[go: up one dir, main page]

CN101724602B - 人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法 - Google Patents

人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101724602B
CN101724602B CN2009102070188A CN200910207018A CN101724602B CN 101724602 B CN101724602 B CN 101724602B CN 2009102070188 A CN2009102070188 A CN 2009102070188A CN 200910207018 A CN200910207018 A CN 200910207018A CN 101724602 B CN101724602 B CN 101724602B
Authority
CN
China
Prior art keywords
insulin
cell
peptide
substratum
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2009102070188A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101724602A (zh
Inventor
金海权
姜贤美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KONG XISHU
Original Assignee
KONG XISHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KONG XISHU filed Critical KONG XISHU
Publication of CN101724602A publication Critical patent/CN101724602A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101724602B publication Critical patent/CN101724602B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

公开了将人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法。将从眼睛周围的皮下脂肪组织分离的人类成体干细胞，在存在细胞因子和生长因子包括B27添加剂，成纤维细胞生长因子-2，表皮生长因子，烟酰胺，胰高血糖素样肽-1，激活素A，胰岛素样生长因子，β细胞素等的培养基中，诱导分化成胰岛素分泌细胞，所述培养基具有从高浓度至低浓度的葡萄糖转变。具有高水平产生胰岛素和C-肽的能力，所述胰岛素分泌细胞可以为用于1型糖尿病的优良治疗物。

Description

人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法
技术领域
本发明涉及诱导人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞。
背景技术
1型糖尿病，也被称为胰岛素依赖性糖尿病，特征在于胰岛素产生β细胞的损失，通常由在胰腺中胰岛的自体免疫攻击产生，导致胰岛素的缺乏。胰岛素在体内血糖水平的动态平衡上扮演关键角色。当胰岛素缺乏或以低量产生时，血糖水平增加，导致各种器官例如肾、神经、视网膜等中的并发症。1型糖尿病的治疗大多数依赖于胰岛素的使用，需要在患者的一生中注射。胰岛素的使用不是对1型糖尿病的根本治疗。另一方面，使用外来胰腺或β细胞的移植治疗1型糖尿病。然而，该方法受许多由于来自外来胰腺的外科手术移植导致的组织学上的限制。例如，移植的细胞可能被接收者的自体免疫反应干扰。近年来，许多研究已经聚焦于使用干细胞开发用于糖尿病的治疗，其中胚胎和成体干细胞是有代表性的。研究已经报道胚胎干细胞能够离体(ex vivo)分化成胰岛素产生细胞，其被发现当移植到糖尿病小鼠时治疗高血糖[Fujikawa T，Oh SH，Pi L，HatchHM，Shupe T，Petersen BE(2005)Teratoma formation leads tofailure of treatment for type I diabetes using embryonic stemcell-derived insulin-producing cells.Am J Pathol 166，1781-1791；D’Amour KA，Bang AG，Eliazer S，Kelly OG，AgulnickAD，Smart NG，Moorman MA，Kroon E，Carpenter MK，Baetge EE(2006)Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cellsfrom human embryonic stem cells.Nat Biotechnol 24，1392-1401]。然而，胚胎干细胞具有当移植时引起癌症产生的极大临床问题[Kroon E，Martinson LA，Kadoya K，Bang AG，Kelly OG，Eliazer S，Young H，Richardson M，Smart NG，Cunningham J，Agulnick AD，D’Amour KA，Carpenter MK，Baetge EE(2008)Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cellsgenerates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.Nat Biotechnol.26，397-398]。
