CN101778952A - 使用寡核苷酸和显著缺乏5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶抑制扩增 - Google Patents
使用寡核苷酸和显著缺乏5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶抑制扩增 Download PDFInfo
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Abstract
提供了通过抑制相关序列的扩增来扩增目标多核苷酸序列的方法和组合物。该方法使用缺乏5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶和不可延伸的阻断剂寡核苷酸，该阻断剂寡核苷酸优选与非目标序列和引物的下游杂交，由此防止通过聚合酶的模板依赖性引物延伸。
Description
发明背景
存在对快速而可靠的核酸分类/鉴定需求的众多实例，尤其是在医学领域中。例如，许多疾病，包括癌症，是罕见突变的结果。检测这些突变可以有助于诊断和预后的确定。
此外，快速而可靠基因分型方法有助于确定个体内和个体间的等位基因组成。例如，个体中特定等位基因的可靠分类可以帮助人的遗传咨询，并且甚至在检测到特异性等位基因的情况中，可以帮助计划预防性的治疗。特定等位基因的鉴定在进行标记辅助选择中也是非常有用的，例如，作物或动物育种项目，病原体和其他生物体的鉴定和基因分型。
发明简述
本发明提供了检测目标序列的方法，其中所述目标序列在生物样品的多核苷酸中，其中样品可以另外或可替换地含有包含第二序列的第二多核苷酸，其中第二序列至少有一个核苷酸不同于目标序列。在一些实施方案中，该方法包括，
i.在允许阻断剂寡核苷酸(blocker oligonucleotide)与第二序列或目标序列(如果存在)杂交的条件下，将样品与阻断剂寡核苷酸接触，
ii.在使得产生引物的模板依赖性延伸的条件下，在杂交的阻断剂寡核苷酸的存在下，将样品与至少一种引物和显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶接触，其中引物与阻断剂寡核苷酸杂交序列的上游多核苷酸(如果存在)杂交；
其中阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱第二序列通过聚合酶的扩增，其中阻断剂寡核苷酸不包含嵌入核苷酸，并且进一步其中寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列通过显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的扩增。
本发明还提供了反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物包括：显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶；含有目标序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二核酸至少有一个核苷酸不同于目标序列；与第二序列和目标序列杂交的阻断剂寡核苷酸；其中阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱在适于在不存在阻断剂寡核苷酸时扩增的条件下第二序列通过聚合酶的扩增，但寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列通过显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的扩增。
本发明还提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶；含有目标序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二核酸至少有一个核苷酸不同于目标序列；与第二序列和目标序列杂交的阻断剂寡核苷酸，其中阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱在适于在不存在阻断剂寡核苷酸时扩增的条件下第二序列通过聚合酶的扩增，但寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列通过显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的扩增。
根据该方法，本发明的试剂盒或优选阻断剂寡核苷酸不含有嵌入核苷酸。
进一步优选的是，在在此所述的方法、试剂盒或混合物中，阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱第二序列通过显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的扩增，但该杂交没有显著削弱具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶的扩增。
在本发明的优选实施方案中，目标序列为5-100个核苷酸长。
在在此所述方法、试剂盒或混合物进一步优选的实施方案中，样品含有目标序列和第二序列。优选，第二序列以目标序列浓度至少十倍的浓度存在于样品中。在此所述方法、试剂盒或混合物的目标序列和第二序列的浓度优选为约1∶1的比例。
根据本发明的多核苷酸特别是基因组DNA。优选，多核苷酸是RNA。
在此所述方法、试剂盒或混合物中所用的阻断剂寡核苷酸通常是可检测标记的。根据本发明，优选可检测标记的阻断剂寡核苷酸是实时检测的，由此检测目标序列的扩增。
在在此所述方法、试剂盒或混合物的优选实施方案中，在第二序列和目标序列之间存在单个核苷酸差异，并且除了在该单个核苷酸的位置，阻断剂寡核苷酸与目标序列完全互补。优选根据本发明，在第二序列和目标序列之间存在2-6个核苷酸差异，并且除了在该2-6个核苷酸的位置，阻断剂寡核苷酸与目标序列完全互补。
在在此所述方法、试剂盒或混合物的优选实施方案中，(1)阻断剂寡核苷酸和第二序列的解链温度；和(2)阻断剂寡核苷酸和目标序列的解链温度之间的差异为至少5℃，根据在2.5％甘油、50mM TricinepH8.3、45mM醋酸钾中测量的。在在此所述方法、试剂盒或混合物的优选实施方案中，阻断剂寡核苷酸对于第二序列的Tm高于阻断剂寡核苷酸对于目标序列的Tm不超过20℃，根据在2.5％甘油、50mM TricinepH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
在在此所述方法、试剂盒或混合物的优选实施方案中，阻断剂寡核苷酸含有至少一个非天然的非嵌入核苷酸，其中与对照寡核苷酸相比，非天然核苷酸提高了阻断剂寡核苷酸的解链温度，除了天然核苷酸代替了非天然核苷酸，对照寡核苷酸在其他方面与阻断剂寡核苷酸相同。
根据本发明的阻断剂寡核苷酸可以含有至少一个非核苷酸部分，其中与对照寡核苷酸相比，非天然核苷酸部分提高了阻断剂寡核苷酸的解链温度，除了缺少非核苷酸部分，对照寡核苷酸在其他方面与阻断剂寡核苷酸相同。对于在此所述的方法、试剂盒或混合物，非核苷酸部分结合DNA的小沟是优选的。
在优选的实施方案中，阻断剂寡核苷酸与第二序列杂交，具有至少70℃的解链温度，该解链温度是在2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
定义
如本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中另外明确指出。因此，例如，关于“一种寡核苷酸(an oligonucleotide)”包括多种寡核苷酸；关于“一个探针(a probe)”包括这样的探针的混合物等。
如在此所用的，“生物样品”指的是含有或推测含有核酸的任何物质(例如，来自细菌、病毒、组织活体检查等)。可以通过本领域技术人员已知的任何方式获得。这样的样品可以是一定含量的组织或流体，或其纯化级分，分离自一个或几个个体，包括但不限于，例如，皮肤、血浆、血清、全血、脊髓液、唾液、外周流体、淋巴流体、房水或玻璃体、滑液、尿液、泪液、血细胞、血液制品、精子、精液、阴道分泌物、肺流出物、浆膜液、器官、支气管肺泡灌洗物、肿瘤、石蜡包埋组织等。样品还可以包括体外细胞培养物的组分和成分，包括但不限于，从细胞培养基中细胞生长获得的条件培养液，重组细胞，细胞成分等。可以通过本领域公知的程序从生物样品获得核酸。
如在此所用的”阻断剂寡核苷酸”指的是如下的寡核苷酸：
(1)在足够低的解链温度下与目标序列形成双链体，以允许显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶来取代阻断剂寡核苷酸并复制目标序列；和
