和标签，例如生物素对探针分子进行修饰。也可在分离杂交体/结合剂复合物后采用酶消化，例如使用DNA酶来除去过量的未结合探针。
对于杂交，探针分子的使用浓度选自：每探针分子50nM至10μM，优选50nM至500nM。技术人员也可确定合适的浓度。如实施例所示，每探针分子100nM的浓度对于长度至少为20nt的探针分子可以很好地起作用。对于较小的探针，优选更高的浓度。
为支持在探针分子和靶RNA之间特异性地形成双链杂交体，优选在步骤a)中加入杂交溶液。优选利用杂交缓冲液。合适的杂交缓冲液是现有技术中熟知的，因此，在此无需作任何具体的说明。基本上可利用任何缓冲的微酸至微碱性溶液(例如，pH值为6-9)，只要该盐浓度是适合于特异性杂交。例如，可利用2X SCC作为最终杂交溶液。
此外，为确保探针分子与其靶RNA有效杂交，优选对初始的含RNA组合物进行变性。此变性步骤，例如去除RNA中的二级结构，从而确保探针分子随后可以与它们的靶区域杂交。可在将探针分子和/或杂交溶液加入初始RNA组合物之前或之后进行变性。根据一实施方式，可将包括含RNA组合物的混合物、杂交溶液和探针分子在至少65℃、优选至少70℃的温度下加热，例如至少3分钟、优选至少5分钟用于变性。在所述变性温度下，优选75℃或更低，最优选约70℃下进行10分钟或更少、7分钟或更少，优选约5分钟的短温育时间已经足以变性RNA。因此，较长的温育时间没有必要，但是当然如果需要的话也可以使用。此外，业已发现，抗杂交体结合剂也可以存在于所述RNA变性步骤期间，并在采用上述变性条件下维持其功能，尤其是在75℃或更低，最优选约70℃的温度以及7min或更少，优选约5min的短温育时间下。由于直接包含了抗杂交体结合剂，由此抗杂交体结合剂相应存在于RNA变性和杂交期间，这是特别方便的，因为节省了处理步骤。在此实施方式中，步骤a)和b)同时进行。变性条件的选择应尽可能降低RNA降解。此外，杂交期间可以存在RNA酶抑制剂，以便尽可能降低RNA酶导致所含RNA的降解。可将RNA酶抑制剂，例如掺入杂交缓冲液。
在步骤a)中，在靶RNA与探针分子之间产生序列特异性双链杂交体。因此，每使用一组探针分子形成一双链杂交体。如上所述，所述双链杂交体可以在邻近的探针分子之间包括小间隙。然而，出于上述原因，优选毗连的探针设计，其中杂交的探针分子之间相应不存在核苷酸缺口。如果利用相应设计多组探针分子和由此的探针集合靶向于靶RNA内的几个靶区域的话，可对较长的靶RNA进行标记以便通过几个相应的双链杂交体消除。在能使一组或多组的探针分子中的探针分子与相应的互补RNA退火形成双链杂交体的条件下发生杂交。采用适合于所用的特定探针分子和杂交缓冲液的杂交条件。例如，所述探针分子和含RNA的组合物可以温育合适的杂交时间，优选至少为约5至约120分钟、约10至约100分钟、约15至约80分钟、约20至约60分钟、约25分钟至约40分钟以及列举范围内的任何数字，因此时间足以允许探针分子与它们的靶RNA退火。杂交条件可包括至少约40℃、优选至少约45℃、更优选至少约50℃的杂交温度。合适的杂交温度还取决于所用探针分子的长度和所用的杂交溶液。合适的杂交溶液如上所述，也可由技术人员确定。合适的杂交温度-特别适合于长度范围在20-35nt的探针分子-可选自一范围，包括但不限于45℃至65℃，优选50℃至约60℃，以及列举范围内的任何数字。对于给定的靶RNA和给定的探针分子，本领域普通技术人员不难通过常规实验确定所需的杂交条件和杂交时间。本领域普通技术人员将进一步了解，杂交的时间和温度可以相对彼此进行优化。可以通过降低或升高温度或降低或升高盐浓度/离子强度，通过加入去污剂或有机溶剂(例如DMSO，甲酰胺等)来控制严格杂交条件，不限于此。
步骤b)
在步骤b)中，所产生的双链核酸杂交体由结合所形成的双链核酸杂交体(分别结合众多形成的杂交体)的分子捕获。此类分子在本文中称为抗杂交体结合剂。由此，形成了杂交体/结合剂复合物，其中此类复合物可以包括由至少一个抗杂交体结合剂结合的至少一个双链杂交体。如本文所述，两种或多种抗杂交体结合剂分子可结合于一种双链杂交体。步骤a)和b)可以同时进行(也参见实施例)，或者可单独进行。
双链核酸杂交体的特异性结合剂包括但不限于，抗体、抗体片段和蛋白，例如RNA酶H。在一方面，与所形成的双链杂交体结合的抗体被用作抗杂交体结合剂，相应的抗体也称为抗杂交体抗体。由于特异性较高，相比于，例如RNA酶H，优选利用抗杂交体抗体。抗杂交体抗体不与包含错配的杂交体良好结合，另外，利用抗杂交体抗体对在从上述单个探针分子形成杂交体的情况中进行的捕获效率不高。RNA酶H可消化包含在错配杂交体中的RNA。因此，本发明优选利用长度为35nt或更小的探针分子的组合，特别是当将上述毗连探针设计与抗杂交体抗体连联用四时，对于提高特异性，同时实现高消除效率特别有利。所以，可以用双链杂交体特异性的抗体或抗体片段捕获本发明形成的双链杂交体。随后，我们将参考抗杂交体抗体描述合适的和优选的实施方式。然而，所述的描述同样适用于抗杂交体抗体片段，例如Fab片段或能够特异性结合所形成的杂交体的其它合适的抗杂交体结合剂。
抗杂交体抗体对于双链杂交体，优选RNA/DNA杂交体具备特异性。为确保不结合双链RNA，对RNA/DNA杂交体的高特异性是有利的。本领域技术人员会理解，可利用多克隆或单克隆抗杂交体抗体。在一方面，利用单克隆抗体，其支持捕获步骤中的高严格温育温度。
在本发明的一方面，利用衍生自杂交瘤细胞系的单克隆抗RNA/DNA杂交体抗体。此类杂交瘤细胞系描述于美国专利号4,865,980、美国专利号4,732,847和美国专利号4,743,535。杂交体特异性单克隆抗体也可以采用本领域的标准技术制备。杂交体特异性单克隆抗体可同时用于捕获和检测靶核酸。适于特异性结合形成杂交体的其它结合剂也可用作结合剂用于杂交体的捕获。
形成的杂交体与抗杂交体结合剂温育足够长的时间，从而使抗杂交体结合剂能结合并由此捕获双链杂交体。藉此，形成了双链杂交体/结合剂复合物。抗杂交体结合剂可以游离存在于溶液中或可固定于固体载体上。在一方面，利用固定于支持物上的抗杂交体结合剂，如抗杂交体抗体。可采用本领域的标准技术实现固定化。支持物包括但不限于：反应容器，包括微量滴定板(其中一个或多个孔用抗杂交体结合剂官能化，优选用抗杂交体抗体官能化)、颗粒、磁性颗粒、柱、板、膜、滤纸和试纸条或可在分离技术中使用的任何其它固体支持物。可以利用任何支持物，只要它能分离液相。优选小且具有高表面积的颗粒，例如直径约0.1μm至20μm、0.25μm至15μm、0.5μm至10μm和0.75μm至5μm的颗粒。当利用磁性颗粒作为抗杂交体结合剂的固体支持物时，例如具有超顺磁性、顺磁性、铁磁性或铁磁特性，可借助磁场，例如利用永磁体方便地分离结合有杂交体/结合剂复合物的相应磁性颗粒。还可以通过过滤分离颗粒。
抗杂交体抗体可以是单克隆或多克隆的。在一个方面，所述抗体是单克隆抗体。在一个方面，所述抗体通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)接头偶联于支持物。在一方面，所述支持物由聚合物颗粒，如聚苯乙烯珠提供。在一方面，用颗粒稀释缓冲液稀释偶联于结合剂，优选抗体的颗粒。颗粒稀释缓冲液有助于尽可能降低珠上蛋白的变性。合适的颗粒稀释缓冲液是现有技术中已知的。
如上所述以及实施例所示，抗杂交体结合剂还可以游离在溶液中。然后可由第二结合剂捕获形成的杂交体/结合剂复合物以简化复合物的分离，这将结合步骤c)中进行说明。第二结合剂可以固定于适用于分离技术的固体支持物，也可以存在于步骤a)和/或步骤b)期间。基本上可利用任何固体支持物，包括上文结合实施方式描述的，其中抗杂交体结合剂直接固定于固体支持物上。此外，以下也落在本发明的范围内：由另一结合剂结合杂交体/结合剂复合物，例如包含在该复合物内的抗杂交体结合剂，所述另一结合剂游离在溶液中以便实质性标记复合物以供消除，然后使用结合所述另一结合剂的第二结合剂，从而也间接结合，相应捕获杂交体/结合剂复合物。
在一方面，进行温育步骤用于将抗杂交体抗体与形成的双链杂交体结合。温育可以在室温下或在升高的温度下进行。如果形成的杂交体的结合以及由此的捕获与探针分子和靶RNA的杂交同时发生，可采用上述升高的温度。温育时间可以为足以进行捕获的约5至约120分钟、约10至约100分钟、15至约80分钟、20至约60分钟或约25至约50分钟，以及所述范围内的任何数字。此外，如上所述，也可同时进行杂交和捕获，如此减少了准备时间。在所述温育期间，可以对组合物并且优选进行搅拌，例如振荡。本领域技术人员应该理解，温育时间、温度和/或振荡条件可以视需要改变以实现其它捕获动力学特征。
根据一实施方式，该方法优选包括在有探针分子的存在下，最好也在有抗杂交体结合剂存在下，在合适的杂交溶液，例如2×SSC缓冲液中，在至少70℃下对纯化的总RNA进行至少3分钟、优选至少5分钟，但更优选少于10min的变性。将所得混合物在50℃温育30分钟，优选同时搅拌该混合物。在该实施方式中，杂交和捕获(步骤a)和b))同时发生，考虑到处理时间，这是有利的。如果抗杂交体结合剂不固定于固体支持物上，变性的杂交混合物与包含固定的第二结合剂的固相接触，并如上所述对得到的混合物进行温育，所述第二结合剂能结合并由此捕获抗杂交体结合剂，因此能捕获所形成的杂交体/结合剂复合物。可将与固定的杂交体/结合剂复合物所结合的固体支持物与剩余样品分离。例如，如果颗粒，如磁性颗粒用作固体支持物，可在步骤c)中利用磁体或通过过滤方便地除去颗粒和相应结合的复合物，从而提供消除了不需要的靶RNA的RNA组合物。如果使用柱作为固体支持物，复合物被保留在柱中，而不需要的靶RNA消除的组合物可以作为流出物收集。
步骤c)
在双链杂交体结合以及由此的捕获之后，捕获的杂交体与剩余的组合物分开，从而提供靶RNA消除的组合物。如果抗杂交体结合剂与相应形成的杂交体/结合剂复合物固定在固体支持物上，分离是特别容易的。上文描述了合适的固体支持物，本领域技术人员可以利用这些固体支持物和合适的分离程序，从而能将固体支持物与剩余样品分开。如上所述，可将抗杂交体抗体，例如偶联于固相，然后可将结合于固体支持物的杂交体/结合剂复合物与剩余的样品分开，从而提供靶RNA消除的组合物。例如，可将抗杂交体抗体偶联于磁性颗粒，这可以利用磁体或通过过滤分离。该实施方式是优选的，因为它与已有的手工或机器人系统兼容。为利用磁场处理磁性颗粒，现有技术中存在不同的系统可与本发明联用来处理结合有杂交体/结合剂复合物的磁性颗粒。根据一实施方式，磁性颗粒收集在反应容器的底部或侧面，而剩余的液体样品从反应容器中除去，留下结合有杂交体/结合剂复合物的所收集磁性颗粒。可通过，例如倾析或抽吸取出相当于靶RNA消除组合物的剩余样品。此类系统是现有技术中熟知的，因此无需在此详细描述。在已知用于处理磁性颗粒的替代系统中，将磁体投入反应容器来收集磁性颗粒，所述磁体通常覆有包覆或外壳。然后可除去携带所结合的杂交体/结合剂复合物的磁性颗粒，从而留下靶RNA消除的组合物。由于相应的系统是现有技术中熟知的，也可以商品化购得(例如凯杰公司-QIAGEN)，无需在此详细描述。在已知用于处理磁性颗粒的进一步替代系统中，可将包含磁性颗粒的样品吸入移液管尖端，通过将磁体应用于，例如移液管尖侧，从而将磁性颗粒收集在移液管尖端。然后，可从移液管尖端释放对应于靶RNA消除组合物的剩余样品，而携带所结合的杂交体/结合剂复合物的所收集磁性颗粒因磁体而保持在移液管尖端。此类系统也是现有技术中熟知的，并且也可商品化购得(例如BioRobot EZ1，凯杰公司)，因此，在此无需任何详细的描述。然而，与任何其它颗粒一样，还可通过其它方式，例如过滤来分离磁性颗粒。还可以利用自动化系统(例如，QIAcube，凯杰公司)进行过滤。
根据另一实施方式，以下方案是可行的，如果抗杂交体结合剂未固定于固体支持物，利用以第二结合剂官能化的固相支持物，所述第二结合剂结合杂交体/结合剂复合物。细节及适宜的固体支持物如上所述。例如，该第二结合剂可结合抗杂交体结合剂，由此能将杂交体/结合剂复合物与剩余的组合物分离。例如，第二结合剂可以是G蛋白或A蛋白，如果利用抗杂交体抗体作为抗杂交体结合剂，它们是合适的。固定于固体支持物的所述第二结合试剂也可以是步骤a)和/或b)中已经存在的，考虑到处理时间，这是有利的。也有可能有实现分离的其它结构，这些结构是本领域技术人员熟知的。
通过将杂交体/结合剂复合物与剩余的组合物分离，从剩余的RNA组合物中有效地除去了不需要的靶RNA。由此，获得靶RNA消除的组合物，以供进一步使用，例如用于扩增方法、微阵列分析、表达分析和/或用于NGS应用。例如，靶RNA消除的RNA组合物可用于构建测序文库。
靶RNA
靶RNA可以是初始RNA组合物中存在的任何不希望的RNA。靶RNA可包括任何序列，只要它凭借其序列可以与剩余的感兴趣RNA群体相区分，从而能序列特异性地设计探针分子。靶RNA可基于任何标准进行选择，包括序列、功能或它们的组合。如本文证实的，可以采用本发明的方法从初始的含RNA组合物中同时消除多种靶RNA。
