CN101762701A - 一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测血液中乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是将包被膜、结合了乙肝表面抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错2mm地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。包被膜上预包被有乙肝表面抗原检测线和质控线，本发明将磁性免疫层析技术和异硫氰酸荧光素系统引入到乙肝表面抗原检测中，操作简便，灵敏度高，特异性好。

Description

一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

肝炎是一个通用的术语，含义是肝脏的炎症，它可以由一系列不同的病毒引起，例如A型、B型、C型、D型和E型肝炎病毒。在引起人类肝炎的众多病毒中，乙型肝炎病毒(HBV)最具有全球影响性。

乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，HBV是一种包含部分双链环状DNA基因组的包膜病毒，属于肝DNA病毒科。当病毒在肝细胞中复制时，可以干扰肝脏的功能，随即免疫系统激活产生一系列特异的反应以对抗并根除传染性因素。作为一种病理性损伤的结果，肝脏发生炎症。持续的HBV感染导致的严重的病理学结果包括：慢性肝脏功能不全，肝硬化和肝细胞癌(HCC)。

乙肝表面抗原(HBsAg)是一种异质性抗原，具有一个共同的抗原，命名为a，以及两对突变的互斥性抗原：d和y，w和r(包括几个亚决定簇)。因而，HbsAg有4种主要的亚型：adw，ayw，adr和ayr。

HBsAg几种亚型的分布具有地域性的特点。在美国、北欧、亚洲和大洋州，d决定簇比较常见，但是y决定簇出现的频率稍少。在日本人口中，d决定簇占绝大多数，y决定簇极少。在非洲和澳洲土著中，y决定簇常见，而d决定簇很少。Y决定簇也经常出现于印度和环地中海地区。在欧洲、美国、非洲、印度、澳大利亚和大洋州，w决定簇占优势。在日本、中国和东南亚，r亚型占优势。adw，ady和adr亚型每一个都在世界的广大地区分布。而ayr亚型在世界上较罕见，只是在大洋州的少量人口中常见。

由于共同决定簇的存在，对一种亚型的保护似乎可以将这种保护作用传递给其他亚型。并且在临床特征上，各亚型间没有区别。

目前的HBsAg病原学诊断技术主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法)、PCR法，这些方法都有各自的特点和使用对象。

ELISA法是目前临床血液筛查中普遍使用检测技术，但是ELISA试验操作程序复杂，容易出现假阳性或假阴性结果，且灵敏度低，CLIA与ELISA方法类似，只是灵敏度提高了一些，并没有根本解决ELISA存在的问题，并且二者都存在操作繁琐，反应时间长的问题，而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备，而且不能单人份检测，进一步限制了他们在一些基层医院、诊所的应用。近几年国内外出现了以胶体金或乳胶颗粒为代表的快速检测试纸条，但是由于结果是肉眼目视观察，容易受观察者主观判断的影响，灵敏度低，结果准确度也不高，检测窗口期较长。

PCR方法需要很高的试验工作环境和条件(无菌操作间，超净工作台)及大量的仪器设备(培养箱，离心机，PCR仪等)，并且操作极其复杂，需要受过严格专业训练的人员操作，且试验周期很长，因此不适合用于临床检测用。

磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一种单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对生物样品的定量检测数据。通过检测磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而达到定量的目的。该技术与传统技术相比具有下述优势：a.所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目测快速诊断法高10-100倍；c.分析速度可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；d.线形范围在4个数量级浓度范围内呈线性；e.超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，代表了当今即时检验(Point of Care Test，POCT)技术发展的方向和潮流，一经问世，发展迅速，目前已经成为替代传统免疫层析技术的首选。

目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰，大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。

将异硫氰酸荧光素系统引入磁性免疫层析中，既提高了检测方法的灵敏度，又提供了一种通用技术平台，增加了工艺的通用性，减少了系统因素的影响。

发明内容

本发明的目的即是将磁性免疫层析技术与异硫氰酸荧光素系统联合应用在HBsAg免疫分析中。将抗FITC抗体共价偶联于超顺磁颗粒上，将FITC化HBsAb与之混合之后作为检测流动相，将HBsAb包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大缩短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的不足，又综合了前述几种方法的优势：可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：本发明的检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条是将包被膜、结合HBsAb的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上预包被有HBsAb检测线，以及FITC化牛血清白蛋白的质控线。