(2)在足够高的解链温度下与第二序列形成双链体(第二序列是目标序列的变体)，以削弱显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶复制目标序列。
阻断剂寡核苷酸可以是，但不必需，包括在3’端的修饰，以阻止阻断剂寡核苷酸通过聚合酶的3’延伸。
“目标序列”指的是生物样品中待检测的多核苷酸序列并且是与阻断剂寡核苷酸的杂交区完全或部分互补的核酸片段(子序列或序列)。“目标序列”可以是至少5个核苷酸长的任何长度。目标序列可以是较大基因序列的一部分或待检测的其他序列。
短语“削弱扩增”指的是消除、抑制或可测量地降低序列的扩增。如在此所述的，通过选择对于目标变体比对于目标具有更高解链温度的阻断剂寡核苷酸，可以削弱目标变体的扩增，由此允许提高的目标序列的扩增和检测。
术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，并且指的是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物的单体的聚合物或其类似物。这包括核苷酸如RNA和DNA的聚合物，及其修饰形式，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)等。在特定的应用中，核酸可以是包括多个单体类型的聚合物，例如，RNA和DNA两者的亚基。核酸可以是或包括，例如，染色体或染色体片段，载体(例如，表达载体)，表达盒，裸NDA或RNA聚合物，扩增子，寡核苷酸，引物，探针等。核酸可以是，例如，单链或双链的，或DNA：RNA杂交体，DNA和RNA嵌合结构。术语“核酸”、“多核苷酸”和”寡核苷酸”之间的长度没有预定的区别，并且在此可以将术语互换使用，除非文中另外明确指出。这样的术语只是指分子的一级结构。
“引物的延伸”指的是结合生物催化剂如聚合酶的核苷酸以模板特异性方式将核苷酸添加至引物3’端的能力。延伸不仅指的是将第一个核苷酸添加至引物的3’端，而且还包括通过延伸的聚合物形成的多核苷酸的任何进一步的延伸。
核酸通常是单链或双链的，并且通常含有磷酸二酯键，尽管在一些情况中，如在此所列出的，包括具有可替换主链的核酸类似物，包括，例如但不限于，磷酰胺(Beaucage等，(1993)Tetrahedron 49(10)：1925，以及其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35：3800；Sprinzl等，(1977)Eur.J.Biochem.81：579；Letsinger等，(1986)Nucl.Acids Res.14：3487；Sawai等，(1984)Chem.Lett.805；Letsinger等，(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470和Pauwels等，(1986)ChemicaScripta 26：1419)，硫代磷酸酯(Mag等，(1991)Nucleic Acids Res.19：1437和U.S.Pat.No.5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321)，O-甲基亚磷酰胺连接(Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach(寡核苷酸和类似物：实践方法)，Oxford University Press(1992))，和肽核酸主链和连接(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等，(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature 365：566和Carlsson等，(1996)Nature 380：207)。其他类似核酸包括具有正电荷主链(Denpcy等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097)；非离子主链(U.S.Pat.Nos.5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English 30：423；Letsinger等，(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等，(1994)Nucleoside &Nucleotide 13：1597；ASC Symposium Series 580，”CarbohydrateModifications in Antisense Research”(反义研究中的碳水化合物修饰)，第2和第3章，编辑Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook；Mesmaeker等，(1994)Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4：395；Jeffs等，(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Tetrahedron Lett.37：743(1996))和非核糖主链的那些，包括U.S.专利No.5,235,033和5,034,506，以及ASCSymposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反义研究中的碳水化合物修饰)，第6和第7章，编辑Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook中描述的那些。含有一个或更多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(Jenkins等，(1995)Chem.Soc.Rev.pp 169-176)。还描述了几种核酸类似物，例如，见Rawls，C & E News，1997年6月2日，p35。可以进行核糖-磷酸酯主链的这些修饰，以促进其他部分如标记部分的添加或改变这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了通常在核酸中发现的天然产生的杂环碱基(例如，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)，核酸类似物还包括具有非天然产生的杂环或其他修饰碱基的那些，其中许多在此得到了描述，或另外进行了参考。特别地，许多非天然产生的碱基进一步描述于，例如，Seela等，(1991)Helv.Chim.Acta 74：1790，Grein等，(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.4：971-976和Seela等，(1999)Helv.Chim.Acta 82：1640。为了进一步说明，任选包括作为解链温度(Tm)修饰剂的核苷酸中所用的特定碱基。例如，这些中的一些包括7-杂氮嘌呤(例如，7-杂氮鸟嘌呤、7-杂氮腺嘌呤等)，吡唑[3，4-D]嘧啶，丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU，丙炔基-dC等)等。参见，例如，U.S.专利No.5,990,303，发明名称为”7-去氮-2’-脱氧鸟苷核苷酸”，其于1999年11月23日授权于Seela。其他代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤，肌苷，黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-去氮-8-氮杂衍生物；6-氮胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-galactosylqueosine，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，7-去氮腺嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，7-去氮鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫-N-6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧醋酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶等。