根据一实施方式，待消除的靶RNA选自：rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和丰富的蛋白质mRNA。优选地，一类或多类rRNA作为靶RNA，相应的靶RNA得到消除。
处理真核样品时，待消除的rRNA优选是真核rRNA，宜选自：28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16S rRNA。优选消除上述rRNA类型中的至少两种、至少三种、更优选至少四种，其中在靶rRNA中优选消除18S rRNA和28S rRNA。根据一实施方式，靶向并由此消除所有上述的rRNA类型。可利用各靶rRNA类型特异性的一组探针分子或探针集合消除所述靶rRNA。如上所述，对于较长的靶RNA，例如18S rRNA和28S rRNA，优选利用相应包含两组或多组探针分子的探针集合，从而靶向并由此消除所述靶RNA。优选地，用于消除特定rRNA的探针分子组或探针集合适合于消除不同真核样品中相应的rRNA，所述样品优选至少来自人、小鼠和大鼠样品，优选还包括其它哺乳动物样品。由于rRNA在这些物种之间高度保守，因此可设计能特异性消除相应靶rRNA的探针集合的两组或多组探针分子或一组探针分子，而无论物种来源。
此外，除了28S rRNA和18S rRNA外，优选还靶向并由此消除其它非编码rRNA物质，如12S和16S真核线粒体rRNA分子。因此，根据一实施方式，利用靶向并由此消除12S和16S真核线粒体rRNA分子的一组或多组探针分子或探针集合。此外，可消除质体rRNA，例如叶绿体rRNA作为靶RNA，例如在处理植物样品中总RNA的情况下。
根据一实施方式，消除靶RNA，所述靶RNA选自：23S、16S和5S rRNA原核rRNA。处理原核样品时，这是特别可行的。优选地，利用相应rRNA类型特异性的一组或多组探针分子或探针集合消除所有这些rRNA类型。
此外，如上所述，还可采用本发明方法来特异性消除丰富的蛋白质编码mRNA。根据所处理的样品，包含在样品中的mRNA可能主要对应于某些特定的丰富mRNA类型。例如，要进行分析，例如测序血样的转录组时，包含在样品中的大多数mRNA会对应于球蛋白mRNA。然而，许多应用对于所包含的球蛋白mRNA的序列不感兴趣，因此，即便是蛋白质编码mRNA，球蛋白mRNA也代表了此应用不需要的靶RNA。为了除去此类不需要的丰富mRNA序列，优选使用一组探针分子，或根据待消除的丰富mRNA的长度，使用特异性靶向各丰富的mRNA作为靶RNA的探针集合。由此，各丰富的mRNA，例如在血液样品中的球蛋白mRNA，可以容易地从样品中消除，因此，不会增加后续测序反应的负担。在此，为用户提供除去丰富的蛋白质mRNA序列(一种特定的样品类型，例如在血液样品中的蛋白质mRNA)所设计的探针分子组或特异性探针集合也落在本发明的范围内。此类探针分子组或探针集合还可用于从初始的含RNA组合物中消除不同类型rRNA的探针分子组和/或探针集合。
如上所述，如果要从初始的含RNA组合物中消除两类或更多类靶RNA，优选利用一组探针分子，或者，特别是在靶RNA较长的情况下，待消除的各靶RNA利用一探针集合。因此，根据一实施方式，利用多组探针分子和/或探针集合，其中的每一个都旨在从含RNA的初始样品中除去不同类型的靶RNA。如上所述，探针集合包含两组或多组的探针分子，其中各组中包含的探针分子靶向并由此与特定靶RNA内的特定靶区域杂交。优选利用多组探针分子和/或探针集合从初始的含RNA组合物中消除三种或更多种，优选四种或更多种，最优选所有的28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16SrRNA。此外，如果需要的话，可以利用单一探针分子，例如，可掺入待消除的特定靶RNA的探针集合中。
实施例中还描述了可用于本发明方法并适合消除28S rRNA和18S rRNA的探针集合以及适合消除5.8S rRNA和5S rRNA的探针分子组，具体参见表1。
根据其中至少28S rRNA作为靶RNA被消除的实施方式，利用28S rRNA探针集合，其中，包含在28S rRNA探针集合中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，至少八组，至少十组，最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子。在此实施方式中，包含在相应毗连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在28S rRNA探针集合的至少三组中，优选在至少六组中，所有包含的探针分子与它们的组成员是毗连的。根据一实施方式，包含在28S rRNA探针集合的各组中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的所有探针分子与它们的组成员是毗连的。包含在28S rRNA集合中的探针分子优选长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。28S rRNA探针集合优选包含表1所示28S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，更优选至少八组，至少十组，最优选所有组。
根据其中至少18S rRNA作为靶RNA被消除的实施方式，利用18S rRNA探针集合，其中，包含在18S rRNA探针集合中的至少一组，优选至少两组，更优选至少三组，至少四组，最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子。在此实施方式中，包含在相应毗连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在18S rRNA探针集合的至少两组中，优选在至少三组中，所有包含的探针分子与它们的组成员是毗连的。优选地，包含在18S rRNA探针集合的各组中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的。包含在18S rRNA探针集合中的探针分子优选长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。18S rRNA探针集合优选包含表1所示18S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组，优选至少两组，更优选至少三组，至少四组，最优选所有组。
根据其中至少5.8S rRNA作为靶RNA被消除的实施方式，利用至少一组探针分子。所述探针分子组优选包含两种或多种毗连的探针分子，优选在5.8SrRNA(探针)组中包含的所有探针分子是毗连的。包含在5.8S rRNA(探针)组中的探针分子优选长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。表1显示了特别适合于靶向并且由此消除5.8S的5.8SrRNA探针分子组。
根据其中至少5S rRNA作为靶RNA被消除的一实施方式，利用至少一组探针分子。所述探针分子组优选包含两种或多种毗连的探针分子，优选在5SrRNA(探针)组中包含的所有探针分子是毗连的。包含在5.8S rRNA(探针)组中的探针分子优选长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。为消除5S rRNA，利用探针分子组，其包含一种或多种，优选所有的表1所示的用于5S的探针分子。
根据其中至少真核线粒体12S rRNA作为靶RNA被消除的一实施方式，利用探针集合，其中12S线粒体rRNA探针集合中包含的探针分子的长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小。优选地，12S线粒体rRNA探针集合所含的至少一组，优选至少两组，最优选所有的探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子。根据一实施方式，包含在12S线粒体rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的。在此实施方式中，包含在相应毗连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在12S线粒体rRNA探针集合的至少两组中，所有包含的探针分子与它们的组成员是毗连的。
根据其中至少真核线粒体16S rRNA作为靶RNA被消除的一实施方式，利用探针集合，其中16S线粒体rRNA探针集合中包含的探针分子的长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小。优选地，16S线粒体rRNA探针集合所含的至少一组，优选至少两组，最优选所有的探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子。根据一实施方式，包含在16S线粒体rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的。
根据优选的实施方式，在本发明方法中利用上述的28s rRNA探针集合和18s rRNA探针集合，以提供其中28s rRNA和18s rRNA作为靶RNA被消除的靶RNA消除的组合物。优选地，还利用上述5.8s rRNA(探针)组，上述5s rRNA(探针)组、上述12S线粒体rRNA探针集合和16S线粒体rRNA探针集合来消除作为靶RNA的5.8s rRNA、5s rRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16S rRNA基因。藉此，获得靶RNA被消除的组合物，其消除了可能干扰后续分析，例如下一代测序应用的大多数常规rRNA。
可以根据现有技术已知的方法从感兴趣样品中分离核酸，以提供初始的含RNA组合物，例如总RNA。因此，可从样品中分离总RNA，以提供初始的含RNA组合物。本文利用广义的术语“样品”，旨在包括各种含有RNA的来源和组合物。所述样品可以是生物学样品。示例性的样品包括但不限于，细胞样品、环境样品、从身体获得的样品，特别是体液样品和人、动物或植物组织样品。具体例子包括但不限于：全血、血液制品、血浆、血清、红细胞、白细胞、血沉棕黄层、尿、痰、唾液、精液、淋巴液、羊水、脑脊液、腹腔积液、胸膜积液、囊肿的液体、滑液、玻璃体液、房水、囊液、眼冲洗液、眼吸出物、肺灌洗、骨髓抽吸物、肺吸出物、组织活检样品、拭子样品，动物，包括人或植物组织，包括但并不限定于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺的样品，细胞培养物以及从上述样品获得的裂解物、提取物或材料和从上述样品中获得的部分，或可存在于样品上或样品中的任何细胞和微生物及病毒，等等。包含RNA的从临床或法医环境中获得的材料也落在术语“样品”的意义中。样品优选是衍生自真核生物或原核生物，优选来自人、动物、植物、细菌或真菌的生物学样品。样品宜选自下组：细胞、组织、肿瘤细胞、细菌、病毒和体液，例如血液、血液制品，如血沉棕黄层、血浆和血清，尿、液体、痰、粪便、CSF和精子、上皮拭子、活检、骨髓样品和组织样品，优选器官组织样本，如肺、肾或肝。术语“样品”也包括经处理的样品，如保存的、固定的和/或稳定化的样品。这些样品的非限制性实例包括已保存的含细胞样品，例如福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE样品)或用交联或非交联固定剂，例如戊二醛或PAXgene Tissue系统处理的其它样本。例如，外科手术后，借助FFPE常规保存的肿瘤活检样品，这可能会危及RNA的完整性，特别是可能会降解所含的RNA。如实施例所示，优选采用公开的方法来除去不需要的片段化靶RNA。因此，初始RNA样品可以包含修饰的或降解的RNA或由它们构成。修饰或降解可以是，例如用一种或多种防腐剂处理所致。
本文所用的术语“核酸”尤其是指包含核糖核苷和/或脱氧核糖核苷的聚合物，所述核糖核苷和/或脱氧核糖核苷通常经由亚单位间的磷酸二酯键共价键合，但是在一些情况下也经由硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等等。DNA包括但不限于所有类型的DNA，如基因组DNA、线性DNA、环状DNA、质粒DNA、cDNA和游离循环DNA，例如肿瘤来源的或胎儿DNA。优选地，DNA是基因组DNA或cDNA。RNA包括但不限于hnRNA、mRNA、非编码RNA(ncRNA)，包括但不限于rRNA、tRNA、lncRNA(长非编码RNA)、lincRNA(长基因间非编码RNA)、miRNA(微小RNA)、siRNA(小干扰RNA)，还包括游离的循环RNA，如肿瘤来源的RNA。
步骤d)