已有报道外胚层祖细胞能够分化成胰岛素产生细胞[Hori Y，GuX，Xie X，and Kim SK.(2005)Differentiation ofinsulin-producing cells from human neural progenitor cells.PLoS Med.2，103]并且胰管上皮细胞能够分化成与胰腺中胰岛的那些相同的结构[Bonner-Weir S，Taneja M，Weir GC，Tatarkiewicz K，Song KH，Sharma A and O’Neil JJ(2000)Invitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.Proc Natl Acad Sci USA.97，7999-8004]。前者在的不利之处在于胰岛素产生细胞获自胎儿脑细胞，其可能在接受者中诱导肿瘤[Amariglio N，Hirshberg A，Scheithauer BW，Cohen Y，LoewenthalR，Trakhtenbrot L，Paz N，Koren-Michowitz M，Waldman D，Leider-Trejo L，Toren A，Constantini S，Rechavi G.Donor-derived brain tumor following neural stem celltransplantation in an ataxia telangiectasia patient.PLoS Med.2009 Feb 17；6(2)：e1000029]。后者的不利之处在于仅非常受限量的干细胞能够从胰管组织中获得。此外，报道当胚胎干细胞在包含胰岛素的培养基中诱导分化时，从分化细胞分泌的胰岛素实际上为取自培养基的胰岛素，这被分裂成胰岛素和C-肽的前肽没有分泌的事实证明[Rajagopal J，Anderson WJ，Kume S，Martinez OI，andMelton DA(2003)Insulin staining of ES cell progeny frominsulin uptake.Science.299，363；Hansson M，Tonning A，Frandsen U，Petri A，Rajagopal J，Englund MC，Heller RS，Hakansson J，Fleckner J，Skold HN，melton K，Semb H，and SerupP(2004)Artifactual insulin release from differentiatedembryonic stem cells.Diabetes  53，2603-2609]。因此，近年来已经进行许多尝试以在不存在胰岛素下诱导分化胚胎干细胞。如以下表1中总结的，在胰岛素样生长因子(insulin-line growthfactors)或β细胞素(betacellulin)的存在下干细胞分化成胰岛素产生细胞方面已有报道。如上所述，种族问题和癌症产生，使得难以利用胚胎干细胞治疗糖尿病。此外，仅显著低水平的胰岛素和C-肽由于来自基于人类皮肤成纤维细胞或间充质干细胞的多潜能干细胞的分化而产生。表1
对干细胞离体分化成胰岛素产生细胞的研究
  细胞   分泌的胰岛素   分泌的C-肽   参考文献
  胚胎干细胞   -   5ng/ug DNA   Jiang et al.，20071)
  皮肤成纤维细胞   0.15ng/ug DNA   Tateishi et al.，20082)
  间充质干细胞   1.291mU/L   163ng/L   Li et al.，20083)
1)Jiang J，Au M，Lu K，Eshpeter A，Korbutt G，Fisk G，Majumdar AS(2007)Generation of insulin-producing islet-likeclusters from human embryonic Stem Cells.Stem Cells 25，1940-1953.
2)Tateishi K，He J，Taranova O，Liang G，D’Alessio AC，Zhang Y(2008)Generation of insulin-secreting islet-likeclusters from human skin fibroblasts.J Biol Chem.283，31601-31607.
3)Li L，Li F，Qi H，Feng G，Yuan K，Deng H，Zhou H.(2008)Coexpression of Pdx1 and betacellulin in mesenchymal StemCells could promote the differentiation of nestin-positiveepithelium-like progenitors and pancreatic islet-likespheroids.Stem Cells Dev.17，815-823。
发明内容
在本发明中完结的精深全面的研究由本发明人进行，涉及用于1型糖尿病的细胞治疗。该研究导致以下发现：当在各种已知在培养基中对分化成β细胞有效的细胞因子和生长因子的存在下进行时，并且其中培养基的葡萄糖浓度从高水平改变为低水平时，人类成体干细胞的孵育允许成体干细胞分化成高度有效的胰岛素产生细胞。
因此，本发明的目的在于提供用于使成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法。
附图说明
根据以下详细描述连同附图，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中：
图1为源自眼睛周围的皮下层的干细胞在各种条件下被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周后，显示细胞形态的光学显微照片；
图2为源自眼睛周围的皮下层的干细胞在各种条件下被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小时后，显示通过酶联免疫吸附检测测定的分泌的胰岛素的量的条形图；
图3为源自眼睛周围的皮下层的干细胞在各种条件下被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小时后，显示通过酶联免疫吸附检测测定的分泌的C-肽的量的条形图；
图4为源自眼睛周围的皮下层的干细胞在各种条件下被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周后，显示通过免疫细胞化学检测测定的胰岛素、胰岛素原、CK19和C-肽的表达的光学显微照片；
图5是源自眼睛周围的皮下层的干细胞被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周后，显示从所述获得的细胞分离的β细胞的特性基因的表达的琼脂糖凝胶照片；
图6为源自眼睛周围的皮下层的干细胞被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周后，显示获得的细胞的对胰岛素产生β细胞特异的二硫腙(dithizone)染色的显微照片；
图7为源自眼睛周围的皮下层的干细胞在各种条件下被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小时后，显示通过酶联免疫吸附检测测定的分泌的胰岛素的量的条形图；以及
图8为源自眼睛周围的皮下层的干细胞在各种条件下被诱导分化成胰岛素分泌细胞三周，并且暴露于25mM葡萄糖2小时后，显示通过酶联免疫吸附检测测定的分泌的C-肽的量的条形图。
具体实施方式
本发明主要通过两个试验实现：一个检查胰岛素样生长因子对分化的影响，另一个在β细胞素(代替激活素A)的存在下进行分化。