修饰的碱基和核苷酸的其他实例还描述于，例如，U.S.专利No.5,484,908，发明名称为“含有5-丙炔基嘧啶的寡核苷酸”，1996年1月16日授权于Froehler等，U.S.专利No.5,645,985，发明名称为“使用含有修饰的嘧啶酮的寡聚物提高三链螺旋和双螺旋形成”，1997年7月8日授权于Froehler等，U.S.专利No.5,830,653，发明名称为“含有修饰的嘧啶酮的寡聚物的使用方法”，1998年11月3日授权于Froehler等，U.S.专利No.6,639,059，发明名称为“[2.2.1]双环核苷酸的合成”，2003年10月28日授权于Kochkine等，U.S.专利No.6,303,315，发明名称为“复杂生物样品中核酸的一步样品制备和检测”，2001年10月16日授权于Skouv，和Kochkine等的U.S.专利申请公开No.2003/0092905，发明名称为“[2.2.1]双环核苷酸的合成”，2003年5月15日公开。
没有打算将本发明限于核酸、多核苷酸或寡核苷酸的来源。这样的核酸可以来自人或非人动物，或任何其他生物体(例如，植物，两栖动物，细菌，病毒，支原体等)，组织或细胞，或源自任何重组来源，在体外合成或通过化学合成。再者，核酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、杂交体或上述的任何混合物。核酸可以以双链、单链或部分双链的形式存在。本发明的核酸包括核酸及其片段，以纯化或未纯化形式，包括基因、染色体、质粒、生物材料的基因组，生物材料如微生物，例如，细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人、支原体等。
“聚合酶链式反应延伸条件”指的是如下的条件：在该条件下，与模板核酸杂交的引物在聚合酶链式反应(PCR)退火步骤过程中通过聚合酶得到延伸。本领域技术人员将了解这样的条件可以改变，并且通常受离子强度和温度的影响。各种PCR退火条件描述于，例如，PCR Strategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand和J.J.Sninsky编辑，1995，Academic Press，圣地亚哥，CA)，第14章；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(PCR实验方案：方法和应用指南)，(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White编辑，Academic Press，NY，1990)。
至少一个核酸片段(即，至少两个连续碱基)可以与另一个核酸的至少一个亚序列反向平行地结合或杂交以形成双链体时，核酸对于另一个核酸是”互补的”。反向平行结合可以是分子内的，例如，核酸内的发夹环形式，或分子间的，如两个或更多个单链核酸彼此杂交时。在本发明的内容中，对于与特定的序列”完全互补”的寡核苷酸，寡核苷酸的每个碱基以反向平行方式与特定序列中的对应碱基互补。通常未在天然核酸中发现的特定碱基可以包括在本发明的核酸中，并且包括，例如，肌苷，7-去氮鸟嘌呤和上述的那些。在一些实施方案中，互补性不是完全的(即，核酸可以是“部分互补”，而非“完全互补”)。例如，稳定的双链体可以含有错配的碱基对或未配对的碱基。
“引物核酸”或“引物”是可以与目标或模板核酸杂交并允许使用例如核苷酸结合催化剂如聚合酶在合适的反应条件下的链延伸或延长的核酸。这样的条件通常包括在合适的缓冲液中和在合适的温度下存在一种或更多种脱氧核糖核苷三磷酸酯和核苷酸结合催化剂(“缓冲液”包括是辅因子，或影响pH、离子强度等的物质)。引物核酸通常是天然或合成的寡核苷酸(例如，单链寡脱氧核苷酸等)。尽管任选利用其他引物核酸长度，它们通常含有约6至约100个核苷酸长的杂交区。短的引物核酸通常需要较低的温度，以与模板核酸形成足够稳定的杂交复合物。与模板核酸的亚序列至少部分互补的引物核酸通常足以与模板杂交，用以发生延伸。例如，为了给定目标序列扩增的合适引物的设计是本领域公知的，并描述于在此所引用的文献中。如果需要，可以通过引入标记将引物核酸进行标记，该标记通过例如分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他技术是可检测的。为了说明，有用的标记包括放射性同位素，荧光染料，电子密试剂，酶(如ELISA中常用的)，生物素或肝素，以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白。这些和其他标记中的许多在此得到了进一步描述和/或另外是本领域已知的。本领域技术人员将认识到，在特定的实施方案中，引物核酸也可以用作探针核酸。
如在此所用的，术语“探针“指的是由于探针中的至少一个序列与目标核酸序列部分或完全互补性，可以在合适的条件下与目标核酸的片段(或源自这样的目标核酸的扩增子)形成双链体结构的寡核苷酸(或其他核酸序列)。如在此所讨论的，探针可以是标记或未标记的。探针的3’端任选可以设计成阻止探针结合引物延伸产物中。这可以通过使用非互补性碱基或通过将化学部分如生物素或磷酸酯基团添加至最后一个核苷酸的3’-羟基来实现，根据选定的部分，其可以提供双重用途，其还可以作为标记，用于连接标记的核酸随后的检测或捕获。还可以通过除去3’-OH或通过使用缺乏3’-OH的核苷酸如二脱氧核苷酸，或通过添加通过位阻阻断延伸的体积大的基团来实现阻止延伸。如在此进一步所述的，本发明的阻断剂寡核苷酸可以，但不必需，作为探针。
术语“杂交片段”指的是与多核苷酸完全或基本上互补并因此与其杂交的核酸片段，并且是至少5个连续的核苷酸长。尽管杂交片段通常指的是与完整的阻断剂寡核苷酸杂交的核酸片段，在一些情况中，阻断剂寡核苷酸还包括其他的核苷酸序列，该其他的核苷酸序列没有杂交，但代替了功能，例如，作为连接物、标记、片状物等。在一些实施方案中，阻断剂寡核苷酸的杂交片段与目标序列完全互补。然而，如在此所述的，完整的互补性不是必需的(例如，通常存在至少一个错配，导致阻断剂寡核苷酸和目标序列之间只有部分互补性)。
如在此所限定的，“5’至3’核酸酶活性”指的是包括5’至3’-核酸外切酶活性的模板特异性核酸聚合酶的活性(传统上与一些DNA聚合酶相关，由此以按序的方式从寡核苷酸的5’端除去核苷酸，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段没有(以下段落中讨论的其他聚合酶)。
“显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性”的聚合酶指的是与TaqDNA聚合酶相比具有50％或更低(例如，＜25％，＜20％，＜15％，＜10％)核酸外切酶活性的聚合酶。测量5’-3’核酸外切酶活性的方法和测量条件是本领域公知的。参见，例如，U.S.专利No.5,466,591。显著缺乏5’至3’核酸酶活性的实例DNA聚合酶包括，例如，在该聚合酶典型的引物延伸条件下，具有不可检测的5’至3’核酸酶活性的任何DNA聚合酶。例如，缺乏或具有突变的5’-3’核酸外切酶结构域的聚合酶；大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N-端235个氨基酸的水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)(例如，如U.S.专利No.5,616,494中所述的，或本领域中通常称为“Stoffel片段”)。其他实例包括具有足够删除(例如，N-端删除)、突变或修饰使得消除或灭活负责5’至3’核酸酶活性的结构域的耐热DNA聚合酶。参见，例如，U.S.专利No.5,795,762。示例性DNA聚合酶包括来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、Thermus sp.Z05、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thermusflavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、Thermus sp.sps17、耐放射异常球菌(Deinococcus radioduran)、温泉家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)、大肠杆菌(Escherchia coli)、海栖热孢菌(Thermotogamaritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)的那些。对于各种耐热DNA聚合酶的完全核酸和氨基酸序列是可获得的。水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)、栖热菌种Z05、栖热菌种sps17、海栖热袍菌(Tma)和非洲栖热腔菌(Taf)聚合酶在PCT国际专利公开No.WO92/06200中已经公开。来自黄栖热菌的DNA聚合酶的序列已经公开于Akhmetzhanov和Vakhitov(NucleicAcids Research 20：5839，1992)。来自Thermus caldophilus的耐热DNA聚合酶的序列可以在EMBL/GenBank登录号No.U62584中找到。