CN101787061A - 曲札茋苷在制备防治心脑缺血疾病制剂中的应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多羟基芪苷类化合物曲札芪苷在制备防治缺血性心脑血管疾病制剂中的用途及其制备方法。所述曲札芪苷为化合物(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，具有如下化学结构式，

Description

曲札茋苷在制备防治心脑缺血疾病制剂中的应用及其制备方法

技术领域

本发明涉及植物活性成分曲札茋苷在制备防治心脑缺血制剂中的用途及曲札茋苷、曲札茋苷提取物的一种制备方法。所述曲札茋苷为化合物(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O--D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，其制备方法是从拉萨大黄的根和/或根茎中提取，通过纯化步骤制备。

背景技术

曲札茋苷为化合物(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，或称为3，5，3′，4′-四羟基茋-3′-O-β-葡萄糖苷，因其植物来源拉萨大黄根茎在藏药材中又名曲札(罗达尚主编。新修晶珠本草，四川科学技术出版社，2004)，故称该化合物为曲札茋苷。茋类物质是一类由二苯乙烯(图1)作为母体结构的衍生物，并由Gorham(Gorham J.Progress in Phytochemistry，Pergamon Press：Oxford，1980，Vol.6，pp.203-252)于1980年正式命名为茋(Stilbenoids)。茋类物质作为植物防御素多存在种子植物中，随着研究的深入，其化学、生物学多样性和不断新发现的生物活性受到了人们的重视。茋的母体结构式如下：

90年代以后，以白藜芦醇(Resveratrol)为代表的天然茋类成分的药理活性研究受到广泛关注。国际上对如白藜芦醇、紫檀茋(Pterostilbene)等茋的药理作用研究主要集中于抗氧化、抗肿瘤以及植物雌激素活性等方面。国内在茋苷类成分如虎杖苷(Polydatin，piceid)、大黄降脂素(Rhapontin，rhaponticin，土大黄苷)、二苯乙烯苷的降血脂、降血糖以及心脑血管活性方面进行一系列研究。茋及茋苷类物质在多方面凸显出的潜在应用价值受到越来越多的关注。如中国专利申请99806755.5及02806583.2均公开了含有茋类化合物的复合抗癌剂，中国专利申请99122378.0公开了波叶组大黄所含茋苷化合物的降糖活性；中国专利申请01118193.5公开了波叶组大黄所含茋苷类化合物的降血脂活性；中国专利01134283.8公开了提取自何首乌的茋苷类化合物二苯乙烯甙的抗心脑缺血作用。

曲札茋苷于1984年(Y.Kashiwada，et al.Isolation andCharacterization of Stilbenes.Chem.Pharm.Bull.1984，32(9)：3501-3517)首次从芋大黄(商品名：Imo-Diao)中得到并进行了结构确认，得率约为0.4％，此后，有报道从河套大黄中分离得到少量该化合物(李军林等。河套大黄非蒽醌类成分研究，中草药，98，29：721)，华北大黄中也含有该化合物，得率约为1.8％(王爱芹等。华北大黄中茋类成分研究，中草药，2001，32：878)。目前尚无曲札茋苷相关药理活性方面的研究或报道。

曲札茋苷的糖苷取代位于非间位羟基取代的苯环上，与大黄降脂素、去氧土大黄苷、虎杖苷及何首乌中得到的系列二苯乙烯苷等茋苷类化合物的糖苷取代位置有结构上的差异。与大黄降脂素、去氧土大黄苷、虎杖苷相比，曲札茋苷具有较多的酚羟基，本发明通过清除DPPH自由基试验发现曲札茋苷的自由基清除能力高于上述化合物。自由基是缺血再灌注时形成的，是缺血组织损伤的重要根源，抗氧化剂和自由基清除剂可减轻缺血组织的损伤，曲札茋苷强的自由基清除活性使其在保护缺血心脑组织损伤中更具优势。本发明人首次对来源于拉萨大黄的曲札茋苷提取物及其纯品进行了系列防治缺血性心脑血管疾病方面的药理和药效研究。研究采用两种与人类疾病相近的动物模型，测定多种药效学指标，综合评价两种样品对急性心脑缺血的影响。试验结果表明，曲札茋苷提取物和纯品能明显降低冠状动脉结扎致心肌缺血大鼠血清CK-MB及LDH的释放，缩小心肌梗死范围，抑制血小板聚集，提示其对心肌缺血有明显保护作用。曲札茋苷提取物和纯品可以明显减少MCAO大鼠脑梗塞范围，使其行为障碍程度得到明显改善，对缺血性心脑血管疾病的具有显著的保护作用。因此，曲札茋苷提取物及其纯品在防治心脑缺血方面具有潜在的临床应用价值。

曲札茋苷不同的结构还带来化合物单体水溶性的优势。茋类物质结构中苯环上羟基的增加和葡糖基的取代使化合物的水溶性增加，如白藜芦醇在水中溶解度是0.03g/L(标准状况：25℃，100kPa)，虎杖苷因带有糖基使其在水中的溶解度增加到约0.5g/L，比白藜芦醇多一个羟基的白杉皮醇(Piceatannol)水溶解度为0.5g/L。而结构中苯环上甲氧基的取代使化合物水溶性大大降低。如大黄降脂素和去氧土大黄苷(甲基虎杖苷)的水溶性小于0.04g/L。曲札茋苷结构中带有糖基和较多的酚羟基，其溶解度约为1.1g/L，为其制作成注射、口服液等制剂应用带来便利。