根据其一方面，本发明提供离体下成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法，包括：在包含20-30mM葡萄糖、补充有5-20％胎牛血清、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的培养基中培养成体干细胞4-10天，然后在包含4-7mM葡萄糖、补充有5-20％胎牛血清、5-20mM烟酰胺、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-100ng/ml胰岛素样生长因子的培养基中培养10-20天。
具体地，在存在细胞因子和生长因子包括成纤维细胞生长因子-2、烟酰胺、胰高血糖素样肽-1、激活素A、胰岛素样生长因子等的培养基中，将从眼睛周围的皮下脂肪组织分离的人类成体干细胞诱导分化成胰岛素分泌细胞，以用于治疗1型糖尿病，所述培养基具有从第一培养基的高浓度至第二培养基的低浓度的葡萄糖的转变。
把该两步培养法应用到三组。如之前由本发明人于2007年5月提交的韩国专利申请No.2007-44663所公开的，对照用包含20-30mM葡萄糖、存在烟酰胺，激活素A和胰高血糖素样肽-1(NAG)的培养基处理4-10天，随后在包含4-7mM葡萄糖、存在相同的细胞因子的培养基中孵育10-20天[NAG组]。对于第二组，在包含4-7mM葡萄糖以及胎牛血清、烟酰胺、激活素A、胰高血糖素样肽-1和胰岛素样生长因子-1的培养基中进行10-20天的第二孵育之前，其初步处理在包含20-30mM葡萄糖以及胎牛血清、激活素A、成纤维细胞生长因子-2和胰高血糖素样肽-1的培养基中进行4-10天[NAGI1组]。关于第三组，其分化以与第二组相同的方式诱导，除了在第二步使用胰岛素样生长因子-2代替胰岛素样生长因子-1之外。
根据其另一方面，本发明提供成体干细胞离体分化成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于使用β细胞素(已知对分化有效)和B27添加剂(B27 supplement)(已知用作血清添加剂(serum supplement))以建立用于高效地分化和胰岛素分泌的条件(实施例7)。
为了使成体干细胞分化，具体地，在包含20-30mM葡萄糖(高葡萄糖培养基)、补充有B27添加剂，成纤维细胞生长因子-2和表皮生长因子的培养基中进行孵育1-7天，然后在具有相同浓度的葡萄糖、补充有胎牛血清，激活素A，成纤维细胞生长因子-2和胰高血糖素样肽-1的培养基中培养1-7天。
其后，在包含4-7mM葡萄糖(低葡萄糖培养基)、存在细胞因子和生长因子包括胎牛血清、激活素A、成纤维细胞生长因子-2，胰高血糖素样肽-1的培养基中培养细胞1-7天，最后在包含4-7mM葡萄糖补充有胎牛血清、β细胞素、烟酰胺和胰高血糖素样肽-1的培养基中培养10-20天。
在本发明中可用的为DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)或DMEM/F12(1∶1的Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物(Nutrient mixture)F-12)。
以下将给出诱导成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的详细描述。
从眼睛或颊周围的皮下层外科手术地获得的脂肪用I型胶原酶在37℃下处理30min，然后离心。这样获得的细胞团在补充有胎牛血清的培养基中培养以提供成体干细胞。
为了分化成胰岛素分泌细胞，将干细胞在分化诱导培养基中培养15-30天。首先，将它们在胶原包被的培养皿中在补充有5-20％胎牛血清、5-20nM胰高血糖素样肽-1、1-10nM激活素A和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的高葡萄糖培养基中孵育4-10天。其后，将它们转移到补充有5-20％胎牛血清、5-20mM烟酰胺、5-20nM胰高血糖素样肽-1、1-10nM激活素A和10-100ng/ml胰岛素样生长因子的低葡萄糖培养基中，然后孵育10-20天。
孵育完成15-30天时，在暴露到高葡萄糖培养基(进行2小时)之前，将细胞在低葡萄糖培养基中用牛血清白蛋白(BSA)处理10-15小时。这样最后获得的培养物使用酶联免疫吸附检测定量分析胰岛素和C-肽。发现与非分化条件(阴性对照)相比，本发明中定义的分化条件以提高的量诱导胰岛素和C-肽的分泌。尽管在NAGI1组(补充有胰岛素样肽-1)和NAG组之间在胰岛素和C-肽的分泌上没有差异，使用胰岛素样肽-2(NAGI2组)允许胰岛素的分泌比使用胰岛素样肽-1(NAGI1组)高8倍，C-肽高6倍。在胰岛素样肽-2存在下分化的细胞的遗传分析指出，当它们的分化在第一步的培养基中诱导时，ND(神经分化因子1(neuro D1))、PC(激素原转化酶)1/3、PC2、NGN3、Glut(葡萄糖转运体)1、Glut 2、pax4、pdx1--已知作为对胰腺的β细胞特异的基因-开始表达；以及在第二步的培养基中的孵育期间nkx 6-1和胰岛素基因表达。同样，所述细胞通过免疫化学染色测定观察到表达CK19、胰岛素原、胰岛素和C-肽，并且被二硫腙，一种对胰腺的β细胞特异的染料，强烈地染色。
因此，根据本发明使成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法基本上由两步培养法组成，其中首先在存在成纤维细胞生长因子-2、激活素A和胰高血糖素样肽-1的高葡萄糖培养基中，然后在存在烟酰胺、激活素A、胰高血糖素样肽-1和胰岛素样生长因子-2的低葡萄糖培养基中，诱导成体干细胞经受分化，在胰岛素分泌的效率上其优于NAG组使用的方法，所述NAG组使用的方法在2007年5月提交的韩国专利申请No.2007-44663中公开。
作为选择，根据本发明有效的胰岛素分泌细胞能够如下从成体干细胞分化。
在包含20-30mM葡萄糖、0.5X-4X B27添加剂、10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2和10-30ng/ml表皮生长因子的高葡萄糖培养基中将成体干细胞培养1-7天，然后在包含20-30mM葡萄糖、5-20％胎牛血清、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的高葡萄糖培养基中1-7天，然后在包含4-7mM葡萄糖、5-20％胎牛血清、1-10nM激活素A、5-15nM胰高血糖素样肽-1和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的低葡萄糖培养基中1-7天，最后在包含5-20％胎牛血清、5-20mM烟酰胺、1-10ng/ml β细胞素、和5-20nM胰高血糖素样肽-1的低葡萄糖培养基中10-20天。
在β细胞素的存在下分化后，发现分化的细胞(BTC)比NAG组各自高6倍地产生胰岛素和C-肽。
因此，在存在B27添加剂和β细胞素(分别代替胎牛血清和激活素A)的情况下分化的细胞，能够比NAG组更有效地分泌胰岛素。
通过以下实施例可以获得本发明的更好理解，所述实施例用于举例说明，但不解释为本发明的限制。实施例1干细胞的分离