来自丝状栖热菌的耐热DNA聚合酶的序列可以使用例如U.S.专利No.4,889,818中提供的方法以及其中提供的序列信息从ATCC保藏No.42380回收。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列来自GeneSeq专利数据库登录号No.R98144和PCT WO97/09451。来自热坚芽孢杆菌的耐热DNA聚合酶的序列描述于例如Uemori等(J Biochem(Tokyo)113(3)：401-410，1993；还可以参见，Swiss-Prot数据库登录号No.Q04957和GenBank登录号D12982和BAA02361)。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的序列已经公开于U.S.专利No.6,066,483中。可以修饰来除去或突变5’-3’核酸外切酶结构域的DNA聚合酶的未修饰形式的实例包括，例如，U.S.专利No.6,228,628；6,346,379；7,030,220；6,881,559；6,794,177；6,468,775和U.S.专利申请No.20040005599；20020012970；20060078928和20040115639。如U.S.专利No.5,795,762中所解释的，已经发现Taq DNA聚合酶氨基酸序列中残基46的Gly的密码子的第二位置中G至A的定点突变(即，DNA序列中的G(137)突变成A)导致了5’至3’核酸外切酶活性大约1000倍的降低，但聚合酶活性、加工性或延伸率没有显著变化。该Taq DNA聚合酶核苷酸序列的定点突变导致Gly(46)至Asp的氨基酸变化。Taq DNA聚合酶的甘氨酸46在栖热菌种sps17 DNA聚合酶中是保守的，但位于残基43，并且相同的Gly至Asp的突变对Tsps17 DNA聚合酶的5’至3’核酸外切酶活性具有相似的作用。Tth(Gly46)、TZ05(Gly46)、Tma(Gly37)和Taf(Gly37)DNA聚合酶的保守的Gly至Asp的突变对这些聚合酶的5’至3’核酸外切酶活性具有相似的减弱作用。
如在此所用的，术语“Tm”指的是“解链温度”。解链温度是如下的温度：在该温度下同质双链或异质双链(即，完全或部分互补的双链体)中的一半双链多核苷酸或核碱基寡聚物(例如，杂交复合物)分离成单链(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。双链多核苷酸的Tm的预测考虑碱基序列以及其他因素，包括结构序列特征和寡聚物连接的性质。预测和通过实验测定Tm的方法是本领域已知的。
例如，传统上通过解链曲线来测定Tm，其中在受控温度程序下加热双链体核酸分子，并且监控双链体中两条单链的结合/解离状态和作出曲线，直至达到两条链完全解离的温度。从该解离曲线测定Tm。或者，可以通过退火曲线来测定Tm，其中将双链体核酸分子加热至两条链完全解离的温度。然后在受控的温度方案中降低温度，并且监控双链体中两条单链的结合/解离状态和作出曲线，直至达到两条链完全退火的温度。然后从该退火曲线测定Tm。
附图简述
图1说明了相关序列的扩增抑制同时允许目标序列扩增的实例。所示样品含有一个拷贝的目标序列(底部)和两个拷贝的相关序列(两个顶端的水平线)。图的左半部分说明了阻断剂寡核苷酸与序列的杂交。在该实施例中，在阻断剂和目标序列的片段中存在错配，而顶端相关序列中不存在错配，因此导致与目标序列的Tm相比，相关序列的Tm较高。图的右半部分说明了较高的相关序列的Tm怎样导致相关序列通过聚合酶的削弱扩增(在该情况中，为阻断)，而目标序列的扩增没有受到削弱。尽管图展示了两个拷贝的目标变体和一个拷贝的目标，将理解本发明在不同比例的目标和变体的情况中也是有用的，这些比例包括，例如，1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000等。
图2说明了在与野生型序列完全互补但与突变序列具有一个错配的不稳定检测探针的存在下，来自因子5野生型和突变DNA的ZO5 DNA聚合酶扩增的解链数据，实施例中详细说明了。
图3说明了在与野生型序列完全互补但与突变序列具有一个错配的稳定检测探针(阻断剂)的存在下，来自因子5野生型和突变DNA的ZO5 DNA聚合酶扩增的解链数据，实施例中详细说明了。
图4说明了在与野生型序列完全互补但与突变序列具有一个错配的不稳定检测探针的存在下，来自因子5野生型和突变DNA的ΔZO5 DNA聚合酶(缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶-参见，例如，U.S.专利No.5,466,591)扩增的解链数据，实施例中详细说明了。
图5说明了在与野生型序列完全互补但与突变序列具有一个错配的稳定检测探针(阻断剂)的存在下，来自因子5野生型和突变DNA的ΔZO5 DNA聚合酶(缺乏5’-3’核酸外切酶活性)扩增的解链数据，实施例中详细说明了。
图6说明了在与野生型序列完全互补但与突变序列具有一个错配的稳定检测探针(阻断剂)的存在或不存在下，来自因子5野生型和突变DNA的ΔZO5 DNA聚合酶(缺乏5’-3’核酸外切酶活性)扩增的解链数据，实施例中详细说明了。在该图中，阻断剂存在于开始时的PCR管中，或在PCR后加入。在PCR过程中不存在探针时，野生型(蓝色)和突变(红色)目标都产生了正常的扩增-虚线。在PCR过程中存在探针时，突变目标仍然得到了扩增并且充分解链，但野生型没有。
详述
I.引言
本发明是部分基于以下令人惊讶的发现：在足够高的解链温度下与多核苷酸形成双链体的寡核苷酸可以削弱通过显著缺乏5’-3’活性的聚合酶的复制和模板扩增。已经发现了该现象可以应用于检测目标变体序列(在此有时候也称为“第二序列”)的存在下的目标序列，通过设计寡核苷酸(称为“阻断剂寡核苷酸”)，使得阻断剂寡核苷酸在足够高的解链温度下与变体形成双链体以削弱变体的扩增，而阻断剂寡核苷酸和目标形成双链体的解链温度较低，因此阻断剂寡核苷酸没有显著削弱目标的扩增。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可用于检测高度相关序列混合物中的特定目标序列。
在不是限制本发明范围的简单实施例中，设计了寡核苷酸，使得寡核苷酸与目标变体序列完全互补，并且因此形成双链体，使用了削弱缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶显著扩增目标变体的Tm。在该实施例中，目标与变体具有单个核苷酸差异，因此寡核苷酸与目标也形成了双链体，但具有至少一个错配的碱基对。该错配的碱基对导致和与变体序列形成双链体的相比，阻断剂寡核苷酸与目标形成双链体的Tm降低，并且该Tm的降低足以使聚合酶扩增目标序列而没有显著削弱聚合酶扩增模板，阻断剂寡核苷酸与该模板杂交。
因此，本发明提供了检测目标序列的方法，即使是在其他不同的但高度相关序列的存在下，并且即使如果相关序列含量显著高于目标序列。因此，本发明的方法可以用于各种应用，包括，例如，表示癌症或其他疾病突变的检测。
II.本发明方法的综述
本发明利用了阻断剂寡核苷酸对目标序列和目标变体序列的杂交亲和性的差异，其中与对目标序列的Tm相比，阻断剂寡核苷酸对一个或更多个目标变体序列形成双链体具有较高的Tm(即，较高的亲和性)。在一些实施方案中，例如，阻断剂寡核苷酸和目标序列之间较低的Tm是杂交片段中至少一个错配的结果。例如，可以设计阻断剂寡核苷酸来与目标变体序列完全互补，但与目标序列只有部分互补。例如，错配可以是插入、删除或核苷酸取代的结果，由此导致目标和目标变体序列之间的差异。
在在此所述的方法、试剂盒或混合物的优选实施方案中，在允许阻断剂寡核苷酸与目标序列(如果存在)和目标变体序列(如果存在)杂交的条件下，将含有具有目标序列的核酸和/或具有目标变体的核酸的样品接触阻断剂寡核苷酸。然后进行引物延伸反应，其中引物与核酸片段的片段上游的核酸杂交，阻断剂寡核苷酸在该位置杂交。如在此所用的，“引物延伸反应”指的是导致一个或更多个引物延伸的任何反应，并且因此术语包括，例如，聚合酶链式反应。测定核酸上引物杂交的位置，使得如果阻断剂寡核苷酸与具有足够亲和性的核酸杂交(即，阻断剂寡核苷酸具有足够高的Tm)，引物的延伸通过阻断剂寡核苷酸得到阻断。使用显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶进行引物核酸反应。如在此所讨论的，本发明人发现了如果阻断剂寡核苷酸以足够高的亲和性杂交，显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶不能置换阻断剂寡核苷酸。因此，使用显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶时，引物延伸反应通常只在核酸含有目标序列(即，阻断剂寡核苷酸对其不具有足够亲和性的序列)的情况中才能完成(即，获得引物的全部延伸)。