选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所述的样品垫处理液是含有1％-5％酪蛋白(casein)和0.1％-1％的聚乙烯醇(PVP)，以及0.01-0.2％吐温-20(Tween-20)的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

A、磁颗粒的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将抗FITC抗体标记到磁颗粒上，选用FITC进行HBsAb的标记，将标记好的FITC化HBsAb以1∶3-1∶10的比例(体积比)与抗FITC抗体磁颗粒混合，确保抗FITC抗体磁颗粒过量；

B、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25μl/cm-50μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；

C、包被膜的制备：使用包被缓冲液分别将HBsAb以及FITC化BSA稀释到0.5-2mg/m的浓度，使用定量喷液装置分别将三者以0.5-1.0cm的间隔于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用；

D、样品垫的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时；

E、试纸条的组装：在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。

所述的步骤A包括以下三步：

1)抗FITC抗体磁颗粒的制备：使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH7.0-7.6的PBS洗涤磁颗粒，加入EDC，室温反应1小时，使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH7.0-7.6的PBS充分洗涤磁颗粒后加入抗FITC抗体使抗FITC抗体与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mM pH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4℃保存备用；

2)FITC-HBsAb的制备：将HBsAb对0.02M，pH7.0-7.6的PBS 4℃透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将FITC使用二甲基甲酰胺(DMF)溶解，终浓度为50mM，以10∶1的分子比例向抗体溶液中加入所需量的FITC溶液，室温反应1小时，对0.02M PBS 4℃透析过夜，加入等体积甘油后-20℃保存备用；

3)FITC-HBsAb与抗FITC抗体磁颗粒的混合，以0.5μl/mg磁颗粒的量向抗FITC抗体磁颗粒溶液中加入FITC-HBsAb，充分混匀后使用保存缓冲液以1∶5-1∶20的比例(体积比)将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。

所述的步骤B中，磁颗粒的喷涂方法是：将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。

所述的步骤C中，包被膜的制备方法是：用包被缓冲液(0.02M PB，pH7.0-7.6)将HBsAb稀释为0.5mg/ml，FITC化BSA稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将三者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点：

1)通过在磁颗粒上引入异硫氰酸荧光素系统，使得试纸条的制备过程大大简化，适合大规模生产。

2)运用磁性检测仪来进行结果的判读，依据检测线与质控线的磁性检测值比值来进行阴阳性判断，降低了主观性，结果准确、可靠。

本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用。

附图说明

图1为本发明检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条结构示意图。

为进一步说明本发明检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

具体实施方式

本发明所述的检测血液中乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条，如图1所示，该试纸条是在底板1)上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜2)、结合了HBsAb的磁颗粒垫3)、样品垫4)、吸水垫5)，并在上层覆盖透明塑料密封膜6)组装而成的试纸条，包被膜2)上预包被有HBsAb检测线T和质控线C。

在具体实施例中，所采用HBsAb为商品化抗体。利用双抗体夹心法原理检测HBsAg的标本，当待测标本中含有HBsAg时，抗原会先和磁颗粒上结合的抗体结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达HBsAb包被线T处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T处，另外，未结合FITC化抗体的抗FITC抗体标记磁颗粒会继续前行到达质控线C时，FITC化BSA会与抗FITC抗体标记磁颗粒结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般反应十五分钟后即可使用磁性免疫层析仪器读卡，T线以及C线都会产生相应的磁性信号值，计算T/C的比值，根据预设的界限比值即可判定结果的阴阳性。整个读卡、计算、与预设界限值比对的过程已经完全程序化，磁性检测仪会直接给出阴阳性结果。

本发明所述的检测血液中乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例：

实施例1

检测血液中乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法

本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤：

A、抗体的制备：选用商品化的HBsAb，对20mM，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，4℃透析过夜备用。

B、包被膜的制备：

包被缓冲液的配制：0.02M pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)为包被缓冲液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期两周。

封闭液的配制：含0.5％BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存备用，有效期一周。

包被膜的制备：用包被缓冲液(0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PB)将HBsAb稀释为0.5mg/ml，FITC化BSA稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将三者以0.6cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5％BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，)中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

C、磁颗粒的制备：

PBS缓冲液的配制：用双蒸水和磷酸二氢钠及磷酸氢二钠配制pH值为7.4(pH7.0-7.6均适用)，浓度为50mM的PBS，加入Tween-20至终浓度为0.1％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期两周。

硼酸保存缓冲液的配制：用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8.5(pH8.2-9.0均适用)，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP，Casine，Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1％，1％，0.5％，5％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期一周。