在整形外科医院在患者的允许下外科手术地从眼睛周围的皮下层切离的脂肪组织，用0.075％1型胶原酶溶液在37℃下处理30min，然后用与胶原酶溶液相同体积的补充有胎牛血清的培养基终止酶活性。离心后，这样形成的细胞团用培养基洗涤两次，并在补充有10％胎牛血清的DMEM-LG中孵育。实施例2干细胞培养
在分化诱导培养基中将获得的干细胞培养21天。为此，首先，将细胞以5x103细胞/孔的密度接种在胶原包被的48孔板，在孵育(进行7天)之前，向所述胶原包被的48孔板添加包含25mM葡萄糖、补充有10％胎牛血清、4nM激活素A、10nM胰高血糖素样肽-1和20ng/ml成纤维细胞生长因子-2的培养基(DMEM-HG)。其后，将细胞在包含5.5mM葡萄糖，补充有10％胎牛血清、10mM烟酰胺、4nM激活素A、10nM胰高血糖素样肽-1和50ng/ml胰岛素样生长因子-1或胰岛素样生长因子-2的培养基(DMEM-LG)中进一步培养另外14天。
孵育期间，每隔3-4天将培养基用新培养基更换。总共孵育3周之后，如下检查细胞的分化。实施例3分化后细胞的形态学变化
将干细胞从眼睛周围的皮下脂肪分离并培养，监视其形态学变化。尽管在无生长因子和细胞因子的培养基中孵育后在形态学上保持不变，但当它们用生长因子和/或细胞因子例如烟酰胺，激活素A和胰高血糖素样肽-1或胰岛素样生长因子-1或-2处理时，观察到所述干细胞经受形态学变化为圆形(图1)。诱导分化3周时，细胞在形态学上变圆，形成细胞簇。实施例4胰岛素和C-肽分泌的检查
3周的培养结束后，将细胞用补充有0.5％牛血清白蛋白的低葡萄糖培养基(DMEM-LG)处理12小时。然后，将细胞暴露于DMEM-HG 2小时并使用酶联免疫吸附检测定量分析分泌的胰岛素(图2)。同样，随胰岛素从胰岛素原剪接的C-肽的量也使用酶联免疫吸附检测测定(图3)。为了胰岛素和C-肽两者的酶联免疫吸附检测，使用商业上购自Mercodia，Sweden的试剂盒。将浓度为已知的标准溶液和如上获得的培养物以25μL每孔的量平板接种在用人胰岛素或C-肽包被的96孔微孔板上，其后将针对胰岛素或C-肽的抗体添加到板上并孵育1小时。随后，与TMB底物溶液孵育30分钟，紧接着进行吸光度测定。胰岛素或C-肽都不从未诱导分化的细胞中分泌，而发现使用本发明两步法培养的组产生胰岛素和C-肽两者。具体地，测定在胰岛素样肽-2存在下培养的组(NAGI2组)比NAG组胰岛素分泌约高8倍，C-肽约高6倍。实施例5对胰岛素分泌细胞特异的蛋白质的表达
在胰岛素样肽-2的存在下将从眼睛周围的皮下脂肪获得的干细胞诱导分化，其已通过酶联免疫吸附检测测定被证明最有效，之后使用免疫细胞化学检测就CK19、胰岛素、C-肽和胰岛素原(细胞外分泌前保持未分裂)的表达，检测所得的胰岛素分泌细胞(图4)。分化持续3周后，将细胞暴露到高浓度的葡萄糖2小时，在4℃下用4％多聚甲醛固定90分钟，用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤3次。将细胞用3％过氧化氢处理10分钟以除去内源性过氧化物酶，然后与补充有2％牛血清白蛋白的PBS在室温下一起孵育60min以阻断背景信号。细胞培养物与在PBS中的针对人CK19(1∶400)、C-肽(1∶500)、胰岛素(1∶500)和胰岛素原(1∶500)的一抗的稀释液在4℃下反应12小时。对于阴性对照，使用无一抗的PBS。将它们各自用生物素缀合的二抗和过氧化氢缀合的抗生蛋白链菌素(streptavidin)处理20min，然后用3，3’-二氨基联苯胺(DAB)着色。与其中未诱导分化的对照相比，用全部烟酰胺、激活素A和胰高血糖素样肽处理的组观察到CK19、C-肽、胰岛素和胰岛素原全部具有显著增加的表达水平(图4)。实施例6参与胰岛素分泌的基因的表达
使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，就胰岛素分泌细胞的特性基因的表达，检查在源自眼睛周围的皮下层的干细胞诱导分化后第7，14和21天取得的细胞。
最初，总RNA从分化细胞分离。将1mL Tri-reagent加入试管中的细胞，并与200μL氯仿彻底地混合，然后在室温下孵育15min。在14,000rpm下离心15min后，将这样形成的上清液转移到新试管并与异丙醇混合。在14,000rpm下离心10min形成团，然后向其添加75％乙醇。该悬浮液再次在14,000rpm下离心10min。抽除(drawn off)上清液，将残余的75％乙醇蒸发，其后将残留物溶解于无菌的去离子水，在65℃下孵育5min以洗脱RNA。该RNA通过在UV分光光度计中在260nm下读取吸光度来定量分析。将7.5μg的总RNA与1x反应缓冲液，1mM dNTP，0.5mg/ml寡脱氧胸腺核苷酸(oligo-dT)，20U RNA酶抑制剂和20U M-MuLV逆转录酶混合，并且在42℃下孵育(进行60min)之前添加无菌的去离子水以形成50μL的终体积。
在包含1x Taq缓冲液、2mM MgCl2、0.25U Taq聚合酶和10pmol引物的混合溶液中进行PCR，其中所述引物序列的各cDNA与如表2中所示的各基因互补。
通过在94℃下预变性5min来开始PCR，进行35个如下循环：在94℃下变性30sec，在各自温度下退火30sec，在72℃下延伸30sec，然后在72℃下后延伸5min。将这样获得的15μL各PCR产物随6x上样缓冲液(loading buffer)(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯蓝，40％蔗糖)一起加载到2％琼脂糖凝胶，在100V电场的存在下运行30min。电泳完成后，将凝胶用溴化乙锭染色，并在UV透照仪(Vilber loumat，FRANCE)上观察。确定各基因的表达水平，并与作为对照的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)比较。为了比较分析，数据从三次测定中获得。
在RT-PCR中用于扩增胰岛素分泌细胞的各特征基因的引物序列，其名称以及PCR产物的大小列于以下表2。表2
基因 引物 大小(bp)   退火温度(℃) 注释
GAPDH   5’-acaactttggtatcgtggaa-3’(SEQ ID NO.1)5’-aaattcgttgtcataccagg-3’(SEQ ID NO.2) 456 53 NM_002046
胰岛素   5’-aaccaacacctgtgcggctc-3’(SEQ ID NO.3)5’-aagggctttattccatctctctcg-3’(SEQ ID NO.4) 320 59 J00265
ngn3   5’-cgtgaactccttgaactgagcag-3’(SEQ ID NO.5)5’-tggcactcctgggacgagtttc-3’(SEQ ID NO.6) 211 61 AF234829
