CN101710070B

CN101710070B - 测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法

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Publication number: CN101710070B
Application number: CN2009102182840A
Authority: CN
Inventors: 郑立雄; 张慧颖; 李俊; 饶高雄
Original assignee: KUNMING ZHENHUA PHARMACY CO Ltd
Current assignee: Yunnan Plant Pharmaceutical Industry Co., Ltd.
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2029-12-07
Also published as: CN101710070A

Abstract

本发明是一种测定竹红菌甲素(Hypocrellin A)含量的高效液相色谱(HPLC)方法。液相色谱条件为：色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-稀磷酸(或稀甲酸、稀乙酸、稀硫酸)组成的混合溶剂，甲醇与稀磷酸(或稀甲酸、稀乙酸、稀硫酸)的体积比为80∶20～70∶30，检测波长462nm。本发明克服了已有分析方法的缺陷，可直接应用于含竹红菌甲素的中药材以及制剂中竹红菌甲素的定量分析。该方法具有分离效果好，测定准确、灵敏，专属性强，测定快速等技术特点。含竹红菌甲素的药材、制剂中竹红菌甲素的吸收峰可在30分钟内全部流出色谱柱，完成分析工作。

Description

测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种测定竹红菌甲素(Hypocrellin A)含量的高效液相色谱(HPLC)方法。

背景技术

光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种新型临床治疗技术，其发展始于20世纪70年代用于肿瘤的临床诊断和治疗研究，随着对其作用机制的深入了解，在90年代开始用于治疗鲜红斑痣、微血管类疾病、视网膜黄斑变性等。从1993年加拿大首先批准光敏药物Photofrin应用于膀胱癌和食管癌的光动力治疗以来，光动力疗法在很多国家获得批准，众多病人受益于光动力疗法。

作为一种新型疗法，PDT是将光敏剂导入体内并让它在组织间分布，然后用与光敏剂吸收光谱相匹配的光照射靶组织，在氧的参与下产生对靶组织的破坏。PDT的关键在于光敏活性化合物的获得以及光的参与，并因而获得双重选择性，也因选择性的获得而在临床治疗上具有高效性和安全性。

竹红菌甲素(Hypocrellin A，HA)是从云南民族药竹红菌(竹生小肉座菌Hypocrellabambusae的干燥子座]中首先发现的一种苝醌类新型天然光敏剂，其化学结构如附图1所示(万象义等，一种新的光化学疗法药物--竹红菌甲素，科学通报，1980年第24期，1148页；Tadashi Kish et al，New Perylenequinones from Shiraia bambusicola，Planta Med，1991年，第57卷，376页)。

HA的光敏活性具有光毒性高、暗毒性低、易排泄等优点，以其为主要有效成分开发的民族药制剂竹红菌软膏，在临床上已用来治疗外阴白色病变、软化疤痕疙瘩、鲜红斑痣等，是一种具有发展前景的新型光疗药物(徐尚杰等，新型光动力药物--竹红菌素衍生物的研究与进展，科学通报，2003年第10期，1005页；魏玉德，竹红菌素研究的进展，中国实用医药，2008年第3期，147页)。

有关HA定量分析的研究，主要有：

(1)分光光度法：利用HA在紫外-可见光区具有吸收的性质，以测定其吸光值来定量。因发色团相似的化合物均具有类似吸收曲线，该方法容易受杂质，尤其是同类物质的干扰，专属性差，已不适应药物分析的实际需求。

(2)高效液相色谱法：利用色谱柱先将HA和其它成分分离，再利用其理化性质检测含量，是目前主流的分析技术，有以下的报道：

①发明专利“高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法”(专利号ZL200410065986.7)和论文“高效液相色谱荧光检测法测定竹红菌中竹红菌甲素的含量”(顾晓天等，药物分析杂志，2006年，第1期，68页)用甲醇-水＝83∶17为流动相分离，以荧光发射性质检测进行定量分析。

②论文“HPLC法测定光疗药物竹红菌乙素的含量”(安红波等，黑龙江八一农垦大学学报，2009年，第3期，70页)用甲醇-水＝83∶17为流动相，在300nm处检测紫外吸收进行定量分析。

③论文“竹红菌中竹红菌乙素的提取及其含量的测定”(周林，南京师范大学学报，2007年，第2期，122页)用乙腈-KH₂PO₄(0.02mmol/L)＝70∶30为为流动相，在300nm处检测紫外吸收进行定量分析。

但经过本发明人系统的研究，结果表明上述专利或论文所确定的主要技术条件有严重缺陷，在实际的生产应用中，存在这以下弊端：

(1)所选用的流动相甲醇-水＝83∶17，或者乙腈-KH₂PO₄(0.02mmol/L)＝70∶30，均不能很好分离样品中HA，图谱中HA峰倾斜，对称度达不到《中国药典》2005年版一部附录VI D对于HPLC分析拖尾因子在0.95～1.05之间的要求。

