CN101762691A - 一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是在底板上依次相互交错2mm粘贴上包被膜、结合了总PSA抗体和兔IgG的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的试纸条，包被膜上预包被有总PSA+fPSA抗体检测线和羊抗兔IgG质控线，本发明将磁性免疫层析技术引入到血液中PSA的定量检测中，并且创造性的将总PSA和游离PSA置于同一个试纸条上进行同时检测，提高检测灵敏度的同时可以给出准确的总PSA和游离PSA的定量结果，二者的比值关系一目了然，大大方便了临床医生对病人进行快速准确的诊断。

Description

一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条及制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术

前列腺特异性抗原(PSA)是人体前列腺上皮组织细胞分泌的丝氨酸蛋白酶，是一种分子量为30～33KDa的单链糖蛋白分子，编码基因位于19q13。PSA由前列腺分泌，以低浓度释放到健康男性的血液中，在人体中主要存在于男性前列腺组织、精液和血清中。PSA在人体中主要以游离(fPSA)和结合态(cPSA)存在，两者总合就是总PSA。游离前列腺特异性抗原(fPSA)是指游离状态下的PSA，它没有与α1抗糜蛋白酶等结合。当PSA处在“诊断灰区”(4～10ng/mL)时，fPSA的检测就有重要意义，fPSA/总PSA的比值对诊断前列腺癌的临床价值很大，对良性前列腺增生及前列腺癌的鉴别有显著意义。

目前的血液中总PSA+fPSA的诊断技术主要包括：放射免疫法(RIA)，酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、时间分辨荧光、胶体金免疫层析等方法，但这些方法都有各自的特点及不足：放射免疫技术成熟，结果比较准确，线性范围较宽，但操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代。ELISA和化学发光以及时间分辨荧光法原理类似，只在灵敏度方面有差异，目前大都已经实现自动化、大批量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点，另外，自动化检测目前由国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了它们在基层医院、诊所的应用。近年来出现了胶体金免疫层析法来检测总PSA，快速，便捷，单人份操作，但是缺点是只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量，而且因为胶体金灵敏度的限制，无法检测游离PSA，异常标本需要使用其他方法复核检测，无形中增加了被测试者的就医成本，在市场推广方面有较大难度，很难大面积使用。

磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的的一种新一代单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对生物样品的定量检测数据。通过检测测量磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而达到定量的目的。该技术与传统技术相比具有下述优势：1)分析灵敏度：比各类目测快速诊断法灵敏10-100倍；2)分析速度：可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；3)线形范围：在4个数量级浓度范围内呈线性；4)所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；5)超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变；独立的快速诊断色谱卡(MAR Cassette)可直接插入MAR检测仪，为目前许多快速临床诊断试剂的整合提供了广泛的开发空间；而且还避免了操作过程中人员或仪器可能发生的交叉污染，提高了分析和过程的安全性。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，代表了当今即时检验(Point of Care Test，POCT)技术发展的方向和潮流，一经问世，发展迅速，目前已经成为替代传统免疫层析技术的首选。

磁性免疫层析是以磁颗粒标记抗体进行免疫反应检测标本中的生物活性物质，通过检测磁性强度来提供对生物样品的定量检测数据，采用标记的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而计算出待测生物样品的量。目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰，大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。

发明内容

本发明的目的即是将磁性免疫层析技术应用在总PSA+fPSA联合定量检测试纸条中，将总PSA抗体和兔IgG分别共价偶联于超顺磁颗粒上，二者按比例混合之后作为检测流动相，将与之配对的总PSA和FPSA抗体以及羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大缩短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的种种弊端，又综合了前述几种方法的优势：可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出准确的定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条，该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜、结合了总PSA抗体和兔IgG的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、上层透明塑料密封膜组装而成的试纸条，包被膜上预包被有检测线T1(fPSA)、T2(总PSA)和质控线C(羊抗兔IgG)。

其中所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液是含有0.1％-1％的聚乙烯醇(PVA)以及0.01-0.2％吐温20(Tween-20)的0.02M磷酸盐缓冲液(PBS)。

一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条制备方法包括以下步骤：

A、抗体的处理：选用单克隆抗体技术制备的商品化高效价抗总PSA+fPSA配对抗体(Hytest公司，cat：4P33)，20mM PBS，pH7.24℃过夜透析；