在任选的步骤d)中，可除去未结合的探针分子。例如，可以进一步纯化靶RNA消除的组合物。相应的纯化步骤可用于，例如除去未结合的短探针分子，缓冲液组分等和/或浓缩RNA。用于相应纯化方法的例子包括但不限于：提取、固相提取、聚硅酸纯化、利用硅胶柱或磁性二氧化硅珠分离、磁性颗粒纯化、酚-氯仿提取、阴离子交换色谱(使用阴离子交换表面)、凝胶电泳、沉淀(如醇沉淀)和它们的组合。还可采用技术人员已知的任何其它核酸分离技术。根据一实施方式，在有至少一种离液剂和至少一种醇的存在下，将RNA结合于固相来进一步纯化靶RNA消除的组合物。优选地，通过结合于含硅的固相，优选聚硅酸玻璃纤维来分离RNA。可商品化购得合适的方法和试剂盒，例如RNeasy系统，特别是RNeasy MINELUTE清理试剂盒和其它RNA制备试剂盒。这里还可利用自动化方案，例如在QIAsymphony系统、EZ1仪器QIAcube(凯杰公司-QIAGEN公司)或MagNApure系统(罗氏公司-Roche)上运行的那些。未结合的探针分子也可以通过其它合适的手段，例如如果使用标记的探针分子的话，可采通过DNA酶消化除去或亲和除去。此外，如所述的，可以探针分子进行修饰以防止它们在测序文库中显示。
步骤e)
如果制备靶的RNA消除组合物用于后续的测序反应，本发明方法则优选包括：
e)对包含在靶RNA消除组合物中的RNA进行测序。
根据一实施方式，通过下一代测序进行测序。在此，不同的方法是可行的。由于利用逆转录酶将RNA转化成cDNA已经显示能引起可同时干扰转录物适当表征和定量的偏差和伪像，单分子直接RNA测序技术得以开发。根据一实施方式，采用直接测序方法对包含在靶RNA消除的组合物中的RNA分子直接测序，例如Ozsolak等，2009(直接RNA测序(Direct RNA sequencing)，Narure第461卷，第814-819页)所述的。此方法能够以大规模平行的方式直接测序RNA分子，而无需将RNA转化为cDNA或其它可能有偏差的样品操作，例如连接和扩增。
根据一实施方式，RNA的测序包括：
i)制备适于大规模平行测序的测序文库；
ii)对包含在测序文库中的分子进行平行测序。
此类测序文库可包含多种双链分子，优选适于大规模平行，因此，适用于下一代测序。制备相应的测序文库亦是在转录组测序中的当前标准。测序文库中存在的多种双链核酸分子可以是线性的或环状的，优选地，包含在测序文库中的核酸分子是线性的。适于下一代测序的测序文库可以采用现有技术中已知的方法来制备。测序文库中的双链分子优选DNA分子。为此目的，可将RNA逆转录为cDNA。制备适合下一代测序的测序文库的方法通常包括获得DNA片段，任选随后进行DNA修复和末端抛光，最后往往进行NGS平台特异性适配体连接。根据一实施方式，通过，例如剪切，如声波处理、水力剪切、超声、雾化或酶促片段化使得所得到的cDNA片段化，以提供适合随后测序的DNA片段。然而，优选在RNA水平上，故在cDNA合成之前，进行片段化至所需长度。例如，包含在靶RNA消除组合物中的不需要的RNA可以通过RNA的镁-催化水解进行片段化。片段的长度可以根据随后用于测序的下一代测序平台的测序能力来选择。所获得的片段的长度一般在1500bp或更少、1000bp或更少、750bp或更少、600bp或更小、优选500bp或更少，因为这对应于最新下一代测序平台的测序能力。优选地，所得片段的长度范围是100-1000bp、125-800bp、150-700bp、175-600bp和200-500bp。各片段的大小特别适合于转录组测序，且可以采用普通的下一代测序平台对相应的短片段进行有效测序。然而，也可利用更长的片段，例如，如果采用允许较长序列读取的下一代测序方法，或为了成对末端测序(paired-end sequencing)或配对末端测序(mate-pair sequencing)，例如，为了分析转录物结构和可变剪接同种型。此外，当然更小的片段尺寸(例如，从10或15bp开始)也是可行的，取决于用于制备测序文库和感兴趣序列的起始材料。例如，如果处理从包含小RNA或由小RNA(在miRNA的情况下，尺寸为200nt或更少、100nt或更少、50nt或更少、或甚至25nt，)构成的RNA得到的cDNA，文库可以包括相应的短片段。
随后可采用现有技术已知的方法修复片段化的DNA并作末端抛光，藉此提供，例如平端或核苷酸突出端，如A突出端。
此外，优选地，适配体连接在DNA片段的5'和/或3'端，优选在所得片段的两端。适配体的具体设计取决于要用的下一代测序平台以及本发明的目的，基本上可利用任何用于供下一代测序用测序文库制备的适配体。适配体序列提供了已知的序列组成，从而能进行，例如后续文库扩增和/或测序引物退火。作为适配体，可利用序列已知的双链或部分双链核酸。适配体可具有平端、具有3'或5'突出端的粘性末端，可由Y形适配体或茎环形适配体提供。Y形适配体描述于，例如US7,741,463，茎环形适配体描述于，例如US2009/0298075，关于适配体的具体设计通过引用纳入本文。优选地，适配体的长度为至少7、优选至少10、更优选至少15个碱基。适配体的长度范围优选在10至100个碱基、优选15-75个碱基、更优选20-60个碱基。相同或不同的适配体可用于片段的3'和5'端。在两端利用相同类型的适配体，例如Y形或茎-环形适配体的优点在于，在文库制备过程中不会因适配体错配而丢失片段，这在进行少量DNA操作时有优势。
因此，优选地，制备的测序文库包含随机片段化的双链DNA分子或由它们组成，所述双链DNA分子在其3'和5'端与适配体序列相连。适配体提供已知的序列，因此提供已知的模板以便扩增和/或测序引物。任选地，适配体也可以提供单独的索引，从而允许后续合并两个或更多个测序文库，然后再进行测序。该实施方式将在下文进一步详细描述。可采用酶操作在体外产生测序文库，但优选不需要活细胞的DNA允许转化和随后的克隆细胞选择、培养和DNA分离。制备测序文库的合适方法也描述于Metzker，2011，Voelkerding，2009和WO12/003374。
单次NGS运行通常产生足够的读取值，以便一次测序几个测序文库。因此，合并策略和索引方法是降低每份样品成本的实用方法。相应的多路复用策略也可与本发明的教导联用。能进行多路复用的特征可以在不同阶段并入。根据一实施方式，利用含有文库标签和分化特定序列基序的适配体(“条形码”或“索引”适配体)产生测序文库。为各测序文库提供单独的和由此文库特异性的适配体，所述适配体提供文库特异性序列。优选地，除索引区域外，各适配体包括共同的通用区域，它提供可用于所有文库中的PCR引物和/或测序引物的已知模板。得到测序文库后，可以将它们合并并在一次运行中进行测序。提供含相应索引适配体的测序文库的DNA片段由此能够在同一测序运行中后续测序几个测序文库，因为可以基于索引适配体的文库特异性序列区分测序的片段。测序后，属于各文库的各序列可以通过随后在所得序列中发现的文库特异性索引进行排序。相应的索引方法是现有技术中已知的，索引适配体也可商品化购得，并且在，例如适用于Illumina平台的DNA样品制备试剂盒中提供。
如上文讨论的，优选在下一代测序平台上进行测序。所有NGS平台都有一共同的技术特征，即，大规模平行测序，例如在流动室中空间上隔开的克隆扩增的或单个DNA或cDNA分子，或通过产生油-水乳液。在NGS中，测序是通过聚合酶介导的核苷酸延伸反复循环而进行，或在一个共同的形式中，通过寡核苷酸连接的迭代循环进行。采用本发明方法获得测序文库后，单分子的克隆分离和随后的扩增通过体外模板制备反应，例如乳液PCR(焦磷酸测序，落罗氏454；半导体测序，Ion Torrent；连接SOLiD测序，Life Technologies；合成测序，Intelligent Biosystems)，流动池上的桥接扩增(例如，Solexa/Illumina)，通过Wildfire技术的等温扩增(Life Technologies)，或滚环扩增产生的rolonies/纳米球(Complete Genomics,Intelligent Biosystems,Polonator)。测序技术，例如Heliscope(Helicos)，SMRT技术(Pacific Biosciences)或纳米孔测序(OxfordNanopore)能直接测序单分子，而无需先进行克隆扩增。本发明的背景还描述了可采用的合适NGS方法和平台，其称为相应的公开内容。可以利用根据本发明教导得到的靶RNA消除组合物中制备的测序文库，在相应平台上进行测序。
可以比对所得的序列信息以提供靶区域的序列。在此，可采用现有技术中已知的方法。合适的方法是，例如Metzker，2010中综述的，包括但不限于将读取值与参比转录物比对。
根据第二方面，提供了对包含在样品中的感兴趣RNA分子进行测序的方法，包括：
a)获得含RNA的组合物，优选从样品中分离总RNA；
b)采用第一方面的方法消除所述含RNA的组合物，优选总RNA中不需要的靶RNA，藉此提供靶RNA消除的组合物；
c)任选除去未接合的探针分子，例如通过纯化靶RNA消除的组合物；
d)对包含在靶RNA消除的组合物中的RNA分子进行测序。
上文已结合第一方面的方法描述了关于各步骤和可用于从含RNA组合物中消除不同类型的不需要靶RNA的一组或多组探针分子和/或探针集合的细节，可参考以上内容。优选在步骤a)中获得纯化的总RNA。在步骤b)中可利用下文和权利要求中描述的试剂盒以便除去一类或多类不需要的靶RNA。根据一实施方式，测序包括制备适合大规模平行测序的测序文库以及对该测序文库所含的分子进行平行测序。上文结合第一方面的方法对细节进行了描述，可参考相应内容。根据一实施方式，利用下一代测序平台进行测序，其中所述下一代测序平台宜选自桥联扩增测序平台或乳液扩增测序平台。上文结合第一方面的方法对细节进行了描述，可参考相应的内容。
根据第三方面，提供了用于消除含RNA组合物中的靶RNA的试剂盒，包括：
a)一组或多组消除靶RNA的探针分子，其中，探针分子组具有以下特征：
i)该组包含长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含在所述组中的探针分子与靶RNA的靶区域互补；
iii)与所述靶区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中彼此相邻；
和
b)适合与探针分子和靶RNA之间形成的双链杂交体进行结合的结合剂。
上文结合第一方面的方法详细描述了关于探针设计、探针集合的使用、待消除的不同靶RNA、抗杂交体结合剂以及它们的合适和优选的实施方式的细节，权利要求中也描述了这些细节。可参考相应的内容。实施例中还描述了合适的探针分子组和探针集合。根据一实施方式，试剂盒装有28S rRNA探针集合，其中，该28S rRNA探针集合中所含的至少一组、优选至少两组、至少四组、至少六组、至少八组、至少十组、最优选所有组的探针分子包含两种或更多种毗连的探针分子。在该实施方式中，包含在相应毗连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在28S rRNA探针集合的至少三组中，更优选至少六组中，所含的所有探针分子与它们的组成员是毗连的。根据一实施方式，28S rRNA探针集合的诸组中所含的所有探针分子的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％与它们的组成员是毗连的。28S rRNA探针集合中所含的探针分子的长度优选为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。28S rRNA探针集合优选包含表1所示28SrRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，更优选至少八组，至少十组，最优选所有组。根据一实施方式，除上述28S探针集合外，试剂盒优选装有18S rRNA探针集合，其中，该18S rRNA探针集合中所含的至少一组、优选至少两组、更优选至少三组、至少四组、最优选所有组的探针分子包含两种或多种毗连的探针分子。在该实施方式中，包含在相应毗连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在18S rRNA探针集合的至少两组中，更优选至少三组中，包含的所有探针分子与它们的组成员是毗连的。优选地，18S rRNA探针集合的诸组中包含的探针分子的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％与它们的组成员是毗连的。18S rRNA探针集合中所含的探针分子的长度优选为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小，最优选在20nt-25nt的范围内。18S rRNA探针集合优选包含表1所示18S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组，优选至少两组，更优选至少三组，至少四组，最优选所有组。此外，该试剂盒可以包含上文结合方法描述的5.8S rRNA组，上文结合方法描述的5S rRNA组，上文结合方法描述的12S线粒体rRNA探针集合和/或上文结合方法描述的16S线粒体rRNA探针集合。通过利用相应的试剂盒，可以获得消除了可能干扰后续分析的最常见rRNA的靶RNA消除组合物。根据一实施方式，包含在试剂盒中的探针分子是长度为35nt或更小，优选30nt或更小的单链DNA分子。优选地，包含在试剂盒中的抗杂交体结合剂是RNA/DNA杂交体特异性的抗杂交体抗体。