茋类物质如白藜芦醇可从虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)中提取纯化，也可进行合成，而茋苷类物质多从植物资源中提取。研究表明，蓼科植物(Polygonaceae)，特别是大黄属(Rheum)植物中常含有较高的茋苷类成分，如河套大黄(Rheum hotaoense C.Y.Cheng et C.T.Kao)的根茎中土大黄苷的含量可达3％(逯海龙等，HPLC法测定栽培河套大黄中土大黄苷的含量，药物分析杂志，2007，27：11)，大黄降脂素在部分地区栽培的唐古特大黄(Rheumtanguticum Maxim.ex Balf.)根茎中的含量可达到10％(张德等，天然产物研究与开发，2005，17：217)。

本发明人在对野生和种植的拉萨大黄(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao)根茎进行系统的成分研究中首次发现该植物含有丰富的茋苷类成分，除去氧土大黄苷、虎杖苷外(中国发明专利200510010757.X，200710066456.8)，还含有3～5％的曲札茋苷。我们在系统研究拉萨大黄化学成分和制备曲札茋苷提取物、纯品的过程中还发现，与上述富含茋苷成分的大黄植物品种相比，拉萨大黄除含高含量的多羟基茋苷类化合物的特点外，几乎不含具有潜在毒副作用的蒽醌及蒽醌苷类化学成分，此特点为该植物中茋苷类有效部位或单一成分的开发、产业化生产带来了实用性和应用优势。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术不足，发明一种曲札茋苷在制备预防和治疗缺血性心脑血管疾病制剂中的应用，及发明一个制备曲札茋苷及含有曲札茋苷提取物的方法。

本发明是这样实现的：

曲札茋苷在制备预防和治疗缺血性心脑血管疾病制剂中的应用，所述曲札茋苷为化合物(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，化学结构是：

使用的曲札茋苷为曲札茋苷提取物。

所述曲札茋苷提取物，按重量百分比计，曲札茋苷提取物中含有曲札茋苷的有效成份为50％-100％。

所述制备方法包括下列步骤：

(1)前处理：前处理步骤包括拉萨大黄原植物根或根茎的采集、净制和/或干燥、切碎或粉碎；

(2)提取：所述提取是采用水、含水或不含水有机溶剂作为提取溶剂对步骤(1)所述拉萨大黄根或根茎进行提取获得拉萨大黄提取液；所述有机溶剂包括含有1~4个碳原子的醇、酮、醚以及它们的混合物。

(3)后处理：后处理步骤包括回收或部分回收步骤(2)所得提取液中的有机溶剂得到提取浓缩液，所得提取浓缩液可加入或不加水，继而将提取液进行静置沉淀，固液分离除去部分杂质；除杂质后的液相经进一步吸附树脂层析纯化、分段洗脱、洗脱物浓缩析晶获得到以重量百分比计，含有曲札茋苷为50％-100％的曲札茋苷提取物。

上述曲札茋苷提取物的一种制备方法，其步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚；其步骤(2)所述提取溶剂为50~100％的乙醇或甲醇水溶液。

上述曲札茋苷纯品的一种制备方法，其特征在于，所述制备方法是采用拉萨大黄作为原料，通过提取纯化步骤获得所需曲札茋苷纯品；所述曲札茋苷纯品纯度以重量百分比计，为90％-100％。

所述曲札茋苷提取物的一种制备方法，其特征在于曲札茋苷提取物是从野生或栽培的拉萨大黄(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao)的根或根茎中提取。

曲札茋苷在制备曲札茋苷纯品中的用途。

曲札茋苷提取物在制备预防或治疗心脑血管疾病制剂中的用途。

曲札茋苷制剂作为各种医药上可接受的制剂或保健食品，可用于制作药物或保健食品。

提供曲札茋苷的在制备防治心脑缺血疾病制剂中的应用，所述曲札茋苷为(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯或3，5，3′，4′-四羟基茋心脑-3′-O-β-葡萄糖苷，曲札茋苷的化学结构式如下。

目前研究较多的多羟基茋苷类化合物如虎杖苷、土大黄苷、去氧土大黄苷等，其葡萄糖基取代在所示曲札茋苷的化学结构的C-3位，曲札茋苷的糖基则取代在C-3′位，这种类型的茋苷类化合物在抗心脑缺血活性方面目前尚无研究。本发明对曲札茋苷进行了抗心脑缺血方面的药理和药效研究，发现曲札茋苷纯品及含有曲札茋苷的提取物在急性心脑缺血疾病的模型中均显示了显著的药理学活性。研究采用两种与人类疾病相近的动物模型，测定多种药效学指标，综合评价两种样品对急性心脑缺血的影响。试验结果表明，50、100mg/kg曲札茋苷提取物和15、30mg/kg纯品腹腔注射能明显降低冠状动脉结扎致心肌缺血大鼠血清CK-MB及LDH的释放，显著缩小心肌梗死范围，显示其对心肌缺血带来的损伤有显著的保护作用。50、100mg/kg曲札茋苷提取物和15、30mg/kg还可以明显减少MCAO大鼠脑梗塞范围，明显改善大鼠局灶性脑缺血所致的神经功能程度，表明其对脑缺血的损伤具有显著的保护作用。多个剂量的曲札茋苷提取物和纯品均能抑制血小板聚集-肾上腺素所致的小数体内血栓形成。上述试验指标显示，曲札茋苷在防治心脑缺血方面具有潜在的临床应用价值，由此，本发明提供曲札茋苷在制备治疗缺血性心脑血管疾病药物中的用途。

所述的制备方法是从拉萨大黄的根和/或根茎提取目标物质，所述拉萨大黄为Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao。