pdx1   5’-cccatggatgaagtctacg-3’(SEQ ID NO.7)5’-gtcctcctcctttttccac-3’(SEQ ID NO.8) 262 54 NM_000209
GK   5’-gaataccccccagagaccttttc-3’(SEQ ID NO.9)5’-ggtttcttcctgagccagcg-3’(SEQ ID NO.10) 182 61 M90299
Isl1   5’-agcatcaatgtcctctcaacttcc-3’(SEQ ID NO.11)5’-tgtttggcaaggcaatgacc-3’(SEQ ID NO.12) 493 57 NM_002202
Nkx6.1   5’-acacgagacccactttttccg-3’(SEQ ID NO.13)5’-tgctggacttgtgcttcttcaac-3’(SEQ ID NO.14) 336 59 NM_006168
Glut 2   5’-agctttgcagttggtggaat-3’(SEQ ID NO.15)5’-aataagaatgcccgtgacga-3’(SEQ ID NO.16) 300 57 NM_000340
ND   5’-cagaaccaggacatgccc-3’(SEQ ID NO.17)5’-atcaaaggaagggctggtg-3’(SEQ ID NO.18) 216 60 NM_002500
  胰高血糖素   5’-atgaacgaggacaagcgc-3’(SEQ ID NO.19)5’-gtaacgaaccgaccactt-3’(SEQ ID NO.20) 236 57 NM_002054
SST   5’-ggctgcgctgtccatcgtcct g-3’(SEQ ID NO.21)5’-ttgcgttctcggggtgccatagc-3’(SEQ ID NO.22) 276 63 NM_001048
PP   5’-ctctgttactacagccactg-3’(SEQ ID NO.23)5’-agtcgtaggagacagaaggt-3’(SEQ ID NO.24) 261 55 NM_002722.3
PC1/3   5’-ttggctgaaagagaacgggatacatct-3’(SEQ ID NO.25)5’-acttctttggtgattgctttggcggtg-3’(SEQ ID NO.26) 457 60 NM_000493.3
PC2   5’-gcatcaagcacagacctacactcg-3’(SEQ ID NO.27)5’-gagacacaaccacccttcatcct tc-3’(SEQ ID NO.28) 309 63 NM 003594.2
GLUT1   5’-ctcactgctcaagaagacatgg-3’(SEQ ID NO.29)5’-ctgggtaacagggatcaaacag-3’(SEQ ID NO.30) 366 60 NM 006516.1
GLP-1R   5’-gttcccctgctgtttgttgt-3’(SEQ ID NO.31)5’-cttggcaagtctgcatttga-3’(SEQ ID NO.32) 228 55 NM002062.2
PAX4   5’-cacctctctgcctgaggacacggtgag-3’(SEQ ID NO.33)5’-ctgcctcattccaagccatacagtagtg-3’(SEQ ID NO.34) 444 63 NM 006193.1
从图5中的数据明显看出，Neuro D和islet 1，都已知在胰腺的发育中起重要作用，并且胰高血糖素、SST(促生长素抑制素)和PP(胰多肽)，都由胰腺的内分泌细胞中除了β细胞之外的细胞分泌，在未诱导分化的细胞中表达，但是当诱导分化时，所述细胞在第7天开始表达PC2、PC1/3、Glp1R、神经元素(neurogenin)3，Glut2，Glut1，pax4和pdx1，在第14天开始表达Nkx6-1和胰岛素，并且其表达水平在第21天显著地增加。实施例7二硫腙染色
已知胰岛素与锌离子(Zn++)络合形成六聚体。二硫腙为已知由于其高的锌含量而选择性将胰腺β细胞染色的锌螯合剂。为此，将在胰岛素样肽-2存在下分化的细胞进行二硫腙染色。为此目的，将50mg的二硫腙溶解于5mL的二甲基亚砜(DMSO)中，将10μL的二硫腙溶液在1mL培养基中稀释。通过0.2μm尼龙过滤器过滤后，将二硫腙染色溶液滴加到培养皿，并在37℃下孵育15min。用PBS将所述细胞洗涤3次，在光学显微镜下观察。如图6所示，分化的细胞被清楚地染色，在细胞簇中发现具有深色。
总之，如上所述，当源自在眼睛周围的皮下脂肪的干细胞用高浓度的葡萄糖以及激活素A、成纤维细胞生长因子-2和胰高血糖素样肽-1初步处理，然后暴露到低浓度的葡萄糖同时存在烟酰胺、激活素A、胰高血糖素样肽-1和胰岛素样生长因子-2时，它们分化成胰岛素分泌细胞，观察到所述胰岛素分泌细胞大量地分泌胰岛素、C-肽和胰岛素原。此外，它们表达胰腺β细胞的特性基因以及被二硫腙清楚地染色。因此，根据本发明定义的方法允许成体干细胞有效地分化成胰岛素分泌β细胞。实施例8：干细胞培养
将获得的干细胞在分化诱导培养基中培养21天。为此，首先，将细胞以5x103细胞/孔的密度接种在胶原包被的48孔板，在孵育(进行3天)之前，向所述胶原包被的48孔板添加包含25mM葡萄糖、补充有1XB27添加剂、20ng/ml成纤维细胞生长因子-2和20ng/ml表皮生长因子的培养基(DMEM-HG)。其后，将细胞在包含25mM葡萄糖，补充有10％胎牛血清、4nM激活素A、20ng/ml成纤维细胞生长因子-2和10nM胰高血糖素样肽-1的培养基中进一步培养另外4天。随后，将细胞在包含5.5mM葡萄糖，补充有10％胎牛血清、4nM激活素A、20ng/ml成纤维细胞生长因子-2和10nM胰高血糖素样肽-1的培养基(DMEM-LG)中培养3天，然后在孵育另外10天之前转移到包含5.5mM葡萄糖，补充有10mM烟酰胺、10nM胰高血糖素样肽和10ng/ml β细胞素的新培养基中(DMEM-LG)。52孵育期间，每隔3-4天将培养基用新培养基更换。总共孵育3周之后，如下检查细胞的分化。实施例9：胰岛素和C-肽分泌的检查
 3周的培养结束后，将细胞用补充有0.5％牛血清白蛋白的低葡萄糖培养基(DMEM-LG)处理12小时。然后，将细胞暴露于DMEM-HG 2小时并使用酶联免疫吸附检测定量分析分泌的胰岛素(图7)。同样，随胰岛素从胰岛素原切离的C-肽的量也使用酶联免疫吸附检测测定(图8)。为了胰岛素和C-肽两者的酶联免疫吸附检测，使用商业上购自Mercodia，Sweden的试剂盒。将浓度为已知的标准溶液和如上获得的培养物以25μL每孔的量平板接种在用人胰岛素或C-肽包被的96孔微孔板上，其后将针对胰岛素或C-肽的抗体添加到孔中并孵育1小时。随后，将200μL TMB底物溶液添加到孔中。孵育30分钟后，测定其吸光度。胰岛素或C-肽都不从未诱导分化的细胞中分泌，而发现使用本发明两步法培养的组产生胰岛素和C-肽两者。具体地，以与实施例8相同方式培养的组比NAG组胰岛素分泌约高6倍，C-肽约高6倍。