如实施例所示，联用杂交体捕获技术与本文所述的特异性探针设计能实现更完整的靶RNA的更完整消除，相比于现有技术方法更好的保护以免降解，以及相比于现有技术方法更好的保护以免非特异性消除。如上所述，本发明方法的特异性更高，因为特异性是在两个水平上获得，即，组设置中所含短探针的特异性和抗杂交体结合剂的捕获，因为抗杂交体结合剂只将具有显著匹配序列的那些探针识别为底物。因此，采用本发明方法不会捕获大多数的非特异性结合事件。本发明技术可自动化进行，因此，非常适合于高通量应用。关键优点是高效率除去最高99.5％以上，甚至99.9％的不希望的靶RNA，例如所有类型的核糖体RNA，其它RNA类型的无偏差保留，优选消除各物种，包括人、小鼠和大鼠的靶RNA，例如rRNA，改进信噪比以便灵敏地检测低丰度RNA。
本申请要求2012年9月18日提交的在先申请US 61/702,594和2012年9月18日提交的EP 12 006 534.7的优先权，它们的全部公开内容通过引用并入本文。
本发明不限于本文公开的示范性方法和材料，与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方式。数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不是对本发明各方面或实施方式的限制，这些标题可参考说明书作为整体阅读。
本文所用的术语“溶液”尤其是指液体组合物，优选水性组合物。它可以是仅有一相的均质混合物，但包含固体组分(如沉淀物)的溶液也属于本发明的范围。
本文参考核苷酸nt显示的尺寸，相应尺寸范围是指链长，因此用于描述单链以及双链分子的长度。所述核苷酸在双链分子中是成对的。因此，如果本文描述一双链分子具有100nt的链长，所述双链分子包含100bp。
根据一实施方式，本文所述的主题是指由相应步骤或成分构成的主题，在方法的情况下包括某些步骤，在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包括某些成分。最好选择和结合本文所述的优选实施方式，优选实施方式的相应组合产生的特定主题也属于本发明。
附图简述
图1显示了为制备靶RNA消除的RNA组合物以供下一代测序应用的本发明方法与现有技术方法之间的差异，本发明方法基于联用多组短探针与杂交体捕获，而现有技术方法采用直接捕获方法，利用标记的长探针分子。在左手侧，显示了本发明方法。右手侧的方法对应于现有技术。
在步骤A中，所述探针分子与靶RNA杂交。在图1所示的本发明方法中(左侧)，利用包括两组探针分子的探针集合。各组靶向同一靶RNA中的不同靶区域。各组包括三种短的、毗连的单链DNA探针分子。当与它们的靶区域杂交时，因包含在一组中的毗连探针分子的序列特异性退火而形成较长的双链杂交体。在其中包含在一组中的所有探针分子呈毗连状的所示实施方式中，形成双链杂交体，其中各组中的探针分子之间不存在核苷酸间隙。然而，邻近探针分子的毗连核苷酸之间不存在磷酸二酯键。相应的缺口示于图1。毗连设计因上文解释的毗连探针分子之间的堆积作用而稳定所形成的双链杂交体。还显示了单一的探针分子，其错配(由X表示)地非特异地结合于非靶RNA。然而，由于利用短探针分子，单探针分子与非靶RNA的非特异性结合事件不产生稳定的杂交体，因为短分子的退火温度通常太低，从而不能在错配的情况下产生稳定的杂交体。因此，可以采用严格的杂交条件除去非特异性结合的短探针分子。在利用生物素标记的较长探针的现有技术方法中(右手侧)，与非靶RNA形成更稳定的杂交体，因为探针长度较长而对不匹配具有更好的耐受性。因此，与现有技术方法相比，在探针杂交的水平上，本发明方法因利用了短探针分子而显著更具有特异性。
在步骤B中，为捕获探针分子和靶RNA之间形成的双链杂交体，本发明方法利用抗杂交体结合剂，此处为抗杂交体抗体(由Y表示)。抗杂交体抗体结合的表位的大致尺寸通常约为20nt。通常，RNA/DNA杂交体越长，抗杂交体抗体的结合效率越好，相应地，靶RNA的捕获和由此的消除更有效。此外，抗杂交体抗体不耐受或只耐受少数的错配。因此，形成的双链杂交体越完美，抗杂交体抗体的结合效率越好。靶RNA和一组探针分子之间形成的较长完美杂交体的识别优于形成的短杂交体，如果单个探针含错配地与非靶RNA杂交的话。因此，特异性因进行的杂交体捕获步骤而进一步提高。现有技术方法不包括此类中间选择步骤，因此，在现有技术中，特异性仅源自探针。此外，由于利用一组探针分子靶向靶RNA内的特定靶区域，其中，所述靶区域优选具有100nt和250nt之间的长度，多种抗杂交体抗体可结合所得到的双链杂交体，其具有优选在100nt和250nt之间的相应长度。这使去除效率得以提高。
在步骤C中，分离所形成的杂交体/结合剂复合物，以除去靶RNA。在图1所示的本发明实施方式中，利用G蛋白官能化的珠(G-B)，其结合抗杂交体抗体，由此结合并从而捕获所形成的杂交体/结合剂复合物。然而，因单个探针分子与非靶RNA的非特异性结合而可能形成的双链杂交体，出于上述原因，抗杂交体抗体不与之结合、不会被捕获，因此不会在步骤C中与剩余样品分离。因此，采用本发明方法，非特异性形成的双链杂交体不在步骤C中除去，所以不会被消除。因此，本发明获得的靶RNA消除组合物保留所需RNA类型的多样性，例如在消除rRNA作为不需要的靶RNA之时保留了其它polyA mRNA、非腺苷酸化的mRNA、非编码RNA和调控RNA，等等。此外，与现有技术中采用的亲和标签方法不同，根据本发明方法，只有杂交的探针被抗杂交体抗体识别，因此被捕获。这导致非常高的消除率和快速反应时间。然而，在利用链霉亲和素官能化的珠(S-B)的现有技术方法中，非特异性产生的杂交体也被消除，因为它们也为分离所用的亲和标签(此处是生物素)所标记。本发明方法的优异效率和优良特异性还表现在随后的实施例中。如其中所示，即使本发明方法对于消除靶RNA，例如rRNA是高效的，非特异性消除的所需RNA显著较低，从而无偏差地保留了其它的RNA种类。
图2显示了本发明方法获得的18S消除RNA组合物得到的数据，其中利用长度为25nt(蓝线)或50nt(红线)的探针分子(参见实施例II)。a)对照RNA，其显示18S和28S rRNA的两个峰(无消除)；b)250μL 1％hc(杂交体捕获)珠得到的结果。C)500μl 1％hc珠得到的结果。
图3显示了采用本发明方法进行18S RNA消除的RT-PCR结果。随着珠用量的增加，形成的杂交体/结合剂复合物的去除得以改善，18S rRNA显著消除。18S rRNA消除样品中保留的原始18S rRNA不到0.5％(参见实施例II)。
图4显示了28S rRNA的相应PCR结果，它不受杂交体捕获过程的影响，证明该方法的特异性(参见实施例II)。
图5显示了两个测序运行(参见实施例VII)的结果。在第一测序运行中，比较了Ribo-Zero(Epicenter)、RiboMinus(英杰公司-Invitrogen)、采用以下实施方式的本发明方法和polyA富集：a)其中抗体共价连接于磁性珠的实施方式(发明A)，和b)其中利用游离抗-杂交体抗体和G蛋白珠进行捕获的实施方式(发明B)，图5a)显示了所获得的生物型分布。可以看出，与现有技术rRNA消除方法相比，本发明方法最佳地保留了蛋白编码mRNA。此外，引入的偏倚较少，RNA样品的天然多样性得到保留。图5b)显示第二测序运行的结果。在此，RiboMinus未重新测试，因为第一测序运行的结果表明其性能不高。相反，测试了两种不同的Ribo-Zero试剂盒(Ribo-Zero and Ribo-Zero gold)，并与本发明方法的实施方式进行比较。在此，利用游离的抗杂交体抗体和G蛋白官能化珠进行捕获，其中在一个实施方式中，利用磁体进行分离并且在其它实施方式中，利用旋转过滤器。此外，polyA富集作为对照。
图6显示了与polyA-富集方法的结果相比，各消除方法(本发明，两种现有技术方法)测序后，绘制成蛋白质编码基因的读取数值，以确定消除方法的特异性(参见实施例VIII)。浅灰色圆点表示在poly-A富集中丢失的无polyA-尾的mRNA的读取值(例如组蛋白)。结果表明，与现有技术的rRNA消除方法相比，本发明方法保留了原始样品中表现出的mRNA概况，因为相比于现有技术方法(0.31和0.27)，获得了接近1的显著较高R2值(0.86)。
图7显示了rRNA消除的特异性以便更好地表示蛋白质编码基因(参见实施例VIII)。将采用本发明方法(见右列)或现有技术消除方法(RZ＝RiboZero，见左列；RM＝RiboMinus，见中间列)消除rRNA后存在于样品中的蛋白质编码基因的数量与polyA富集作比较。消除基因的数量和消除的幅度均显著低于本发明。
图8显示本发明方法能消除总RNA中含量低至10ng的靶RNA，同时保持消除性能(参见实施例X)。通过消除与阳性对照之间的delta Ct检测到，本发明方法观察到等效性能。不应消除的RNA(此处为：beta肌动蛋白)即使在低浓度下也得到了保留。
图9显示了利用长度为12/13nt的探针分子得到的结果(参见实施例XI)。图9证明，如果将探针分子置于彼此相邻，特别是如果利用多个探针分子，消除结果得到改善。结果证实了上文解释的增加邻近性的益处，并显示使用更多的探针也更有利。
图10显示不同水平毗连性对b-肌动蛋白的特异性(参见实施例XII)。
实施例
I.材料与方法
1.5S、5.8S、18S、28S的DNA寡核酸探针
通过取得人、小鼠、大鼠核糖体RNA的参比序列并将它们在ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)中比对来设计探针。分析得到的文件中在3个物种之间具有100％同源性的区域，并设计相应探针。虽然人、小鼠和大鼠用作主要的设计标准，但这些探针与各种其它物种中的rRNA高度同源，其中在其它哺乳动物中的同源性最高，但在所有真核生物中发现显著的同源性。因此，可同时为更多的物种设计多组探针分子和探针集合，而不限于此处所显示的。植物、细菌和其它生物都可以具有所设计的特异性探针集合，它们将是同样有效的。还可以为任何意欲消除的特定核酸序列，例如球蛋白RNA(例如，在全血制剂中)设计探针。可以相同的方式消除线粒体和质体rRNA。
探头设计的首要考虑是提供包含连续(“堆叠”)探针分子的各组。一组的探针分子靶向的靶区域的尺寸约为总计100-150nt。对于较长的rRNA(18S，28S)，制备包含多组探针分子的探针集合，其中各组靶向靶RNA内的不同靶区域。将靶区间隔开，以便尽可能均匀地覆盖所述靶核糖体RNA，从而能有效除去片段化以及完整的rRNA。探针设计的次要考虑是GC(优选40-60％)。实施例中设计并测试了长度介于10nt和50nt之间的探针。优选25nt的长度，从而在较小的探针长度(增加特异性和确保随后干扰较少)和消除性能(较长探针的效率略高)之间作出平衡。这种结合确保非常高的消除性能，同时确保高特异性，特别是如果利用本文所述的毗连探针设计的话。当为本文所述原因利用抗杂交体抗体时，尤其能实现这点。
所用的25聚体示于表1。显示了靶向靶RNA中靶区域的探针分子组。探针名称提供靶RNA(例如，5S rRNA)，物种(HMR＝人、小鼠、大鼠)，靶rRNA上的核苷酸位置(例如2)和探针长度(25)的信息。可以看到，为消除短RNA(5S RNA和5.8S RNA)，每种靶RNA利用一组探针分子。为靶向5S RNA，该组中包含的四种探针分子均是毗连的。靶向5.8S RNA的组中包含的第一和第二以及第三和第四探针分子是毗连的，同时3nt的缺口隔开第二和第三探针分子。为靶向18S RNA，利用由五组探针分子构成的探针集合，其中各组包含6种探针分子。除了第一组，所有组的探针分子是毗连的，其中1nt的缺口隔开第一探针分子与第二探针分子。因此，包含在18S rRNA探针集合中的95％以上的探针分子与它们的组成员是毗连的。为消除长28S rRNA，利用包含13组探针分子的探针集合。可以看到，除了组III，利用的各组探针分子中整组中的所有探针分子均是毗连的。在组III中，利用邻近的探针分子，然而，其中当杂交于靶区域时，探针分子之间存在20nt或更小的缺口，藉此形成双链杂交体。
表1：探针分子
组 5S RNA组 SEQ ID NO
5S组I 5S_HMR_2_25 GCGTTCAGGGTGGTATGGCCGTAGA SEQ ID NO 1