本发明进一步提供曲札茋苷和含有曲札茋苷提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：

(1)前处理：前处理步骤包括拉萨大黄原植物根或根茎的采集、净制和/或干燥、切碎或粉碎。

(2)提取：所述提取是采用含水或不含水有机溶剂作为提取溶剂对步骤(1)所述拉萨大黄根或根茎进行提取获得拉萨大黄提取液；所述有机溶剂包括含有1~4个碳原子的醇、酮、醚以及它们的混合物。

(3)后处理：后处理步骤包括回收或部分回收步骤(2)所得提取液中的有机溶剂得到提取浓缩液，所得提取浓缩液可加入或不加水，继而将提取液进行静置沉淀，固液分离除去部分杂质；除杂质后的液相经进一步吸附树脂层析纯化、分段洗脱、洗脱物浓缩析晶可得到权利要求2~3所述的提取物。

步骤(1)所述前处理步骤中，所述拉萨大黄是指蓼科植物Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao。所述拉萨大黄可以是野生的，也可以是人工种植的，人工引种栽培大黄的成功可以进一步扩大拉萨大黄的药源或产生更优的变种。本发明发现，拉萨大黄根及根茎中存在高含量的曲札茋苷，随采收年限、季节、地点以及其它因素的不同，拉萨大黄根及根茎所含曲札茋苷的量可达3％~5％(以干重计)，此在植物中非常罕见。

此外，本发明还惊奇发现，拉萨大黄根和根茎中几乎不含蒽醌类化合物，此在大黄类植物中为罕见，这是拉萨大黄的一项非常重要的特征：其一，应用拉萨大黄入药不存在对蒽醌类化合物潜在严重毒副作用的担忧；其二，应用拉萨大黄提取二苯乙烯类活性成分时，其提取工艺可以不受蒽醌类化合物特别是蒽醌苷的干扰，因此工艺可以更简便，上述特点为拉萨大黄中茋苷类有效部位或单一成分的开发、利用和产业化生产带来了应用优势和实用性。

拉萨大黄地上茎叶中二苯乙烯类成分含量很低，作为提取原料的价值相对较低，但是仍可作为二苯乙烯类化合物的来源之一。本发明优选采用拉萨大黄的地下根和根茎作为提取原料，但不排除以其整个植株作为提取原料。

采集的拉萨大黄一般需要经过净制、切制和/或粉碎等前处理。所述净制可包括去除采集过程中附着于拉萨大黄根和根茎上的泥土等杂物，还可以包括将根和根茎与地上茎叶分开等。所采集的拉萨大黄可以应用其鲜品，也可以采用其风干、晒干或机器干燥的干品；所得此根和根茎或整个植株优选进行适当切制或粉碎以利提取。

步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚。其提取溶剂优选乙醇或甲醇的水溶液；其中特别优选乙醇水溶液作为提取溶剂；进一步地，本发明优选采用45％~95％乙醇水溶液作为提取溶剂。

步骤(2)所得拉萨大黄提取液需经适当的后处理方可获得曲札茋苷提取物。由于拉萨大黄所含的一些主要的茋及茋苷类物质如土大黄苷元、去氧土大黄苷元、去氧土大黄苷、虎杖苷水溶性有限，本发明发现，回收提取液中的有机溶剂和/或适当浓缩提取物可以使提取物所含的部分脂溶性茋及茋苷类化合物、杂质从提取液中析出，而曲札茋苷由于水溶性较好则保留在上清液中。其转移率可达85％以上。上清液中的曲札茋苷可以采用合适的有机溶剂萃取进行纯化，例如采用正丁醇、乙酸乙酯-甲醇混合溶剂、正丁醇-二氯甲烷混合溶剂等萃取；此类化合物还可以采用连续逆流萃取法等本领域内熟知的方法萃取纯化。

本发明中优选采用大孔吸附树脂层析法纯化上清液中的二苯乙烯类化合物。上述后处理步骤中，随着提取液中的有机溶剂的回收，上清液上样于大孔吸附树脂柱时，上清液中所含的曲札茋苷易于被树脂柱床所吸附；上样吸附后，树脂柱床可采用水以及低浓度有机溶剂水溶液洗涤以进一步去除极性较大的杂质，随后可采用较高浓度的有机溶剂水溶液分步洗脱所需的化学成分，所得洗脱溶液经浓缩、析晶、干燥即可获得所述的曲札茋苷提取物。提取物可采用醇水或单纯的水溶液重结晶进行进一步精制来提高曲札茋苷的纯度，通过反复重结晶、脱色或其它纯化手段可得权利要求7~8所述的纯品。

采用大孔树脂吸附上清液所含曲札茋苷时，柱床体积一般按每100ml吸附树脂(装柱后体积)吸附1~3g上清液设置，这时一般可以获得良好的吸附转移率。上清液上样吸附后，可采用水溶液、10％~15％的乙醇溶液或甲醇水溶液洗涤除去大部分水溶性杂质，随后采用约25％~50％的乙醇或甲醇水溶液即可洗脱吸附于大孔树脂的曲札茋苷。本发明中，优选的大孔吸附树脂为弱极性和中极性的树脂，例如商品型号D101、D1300、AB8型吸附树脂。在合适的条件下，大孔树脂吸附法所得产物中，曲札茋苷总含量可达约50％至85％，转移率为80％~95％。

经过上述纯化步骤后，曲札茋苷已经得到富集，采用这些提取物作为原料可以方便地制备曲札茋苷含量更高的提取物和纯品。例如，本发明中，采用大孔树脂吸附法所得洗脱部分为原料，通过合适浓缩，析晶可得含量为70％~89％的曲札茋苷提取物，此提取物采用反复重结晶、活性碳脱色、硅胶层析、聚酰胺等层析结合重结晶法纯化可获得纯度高达90％以上的曲札茋苷纯品。