以NAG组(公开于2007年5月提交的韩国专利申请No.2007-44663)产生的量的7-8倍产生胰岛素和C-肽，认为根据本发明在培养基中从成体干细胞分化的胰岛素分泌细胞为用于1型糖尿病的优良治疗物。
尽管已经描述本发明的优选实施方式以用于举例说明目的，本领域技术人员将意识到各种改进、添加和取代是可行的，而无需背离附带的权利要求书中公开的本发明的范围和精神。
序列表
<110>HeeSuk KONG
<120>人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法
<160>34
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH正向引物
<400>1
acaactttgg tatcgtggaa
20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH反向引物
<400>2
aaattcgttg tcataccagg
20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素 正向引物
<400>3
aaccaacacc tgtgcggctc
20
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素 反向引物
<400>4
aagggcttta ttccatctct ctcg
24
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ngn3正向引物
<400>5
cgtgaactcc ttgaactgag cag
23
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ngn3反向引物
<400>6
tggcactcct gggacgagtt tc
22
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pdx1正向引物
<400>7
cccatggatg aagtctacg
19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pdx1反向引物
<400>8
gtcctcctcc tttttccac
19
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Glucokinase正向引物
<400>9
gaataccccc cagagacctt ttc
23
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Glucokinase反向引物
<400>10
ggtttcttcc tgagccagcg
20
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Isl1正向引物
<400>11
agcatcaatg tcctctcaac ttcc
24
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Isl1反向引物
<400>12
tgtttggcaa ggcaatgacc
20
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Nkx6.1正向引物
<400>13
acacgagacc cactttttcc g
21
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Nkx6.1反向引物
<400>14
tgctggactt gtgcttcttc aac
23
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Glut 2正向引物
<400>15
agctttgcag ttggtggaat
20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Glut 2反向引物
<400>16
aataagaatg cccgtgacga
20
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ND正向引物
<400>17
cagaaccagg acatgccc
18
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ND反向引物
<400>18
atcaaaggaa gggctggtg
19
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Glucagon正向引物
<400>19
atcaaaggaa gggctggtg
19
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Glucagon反向引物
<400>20
gtaacgaacc gaccactt
18
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SST正向引物
<400>21
ggctgcgctg tccatcgtcc tg
22
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SST反向引物
<400>22
ttgcgttctc ggggtgccat agc
23
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PP正向引物
<400>23
ctctgttact acagccactg
20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PP反向引物
<400>24
agtcgtagga gacagaaggt
20
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PC1/3 fprward primer
<400>25
ttggctgaaa gagaacggga tacatct
27
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PC1/3反向引物
<400>26
acttctttgg tgattgcttt ggcggtg
27
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PC2正向引物
<400>27
gcatcaagca cagacctaca ctcg
24
<210>28
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PC2反向引物
<400>28
gagacacaac cacccttcat ccttc
25