5S组I 5S_HMR_27_25 CTTCCGAGATCAGACGAGATCGGGC SEQ ID NO 2
5S组I 5S_HMR_52_25 ACTAACCAGGCCCGACCCTGCTTAG SEQ ID NO 3
5S组I 5S_HMR_77_25 TTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGT SEQ ID NO 4
5.8S RNA组
5.8S组I 5.8S_HMR_1_25 CCGAGTGATCCACCGCTAAGAGTCG SEQ ID NO 5
5.8S组I 5.8S_HMR_26_25 GCTGCGTTCTTCATCGACGCACGAG SEQ ID NO 6
5.8S组I 5.8S_HMR_54_25 GCAATTCACATTAATTCTCGCAGCT SEQ ID NO 7
5.8S组I 5.8S_HMR_79_25 GAAGTGTCGATGATCAATGTGTCCT SEQ ID NO 8
18S rRNA探针集合
18S组I 18S_HMR_35_25 AGACATGCATGGCTTAATCTTTGAG SEQ ID NO 9
18S组I 18S_HMR_61_25 TTTCACTGTACCGGCCGTGCGTACT SEQ ID NO 10
18S组I 18S_HMR_86_25 AACTGATTTAATGAGCCATTCGCAG SEQ ID NO 11
18S组I 18S_HMR_111_25 AGGAGCGAGCGACCAAAGGAACCAT SEQ ID NO 12
18S组I 18S_HMR_136_25 ATTACCACAGTTATCCAAGTAGGAG SEQ ID No 13
18S组I 18S_HMR_161_25 CCCGTCGGCATGTATTAGCTCTAGA SEQ ID NO 14
18S组II 18S_HMR_428_25 TTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATC SEQ ID NO 15
18S组II 18S_HMR_453_25 CTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCG SEQ ID NO 16
18S组II 18S_HMR_478_25 CGGGAGTGGGTAATTTGCGCGCCTG SEQ ID NO 17
18S组II 18S_HMR_503_25 ATTTTTCGTCACTACCTCCCCGGGT SEQ ID NO 18
18S组II 18S_HMR_528_25 GGCCTCGAAAGAGTCCTGTATTGTT SEQ ID NO 19
18S组II 18S_HMR_553_25 TAAAGTGGACTCATTCCAATTACAG SEQ ID No 20
18S组III 18S_HMR_819_25 CTCGGGCCTGCTTTGAACACTCTAA SEQ ID NO 21
18S组III 18S_HMR_844_25 ATTCCTAGCTGCGGTATCCAGGCGG SEQ ID NO 22
18S组III 18S_HMR_869_25 AATAGAACCGCGGTCCTATTCCATT SEQ ID NO 23
18S组III 18S_HMR_894_25 TGGCCTCAGTTCCGAAAACCAACAA SEQ ID NO 24
18S组III 18S_HMR_919_25 TGCCCCCGGCCGTCCCTCTTAATCA SEQ ID NO 25
18S组III 18S_HMR_944_25 TTCACCTCTAGCGGCGCAATACGAA SEQ ID NO 26
18S组IV 18S_HMR_1234_25 TGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGC SEQ ID NO 27
18S组IV 18S_HMR_1259_25 TGTCCGGGCCGGGTGAGGTTTCCCG SEQ ID NO 28
18S组IV 18S_HMR_1284_25 GCTATCAATCTGTCAATCCTGTCCG SEQ ID NO 29
18S组IV 18S_HMR_1309_25 CCACCACCCACGGAATCGAGAAAGA SEQ ID NO 30
18S组IV 18S_HMR_1334_25 TCCACCAACTAAGAACGGCCATGCA SEQ ID NO 31
18S组IV 18S_HMR_1359_25 TATCGGAATTAACCAGACAAATCGC SEQ ID NO 32
18S组V 18S_HMR_1604_25 ATTGCAATCCCCGATCCCCATCACG SEQ ID NO 33
18S组V 18S_HMR_1629_25 GGGAATTCCTCGTTCATGGGGAATA SEQ ID NO 34
18S组V 18S_HMR_1654_25 CGCAAGCTTATGACCCGCACTTACT SEQ ID NO 35
18S组V 18S_HMR_1679_25 GTACAAAGGGCAGGGACTTAATCAA SEQ ID NO 36
18S组V 18S_HMR_1704_25 AATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGT SEQ ID NO 37
18S组V 18S_HMR_1729_25 ATCCGAGGGCCTCACTAAACCATCC SEQ ID NO 38
28S rRNA探针集合
28S组I 28S_HMR_282_25 TTGGGCTGCATTCCCAAGCAACCCG SEQ ID NO 39
28S组I 28S_HMR_307_25 CCTTAGATGGAGTTTACCACCCGCT SEQ ID NO 40
28S组I 28S_HMR_332_25 CTATCGGTCTCGTGCCGGTATTTAG SEQ ID NO 41
28S组II 28S_HMR_376_25 CTCTTCAAAGTTCTTTTCAACTTTC SEQ ID NO 42
28S组II 28S_HMR_401_25 ACGGTTTCACGCCCTCTTGAACTCT SEQ ID NO 43
28S组II 28S_HMR_426_25 GCGGACCCCACCCGTTTACCTCTTA SEQ ID NO 44
28S组II 28S_HMR_451_25 GGGTTGAATCCTCCGGGCGGACTGC SEQ ID NO 45
28S组III 28S_HMR_663_25 CGACCCCACCCCCGGCCCCGCCCGC SEQ ID NO 46
28S组III 28S_HMR_708_25 TGCGCCCGGCGGCGGCCGGTCGCCG SEQ ID No 47
28S组III 28S_HMR_746_25 GTCCCGGAGCCGGTCGCGGCGCACC SEQ ID NO 48
28S组IV 28S_HMR_1485_25 TGGAGAGGCCTCGGGATCCCACCTC SEQ ID NO 49
28S组IV 28S_HMR_1510_25 GGCCGGTGGTGCGCCCTCGGCGGAC SEQ ID NO 50
28S组IV 28S_HMR_1535_25 CCTCCCCGGCGCGGCGGGCGAGACG SEQ ID NO 51
28S组V 28S_HMR_1794_25 AATCATTCGCTTTACCGGATAAAAC SEQ ID NO 52
28S组V 28S_HMR_1819_25 AGATCGTTTCGGCCCCAAGACCTCT SEQ ID NO 53
28S组V 28S_HMR_1844_25 CCATTTAAAGTTTGAGAATAGGTTG SEQ ID NO 54
28S组V 28S_HMR_1869_25 CACGCCAGCGAGCCGGGCTTCTTAC SEQ ID NO 55
28S组VI 28S_HMR_1913_25 TTACCAAAAGTGGCCCACTAGGCAC SEQ ID NO 56
28S组VI 28S_HMR_1938_25 GTTCATCCCGCAGCGCCAGTTCTGC SEQ ID NO 57
28S组VI 28S_HMR_1963_25 ATCGGGCGCCTTAACCCGGCGTTCG SEQ ID NO 58
28S组VI 28S_HMR_1988_25 TTTCTGGGGTCTGATGAGCGTCGGC SEQ ID NO 59
28S组VI 28S_HMR_2013_25 CTGCTGTCTATATCAACCAACACCT SEQ ID NO 60
28S组VI 28S_HMR_2038_25 GATTCCGACTTCCATGGCCACCGTC SEQ ID NO 61
28S组VII 28S_HMR_2364_25 GCCCTAGGCTTCAAGGCTCACCGCA SEQ ID NO 62
28S组VII 28S_HMR_2389_25 CTGCGGCGGCTCCACCCGGGCCCGC SEQ ID NO 63
28S组VII 28S_HMR_2414_25 TTGCTACTACCACCAAGATCTGCAC SEQ ID NO 64
28S组VII 28S_HMR_2439_25 GCCTTCAAAGTTCTCGTTTGAATAT SEQ ID NO 65
28S组VII 28S_HMR_2464_25 TCACATGGAACCCTTCTCCACTTCG SEQ ID NO 66
28S组VII 28S_HMR_2489_25 CGACTGACCCATGTTCAACTGCTGT SEQ ID NO 67
28S组VIII 28S_HMR_2780_25 AGAGCTCACCGGACGCCGCCGGAAC SEQ ID NO 68
28S组VIII 28S_HMR_2805_25 TCCCCCGGATTTTCAAGGGCCAGCG SEQ ID NO 69
28S组VIII 28S_HMR_2830_25 GGCCCGGCGCGAGATTTACACCCTC SEQ ID NO 70
28S组VIII 28S_HMR_2855_25 GGAGACCTGCTGCGGATATGGGTAC SEQ ID NO 71
28S组IX 28S_HMR_3320_25 CGTCCAGAGTCGCCGCCGCCGCCGG SEQ ID NO 72
28S组IX 28S_HMR_3345_25 CGATCCACGGGAAGGGCCCGGCTCG SEQ ID NO 73
28S组X 28S_HMR_3831_25 ACCCGCGCTTCATTGAATTTCTTCA SEQ ID NO 74
28S组X 28S_HMR_3856_25 AGAGTCATAGTTACTCCCGCCGTTT SEQ ID NO 75
28S组X 28S_HMR_3881_25 TGACGAGGCATTTGGCTACCTTAAG SEQ ID NO 76
28S组X 28S_HMR_3906_25 CCATTCATGCGCGTCACTAATTAGA SEQ ID NO 77
28S组X 28S_HMR_3931_25 TAGGGACAGTGGGAATCTCGTTCAT SEQ ID NO 78
28S组X 28S_HMR_3956_25 GGCTGTGGTTTCGCTGGATAGTAGG SEQ ID NO 79
28S组XI 28S_HMR_4283_25 GTCAAACTCCCCACCTGGCACTGTC SEQ ID NO 80
28S组XI 28S_HMR_4308_25 ACCGTTTGACAGGTGTACCGCCCCA SEQ ID NO 81
28S组XI 28S_HMR_4333_25 GAGCTCGCCTTAGGACACCTGCGTT SEQ ID NO 82
28S组XI 28S_HMR_4358_25 TCCACGGGAGGTTTCTGTCCTCCCT SEQ ID NO 83
28S组XI 28S_HMR_4383_25 ATCAAGCGAGCTTTTGCCCTTCTGC SEQ ID NO 84
28S组XI 28S_HMR_4408_25 GTCTGTATTCGTACTGAAAATCAAG SEQ ID NO 85
28S组XII 28S_HMR_4676_25 CATGGCAACAACACATCATCAGTAG SEQ ID NO 86
28S组XII 28S_HMR_4701_25 TTCCTCTCGTACTGAGCAGGATTAC SEQ ID NO 87
28S组XII 28S_HMR_4726_25 ATACACCAAATGTCTGAACCTGCGG SEQ ID NO 88