B、磁颗粒垫的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)共价偶联的方式将总PSA抗体和兔IgG标记到磁颗粒上；将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以5μl/cm-25μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；

C、包被膜的制备：使用包被缓冲液分别将抗总PSA和fPSA包被抗体以及羊抗兔IgG稀释到0.5-2mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将三者以0.5-0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用；

D、样品垫的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时；

E、试纸条的组装：在透明塑料底板上依次相互交错2mm地贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。

进一步，上述的步骤B包括以下三步：

1)磁颗粒的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用含有0.1％Tween-20的50mmol醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC使终浓度为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入总PSA抗体与磁颗粒的分子比为5∶1，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02MPBS，pH7.2室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mmol硼酸pH8.5的保存缓冲液，复溶磁颗粒，4℃保存备用；使用同样的方法将兔IgG标记到磁颗粒上；将二者按照2∶1的比例充分混匀后使用保存缓冲液以1∶10-1∶15的比例将混合物稀释；

进一步，上述的步骤B中，磁颗粒的喷涂方法是：将稀释好的磁颗粒使用定量喷膜装置以10μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。

进一步，上述的步骤C中，包被膜的制备方法是：用包被缓冲液将总PSA和fPSA抗体分别稀释为0.5mg/ml和0.8mg/ml，羊抗兔IgG稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将三者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点：

1)通过对试纸条的改进，首次将磁性免疫层析技术引入PSA的检测中，结合磁性检测仪，实现了PSA的定量检测，为临床使用提供了极大便利。

2)首次实现在一个试纸条上同时检测总PSA和fPSA，二者的比值关系一目了然，大大方便了临床判断。

本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用。对于前列腺癌的定量诊断有着积极的意义。

附图说明

图1为本发明磁性免疫层析法定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条结构示意图

为进一步说明本发明磁性免疫层析法定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条及制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

具体实施方式

本发明所述的定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条如图1所所示，该试纸条是在底板1)上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜2)、结合了总PSA抗体和兔IgG的磁颗粒垫3)、样品垫4)、吸水垫5)，然后在上层覆盖透明塑料密封膜6)组装而成的试纸条，包被膜2)上预包被有检测线T1(游离PSA抗体)、T2(总PSA抗体)和质控线C(兔IgG)。

在具体实施例中，所采用总PSA+fPSA配对抗体为单克隆抗体技术制备的单抗。利用双抗体夹心检测总PSA+fPSA抗原的原理检测标本，当待测标本中含有总PSA+fPSA抗原时，抗原会先和磁颗粒上偶联的抗体结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达fPSA抗体包被线T1和总PSA抗体包被线T2处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T线(T1、T2)处，另外，兔IgG标记磁颗粒会继续前行，到达指控线C时，兔IgG会与羊抗兔IgG结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般反应十五分钟后即可进行上机读卡，T线以及C线都会产生相应的磁性信号值，磁性免疫层析检测仪会根据检测卡上的二维码信息将实际测值代入预设的标准曲线即可得出确定量的结果。整个读卡、识别二维码、将实测值代入预设标准曲线得出定量值的过程已经完全程序化，磁性检测仪会直接给出定量结果。

本发明所述的定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例：

实施例1

定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法

本实施例的制备方法包括以下步骤：

A、抗体制备：选用商品化的的总PSA+fPSA配对抗体(Hytest公司，cat：4P33)，20mM PBS，pH7.24℃过夜透析备用。

B、包被膜的制备：

包被缓冲液的配制：0.02M pH 7.2的磷酸缓冲液(PB)为包被缓冲液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期两周。

封闭液的配制：0.5％BSA，0.02M磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存备用，有效期一周。

包被膜的制备：用包被缓冲液(0.02M PB，pH7.2)将总PSA+fPSA抗体分别稀释为0.5mg/ml和0.8mg/ml，兔IgG稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将三者以0.6cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5％BSA的0.02M PBS，pH7.2)中浸泡10分钟后于25-35度烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

C、磁颗粒的制备：

醋酸钠缓冲液的配制：用双蒸水和醋酸钠及冰醋酸配制pH值为4.7，浓度为50mM的醋酸缓冲液，加入Tween-20至终浓度为0.1％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期两周。

硼酸保存缓冲液的配制：用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8.5，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP，Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1％，0.5％，5％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期两周。