图1说明了上述的方法。图1的左侧表示管中的样品，其中存在两个拷贝的含有目标变体的核酸和一个拷贝的含有目标序列的核酸。将阻断剂寡核苷酸接触核酸并与目标或目标变体序列杂交。因为目标序列含有至少一个不同于目标变体的核苷酸，阻断剂寡核苷酸没有与目标序列完全互补(图1中用”X”表示)。因此，尽管阻断剂寡核苷酸与目标序列杂交，但其以阻断剂寡核苷酸和目标变体的Tm低的Tm来进行这。
图1的右侧说明所得到的引物延伸反应。通过小箭头来表示引物，引物朝每个核酸的左边杂交。通过显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶在含有目标变体的核酸上延伸引物时，阻断剂寡核苷酸的杂交削弱了(即，抑制至少一些，并且通常是大部分，或几乎全部)跨过目标变体序列的延伸，并且因此导致不完全的延伸。相反，因为阻断剂寡核苷酸以较低的亲和性(即，较低的Tm)与目标序列杂交，聚合酶能够延伸跨过目标序列的引物(通过置换阻断剂寡核苷酸来推测)。
目标和目标变体序列在杂交片段(即，阻断剂寡核苷酸与序列杂交的片段)中有至少一个核苷酸不同(例如，插入、删除或改变的核苷酸)。通常，目标和目标变体足够相似，使得阻断剂寡核苷酸可以在相同的条件下与目标和目标变体杂交，例如，引物延伸反应的条件，包括但不限于，扩增反应如PCR或其他扩增反应。因此，在一些实施方案中，目标和目标变体在杂交片段有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个核苷酸不同，例如，1-5、1-4、1-3、1-2、2-3、2-4、2-5、1-20、2-20个核苷酸。在一些实施方案中，目标序列与目标变体序列的同一性低于100％，但高于，例如，80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。在各种实施方案中，目标和目标变体序列之间的差异发生于序列的内部，而不是末端5’或3’核苷酸。
目标序列可以是任何长度的。在一些实施方案中，目标核苷酸是至少5个核苷酸长，例如，至少10、15或更多个核苷酸，例如，5-200、5-100、10-200、10-100、10-50、20-80个核苷酸等。
尽管本公开内容按照如果存在一个目标和一个目标变体概括地讨论了本发明，将可以理解在一些实施方案中，在样品内存在多个不同目标序列和/或目标变体。在一些实施方案中，在含有目标序列的样品中存在或可能存在超过一个的不同目标变体序列。因此，例如，样品可以含有目标序列，含有一个核苷酸不同于目标序列的一个目标变体和含有不同于目标序列的核苷酸的第二目标变体。
在在此所述的方法、试剂盒或混合物的优选实施方案中，可以进行”多元”反应，其中检测了至少两个不同的目标序列。这些实施方案通常，但不是总是，包括使用两个或更多个(例如，2、3、4、5等，取决于待检测的目标数量)不同的阻断剂寡核苷酸，其中每个阻断剂寡核苷酸削弱了不同目标序列变体的延伸，
其中引物杂交和阻断剂寡核苷酸杂交的核酸片段之间的距离可以不同，只要距离不是远得在到达阻断剂寡核苷酸杂交的片段之前完成了延伸反应。在一些实施方案中，其中引物3’大部分片段杂交和阻断剂核苷酸5’大部分片段的核苷酸之间的距离约5-1000个核苷酸，例如，10-100个核苷酸，但可以小如零(邻接)。
在与含有目标变体的核酸杂交的那些和含有目标序列的那些之间，用于引物延伸的引物可以相同，但引物也可以是不同的。例如，在期望检测生物体中罕见体细胞突变的情况中，生物体的基因组通常是相同的，除了突变位点的变化。因此，目标序列将包括突变位点，并且可以使用相同的引物，因为突变位点的上游片段(不管突变位点是否突变了)将具有相同的序列。然而，尽管可能更罕见，存在如下的情况：可以预想其中用于目标和目标变体核酸的延伸反应的引物是不同的，并因此没有从本发明中排除这些实施方案。
可以通过各种方法检测延伸产物，并且可以将失败的目标变体延伸产物与目标延伸产物区分开来。在一些实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)和其他类型的核酸扩增。对于PCR反应，通常使用两个引物。如本发明的方法中所用的，一个PCR引物是参考以上“引物延伸”反应所讨论的引物，而将第二引物(例如，反向引物)设计来与阻断剂寡核苷酸下游的核酸序列的补体杂交。如本发明方法中所用的，PCR是有用的，因为只对于其中聚合酶能够置换阻断剂寡核苷酸(即，涉及目标序列的那些)的那些反应才产生指数扩增。各种显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的耐热聚合酶是已知的和在此所述的。本发明的方法发现了在不对称PCR反应中的特别用途，不对称PCR反应即其中一个引物与反应中的另一个引物相比是处于限制浓度的。通常，产生阻断剂寡核苷酸与其杂交的链的引物(以上实施例中的反向引物)是限制浓度的引物。
与进行的引物延伸反应的类型无关，可以使用各种不同类型的方法来检测延伸产物。在一些实施方案中，将探针(例如，可检测标记的探针)设计来与延伸产物杂交，该延伸产物对应于目标序列和核酸上目标序列下游的序列，和这些序列的补体。这样的探针将只可以，或主要，检测延伸产物，该延伸产物涉及含有目标序列的核酸，因为来自含有目标变体的核酸的延伸产物将受到削弱，并因此通常不包括目标序列、目标变体序列或下游序列。
例如，在一些实施方案中，使用可检测标记的“实时”探针并作为阻断剂寡核苷酸。这样的探针可以包括，但不限于，探针和分子信标。在一些实施方案中，可检测“实时”标记(也用作阻断剂寡核苷酸)和实时扩增反应如实时PCR反应中所用的一样。循环极限(Ct)值常常用来监控实时扩增中的目标含量。在一些实施方案中，在目标和目标变体之间存在至少5、10、15或更多Ct的差异，这是在等量目标和目标变体序列的存在下在实时扩增反应中检测的。
在一些实施方案中，基于质量的检测方法可以用来检测延伸产物。因为来自含有目标序列的核酸的延伸产物通常将显著长于从含有目标变体序列的核酸产生的那些，可以使用检测核酸长度或质量差异的任何方法。例如，可以使用各种质谱方法来检测、区分和定量延伸产物。
优选，使用解链温度分析来检测延伸产物。例如，在一些实施方案中，将阻断剂寡核苷酸标记并进行解链曲线分析来定量标记的寡核苷酸与其杂交的模板的含量。
III.阻断具有削弱的5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶延伸的寡核苷酸
将本发明的阻断剂寡核苷酸设计来以高于阻断剂与目标序列自身杂交的解链温度(Tm)与目标序列变体杂交。阻断剂寡核苷酸不需要与目标变体完全互补，只要阻断剂寡核苷酸以足够高的Tm与目标变体杂交，以在指定的条件下削弱聚合酶复制阻断剂寡核苷酸与其杂交的模板的片段。在一些实施方案中，阻断剂寡核苷酸与目标变体完全互补，但与目标序列杂交时，形成至少一个错配(例如，1、2、3、4、5、6、7、1-3、1-4、2-6个错配等)，由此导致目标的Tm低于目标变体。在一些实施方案中，阻断剂寡核苷酸没有与目标或目标变体序列完全互补。在一些实施方案中，阻断剂寡核苷酸与目标变体形成至少一个或更多个错配，然而，以足够高的Tm杂交以削弱在阻断剂寡核苷酸存在下聚合酶复制变体序列，而没有显著削弱目标序列的复制。在一些实施方案中，阻断剂寡核苷酸与目标序列比与目标变体具有更大量的错配或与目标变体相比与目标序列具有不同的错配，使得在阻断剂寡核苷酸的存在下，目标变体序列的复制受到削弱，而在阻断剂寡核苷酸的存在下，目标序列的复制没有受到显著削弱。在一些实施方案中，目标和变体序列之间的错配没有发生在序列的5’或3’端。在一些实施方案中，将阻断剂寡核苷酸进行设计，使得在通过阻断剂寡核苷酸和目标变体的双链体形成的杂交片段中间(不在末端)形成一个或更多个错配。在一些实施方案中，将阻断剂寡核苷酸进行设计，使得在通过阻断剂寡核苷酸和目标变体的双链体形成的杂交片段的一端或两端形成一个或更多个错配。
如在此所讨论的，阻断剂寡核苷酸与特定目标变体的Tm显著高于阻断剂寡核苷酸对于目标序列的Tm，使得目标变体的复制受到削弱，而相同条件下的目标复制没有受到显著削弱，由此允许可以在目标变体的存在下检测目标序列。优选，阻断寡核苷酸对于目标变体的Tm与对于目标序列的相比的差异为至少约5℃、10℃、15℃、20℃或更多。将认识到可以以不同的方式来测量Tm。可以使用其他混合物的任何扩增缓冲液来测定Tm，该缓冲液就是或模仿了测试使用聚合酶复制的条件。这样条件的一个实例是，例如，2.5％甘油、50mM pH8.3 Tricine、45mM醋酸钾，和合适的核苷酸，用于引物延伸。
本发明的阻断剂寡核苷酸可以是任何长度。优选，阻断剂寡核苷酸为5-200个核苷酸，例如，5-100、10-100、5-40、5-25、10-50、15-50个核苷酸长。