通过上述步骤制备的提取物是以曲札茋苷为主要化学成分的混合物。可以理解，此提取物中曲札茋苷的含量随原料批次不同、处理工艺参数变化而有所变化。一般地，按重量百分比计，所述提取物中含有约50％~85％的曲札茋苷。

显然，上述提取物可以用于进一步精制纯化以获得曲札茋苷纯品。本发明中，所谓纯品是指化合物的纯度不低于90％。

由此本发明进一步提供拉萨大黄提取物在制备曲札茋苷纯品，以及曲札茋苷提取物在制备该曲札茋苷纯品中的用途。

研究结果显示，曲札茋苷提取物及曲札茋苷纯品在作为制备治疗心脑血管疾病的治疗药物方面有广泛的用途。所述的有效部位中活性成分的结构清楚、组成明确，有利于各级产品的质量监测和控制，符合天然产物复合制剂的发展方向和要求。另外，本发明所述有效部位的制备方法简单易行，生产成本低，可连续操作，具有极强的实用性。

按照常规的制剂工艺，可以将本发明之提取物制备成任何一种适用于临床应用的药物制剂。如片剂，胶囊剂，丸剂，散剂，膏剂，分散剂，颗粒剂，粉针剂，水针剂等。

同样，本发明之曲札茋苷提取物也可以与其它活性成分联合使用形成新的制剂。显然，这些含有本发明所述有效部位的制剂在本发明的权利要求范围内。

附图说明

图1为本发明薄层鉴别(碘显色)。

图2野生拉萨大黄原料供试品液HPLC典型图谱(曲札茋苷，RT：7.862)。

图3种植拉萨大黄原料供试品液HPLC典型图谱(曲札茋苷，RT：7.885)。

图4曲札茋苷提取物供试品液HPLC典型图谱(曲札茋苷，RT：7.878)。

图5曲札茋苷纯品HPLC典型图谱(曲札茋苷，RT：7.896)。

其中在图1中：1.表示去氧土大黄苷对照品液；2.表示曲札茋苷对照品液；3.表示野生拉萨大黄原料(20080913)供试品液；4.表示种植拉萨大黄原料(20080915)供试品液；5.表示种植拉萨大黄原料(20080915)供试品液；6.表示种植拉萨大黄原料(20080915)供试品液。

具体实施方案

以下通过具体实施例将进一步说明本发明的内容。下文实施例仅为就本发明所述有效部位的来源、制备方法、化学组成及其用途的特殊说明，显然，本发明权利范围不受这些实施例限制。

实施例1：拉萨大黄原料及曲札茋苷提取物中曲札茋苷的定性鉴别与定量检测

(1)样品来源

野生拉萨大黄根茎：收购于西藏拉萨地区，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：20080913

种植拉萨大黄根茎：收获于云南香格里拉县，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：20080915

对照品：曲札茋苷，自制，纯度99％，批号：080602。

(2)样品及标准品溶液配制

对照品溶液配制：精密称取以五氧化二磷真空干燥的曲札茋苷对照品适量，以甲醇配成1mg/ml对照品储备液，27％甲醇-3％乙酸溶液稀释成25g/ml作为标准品溶液。

拉萨大黄原料供试品溶液制备：精密称取以五氧化二磷真空干燥的上述拉萨大黄根茎粉末10g，95％乙醇回流提取3次(120min/次)，合并提取液，滤纸过滤，滤液进一步以0.45μm微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液作为拉萨大黄供试品溶液。

曲札茋苷提取物供试品溶液制备：精密称取以五氧化二磷真空干燥的实施例2所述曲札茋苷提取物适量，以甲醇配成10mg/ml样品储备液，精密吸取1ml，置于25ml容量瓶中，27％甲醇定容，密塞，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，弃初滤液，取续滤液作为拉萨大黄提取物供试品溶液。

(3)定性鉴别：薄层色谱法检查

本法采用硅胶薄层层析。取上述供试品液及对照品液各4l，分别点于同一硅胶薄层层析板(硅胶G)板上，以氯仿∶甲醇(体积比，7.5∶2.5)为展开剂展开，取出，晾干，置于碘缸中显色，在对照品相同的位置，供试品应有相应的斑点。

(4)供试品所含曲札茋苷含量定量检测：高效液相色谱法(HPLC)

色谱条件：采用Zorbax SB-C18(4.5×150mm，Agilent)反相色谱柱，27％甲醇-3％醋酸水为流动相，流速O.8ml/min，用DAD紫外检测仪进行检测，检测波长319nm。

标准曲线建立：上述对照品储备液分别稀释成5、15、25、35、45μg/ml溶液，各取10μl分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以各对照品峰面积(Y，A)对进样量(X，mg)进行线性回归，回归方程：Y＝6.3324X+0.1158，r＝0.9999(曲札茋苷，n＝5)。

样品测定：上述拉萨大黄原料供试品溶液、曲札茋苷提取物供试品溶液各10μl分别注入液相色谱仪中，根据标准曲线计算拉萨大黄原料提取物、曲札茋苷提取物中曲札茋苷的含量。

(4)结果：

i)定性鉴别：拉萨大黄原料提取物及曲札茋苷提取物的典型薄层色谱图如图3所示，结果表明，在对照品相同的位置，供试品均有相应的斑点。

ii)曲札茋苷含量检测：拉萨大黄原料及其曲札茋苷提取物的典型HPLC谱图如图4~6所示，结果表明，拉萨大黄野生药材原料和种植药材原料中曲札茋苷的含量分别为4.38％和4.18％，提取物中曲札茋苷的含量为78.5％。