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GLUT1正向引物
<400>29
ctcactgctc aagaagacat gg
22
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GLUT1反向引物
<400>30
ctgggtaaca gggatcaaac ag
22
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1R正向引物
<400>31
gttcccctgc tgtttgttgt
20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1R反向引物
<400>32
cttggcaagt ctgcatttga
20
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PAX4正向引物
<400>33
cacctctctg cctgaggaca cggtgag
27
<210>34
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PAX4反向引物
<400>34
ctgcctcatt ccaagccata cagtagtg
28

Claims (3)

1.将人类成体干细胞离体分化成胰岛素分泌细胞的方法，包括：
在包含20-30mM葡萄糖、补充有5-20％胎牛血清、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的培养基中培养成体干细胞4-10天；和
在包含4-7mM葡萄糖、补充有5-20％胎牛血清、5-20mM烟酰胺、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-100ng/ml胰岛素样生长因子的培养基中培养所述培养的干细胞10-20天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-2。
3.将人类成体干细胞离体分化成胰岛素分泌细胞的方法，包括顺序地培养成体干细胞：
在包含20-30mM葡萄糖，补充有B27添加剂、10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2和10-30ng/ml表皮生长因子的培养基中1-7天；
在包含20-30mM葡萄糖，补充有5-20％胎牛血清、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的培养基中1-7天；
在包含4-7mM葡萄糖，补充有5-20％胎牛血清、1-10nM激活素A、5-20nM胰高血糖素样肽-1和10-30ng/ml成纤维细胞生长因子-2的培养基中1-7天；以及
在包含4-7mM葡萄糖，补充有5-20％胎牛血清、5-20mM烟酰胺、1-10ng/ml β细胞素和5-15nM胰高血糖素样肽的培养基中10-20天。
CN2009102070188A 2008-10-23 2009-10-23 人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法 Expired - Fee Related CN101724602B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2008-0104393 2008-10-23
KR1020080104393A KR101025880B1 (ko) 2008-10-23 2008-10-23 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화 유도방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101724602A CN101724602A (zh) 2010-06-09
CN101724602B true CN101724602B (zh) 2013-01-09

Family

ID=41426888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009102070188A Expired - Fee Related CN101724602B (zh) 2008-10-23 2009-10-23 人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20100190251A1 (zh)
EP (1) EP2180043A1 (zh)
JP (1) JP2010099069A (zh)
KR (1) KR101025880B1 (zh)
CN (1) CN101724602B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101585914B1 (ko) * 2014-02-18 2016-01-18 강원대학교산학협력단 각질세포성장인자를 이용한 유선지방체지방줄기세포의 유선상피세포로의 분화 유도 방법
KR101588423B1 (ko) * 2014-04-03 2016-01-25 주식회사 녹십자랩셀 중간엽 줄기세포 스페로이드로부터 분화된 인슐린 분비세포의 제조방법 및 그의 용도
US9707336B2 (en) * 2014-04-07 2017-07-18 Medtronic Minimed, Inc. Priming detection system and method of using the same
CN107406830A (zh) 2014-12-30 2017-11-28 细胞治疗神经科学有限公司 Rpe细胞群和制备它们的方法
JP2018501281A (ja) * 2014-12-30 2018-01-18 セル キュア ニューロサイエンシズ リミテッド 網膜疾患を治療する方法
CN108841779A (zh) * 2018-06-11 2018-11-20 南通大学附属医院 胰腺特异性ECM在促进BMSCs增殖、迁移及定向分化为胰岛素分泌细胞中的应用
CN111848744B (zh) * 2018-09-03 2021-07-23 宁波希诺赛生物科技有限公司 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003050249A2 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003301312A1 (en) * 2002-10-18 2004-05-04 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
KR20070044663A (ko) 2005-10-25 2007-04-30 엘지.필립스 엘시디 주식회사 백라이트 유닛