本发明的阻断剂寡核苷酸可以包括，并且有时候只包括，天然单声道核苷酸(即，A、C、T、G和U)。或者，在一些实施方案中，阻断剂寡核苷酸包括至少一个(例如，1、2、3、4、5、6等)人工(即，不是在天然产生RNA或DNA中产生的那些)核苷酸。引起提高的Tm的示例性人工碱基在本领域中有描述，包括但不限于，Lebedev等，GeneteicAnalysis-Biomolecular Engineering(遗传分析-生物分子工程化)，13：15-21(1996)；Xodo等，Nucleic Acids Res.19：5625-5631(1991)；Froehler等，Tetrahedron Lett.33：5307-5310(1992)；Kutyavin等，Biochemistry 35：11170-11176(1996)；Nguyen等，Nucleic Acids Res.25：30599-65(1997)。例如，2-氨基A将Tm提高超过A约3℃，5-甲基-C将Tm升高超过C约1.3℃，C-5丙炔基-C将Tm提高超过C约2.8℃和C-5丙炔基-U将Tm提高超过T约1.7℃。优选，根据本发明，阻断剂核苷酸不含有任何嵌入核苷酸。此外，本发明的阻断剂寡核苷酸不含有内部嵌入拟核苷酸，如WO2006/026828中所述的那些。
在进一步优选的实施方案中，本发明的阻断剂寡核苷酸含有至少一个提高阻断剂寡核苷酸解链温度的非核苷酸部分(任选，不同于嵌入核苷酸)。这样的非核苷酸部分的实例包括，例如，较小基团粘合剂，参见，例如，US专利No.6,486,308。
根据本发明，将阻断剂寡核苷酸可检测地标记并因此进一步用于检测混合物的目标序列。例如，将可检测标记的阻断剂寡核苷酸用于检测和定量扩增反应中的目标序列，扩增反应包括但不限于实时扩增反应。各种可检测标记是已知的。示例性标记包括荧光标记(包括，例如淬灭剂或吸附剂)、非荧光标记、比色标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、改变质量的基团、抗体、抗原、生物素、半抗原、酶(包括，例如，过氧化物酶、磷酸酶)等。标记可以提供通过荧光、放射性、比色、重量测定、X-射线衍射或吸收、磁力、酶活性等可检测的信号。标记可以用于提供可检测(并且任选可定量)的信号，并且将其连接核酸或蛋白质。
在本发明特定的优选实施方案中，标记是荧光染料或荧光团。通常，特定的荧光团在吸收较短波长的光后可以发出特定波长的光。由特定的荧光团发出的光的波长是该荧光团特征性的。因此，可以通过用较短波长的光激发荧光团后检测合适波长的光来检测特定的荧光团。荧光标记可以包括负电荷的染料，如荧光素家族的染料，或中性电荷的染料，如羧基若丹明家族的染料，或正电荷的染料，如花菁家族或若丹明家族的染料。可以用于本发明中的染料的其他家族包括，例如，多卤代荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合的镧系元素家族染料、ALEXA
染料和
家族染料。荧光素家族的染料包括，例如，FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。羧基若丹明家族的染料包括Texas红、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA由Perkin-Elmer(Foster City，Calif.)销售，而Texas红由Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oreg.)销售。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7由AmershamGE Healthcare(Piscataway，N.J.)销售。
IV.具有削弱的5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶
各种显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶是本领域已知的。聚合酶的N-端片段通常给予5’-3’核酸外切酶活性。因此，聚合酶N-端的所有或部分突变或删除可以用来产生显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶。显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的示例性聚合酶包括大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段；缺乏N-端235个氨基酸的水生栖热菌Taq(例如，如U.S.专利No.5,616,494中所述的)；和/或具有足够删除(例如，N-端删除)、突变或修饰以消除或灭活负责5’至3’核酸外切酶活性的结构域的耐热DNA聚合酶。参见，例如，U.S.专利No.5,795,762。这样的聚合酶通常是分离的或纯化的聚合酶，并可以是重组蛋白。
在扩增反应，包括在热循环扩增反应中起作用的聚合酶在本发明中特别有用。用于本发明方法的聚合酶缺乏显著的5’-3’核酸外切酶活性，使得聚合酶不能够以模板依赖性方式通过阻断剂寡核苷酸杂交的目标变体模板片段来延伸引物，但能够通过阻断剂寡核苷酸杂交的目标模板片段来延伸引物，其中阻断剂寡核苷酸对目标变体模板的Tm高于对目标模板的。因此，本领域技术人员将认识到聚合酶中5’-3’核酸外切酶活性的精确水平(如果有的话)可以根据阻断剂寡核苷酸对于目标和目标变体的Tm而不同。
根据本发明的方法，通过阻断剂寡核苷酸足以削弱显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶对目标变体序列的复制，这有利于目标的相应扩增。不是用来限制本发明的范围，认为在目标序列和密切相关的目标变体之间可以存在竞争反应。在与目标相比存在显著更多拷贝目标变体的情况中，在阻断剂不存在下的扩增导致使目标序列具有降低的可检测性或不可检测的扩增。期望在目标变体存在下检测目标时，通过阻断剂寡核苷酸的杂交来削弱变体的扩增，而目标的扩增没有削弱或削弱程度较低，以允许可以在目标变体的存在下检测目标。与缺乏阻断剂寡核苷酸的对照反应相比，阻断剂的存在将变体扩增子的含量降低至少20％时，认为目标变体的扩增显著受损，更常见降低至少50％、75％、90％、95％或更多。
根据本发明，还使用具有显著5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶替代显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶进行了对照反应。这样的对照反应可以用于测定目标变体的存在或不存在，因为在这样的对照反应中，目标变体得到了扩增。这样的对照反应还可以用于证实扩增试剂是功能性的。将认识到也可以使用其他不同的对照。
V.该方法的用途
本发明可用于检测目标序列和含有目标序列的核酸。本发明特别可用于检测目标变体存在下的目标序列，尤其是其中与待检测的目标序列相比，目标变体为过量浓度的情况。没有用来限制本发明的范围，这样的情况的一些实例是体细胞突变或癌症相关突变的检测。例如，本发明可用于检测生物活体检查中的癌症或其他体细胞突变，其中大部分细胞很可能具有“正常”形式的基因序列(即，目标变体)，但至少一些细胞具有突变(即，目标序列)。
本发明可以用于分析和检测任何样品中的核酸，包括如在此所述的生物样品。本发明方法中所用的样品可以含有目标和目标变体序列两者，只有目标或目标变体序列或两者都无。在一些实施方案中，目标或目标变体的存在是已知的，而在其他实施方案中，不知道是否存在目标或目标变体。
VI.反应混合物
本发明还提供了本发明方法中涉及的反应混合物。可以产生如上所述的任何反应混合物。示例性反应混合物包括，例如，显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶；含有目标序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二序列与目标序列至少有一个核苷酸不同；和阻断剂寡核苷酸，其中阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱第二序列通过聚合酶的扩增，但寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列的扩增。反应混合物可以进一步包含浓度为用于引物延伸和/或扩增反应的核苷酸(例如，dNTP，如dATP、dCTP、dGTP、dTTP和/或dUTP，或其任意组合)。此外，反应混合物含有一个或更多个与目标和/或第二序列杂交的引物，例如，至少一个与阻断剂寡核苷酸杂交片段的上游杂交的引物和/或含有5’正义引物和相应3’反义引物的引物对。在其他、互斥变化中，反应混合物包括一个或更多个提供游离核苷酸(常规和/或非常规)的核苷酸。例如，反应混合物可以包括α-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dITP和/或标记的dNTP，如，例如，荧光素-或花菁-染料家族dNTP。在此所述的特定阻断剂寡核苷酸、聚合酶、引物和其他试剂也可以包括在以上部分中详述的反应混合物中。根据本发明的反应混合物也可以包括在提供5’正义引物的容器中或与提供5’正义引物的容器一起使用，该引物在引物延伸条件下可与目标和/或第二序列杂交。