28S组XII 28S_HMR_4751_25 CCCCATTGGCTCCTCAGCCAAGCAC SEQ ID NO 89
28S组XII 28S_HMR_4776_25 CATAATCCCACAGATGGTAGCTTCG SEQ ID NO 90
28S组XII 28S_HMR_4801_25 GGATTCTGACTTAGAGGCGTTCAGT SEQ ID NO 91
28S组XIII 28S_HMR_5088_25 CCAGAAGCAGGTCGTCTACGAATGG SEQ ID NO 92
28S组XIII 28S_HMR_5113_25 GCTCTGCTACGTACGAAACCCCGAC SEQ ID NO 93
28S组XIII 28S_HMR_5138_25 TTCAATAGATCGCAGCGAGGGAGCT SEQ ID NO 94
28S组XIII 28S_HMR_5163_25 CAAACCCTTGTGTCGAGGGCTGACT SEQ ID NO 95
2.抗-杂交体抗体和磁性珠
作为抗杂交体抗体官能化的磁珠(hc珠)，利用偶联于羧基化珠的抗杂交体抗体的1％固体溶液。或者，利用溶液中游离的抗杂交体抗体，然后由对抗体有亲和力的结合剂捕获，在实施例中，G蛋白官能化的磁珠，如BioMag G蛋白珠。
3.杂交缓冲液
加入20X SSC以便杂交。将10μl 20×SSC加入100μl组合物，从而获得2×SSC杂交液。杂交溶液含有RNA酶抑制剂，此处是抗RNA酶抗体。
4.方案
如果不作另外说明，从纯化的总RNA样品开始进行如下所述手动方案：
1 将适量的hc珠和不同的珠分装在磁架上。弃上清，保留珠。
2 混合RNA、探针和杂交缓冲液。
3 在70℃温育5分钟。
4 将杂交混合物传送给珠。
5 在50℃下温育30分钟，同时以900rpm震荡。
6 分离磁架上的珠。
7 除去含有rRNA消除样品的上清液。
如果利用“游离”的抗杂交体抗体和G蛋白偶联珠进行捕获，如hc珠所述，制备G蛋白珠，并在步骤2中将抗杂交体抗体加入杂交混合物。如上所述，短RNA变性不损害抗杂交体抗体的功能。
可立即测定或进一步处理(例如，通过RT-qPCR，制备测序文库)靶RNA消除的样品，或者也可在测定之前先，例如纯化以除去多余的探针、缓冲液成分等。可采用多种纯化和浓缩方法，包括二氧化硅柱、凝胶电泳、乙醇沉淀等。
II.通过靶向的探针和杂交体捕获去除18S rRNA
进行本实施例以显示原理验证。它表明本发明方法能够高效、特异性地除去靶向的核糖体RNA。利用从人、小鼠和大鼠18S核糖体RNA序列设计的DNA探针。6x50聚体(红线)或12x25聚体(蓝线)用于靶向作为靶RNA的18S RNA，将探针安排在三组中，各100nt，均匀分布在整个18S序列上。多组探针分子与总RNA接触，以使探针分子与18S靶RNA杂交。在其表面携带抗杂交体抗体的不同量磁性颗粒(hc珠)用于捕获所形成的RNA/DNA杂交体。通过应用磁场收集与形成的杂交体/结合剂复合物结合的磁性颗粒，并且与剩余的样品分离，以提供18S rRNA消除的RNA组合物，然后进行分析。
图2显示了不同方案制备的18S消除RNA组合物得到的数据。图a)显示对照RNA的结果(无消除)，由此显示了18S和28S核糖体rRNA的两个峰。图b)显示了250μL 1％hc珠得到的结果。利用包含25聚体探针分子的组仅可分辨小的18S峰(蓝线)。图c)显示500μl 1％hc珠得到的结果。两种探针混合物中18S峰均消失。重要的是，28S峰的大小不受本发明方法的影响，这显示了利用多组邻近探针分子的本发明杂交体捕获过程的特异性。图3显示了消除的PCR检测结果。利用QuantiFast试剂()，在RotorGene-Q循环仪上通过RT-PCR研究18S和28S核糖体RNA的相对消除。其显示随着珠用量增加，18S rRNA得以显著消除。在所用的测试设置的最好情况下，观察到delta Ct为7.88，表示大于200x消除，其意味着样品中保留的原始18S rRNA小于0.5％。因此，即使利用仅包含三组探针分子的探针集合靶向18S RNA，本发明方法也是高效的。如后续的实施例所示，增加探针集合中所含的探针分子组的数量能进一步提高消除效率。图4显示了28S rRNA不受杂交体捕获过程的影响，证明本发明方法的特异性。
如本文所述，随着特异性提高，优选利用长度为35nt或更小、或30nt或更小的较短探针，如25聚体，而非利用较长的探针长度，甚至优于利用长度为50nt的探针。因交叉杂交导致捕获非靶RNA的风险随着探针的长度而提高。如本文所述，优选利用较短的毗连探针，因为单个短探针太短，从而无法被抗杂交体抗体有效识别。例如，两个短探针交叉杂交于同一位置是极不可能的。
III.从5μg总RNA中除去18S、28S、5S和5.8S rRNA
在该实施例中，本发明的方法与现有技术方法(RiboMinus(英杰公司))进行比较。总RNA用作起始材料，采用两种方法同时消除5S、5.8S、18S和28SrRNA。通过qPCR分析两种方法获得的靶rRNA消除RNA组合物，并相对于按照相同方法处理的阳性对照定量。
表2显示了采用本发明方法或RNA消除方法RiboMinus(英杰公司)纯化后，各核糖体RNA的去除％。就效率而言，特别是对于较大的核糖体RNA，本发明方法优于现有技术方法RiboMinus(英杰公司)。
表2：
rRNA 本发明 RiboMinus
5S >99.99％ >99.99％
5.8S >99.99％ 99.13％
18S >99.99％ 98.43％
28S 99.51％ 92.30％
此外，通过优化杂交条件并28S rRNA的探针集合中利用多组探针分子，得到改善的结果，其中28S rRNA的消除效率也为99.97％和更高(见下文)。
IV.从降解的RNA中去除rRNA
为测试本发明方法除去作为靶RNA常见示例的降解rRNA的效率，在80℃下降解RNA30分钟以上，并在0分钟、10分钟、20分钟和30分钟采用本发明方法除去相应的含RNA组合物中的rRNA。表3显示了PCR分析获得的rRNA消除RNA的结果，各时间点针对对照作标准化。从RNA完整性数值(RIN)的降低可以得到以下结论，温育时间越长，RNA降解越高。即使在高度降解的RNA样品(RIN3.7)中，即使是长28S RNA，也实现了97％以上的消除效率。这表明，在降解并由此片段化的RNA的情况中，本发明方法也高度有效。
表3：片段化RNA的消除效率
rRNA除去 0分钟 10分钟 20分钟 30分钟
降解后的RIN 8.9 6.4 4.3 3.7
％18S rRNA消除 99.89％ 99.86％ 99.76％ 98.53％
％28S rRNA消除 99.73％ 99.5％ 99.25％ 97.08％
V.通过杂交体捕获消除rRNA的自动化
靶RNA消除后，可先进行净化步骤再构建文库。藉此可除去未结合的探针分子。RNeasy MinElute可用于此目的，该方法可以容易地在QIAcube自动进行。此外，本发明的杂交体捕获方法也非常适合于自动化，仅仅需要在两个温度下温育(1次优选振荡)和分离捕获的复合物。这些步骤也可以自动进行。根据一实施方式，可制备杂交混合物，可在70℃下离线变性RNA组合物。然后将分别制备的样品转移到QIAcube上的加热器/振动器，在那里加入珠并进行杂交和捕获。然后将反应(体系)转移至中央QIAcube位置的旋转柱，过滤珠，从而除去杂交体/结合剂复合物。弃去含除去的rRNA的过滤器旋转(柱)，利用QIAcube的RNeasy Minelute程序直接处理含rRNA消除的RNA组合物的流出物。对于各种过滤材料，分析用QIAcube处理后获得的Ct值。用QIAcube机器处理的所有样品与人工处理的样品在性能上等效，其中利用磁场除去磁性珠，10-12个循环优于相关的阳性对照(相当于高于99.9％消除)。β肌动蛋白用作特异性对照。
VI.采用本发明方法除去5μg总RNA中的18S、28S、5S、5.8S、12S mt和16S mt rRNA
如上所述进行消除，然而，还包消除12S线粒体(mt)rRNA和16S线粒体(mt)rRNA的探针。表4显示了对于采用本文所述方法同时消除作为靶RNA的各核糖体RNA，本发明获得的delta Ct值和相应的去除％。为消除5S、5.8S、18S和28S，利用材料中所述的组和探针集合(参见表1)，相应设计的探针集合用于消除12S和16S线粒体rRNA。测量通过qPCR进行。
表4：
核糖体RNA Delta Ct ％除去
18S 11.84 99.97％
28S 11.81 99.97％
5S 11.16 99.96％
5.8S 11.51 99.97％
12S mt 12.84 99.99％
16S mt 10.32 99.92％
可以再次看出，本发明方法能高效消除所有靶RNA。
VII.采用本发明方法或现有技术rRNA消除方法除去5μg总RNA中的18S、28S、5S和5.8S rRNA
采用不同的现有技术方法和本发明方法从总RNA样品中消除rRNA。总RNA用作起始材料，所有的方法消除了5S、5.8S、18S和28S rRNA。此外，采用本发明的探针设计消除12S和16S线粒体rRNA。作为现有技术方法，按照生产商的使用说明，采用polyA富集、Ribo-Zero(Epicentre)和Ribo-Minus(英杰公司)。也利用第二实验中使用的Ribo-Zero Gold试剂盒消除线粒体rRNA。
采用以下实施方式，在第一测序运行中实施本发明方法，其中抗杂交体抗体共价连接于磁珠(发明A)和其中利用游离的抗杂交体抗体和G蛋白珠进行捕获(发明B)。消除后，剩余的RNA通过MiSeq运行NGS分析，并分类为蛋白质编码RNA、rRNA、mt-rRNA、scRNA、miRNA与其它(参见图5-第一测序的结果)。利用Ensembl基因数据库和Bowite2作图进行RNA测定。在第二测序运行中，未重新测试RiboMinus，因为第一测序运行的结果表明其性能很低。相反，测试了两种不同的Ribo-Zero试剂盒(Ribo-Zero和Ribo-Zero Gold)，并与本发明方法的实施方式作比较。在此，利用游离的抗杂交体抗体和G蛋白官能化的珠进行捕获，其中在一个实施方式中，利用磁体进行分离，在其它实施方式中，利用旋转过滤器。如所述进行测序和RNA分类，其中snRNA作为额外类别(参见图5b-第二测序结果)。
如图5a)所示，本发明的rRNA含量为2％或更低；polyA富集和Ribo-Zero也表现出良好的rRNA去除。与此相反，现有技术方法RiboMinus的rRNA含量为28％。此外，采用RiboMinus和Ribo-Zero时线粒体rRNA仍存在，而采用本发明方法时它们已被消除。此外，Ribo-Zero强力富集了常规转录组分析中也兴趣不大的scRNA(7SL，Alu)，从而扭曲了RNA类型的自然分布。此外，可以看出，基于rRNA消除而非polyA RNA富集的方法(本发明，RiboZero，RiboMinus)相比于polyA富集保留更多感兴趣的非编码RNA种类(不含polyA尾)。如图5b)所示，在第二测序运行中确认了结果。本发明方法最好地保留了多种感兴趣RNA类型的天然分布，同时高效地消除不需要的靶RNA。因此，本发明通过提供改进的消除方法而作出显著贡献。
VIII.所得消除文库中偏差的分析
如上文讨论的，当通过杂交进行消除时，所需RNA有非特异性消除的风险。为检测本发明方法和现有技术消除方法的相对性能，将所有三种消除方法的蛋白质编码读取值与poly(A)文库进行比较。消除后，将样品制成文库并用Illumnia平台测序，深度约为100万读取值/样品。将对应于蛋白质编码基因的读取值与polyA富集样品构成的文库进行比较，其显示样品中mRNA的正常表示(normalrepresentation)。所有的结果均是来自MiSeq实验。基因计数进行标准化，并绘制成散点图，各文库对poly(A)。高度一致性表明蛋白质编码基因的表现未偏离polyA文库所见的。
从图6中可以看出，相比于RiboMinus(图6B)和Ribo-Zero(图6C)，本发明方法(图6a)最好地保留了PolyA mRNA的天然表现。浅灰色标识的基因是组蛋白，其是非腺苷酸化的mRNA。它们预计在消除文库中富集。结果证明，相比于现有技术的rRNA消除方法，本发明方法保留原始样品中存在的mRNA表现，因为相比于现有技术方法(0.31和0.27)，获得了接近1的显著较高的R2值(0.86)。因为rRNA探针和其它mRNA序列之间的相互作用导致rRNA消除方法有非特异性消除信息RNA的风险。从图7可以看出，消除的基因数和它们的消除因数在两种现有技术方法中显著高于本发明方法的。观察到的最大消除因数是10，而现有技术方法显示出消除因数最高50。因此，与现有技术方法相比，本发明方法显示显著较少的mRNA消除，以及最大消除水平降低。因此，本发明方法显示特异性显著改善，因为非特异性杂交较少，由此，不必要的蛋白质编码转录物消除较少。这表明本发明的非特异性杂交远低于现有技术方法。