实施例2：曲札茋苷提取物制备

(1)材料：拉萨大黄根茎：收购于西藏拉萨地区，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：20080913

树脂：D101大孔吸附树脂，天津市海光化工有限公司产品，按照生产厂说明书进行预处理。

(2)制备

i)拉萨大黄前处理及其曲札茋苷含量测定：

采集的拉萨大黄植株，去泥晾干，分离地下根茎和地上茎叶，粉碎机分别将其粉碎成粗粉末。

取地下根茎和地上茎叶粉末各100g，用95％乙醇浸泡回流提取，120分钟/次，间隔取样进行HPLC检测，直至提取液中基本不含曲札茋苷，合并提取液，按实施例1中所述方法方法曲札茋苷的含量，此检测结果作为药材所含该化合物总量。

结果：批号20080913的拉萨大黄地下根茎和地上茎叶中的所含曲札茋苷化合物总量分别为5.01％和0.001％。

ii)提取：

拉萨大黄地下根茎粉末每份600g，分别以50％、75％、95％乙醇；50％、90％甲醇；50％丙酮；正丁醇作为提取溶剂提取。各份药材分别以上述不同提取溶剂共5.4L回流提取3次(2.4L/1.8L/1.2L)，120min/次。分别合并提取液，HPLC法检测提取液中曲札茋苷平均量(A)：，计算曲札茋苷转移率(B)：提取液中曲札茋苷总量/药材曲札茋苷总量×100％。

提取试验结果如表1所示。

表1：不同提取溶剂的提取试验结果

A：HPLC法检测的提取液中曲札茋苷化合物量；B：曲札茋苷转移率

上述提取试验中，以50％、75％、95％乙醇；50％、90％甲醇；50％丙酮；正丁醇作为提取溶剂提取时，提取步骤中曲札茋苷转移率在70％~95％之间。可见它们均可作为该化合物的有效提取溶剂，其中，鉴于乙醇的安全、廉价且提取转移率较高，因此本发明优选乙醇水溶液作为提取溶剂。

iii)后处理：

沉淀处理：分别合并步骤ii)所得各提取溶液，减压(0.1~0.08Mpa，60℃)回收其中所含的有机溶剂，加水定容至600mL后，混合均匀，4℃放置24h，离心(4000rpm×30min)，得上清液和沉淀。沉淀真空干燥，称重(C)；HPLC法检测上清液和沉淀中曲札茋苷的量(D、E)。计算上清液和沉淀中曲札茋苷转移率(F、G)：上清液或沉淀曲札茋苷总量/提取液曲札茋苷总量×100％。

表2：沉淀处理试验结果

C：沉淀量                  D：沉淀中曲札茋苷量

E：上清液中曲札茋苷量      E：沉淀中曲札茋苷转移率

F：上清液中曲札茋苷转移率；

表2数据显示，上述各组提取液浓缩除有机溶剂加水后低温静置，除正丁醇组外，其余各组样品均产生沉淀，沉淀中曲札茋苷的转移率在2％~5％之间，沉淀量在10~30g之间，上清液中曲札茋苷转移率在85％~95％之间，可见该步骤处理可有效去除脂溶性杂质，且曲札茋苷的损失较小。因此本发明把该步骤作为制备曲札茋苷提取物的一个重要环节。

上清液处理：除正丁醇提取液外，合并其它全部上清液，再次过滤，HPLC法检测所得滤液中的曲札茋苷总量，将其平均分成4份，分别上样于4根D101大孔吸附树脂柱(φ5.0cm，105cm，柱床体积2000ml)和HPLC检查D101树脂柱上样流出液，未见二苯乙烯类化合物泄漏。4根D101树脂柱分别顺次以1000ml水、1000ml 15％乙醇或10％甲醇洗涤，HPLC检查洗涤流出液，流出液基本不含或仅含少量曲札茋苷。D101树脂柱再分别以25、50％7醇或20％甲醇、45％甲醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥得曲札茋苷提取物，计量所得终产物的重量(H)，HPLC法检测终产物中曲札茋苷总量(I)；计算终产物中的曲札茋苷的含量(J)：终产物中曲札茋苷总量/终产物重量×100％；计算曲札茋苷转移率(K)：终产物中曲札茋苷总量/上样滤液中曲札茋苷总量×100％。

表3上清液处理试验结果

H：终产物量；                  I：终产物量中曲札茋苷总量

J：终产物量中曲札茋苷含量      K：曲札茋苷转移率；

每根树脂柱上样滤液(750ml)中曲札茋苷总量：33.82g

表3数据显示，从吸附树脂上洗脱部分的曲札茋苷含量在50％~85％之间，曲札茋苷的转移率在85％~96％之间。其中，鉴于乙醇的安全、廉价，因此本发明优选乙醇水溶液作为洗脱剂，洗脱浓度优选25％~50％之间，可以预见，随着洗脱液乙醇浓度的降低，洗脱部分曲札茋苷的含量会有所上升，而转移率有所下降，乙醇浓度升高则反之。

实施例3：由拉萨大黄提取物及曲札茋苷提取物制备纯品曲札茋苷

(1)材料：拉萨大黄根茎：收购于西藏拉萨地区，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：20080913。

(2)拉萨大黄提取物制备：取拉萨大黄干燥根茎粉末100g，采用95％乙醇作为提取溶剂回流提取3次(2.4L/1.8L/1.2L)，120min/次，合并提取液，浓缩，真空干燥，得拉萨大黄提取物。

(3)纯化：拉萨大黄提取物2g，以40g 200目硅胶拌，采用硅胶柱层析纯化。采用氯仿/甲醇(V/V，8/1)作为洗脱溶剂，分部收集不同流份，薄层层析(TLC)监测，合并含有曲札茋苷的流分，减压回收溶剂，15％乙醇重结晶，真空干燥，得曲札茋苷纯品。