VII.试剂盒
本发明还提供了用于本发明方法中的试剂盒。通常，为了易于使用，将试剂盒分隔，并含有至少一个提供显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶的容器。还可以包括一个或更多个提供其他试剂的其他容器。这样其他的容器可以包括本领域技术人员知道的任何试剂或其他元件，用于根据上述方法的引物延伸程序中，包括用于例如核酸扩增程序(例如，PCR、RT-PCR)、DNA测序程序或DNA标记程序中的试剂。例如，试剂盒可以包括含有目标序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二序列与目标序列至少有一个核苷酸不同；和阻断剂寡核苷酸，如在此所述的。在优选的实施方案中，试剂盒进一步包括提供在引物延伸条件下可与目标和/或第二序列杂交的5’正义引物和/或含有5’正义引物和相应3’反义引物的引物对的容器。在其他、非互斥变化中，试剂盒包括一个或更多个提供游离核苷酸(常规和/或非常规的)的容器。在特定的实施方案中，试剂盒包括α-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dITP和/或标记的dNTP，如，例如，荧光素-或花菁-染料家族dNTP。在更多其他、非互斥变化实施方案中，试剂盒包括一个或更多个提供适用于引物延伸反应的缓冲液的容器。
实施例
提供以下实施例来说明但非限制所要求的发明。
实施例1：
该实施例说明了使用阻断剂寡核苷酸来抑制因子5野生型等位基因的扩增，使用解链曲线分析来检测突变等位基因。
在该实施例中，不对称PCR样品主体混合物由以下组成：2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾；200uM dATP，200uM dGTP，200uM dCTP，400uM dUTP；0.7uM上游(过量)引物；0.1μM下游(有限)引物；0.4μM检测探针；4U尿嘧啶-N-糖基化酶；40U ΔZO5 DNA聚合酶或ZO5 DNA聚合酶；和4mM醋酸镁。
将主体混合物用于扩增因子5野生型和突变质粒DNA目标。过量引物以7x有限引物浓度存在，以确保单链扩增子对于与其结合的检测探针的过量。在Roche Lightcycler LC480上进行扩增和解链。
用于该实施例的热循环特征为：50℃ 5分钟(UNG步骤)；94℃ 15秒-59℃ 40秒x2个循环；91℃15秒-59℃40秒x48循环，94℃30秒，在59℃退火步骤过程中收集数据；在40℃至95℃之间的解链步骤中收集恒定数据。
上游引物的序列是TGAACCCACAGAAAATGATGCCCBz(SEQ IDNO：1)；下游引物的序列是GGAAATGCCCCATTATTTAGCCAGGBz(SEQ ID NO：2)；Bz＝t-丁基dA。稳定的检测探针(阻断剂)的序列为EFFLLFLGLLFGFLLAGGGQ(SEQ ID NO：3)，其中E＝cx-FAM、Q＝BHQ2、F＝丙炔基dU和L＝丙炔基dC。不稳定检测探针的序列(非阻断剂)是ECTGTATTCCTCGCCTGTCCAGQP(SEQ ID NO：4)，其中E＝cx-FAM、Q＝BHQ2、F＝丙炔基dU、L＝丙炔基dC和P＝3’磷酸酯。这些寡核苷酸优选与野生型目标配对，并且与突变目标具有一个错配(CA错配)，用粗体和下划线标出了。
来自该实施例的解链数据表明使用ZO5 DNA聚合酶，两个探针获得和预期一样的解链曲线，而野生型获得最高的Tm，突变目标获得最低的Tm和杂合子获得野生型合突变等位基因两者的Tm(图2&图3)。因为ZO5分裂了探针，观察到没有扩增抑制。可以看到稳定探针对2个等位基因的Tm高于不稳定探针大约12℃。此外，还观察到不确定的较高Tm峰，如主要解链峰右侧的肩部。
使用ΔZO5，不稳定的探针也获得了相同的解链曲线，但是信号更多，因为在PCR过程中探针没有降解(图4)。
然而，将ΔZO5与稳定探针一起使用时(图5)，杂合子样品中的野生型等位基因没有形成野生型等位基因的解链曲线；得到了与突变目标相同的解链曲线，表明野生型等位基因的扩增受到抑制。使用ZO5，纯野生型目标获得比野生型目标低得多和宽得多的解链曲线(图3)。
实施例2：
使用稳定探针和非分裂酶对扩增的影响的更多证据显示于图6中。使用实施例1中所述的相同扩增条件，使用ΔZO5，稳定的探针存在于开始时的PCR管中，或在PCR-后加入。然后进行解链，产生了野生型(蓝色)和突变(红色)目标的正常扩增-虚线。在PCR过程中存在探针时，突变目标仍然充分扩增和解链，但野生型没有。
实施例3：
在实时PCR中也观察到了抑制。使用实施例1中所述的相同PCR条件，来自相同实验的生长曲线数据显示了与使用ZO5的无延迟相比，使用ΔZO5野生型和突变目标之间约12个循环的极限循环(Ct)延迟，以测试阻断剂寡核苷酸作用是否是由于稳定碱基的存在(丙炔基dU &丙炔基dC)，制得并测试了长的不稳定探针(52-mer)，其与短的稳定探针具有相同的Tm。该探针的序列为：
ECAAGGACAAAATACCTGTQATTCCTCGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGP(SEQ ID NO：5和6)，其中E＝cx-FAM、Q＝BHQ2和P＝3’磷酸酯。
与使用ZO5的无延迟相比，观察到使用ΔZO5，野生型和突变目标之间的11个循环延迟。该结果表明在确定探针是否可以作为阻断剂中，Tm是最关键的因素。
实施例4：
进行实验来模拟罕见突变检测测试。使用实施例1中所述的反应条件，将不同比例的野生型和突变质粒DNA目标混合在一起，以观察在野生目标的背景中可以检测哪个水平的突变目标。制备了100∶1(对应于10,000野生型拷贝+100突变拷贝)，500∶1(50,000野生型拷贝+100突变拷贝)，1000∶1(100,000野生型拷贝+100突变拷贝)，5000∶1(500,000野生型拷贝+100突变拷贝)和10,000∶1(1,000,000野生型拷贝+100突变拷贝)的比例。对于高达1000∶1比例的突变目标，观察到清楚的可说明的解链曲线。而在此之上，来自野生型的解链曲线开始干扰突变体解链曲线，表明野生型目标的扩增的有效阻断不再发生。
理解在此所述的实施例和实施方案只是用于说明性的目的，并且根据其的各种改变或变化是本领域技术人员显而易见的并且包括在本申请的精神和范围中以及所附权利要求的范围中。
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH，
F.Hoffmann-La Roche AG
<120>使用寡核苷酸和明显缺乏5-3’核酸外切酶活性的聚合酶抑制扩增
<130>24312WO
<140>US尚未指定
<141>尚未指定
<150>US 60/964,089
<151>2007-08-08
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：因子5野生型等位基因不对称PCR扩增上游引物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(24)
<223>a＝t-丁基苯甲基dA
<400>1
tgaacccaca gaaaatgatg ccca 24
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：因子5野生型等位基因不对称PCR扩增下游引物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(26)
<223>a＝t-丁基苯甲基dA
<400>2
ggaaatgccc cattatttag ccagga 26
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：因子5野生型等位基因不对称PCR扩增稳定的检测探针(阻断剂)
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)
<223>n＝通过脱碱基亚磷酰胺cx-FAM修饰的丙炔基dU
其中cx-FAM＝结合6-羧基荧光素(FAM)的环己烷连接物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(2)
<223>u＝丙炔基dU
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(4)
<223>c＝丙炔基dC
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(5)
<223>u＝丙炔基dU