KR100895324B1 (ko) * 2007-05-08 2009-05-07 주식회사 휴림바이오셀 성체 줄기세포를 이용한 인슐린 분비세포로의 분화유도방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003050249A2 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEABERG R ET AL.Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.《NATURE BIOTECHNOLOGY》.NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US,2004,第22卷(第9期), *
SEGEV H ET AL.DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS INTO INSULIN-PRODUCING CLUSTERS.《STEM CELLS》.ALPHAMED PRESS, DAYTON, OH, US,,2004,第22卷(第3期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101724602A (zh) 2010-06-09
KR20100045281A (ko) 2010-05-03
US20100190251A1 (en) 2010-07-29
EP2180043A1 (en) 2010-04-28
JP2010099069A (ja) 2010-05-06
KR101025880B1 (ko) 2011-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101724602B (zh) 人类成体干细胞分化成胰岛素分泌细胞的方法
CN101952415B (zh) 人胚胎干细胞的分化
Mao et al. The reversal of hyperglycaemia in diabetic mice using PLGA scaffolds seeded with islet-like cells derived from human embryonic stem cells
US20040132183A1 (en) Methods and compositions for expanding and differentiating insulin-producing cells
EP1507552A2 (en) Methods, compositions, and growth and differentiation factors for insulin-producing cells
CA2435826A1 (en) Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
CN101160390A (zh) 诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法
CN102899288B (zh) 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法
CN110691842A (zh) 从孵化的爬行动物卵分离用于生产生物人造皮肤和皮革的细胞
Zhou et al. Genetic modification of primate amniotic fluid-derived stem cells produces pancreatic progenitor cells in vitro
Zhang et al. Generation of pancreatic islet cells from human embryonic stem cells
RU2430158C1 (ru) Способ дифференцировки стволовых клеток взрослого человека в клетки, секретирующие инсулин
CN111848745B (zh) 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法
Xiao et al. Establishing a human pancreatic stem cell line and transplanting induced pancreatic islets to reverse experimental diabetes in rats
KR20080023081A (ko) 인간배아 줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화유도 방법
CA2701014A1 (en) Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells
AU2010201431A1 (en) Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells
WO2021228104A1 (zh) 一种胰岛样细胞团及其制法和应用
MX2010004284A (es) Metodo para la diferenciacion de celulas troncales adultas en celulas secretoras de insulina.
SG175463A1 (en) Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells
Roche et al. Generation of new islets from stem cells
CN116783287A (zh) 从干细胞诱导生成视网膜外层细胞的方法及包含通过该方法生成的细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的组合物
CN117402811A (zh) 一种胰腺内分泌细胞及其制备方法和用途
KR20200120929A (ko) 당뇨병을 치료하기 위한 췌장 세포 및 이를 생성하는 방법
Vicente-Salar et al. Phenotypic and functional characterization of glucagon-positive cells derived from spontaneous differentiation of D3-mouse embryonic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130109

Termination date: 20141023

EXPY Termination of patent right or utility model