总而言之，图6和7显示现有技术消除方法可能使得样品中蛋白质编码基因(polyA)RNA的表现有偏差，特别是通过非特异性除去非靶RNA。与此相反，本发明方法显示出与polyA富集更大的一致性，并保留其它RNA种类和蛋白质编码基因的天然表现。
IX.利用不同长度和浓度的探针集合消除5S rRNA和β-肌动蛋白mRNA
利用杂交体捕获抗体和短的堆叠rRNA探针的集合对RNA样品进行rRNA消除。探针长度为10、15、20或25个核苷酸/探针，并且使用浓度为100nm、1μM或10μM。使用以下各组：4×25聚体、5×20聚体、7×15聚体和10×10聚体。rRNA消除后，经实时PCR检测分析样品的5S RNA(表5)和β-肌动蛋白mRNA(表6)。一式两份分析的平均Ct值和标准偏差示于下表。
表5：5S rRNA
探针分子类型 100nM 1μM 10μM
10聚体探针 15.10+/-0.08 15.39+/-0.23 23.30+/-0.74
15聚体探针 17.98+/-0.14 25.46+/-0.24 25.25+/-0.20
20聚体探针 25.83+/-0.06 26.39+/-0.48 25.93+/-0.48
25聚体探针 27.24+/-0.03 27.20+/-0.06 27.27+/-0.15
就100nM和1μM测试设置而言，阳性对照的结果是15.55+/-0.11，就10μM测试设置而言，是15.16±0.14，测试分别进行。表5显示，在100nM的20和25聚体的情况中，用于捕获的抗杂交体抗体有效地消除了5S rRNA。进一步的实验表明，50nm的较低浓度也起作用。如果探针浓度增加至1μM，15聚体起作用，而10聚体在10μM的探针浓度下是可行的。该实施例表明探针分子的不同长度是可行的。
表6：β-肌动蛋白mRNA
探针类型 100nM 1μM 10μM
10聚体探针 23.75+/-0.16 23.64+/-0.01 21.86+/-0.56
15聚体探针 23.64+/-0.38 23.63+/-0.52 21.58+/-0.30
20聚体探针 24.41+/-0.46 23.70+/-0.30 21.83+/-0.20
25聚体探针 24.04+/-0.50 23.66+/-0.36 21.79+/-0.67
就100nM和1μM测试设置而言，阳性对照的结果是24.10+/-0.43，就10μM测试设置而言，是22.10+/-0.82，测试分别进行。
β-肌动蛋白mRNA与rRNA未从样品中共同消除。因此，本发明方法特异性消除rRNA，而没有mRNA的共同消除。
X.低浓度的短堆叠探针足以特异性消除rRNA
采用本发明方法，从各种浓度(1μg、0.25μg、0.1μg、0.025μg和0.01μg)的总RNA中消除18S和28S rRNA。消除后，通过实时PCR分析样品的18S rRNA、28S rRNA和β-actin mRNA。利用样品与阳性对照的比率来计算ΔCt值。
如图8所示，可以有效、特异性地消除rRNA，即使利用非常低量的总RNA输入材料(10ng)。
XI.rRNA消除效率随连续性和探针数量而增加
为分析探针数量和探针连续性对rRNA消除的影响，设计短的12/13聚体探针，这些探针或在靶rRNA内彼此相邻地退火或不相邻(300bp或600bp)。利用抗杂交体抗体进行rRNA消除，通过定量实时PCR检测分析消除样品的18SrRNA。两相邻和四相邻之间的区别类似于单个的或成对的相邻25聚体。八相邻类似于四倍的25聚体。图8示出了定量RT-PCR的结果。因此，人们可以精确定量到底有多少留下，而非依赖于delta Ct值。实验显示，利用相邻探针可实现的高连续性有益于采用杂交体捕获策略的rRNA消除。此外，增加相邻结合探针的数量也增加了rRNA消除的效率。
XII.使用抗杂交体抗体和短探针的rRNA消除效率
以下实验表明，抗杂交体抗体是特异性的，对即使完美匹配序列的短区域也不予识别。
下表显示18S特异性探针的不同混合物的消除效率(粗体)，以及识别20-25nt大小区域的抗体的必要性。该实验中使用的探针是12或13聚体。混合物1和混合物2采用了相同数量的探针，混合物2具有毗连探针设计。只有混合物2有效地去除了rRNA。这表明，如果不以毗连方式杂交，12-13nt不足以通过抗体识别，但由两个毗连探针杂交获得的25nt就足够了。与25-聚体匹配相比，更可能意外发生12-13nt匹配。如果使用生物素标记的探针，13聚体匹配足以拉下脱靶RNA，但在利用抗杂交体抗体时不够。
总探针 #区域 #邻近探针/区域 ％18S rRNA除去
混合物1 12 12 0 4.03％
混合物2 12 6 2 74.94％
混合物3 12 3 4 94.86％
混合物4 24 3 8 99.36％
图10显示了用上表所示混合物处理样品时，对β肌动蛋白的影响。条件之间没有差异，显示随着rRNA去除效率的提高，对非靶RNA没有影响。这再次表明了所获得的特异性。

Claims (28)

1.一种从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法，包括：
a)使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：
i)该组包括长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA中的靶区域互补；
iii)当与所述靶区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中处于彼此邻近定位；
b)利用结合双链杂交体的结合剂捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂复合物；
c)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供靶RNA消除的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当杂交到所述靶区域时，一组中的两种或多种探针分子在形成的双链杂交体中彼此毗连，或者其中，一组中的所有探针分子在形成的双链杂交体中彼此毗连。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述探针分子的长度选自35nt或更小、30nt或更小或25nt或更小，优选长度在10nt-35nt或15nt-30nt的范围内。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，利用探针集合消除特定的靶RNA，其中探针集合包含两组或多组探针分子，并且其中包含在该探针集合中的各组探针分子靶向于靶RNA中的不同靶区域。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在特定的靶RNA中，所述靶区域位于500nt或更小、450nt或更小、400nt或更小、350nt或更小、300nt或更小、250nt或更小、200nt或更小或150nt或更小的距离内。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，包含在探针集合中的至少85％、至少90％或至少95％的探针分子与它们的组成员毗连。
7.如权利要求1-6中一项或多项所述的方法，其特征在于，具有以下一种或多种特征：
i)所述靶区域基本上对应于所述靶RNA的全长；
ii)所述靶区域是在所述靶RNA中保守的区域；
iii)所述靶区域是在不同物种中保守的区域；
iv)所述靶区域是在所述靶RNA中保守的且至少在人、小鼠和大鼠中保守的区域；
v)与一组探针分子杂交的靶区域的尺寸选自：50nt至500nt、50nt至350、50nt至250nt、75nt至225nt、100nt至200nt和100nt至175nt；
vi)利用探针集合消除特定靶RNA，其中探针集合包括两组或多组探针分子，其中各组探针分子靶向靶RNA中的不同靶区域，并且其中所述靶区域分布在靶RNA的全长上；和/或
vii)其中所述靶RNA消除效率为至少95％、优选至少98％、优选至少99％、更优选至少99.5％、最优选至少99.9％。
8.如权利要求1-7中一项或多项所述的方法，其特征在于，从初始的含RNA组合物中消除多种靶RNA。
9.如权利要求1-8中一项或多项所述的方法，其特征在于，具有一种或多种以下特征：
i)至少一类rRNA作为靶RNA得到消除；和/或
ii)至少一类选自以下的rRNA得到消除：28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16S rRNA，其中优选至少三种、更优选至少四种和最优选所有上述的rRNA类型得到消除；和/或
iii)利用多组探针分子和/或探针集合将三种或更多种，优选四种或更多种，最优选所有的的28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体12SrRNA和线粒体16S rRNA自初始的含RNA组合物中消除。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，包括一种或多种以下特征：
aa)如果28S rRNA作为靶RNA消除，利用具有以下一种或多种，优选全部特征的28S rRNA探针集合：
i)包含在28S探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；
ii)包含在28S rRNA探针集合中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；
iii)包含在28S rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；和/或
iv)28S rRNA探针集合包含表1所示28S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组、优选至少两组、至少四组、至少六组、更优选至少八组、至少十组，最优选所有组；
和/或
bb)如果18S rRNA作为靶RNA消除，利用具有以下一种或多种，优选全部特征的18S rRNA探针集合：
i)包含在18S探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在18S rRNA探针集合中的至少一组、优选至少两组、更优选至少三组、至少四组和最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；
iii)包含在18S rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；和/或
iv)18S rRNA探针集合包含表1所示18S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组、优选至少两组、更优选至少三组、至少四组、最优选所有组；
和/或
cc)如果5.8S rRNA作为靶RNA消除，利用具有以下一种或多种，优选全部特征的至少一组探针分子：
i)所述探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在该组中的至少两种、优选至少三种、更优选所有探针分子是毗连的探针分子；
iii)该5.8S rRNA组包含一种或多种表1所示5.8S rRNA的探针分子；
和/或
dd)如果5S rRNA作为靶RNA消除，利用具有以下一种或多种，优选全部特征的至少一组探针分子：
i)所述探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在该组中的至少两种、至少三种、更优选所有探针分子是毗连的探针分子；和/或
iii)该5S rRNA组包含一种或多种表1所示5S rRNA的探针分子；
和/或
ee)如果线粒体12S rRNA作为靶RNA消除，利用具有以下一种或多种，优选全部特征的探针集合：
i)包含在12S线粒体rRNA探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在12S线粒体rRNA探针集合中的至少一组、优选至少两组、最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；和/或
iii)包含在12S线粒体rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；
和/或
ff)如果线粒体16S rRNA作为靶RNA消除，利用具有以下一种或多种，优选全部特征的探针集合：
i)包含在16S线粒体rRNA探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在16S线粒体rRNA探针集合中的至少一组、优选至少两组、最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；和/或