实施例2中所述曲札茋苷提取物2g，按16∶1加入纯水(32ml)，60℃加热溶解，放置4小时析晶，抽滤，晶体加入适量水，0.5％活性碳脱色，重结晶，得1.25g曲札茋苷，真空干燥，得曲札茋苷纯品。

(4)HPLC检测：按实施例1中HPLC法检测所得曲札茋苷的纯度，其不同流份产物中去氧土大黄苷的纯度可在90％～99.9％之间；结晶-脱色-重结晶所得曲札茋苷纯度在98％～99.6％之间。HPLC检测典型图谱见图7。

(5)曲札茋苷结构确认

检测所得曲札茋苷的UV、negative FABMS、MS、¹H NMR、¹³CNMR谱图，其检测数据如下：

曲札茋苷：白色毛状晶体(水)，mp.220-225℃。紫外灯下呈蓝紫色荧光。UVλmax(MetOH)：217(4.38)，320(4.48)；EI-MS(m/z)：406[M]⁺，244[M-glycosy]⁺；negative FAB-MS(m/z)：405[M-H]^-，243[M-H-glycosy]^-；1H NMR(CD₃OD，500M Hz)δppm：7.44(1H，d，J＝2.0Hz，C₂′-H)，7.05(1H，dd，J₁＝2.0Hz，J₂＝8.0Hz，C₆′-H)，6.92(1H，d，J＝16.3Hz，C-H)，6.83(1H，d，J＝16.3Hz，C-H)，6.82(1H，d，J＝8.3Hz，C₅′-H)，6.47(1H，d，J＝2.2Hz，C_2，6-H)，6.18(1H，t，J＝2.2Hz，C₄-H)，4.81(1H，d，J＝7.4Hz，anomericH)，3.95(1H，dd，J₁＝2.0，2.1Hz，J₂＝12.2Hz，C6″-H)，3.74(1H，dd，J₁＝6.0Hz，J₂＝＝12.1Hz，C6″-H)，3.41-3.56(4H，m sugar-H)；¹³C NMR(CD₃OD，125MHz)δppm：141.1(C-1)，105.9(C-2，6)，159.4(C-3，5)，102.7(C-4)，131.3(C-1′)，116.6(C-2′)，146.9(C-3′)，148.1(C-4′)，117.2(C-5′)，123.0(C-6′)，127.8(C-α)，129.1(C-β)，104.4(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.4(C-4″)，77.5(C-5″)，62.5(C-6″)。

通过与文献的比较，可以看出，本检测结果中各质子的化学位移数值与偶合常数的数值均与文献中(Y.Kashiwada，et al.I solation andCharacterization of Stilbenes.Chem.Pharm.Bull.1984，32(9)：3501-3517；郑俊华，果德安。大黄现代研究.北京大学医学出版社，2007，第一版，286)的相应数值吻合。曲札茋苷鉴定为(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O- -D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯

[(E)-1-(3，5-dihydroxyphenyl)-2-(3-hydroxyl-4-O-β-D-glucopyranyphenyl)ethylene]，或称为3，5，3′，4′-四羟基茋-3′-O-β-葡萄糖苷(3，5，3′，4′-tetrahydroxystilbene-3′-O-β-D-glucopytanoside)。

实施例4：拉萨大黄提取物的药理学作用

(1)试验样品

曲札茋苷提取物：实验代号QZQ-00-01。样品按照实施例2所述步骤制备。其中曲札茋苷含量为78.5％

曲札茋苷：实验代号QZQ。样品按照实施例3所述步骤有曲札茋苷提取物制备，纯度为99.1％。

虎杖苷：购自西安华萃生物技术有限公司，批号：POL050817，纯度为98.0％。

上述试验样品均以-羟丙基环糊精配制成不同浓度的供试溶液。

(2)试验动物

SPF级ICR小鼠，购自于昆明医学院实验动物中心。

SPF级SD大鼠，购自于昆明医学院实验动物中心。

(3)试验方法

对大鼠MCAO局灶性脑缺血的影响

各组雄性SD大鼠动物每日按剂量灌胃给药一次，连续5天。末次灌胃后30min，用12％水合氯醛腹腔注射350mg/kg麻醉动物，左侧卧位，沿右耳眼线中点切开皮肤，分离颞肌，绞断颧骨，在颧骨根前方用牙科钻钻孔，暴露MCAO，在大脑下静脉和嗅束间用针挑起，断之，棉球压迫止血后，分层缝合肌肉和皮肤。假手术组除了不挑断MCAO外，其余步骤相同。动物于造模后6h及24h根据运动等行为表现进行神经功能评分，以此作为脑功能障碍指标。评分采用盲法，即评分者不知道给药的情况，

评分标准如下：

症状                                                        行为障碍评分

                                                                               

提鼠尾离开地面约一尺，手术对侧前肢出现腕屈曲，肘屈曲，肩内旋1~4

或有腕，肘屈曲又有内旋。

将动物置于平地面上，分别推双肩向内侧，检查阻力。            1~3

将动物置于金属网面上，观察两前肢的张力。                    1~3

将动物置于平地面上，观察有无转圈。                          1~2

满分                                                        12

                                                                               