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(6)
<223>c＝丙炔基dC
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(8)..(9)
<223>c＝丙炔基dC
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(10)
<223>u＝丙炔基dU
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(12)
<223>u＝丙炔基dU
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(13)..(14)
<223>c＝丙炔基dC
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)
<223>通过Black Hole Quencher BHQ2(Q)修饰的g
<400>3
nuccucgccu guccaggg 18
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：因子5野生型等位基因不对称PCR扩增不稳定的检测探针(非阻断
剂)
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)
<223>通过5′脱碱基亚磷酰胺cx-FAM修饰的c
其中cx-FAM＝连接6-羧基荧光素(FAM)的环己烷连接物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(21)
<223>通过Black Hole Quencher BHQ2(Q)和3′
磷酸酯(P)修饰的g
<400>4
ctgtattcct cgcctgtcca g 21
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：因子5野生型等位基因实时PCR长的不稳定探针
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)
<223>通过缀合cx-FAM的脱碱基亚磷酰胺修饰的c
其中cx-FAM＝结合6-羧基荧光素(FAM)的环己烷连接物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)
<223>在连接SEQ ID NO：6的5′端的糖-磷酸酯主链中通过缀合Black Hole Quencher BHQ2(Q)
的脱碱基亚磷酰胺修饰的t
<400>5
caaggacaaa atacctgt 18
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：因子5野生型等位基因实时PCR长的不稳定探针
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)
<223>在连接SEQ ID NO：5的3′端的糖-磷酸酯主链中通过缀合Black Hole Quencher BHQ2(Q)
的脱碱基亚磷酰胺修饰的a
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(33)
<223>通过3′磷酸酯修饰的g
<400>6
attcctcgcc tgtccaggga tctgctctta cag 33
Claims (15)
1.检测目标序列的方法，其中所述目标序列在生物样品的多核苷酸中，其中样品可以另外或可替换地含有第二多核苷酸，所述第二多核苷酸含有第二序列，其中所述第二序列与所述目标序列至少有一个核苷酸不同，所述方法包括：
i.在允许阻断剂寡核苷酸在存在第二序列或目标序列时与所述第二序列杂交或目标序列杂交的条件下，将样品与阻断剂寡核苷酸接触，
ii.在杂交的阻断剂寡核苷酸的存在下，将样品与至少一种引物和显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶接触，以便发生引物的模板依赖性延伸，其中，引物与阻断剂寡核苷酸杂交序列上游的多核苷酸杂交，如果存在该多核苷酸；
其中阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱第二序列通过聚合酶的扩增，其中阻断剂寡核苷酸不包含嵌入核苷酸，并且进一步其中寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列通过显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的扩增。
2.权利要求1的方法，其中所述阻断剂寡核苷酸是可检测标记的。
3.权利要求1的方法，其中在所述第二序列和目标序列之间存在单个核苷酸差异，并且除了在所述单个核苷酸的位置外，所述阻断剂寡核苷酸与所述目标序列完全互补。
4.权利要求1的方法，其中在所述第二序列和目标序列之间存在2-6个核苷酸差异，并且除了在这2-6个核苷酸的位置，所述阻断剂寡核苷酸与目标序列完全互补。
5.权利要求1的方法，其中
-所述阻断剂寡核苷酸和第二序列的解链温度；和
-所述阻断剂寡核苷酸和目标序列的解链温度
之间的差异为至少5℃，根据在2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
6.权利要求1的方法，其中所述阻断剂寡核苷酸含有至少一个非天然核苷酸，其中与对照寡核苷酸相比，非天然、非嵌入核苷酸提高了所述阻断剂寡核苷酸的解链温度，其中，除了天然核苷酸代替了非天然核苷酸，所述对照寡核苷酸在其他方面与所述阻断剂寡核苷酸相同。
7.权利要求1的方法，其中所述阻断剂寡核苷酸含有至少一个非核苷酸部分，其中与对照寡核苷酸相比，所述非核苷酸部分提高了阻断剂寡核苷酸的解链温度，其中，除了缺乏所述非核苷酸部分，所述对照寡核苷酸在其他方面与所述阻断剂寡核苷酸相同。
8.权利要求7的方法，其中所述非核苷酸部分结合DNA的小沟。
9.权利要求1的方法，其中所述阻断剂寡核苷酸以至少70℃的解链温度与第二序列杂交，根据在2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
10.反应混合物，其含有：
-显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶；
-含有目标序列的多核苷酸；
-含有第二序列的多核苷酸，其中所述第二序列与目标序列至少有一个核苷酸不同；
-与所述第二序列和目标序列杂交的阻断剂寡核苷酸，其中所述阻断剂寡核苷酸不含嵌入核苷酸；
其中所述阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交，足以削弱在适于在不存在阻断剂寡核苷酸时扩增的条件下所述第二序列通过聚合酶的扩增，但寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列通过聚合酶的扩增。
11.权利要求10的反应混合物，其中所述阻断剂寡核苷酸对于第二序列的Tm高于阻断剂寡核苷酸对于目标序列的Tm不超过20℃，根据在2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
12.权利要求10的反应混合物，其中所述阻断剂核苷酸以至少70℃的解链温度与第二序列杂交，根据在2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
13.权利要求10的反应混合物，其中：
-所述阻断剂寡核苷酸和第二序列的解链温度；和
-所述阻断剂寡核苷酸和目标序列的解链温度
之间的差异为至少5℃，根据在2.5％甘油、50mM Tricine pH8.3、45mM醋酸钾中测量的。
14.权利要求10的反应混合物，其中所述阻断剂寡核苷酸含有至少一个非天然核苷酸，其中与对照寡核苷酸相比，所述非天然核苷酸提高了所述阻断剂寡核苷酸的解链温度，其中，(a)除了天然核苷酸代替了非天然核苷酸，所述对照寡核苷酸在其他方面与阻断剂寡核苷酸相同，或(b)除了缺乏非核苷酸部分，所述对照寡核苷酸在其他方面与阻断剂寡核苷酸相同。
15.试剂盒，其含有
-显著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶；
-含有目标序列的多核苷酸；
-含有第二序列的多核苷酸，其中所述第二序列与目标序列至少有一个核苷酸不同；
-与所述第二序列和目标序列杂交的阻断剂寡核苷酸，其中所述阻断剂寡核苷酸不含嵌入核苷酸；
其中所述阻断剂寡核苷酸与第二序列的杂交足以削弱在适于在不存在阻断剂寡核苷酸时扩增的条件下所述第二序列通过聚合酶的扩增，但寡核苷酸与目标序列的杂交没有显著削弱目标序列通过聚合酶的扩增。
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