磁颗粒的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用含有0.1％Tween-20的50mmol醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC使终浓度为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入总PSA抗体与磁颗粒的分子比为5∶1，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02MPBS，pH7.2室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mmol硼酸pH8.5的保存缓冲液，复溶磁颗粒，4℃保存备用；使用同样的方法将兔IgG标记到磁颗粒上；将二者按照2∶1的比例充分混匀后使用保存缓冲液以1∶10-1∶15的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。

D、磁颗粒的喷涂与冻干

使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒以20μl/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，

E、样品垫的处理

将1.8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时。

样品垫处理液是含有0.1％-1％的PVA以及0.01-0.2％Tween-20的0.02M PBS溶液。

F、试纸条的组装及切割

下述所有操作都必须在湿度小于20％，温度20-25℃的房间内进行。

试纸板的组装：使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3.5cm包被膜，2.5cm吸水纸，0.8cm磁颗粒垫，1.8cm样品垫组装于9.8cm宽度透明塑料底板上，覆盖上层透明塑料盖板，组装成试纸板。

试纸条的裁切：使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条。

G、试纸卡的组装

将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。

H、确定该批次的二维码信息

品名：总PSA+fPSA联合定量磁性检测卡

批次：试纸卡的组装日期，格式为：年/月/日，XXXX/XX/XX

判读标准的确定：取PSA标准抗原原料，以国家标准品为参照标准进行标定，用标准品稀释液稀释成60ng/ml，20ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，每个标准点作10个测试，按照统计学方法确定每个标准点与磁性测量值的关系并建立方程使之拟合成线性，此方程和标准曲线即可使磁性检测仪得以确定标本测量值。

标准品稀释液配方：20mmol PBS，pH7.2，0.5％casein，0.01％NaN₃。

I、二维码的打印粘贴

将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2％确保二维码粘贴无误。

J、成品包装

将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液，于室温避光保存，保质期为18个月。

层析缓冲液配方为：1％Tween-20，0.5％Triton X-100，1％NP-40，0.05％NaN₃，20mmolPBS，pH7.2。

实施例2

除了磁颗粒的制备的步骤中：加入总PSA抗体与磁颗粒的分子比为2∶1。其它步骤同实施例1，

实施例3

除了磁颗粒的制备的步骤中：加入总PSA抗体与磁颗粒的分子比为10∶1。其它步骤同实施例1。

实施例4

除了磁颗粒的混合步骤中：将二者按照2∶1的比例充分混匀后使用保存缓冲液以1∶10的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。

实施例5

除了磁颗粒的混合步骤中：将二者按照2∶1的比例充分混匀后使用保存缓冲液以1∶15的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。

实施例6

本发明的检测卡的使用方法

1、加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取50μl样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50μl层析缓冲液，等待反应进行15分钟。

2、测量及结果输出

将检测卡插入磁性免疫层析检测仪的插卡口，运行仪器，仪器会自行读取卡的二维码信息，进行测量并即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。

Claims (2)

1.一种定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴包被膜、结合了总PSA抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、然后在上层覆盖透明塑料密封膜而组装成的试纸条，包被膜上预包被有总PSA+fPSA抗体的检测线T1、T2和质控线C。

2.磁性免疫层析法定量检测血液中PSA和fPSA的磁性免疫层析试纸条制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、包被膜的制备：选用单克隆抗体技术制备的高效价总PSA+fPSA配对抗体，使用亲和层析技术纯化；使用0.02mM PBS，pH7.2分别将抗总PSA+fPSA包被抗体以及羊抗兔IgG稀释到0.5-2mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将三者以0.5-0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用；

B、磁颗粒垫的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用含有0.1％Tween-20的50mmol醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC使终浓度为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入总PSA抗体与磁颗粒的分子比为5∶1，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02MPBS，pH7.2室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mmol硼酸pH8.5的保存缓冲液，复溶磁颗粒，4℃保存备用；使用同样的方法将兔IgG标记到磁颗粒上；将二者按照2∶1的比例充分混匀后使用保存缓冲液以1∶10-1∶15的比例将混合物稀释。将稀释好的磁颗粒使用定量喷液装置以5μl/cm-25μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；

C、样品垫的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时；所述的样品垫处理液是含有1％-5％酪蛋白和0.1％-1％的聚乙烯醇以及0.01-0.2％吐温-20的0.02M磷酸盐缓冲液；

D、试纸条的组装：在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上，包被膜，磁颗粒垫，样品垫，吸水垫，上层透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。

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