抗FITC抗体磁颗粒的制备：使用含有0.1％Tween-20的50mM pH7.4(pH7.0-7.4均适用)PBS洗涤磁颗粒，加入EDC，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入抗FITC抗体使抗FITC抗体与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mmolpH8.5(pH8.2-9.0均适用)的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4℃保存备用。

FITC-HBsAb的制备：将HBsAb对0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS 4℃透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将FITC使用DMF溶解，终浓度为50mM，以10∶1的分子比例向抗原或抗体溶液中加入所需量的FITC溶液，室温反应1小时，对0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS 4℃透析过夜，加入等体积甘油后-20℃保存备用。

FITC-HBsAb与抗FITC抗体磁颗粒的混合：以0.5μl/mg的量向抗FITC抗体磁颗粒溶液中加入FITC-HBsAb，充分混匀后使用保存缓冲液以1∶5比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。

D、磁颗粒的喷涂与冻干

使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒以50μl/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，

E、样品垫的处理

将1.8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时。

样品垫处理液是含有1％-5％Casein和0.1％-1％的PVA以及0.01-0.2％Tween-20的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS溶液。

F、试纸条的组装及切割

下述所有操作都必须在湿度小于20％，温度20-25℃的房间内进行。

试纸板的组装：使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3.5cm宽的包被膜，2.5cm宽的吸水纸，0.8cm宽的磁颗粒垫，1.8cm宽的样品垫组装于9.8cm宽度透明塑料底板上，贴上上层透明塑料盖板，组装成试纸板。

试纸条的裁切：使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条。

G、试纸卡的组装

将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。

H、确定该批次的二维码信息

品名：HBsAg磁性检测卡

批次：试纸卡的组装日期，格式为：年/月/日，XXXX/XX/XX

阴阳性判读标准的确定：取100份确认HBsAg标本(强弱均有)、500份随机标本使用该批次试纸卡检测，使用磁性检测仪检测结果，计算每个检测卡的T1/C值，T2/C值，使用统计学方法计算均值和标准差，确定：T/C＜0.1，T/C＞0.2为阳性，二者之间为灰区。

I、二维码的打印粘贴

将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2％确保二维码粘贴无误。

J、成品包装

将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液，即制成试纸盒，该试纸盒于室温避光保存，保质期为18个月。层析缓冲液配方为：1％Tween-20，0.5％Triton X-100，1％NP-40，0.05％NaN3，20mmol pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS。

实施例2

除了FITC-HBsAb与抗FITC抗体磁颗粒的混合步骤中：充分混匀后使用保存缓冲液以1∶10的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。

实施例3

除了FITC-HBsAb与抗FITC抗体磁颗粒的混合步骤中：充分混匀后使用保存缓冲液以1∶20的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。

实施例4

本发明的检测卡的使用方法

1、加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取50μl样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50μl层析缓冲液，等待反应进行15分钟。

2、测量及结果输出

将MICT检测仪预先开机，将检测卡插入检测仪的插卡口，运行仪器，仪器会自动读取卡上的二维码信息并进行测量，即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。

Claims (6)

1.一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是将包被膜、结合了乙肝表面抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有乙肝表面抗原检测线和质控线。

2.根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：所述的磁颗粒垫制备是选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺共价偶联的方式将抗异硫氰酸荧光素抗体标记到磁颗粒上；选用异硫氰酸荧光素进行乙肝表面抗体的标记，将标记好的异硫氰酸荧光素抗体以1∶3-1∶10的比例(体积比)与抗异硫氰酸荧光素抗体磁颗粒混合，确保抗异硫氰酸荧光素抗体磁颗粒过量；将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25μl/cm-50μl/cm的量喷涂于玻璃纤维上。

3.根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液是含有1％-5％酪蛋白和0.1％-1％的聚乙烯醇，以及0.01-0.2％吐温-20的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：所述的包被膜制备是使用0.02mM，pH7.0-7.6的PBS，分别将乙肝表面抗体以及异硫氰酸荧光素化牛血清白蛋白稀释到0.5-2mg/ml的浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0.5-1.0cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

5.根据权利要求2所述的磁颗粒的喷涂方法是：将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。

6.根据权利要求4所述的包被膜的制备方法是：用包被缓冲液将乙肝表面抗原稀释为1.0mg/ml，异硫氰酸荧光素化BSA稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1ul/cm的量将三者以0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

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