以上标准满分为12分，分数越高，表明动物行为障碍越严重

造模24h，经神经功能评分后，颈动脉插管取血，一份分离血清按试剂盒方法测定AST及LDH的活性；一份用3.8％枸橼酸钠以1∶9抗凝，1000rpm离心5min制备富血小板血浆(PRP)，3500rpm离心10min制备贫血小板血浆(PPP)。按比浊法测定ADP-2Na诱导的血小板聚集率，ADP的终浓度为6mol/L；按试剂盒方法分别测定TT、PT、APTT及FIB。取血后快速断头取脑，放入冰生理盐水中去除嗅球、小脑和低位脑干，吸干水分称取脑重，沿冠状切成5片，置入5ml含有4％TTC及1mol/LK₂HPO₄0.1ml的溶液中，避光于37℃温孵30min，其间每隔7-8min翻动一次，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈白色，将梗塞部位剪下称重，以重量求面积法计算梗死组织重量占双侧大脑半球重的百分比作为脑梗塞范围。

对胶原蛋白-肾上腺素所致小鼠血栓形成影响  取20～22g小鼠，雌雄各半，按性别和体重随机分组，见表6。各组动物每日按剂量腹腔注射给药一次，连续5天。末次给药后30min，每鼠按0.1ml/10g体重的剂量静脉注射由胶原蛋白-肾上腺素制成的诱导剂，观察并记录15min内各组动物偏瘫发生率、死亡率及恢复率。X2检验组间差异的显著性。

对冠脉结扎致大鼠心肌缺血影响

雄性SD大鼠，330～385g，按体重随机分组见表7，各组动物按剂量每日灌胃给药一次，连续5天，空白组和模型组给予等容量0.5％CMC-Na 10ml/kg体重。末次给药后30min，用12％水合氯醛腹腔注射350mg/kg麻醉动物，行开胸手术暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支，距根部2～3mm处结扎，快速心脏复位关闭胸腔。假手术组仅置线头而不结扎，造成急性心肌缺血模型，24h后，颈动脉插管取血分离血清按试剂盒方法测定AST、LDH及CK-MB的活性；取血后立即取心脏，置于冰生理盐水中泵出心腔内积血，去掉心房及脂肪组织，吸干水分称取心室重，随后沿冠状切成5片，在1％TTC溶液中避光于37℃孵育染色10min。经染色后，正常心肌组织呈红色，而梗死组织呈白色，将梗塞部位剪下称重，计算坏死部分占心室重的百分比为心肌梗塞范围。

(5)试验结果

对大鼠中动脉结扎(MCAO)致局灶性脑缺血的影响

曲札茋苷提取物以50,100mg/kg，曲札茋苷纯品以15,30mg/kg的剂量分别于MCAO手术后即刻和缺血再灌注6h静脉注射2次，能明显减轻大鼠局灶性脑缺血所致的神经功能障碍，明显减小脑梗塞的范围，曲札茋苷提取物两剂量组分别缩小65.87％、40.38％；曲札茋苷纯品两剂量组分别缩小75.87％、52.21％，优于虎杖苷。

表4曲札茋苷纯品及提取物对MCAO再灌注大鼠神经功能障碍及脑梗塞范围的影响(X±SD)

与假手术组相比：ΔΔP＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；

表5曲札茋苷纯品及提取物对MCAO再灌注大鼠血凝及血小板聚集的影响

与假手术组相比：^ΔP＜0.05；与模型组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01；

对胶原蛋白-肾上腺素所致小鼠血栓形成影响

曲札茋苷提取物60mg/kg、120mg/kg剂量组，曲札茋苷纯品各剂量组均能明显抑制胶原-肾上腺素所致的小鼠体内血栓形成；。

表6曲札茋苷纯品及提取物对小鼠体内血栓形成的影响

与对照组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01

对冠脉结扎致大鼠急性心肌梗塞范围的影响

模型组大鼠血清AST、LDH及CK-MB活性有不同程度的增高，尤以CK-MB及LDH活性增高更明显，表明心肌损伤造模成功。曲札茋苷(50mg/kg)及曲札茋苷提取物(200mg/kg)均能明显降低CK-MB和LDH的释放，表明减轻心肌细胞损伤作用显著；两给药组大鼠的心肌梗塞范围均显著小于模型对照组，与模型组相比分别缩小64.33％和47.72％。结果见表7。

表7.QHQ及QZQ对大鼠心肌梗塞范围和酶学的影响

实施例5几种茋苷类物质的DPPH自由基清除活性试验

(1)试验样品

曲札茋苷：自制，样品按照实施例3所述步骤有曲札茋苷提取物制备，

纯度为99.1％。

虎杖苷：购自西安华萃生物技术有限公司，批号：POL050817，纯度为98.0％。

土大黄苷：自制，按中国发明专利200510010757.X中所述土大黄苷纯品制备，纯度：99.5％。

大黄降脂素：自制，从河套大黄(Rheum hotaoense C.Y.Cheng et C.T.Kao)中制备，纯度：99.0％

维生素E(-Tocpherol)、BHA(butylated hydroxyanisol)、DPPH自由基(，-diphenyl- -picrylhydrazyl)均为Sigma产品。其中，维生素E为常用的天然来源的抗氧化剂，BHA为食品工业中常用的合成抗氧化剂。

上述试验样品均以甲醇配制成不同样品浓度的供试溶液。

(2)试验方法

自由基清除活性测定参照M.H.Gorden等人的方法(M.H.Gordon，et al.Antioxidant activity of hydroxytyrosol acetate compared with that of otheroliver oil polyphenols.J.Agric.Food Chem.，2001，49：2480)。每一测定的试液为0.06Mm DPPH自由基甲醇溶液.参照品及供试样品均配成2.1(0.06×35)mM的甲醇溶液，分别稀释成1/10，1/4，1/2三个不同的浓度。测定时，在3.5ml DPPH自由基甲醇溶液中加入0.1ml参照品或样品溶液，混合，在15分钟测定其光吸收值(A_sample)，检测波长为515nm，每个不同浓度的参照品及样品平行测定三次。甲醇为空白，0.06mM DPPH溶液为对照(Control)。每一参照品和供试样品得到3-4个不同浓度分别在不同时间的三组平行测定值。每一测定值表示DPPH自由基在溶液中的残留值，用以下公式将其换算成DPPH自由基清除率(scavenged DPPH radical rate％)：Scavenged DPPH radical rate％＝(A_control-A_sample)/A_control)