iii)包含在16S线粒体rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；
和/或
gg)其中利用aa)限定的28S rRNA探针集合和bb)限定的18S rRNA探针集合提供消除了28S rRNA和18S rRNA作为靶RNA的靶RNA消除组合物，并且其中cc)限定的5.8S rRNA组、dd)限定的5S rRNA组、ee)限定的12S线粒体rRNA探针集合和ff)限定的16S线粒体rRNA探针集合任选用于额外将5.8S rRNA、5SrRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16S rRNA作为靶RNA进行消除。
11.如权利要求1-10中一项或多项所述的方法，其特征在于，具有一种或多种以下特征：
i)对丰富的蛋白质编码mRNA作为靶RNA进行消除，其中丰富的蛋白质编码mRNA优选为球蛋白RNA；
ii)所述抗杂交体结合剂是RNA/DNA杂交体特异性的抗杂交体抗体；
iii)所用的抗杂交体结合剂固定于固体支持物或者所述抗杂交体结合剂游离于溶液中，利用固定于固体支持物的第二结合剂以结合所述抗杂交体结合剂，由此捕获形成的杂交体/结合剂复合物；
iv)步骤a)和b)同时进行，和/或
v)利用任选修饰的DNA分子作为探针分子，其中形成双链RNA/DNA杂交体。
12.如权利要求1-11中一项或多项所述的方法，包括
a)使总RNA与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：
i)该组包括长度为35nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA中的靶区域互补，其中所述靶RNA是rRNA；
iii)当与所述靶区域杂交时，两种或多种，优选所有的不同探针分子在形成的双链杂交体中彼此毗连定位；
b)利用结合双链杂交体的抗杂交体抗体捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂复合物；
c)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供靶rRNA消除的组合物。
13.如权利要求1-12中一项或多项所述的方法，包括：
d)任选除去未结合的探针分子，优选对所述靶RNA消除的组合物进行纯化；和
e)对包含在所述靶RNA消除组合物中的RNA进行测序。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，通过下一代测序进行测序。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，测序RNA包括：
i)制备适于大规模平行测序的测序文库；
ii)对包含在测序文库中的分子进行平行测序。
16.一种测序包含在在样品中的感兴趣RNA分子的方法，包括：
a)获得含RNA的组合物，优选从样品中分离总RNA；
b)采用权利要求1-12中一项或多项所述的方法，从该含RNA的组合物，优选总RNA中消除不需要的靶RNA，从而提供靶RNA消除的组合物；
c)任选除去未结合的探针分子；
d)对包含在靶RNA消除组合物中的RNA分子进行测序。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于
i)在步骤c)中，靶RNA消除的组合物经纯化和/或进行DNA酶消化；和/或
ii)对包括制备适于大规模平行测序的测序文库进行测序和对包含在测序文库中的分子进行平行测序。
18.一种试剂盒，适合于从含有RNA的组合物中消除靶RNA，包括
a)一组或多组消除靶RNA的探针分子，其中，探针分子组具有以下特征：
i)该组包含长度为100nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
ii)包含在所述组中的探针分子与靶RNA的靶区域互补；
iii)与所述靶区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成的双链杂交体中彼此邻近定位；
和
b)适合与探针分子和靶RNA之间形成的双链杂交体结合的结合剂。
19.如权利要求18所述的试剂盒，具有一种或多种以下特征：
i)当杂交于所述靶区域时，一组中的两种或多种，优选所有的不同探针分子在形成的双链杂交体中彼此是毗连的；
ii)包含在所述试剂盒中的探针分子的长度选自35nt或更小、30nt或更小或25nt或更小，优选长度在10nt-35nt或15nt-30nt的范围内。
iii)所述试剂盒包含用于消除特定靶RNA的探针集合，其中探针集合包含两组或多组探针分子，其中所述探针集合中包含的各组探针分子靶向于靶RNA中不同的靶区域，和其中任选地，在特定的靶RNA中，所述靶区域位于500nt或更小、450nt或更小、400nt或更小、350nt或更小、300nt或更小、250nt或更小、200nt或更小或150nt或更小的距离内；
iv)所述试剂盒包含探针集合，所述探针集合包含两组或更多组探针分子，其中所述探针集合中包含的各组探针分子靶向于靶RNA中不同的靶区域，和其中包含在所述探针集合中的至少85％、至少90％或至少95％的探针分子与它们的组成员毗连；
v)靶区域基本上对应于靶RNA的全长；
vi)靶区域是在靶RNA中保守的区域；
vii)靶区域是在不同物种中保守的区域；
viii)靶区域是在靶RNA中保守的且至少在人、小鼠和大鼠中保守的区域；
ix)与一组探针分子杂交的靶区域的尺寸选自：50nt至500nt、50nt至350、50nt至250nt、75nt至225nt、100nt至200nt和100nt至175nt；
x)所述试剂盒包含用于消除特定靶RNA的探针集合，其中探针集合包括两组或多组探针分子，其中各组探针分子靶向于靶RNA中的不同靶区域，并且其中所述靶区域分布在靶RNA的全长上；
xi)包括在所述试剂盒中的探针分子是任选修饰的DNA分子；
xii)所述抗-杂交体结合剂是RNA/DNA杂交体特异性的抗-杂交体抗体；
xiii)一组探针分子包含2-10、3-8或4-6种探针分子；和/或
xiv)所述试剂盒包括一组或多组探针分子和/或探针集合以便消除多种靶RNA。
20.如权利要求18或19所述的试剂盒，包括一组或多组探针分子和/或一种或多种探针集合以便：
i)消除至少一类rRNA作为靶RNA；和/或
ii)消除选自28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体12S rRNA或线粒体16S rRNA中的至少一类rRNA、优选消除至少三类、更优选至少四类、最优选所有的上述rRNA种类；和/或
iii)消除28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16S rRNA中的三类或更多、优选四类或更多、最优选所有的种类。
21.如权利要求18-20中一项或多项所述的试剂盒，包括
aa)28S rRNA探针集合，其具有以下一种或多种，优选全部特征：
i)包含在所述28S探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；
ii)包含在所述28S rRNA探针集合中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；
iii)包含在所述28S rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；和/或
iv)所述28S rRNA探针集合包含表1所示28S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组、优选至少两组、至少四组、至少六组、更优选至少八组、至少十组，最优选所有组；
和/或
bb)18S rRNA探针集合，其具有以下一种或多种，优选全部特征的：
i)包含在所述18S探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在所述18S rRNA探针集合中的至少一组、优选至少两组、更优选至少三组、至少四组和最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；
iii)包含在所述18S rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；和/或
iv)所述18S rRNA探针集合包含表1所示18S rRNA探针集合的各探针分子组中的至少一组、优选至少两组、更优选至少三组、至少四组、最优选所有组；
和/或
cc)至少一组用于消除5.8S rRNA的探针分子，其具有以下一种或多种，优选全部的特征：
i)所述探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)至少两种、优选至少三种、更优选所有探针分子是毗连的探针分子；和/或
iii)该5.8S rRNA组包含一种或多种表1所示5.8S rRNA的探针分子；
和/或
dd)至少一组用于消除5S rRNA的探针分子，其具有以下一种或多种，优选全部特征：
i)所述探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在该组中的至少两种、至少三种、更优选所有探针分子是毗连的探针分子；和/或
iii)该5S rRNA组包含一种或多种表1所示5S rRNA的探针分子；
和/或
ee)线粒体12S rRNA探针集合，其具有以下一种或多种，优选全部的特征：
i)包含在12S线粒体rRNA探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在12S线粒体rRNA探针集合中的至少一组、优选至少两组、最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；和/或
iii)包含在12S线粒体rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；
和/或
ff)线粒体16S rRNA探针集合，其具有以下一种或多种，优选全部的特征：
i)包含在16S线粒体rRNA探针集合中的探针分子的长度为50nt或更小、优选35nt或更小、更优选30nt或更小；和/或
ii)包含在16S线粒体rRNA探针集合中的至少一组、优选至少两组、最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子；和/或
iii)包含在16S线粒体rRNA探针集合中的至少75％、至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的探针分子与它们的组成员是毗连的；
和/或
gg)aa)限定的28S rRNA探针集合和bb)限定的18S rRNA探针集合，任选额外包括cc)限定的5.8S rRNA组、dd)限定的5S rRNA组、ee)限定的12S线粒体rRNA探针集合和ff)限定的16S线粒体rRNA探针集合。
22.如权利要求18-21中一项或多项所述的试剂盒，包括一组或多组探针分子和/或一种或多种探针集合以便消除靶RNA，所述靶RNA选自丰富的蛋白质编码mRNA、tRNA、snoRNA、snRNA或质体rRNA。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述丰富的蛋白质编码mRNA是球蛋白mRNA。
24.如权利要求18-23中一项或多项所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-杂交体结合剂是抗-杂交体抗体，优选RNA/DNA杂交体的特异性抗-杂交体抗体。
25.如权利要求18-24中一项或多项，特别是24所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-杂交体抗体固定于固体支持物上。
26.如权利要求18-25中一项或多项所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-杂交体结合剂不固定于固体支持物上，其中所述试剂盒包括能结合所述抗杂交体结合剂的第二结合剂，其中所述第二结合剂固定于固体支持物上。
27.如权利要求18-26中一项或多项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括杂交溶液。
28.如权利要求18-27中一项或多项所述的试剂盒，其特征在于，一组探针分子包含2-10、3-8或4-6种探针分子。
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