以此值作出样品在不同浓度时DPPH自由基清除率与时间的关系图及在不同时间下DPPH自由基清除率与样品浓度的关系。样品浓度用加入样品与DPPH自由基的摩尔数比值(molar ratio)来表示，本实验中取0.10，0.25，0.50，1.00。样品清除自由基的活性EC₅₀是指使DPPH自由基被清除50％所需的样品摩尔数与加入DPPH摩尔数的比值。

(3)试验结果

表8copherol、BHA及各茋苷类化合物DPPH自由基活性

样品名称	EC50(n＝3)
		copherol	0.25±0.03
	0.14±0.01
		虎杖苷	0.57±0.02
去氧土大黄苷	0.78±0.01
		大黄降脂素	0.44±0.03
曲札茋苷	0.28±0.01

表8数据显示，曲札茋苷清除DPPH自由基的活性较强。

实施例6曲札茋苷片剂制备

曲札茋苷提取物：样品按照实施例2所述步骤制备，其中提取溶剂采用90％乙醇；其中曲札茋苷的含量为78.5％。

制法：称取曲札提取物100g，溶解于适量乙醇中，加入900g PVP K29/32，混合均匀，使充分溶解；旋转蒸发使乙醇挥发，冷却，干燥，固化，粉碎固化物，取100克与50克乳糖、30克预胶化淀粉、10克羧甲基淀粉钠混合，过80目筛2遍，混合均匀，以1％低取代羟丙基纤维素乙醇溶液(浓度50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒，加入1.5克滑石粉混合均匀，压片，可制备曲札茋苷片1000片。

实施例7：曲札茋苷冻干粉针

曲札茋苷纯品：样品按照实施例3所述步骤制备，其中提取溶剂采用90％乙醇；其中曲札茋苷的含量为99.0％。

配方：

曲札茋苷纯品                10g

大豆磷脂                    8g

甘露醇                      200g

制备工艺：在1万级的条件下，将合格的药物和辅料一起溶于注射用水中，经脱色等处理后，加入注射用水稀释至所2000ml。过滤，滤液经过滤纸及0.4μm的滤膜粗滤等处理后，在100级的条件下，用0.2μm以下的滤膜过滤。精滤液送入分装机，按每支2ml分装，盖上带槽的盖子，送入冷冻真空干燥机，快速冷至35℃~40℃，2~3小时，逐步缓慢升温至35℃~45℃(约需10小时)。塞紧盖子，取出制品，扎盖、包装、检验、合格的药用粉针成品(1000支10mg之规格的冻干粉针)。

实施例8：曲札茋苷口服液产品

配方：脂溶性芪苷(含量98％)        48g

蜂蜜                              1000g

丙二醇                            500g

蒸馏水                            加至10kg

制备方法：取处方量药物和辅料，按普通口服液制备方法制备，可得1000支的口服液。

Claims (9)

1.曲札茋苷在制备预防和治疗缺血性心脑血管疾病制剂中的应用，所述曲札茋苷为化合物(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，化学结构是：

使用的曲札茋苷为曲札茋苷提取物。

2.权利要求1所述曲札茋苷在制备预防和治疗缺血性心脑血管疾病制剂中的应用其特征在于所述曲札茋苷提取物，按重量百分比计，曲札茋苷提取物中含有曲札茋苷的有效成份为50％-100％。

3.权利要求1所述曲札茋苷提取物的一种制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：

(1)前处理：前处理步骤包括拉萨大黄原植物根或根茎的采集、净制和/或干燥、切碎或粉碎；

(2)提取：所述提取是采用水、含水或不含水有机溶剂作为提取溶剂对步骤(1)所述拉萨大黄根或根茎进行提取获得拉萨大黄提取液；所述有机溶剂包括含有1~4个碳原子的醇、酮、醚以及它们的混合物。

(3)后处理：后处理步骤包括回收或部分回收步骤(2)所得提取液中的有机溶剂得到提取浓缩液，所得提取浓缩液可加入或不加水，继而将提取液进行静置沉淀，固液分离除去部分杂质；除杂质后的液相经进一步吸附树脂层析纯化、分段洗脱、洗脱物浓缩析晶获得到以重量百分比计，含有曲札茋苷为50％-100％的曲札茋苷提取物。

4.根据权利要求3所述曲札茋苷提取物的一种制备方法，其步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚；其步骤(2)所述提取溶剂为50~100％的乙醇或甲醇水溶液。

5.曲札茋苷纯品的一种制备方法，其特征在于，所述制备方法是采用拉萨大黄作为原料，通过提取纯化步骤获得所需曲札茋苷纯品；所述曲札茋苷纯品纯度以重量百分比计，为90％-100％。

6.根据权利要求3所述曲札茋苷提取物的一种制备方法，其特征在于曲札茋苷提取物是从野生或栽培的拉萨大黄(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao)的根或根茎中提取。

7.曲札茋苷在制备曲札茋苷纯品中的用途。

8.曲札茋苷提取物在制备预防或治疗心脑血管疾病制剂中的用途。

9.曲札茋苷制剂作为各种医药上可接受的制剂或保健食品，可用于制作药物或保健食品。

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