(2)上述方法①采用的荧光检测器，为不常用仪器，适用面窄。方法①中专利技术只选用双封端保证很低硅羟基活性的Zorbax Extend C18柱，适用面窄，且此类色谱柱一般价格较高，增加了分析成本。

(3)上述方法②、③采用在300nm处检测紫外吸收，而HA的紫外-可见吸收曲线(如附图2所示)在300nm不是吸收峰，不适宜用作定量分析的检测波长。

为寻求对于HA更科学合理，更具有适用性的药物分析方法，本发明人经过系统的对比研究，提供了一种不同于上述专利或论文所公布的，可用于测定中药材或者其制剂产品中HA含量的HPLC方法。

发明内容

本发明的目的是为准确地分析测定中药材及其制剂中HA的含量，更好地控制药品质量，保障临床用药安全有效，提供一种测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法。

本发明通过以下的技术方案实现：

1.HPLC分析检测方法和检测波长的确定

HA在紫外-可见区有吸收(附图2)，可用紫外-可见检测器直接检测，这也是最常用、最普及的检测方法和仪器，考虑到应用普遍性，优先采用此检测方法。适量HA溶解于甲醇或HPLC流动相中，制成约1mg/100mL的溶液，用分光光度计在200～800nm波长范围内扫描紫外-可见光谱，结果表明HA吸收曲线有6个吸收峰(附图2)：581.0、540.5、462.0、342.5、266.5、231.0nm，其中以462nm处的吸收峰干扰少且较平坦，随后的HPLC分析也明确，在此检测波长下的HPLC图谱没有杂质干扰，故此确定：用紫外检测法，检测波长462nm。

2.HPLC分析色谱柱的选择

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(C-18柱)是HPLC分析最常用、性价比最高的色谱柱系列，考虑到应用普遍性，比较了不同厂牌、型号C-18柱(大连依利特公司C-18柱，Phenomenex公司C-18柱、Merck公司C-18柱)的分离效果，结果表明在本发明分析条件下，对中药材及制剂中HA的含量分析没有明显区别，均能很好的实现定量分析。因此确定：选用以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱。

3.HPLC分析流动相的筛选

选择合适的流动相以得到良好分离效果是HPLC分析的关键，基于一般的公知事实和工作经验，在HPLC分析中最常用的溶剂有甲醇、乙腈等，调节流动相酸碱性的常用试剂有磷酸、甲酸、二乙胺、三乙胺等。根据理化性质和经验，选择甲醇-水、乙腈-水系统为基础，辅以磷酸等调节酸性来对比筛选分析中药材及其制剂中HA含量的流动相组成和配比。筛选选用Phenomenex公司C-18柱(Φ4.6×150mm，5μm，使用pH范围为1.5～10)，流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长642nm。对比研究数据及其分析结果见表一。

表一HA含量HPLC分析的流动相对比筛选试验评价结果

No	色谱流动相	HA吸收峰参数	系统综合评价
				1	甲醇-水(70∶30)	保留时间：27.4min理论板数：5437拖尾因子：1.574	保留时间：稍长理论板数：较高吸收峰形：不对称
2	甲醇-水(75∶25)	保留时间：13.6min理论板数：6971拖尾因子：1.251	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：不对称
				3	甲醇-0.01％磷酸(75∶25)	保留时间：13.7min理论板数：7283拖尾因子：1.113	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：不对称
4	甲醇-0.04％磷酸(75∶25)	保留时间：13.6min理论板数：7425拖尾因子：1.078	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：接近对称
				5	甲醇-0.08％磷酸(75∶25)	保留时间：13.4min理论板数：7555拖尾因子：1.036	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：对称
6	甲醇-0.12％磷酸(75∶25)	保留时间：13.3min理论板数：7762拖尾因子：1.050	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：对称
				7	甲醇-0.08％磷酸(70∶30)	保留时间：22.0min理论板数：5741拖尾因子：1.078	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：接近对称

8	甲醇-0.08％磷酸(80∶20)	保留时间：10.4min理论板数：6135拖尾因子：1.088	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：接近对称
				9	甲醇-0.08％硫酸(75∶25)	保留时间：10.3min理论板数：5436拖尾因子：1.076	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：接近对称
10	甲醇-0.10％甲酸(75∶25)	保留时间：14.1min理论板数：4765拖尾因子：1.112	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：不对称
				11	甲醇-0.30％甲酸(75∶25)	保留时间：13.8min理论板数：6642拖尾因子：1.067	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：接近对称
12	甲醇-0.30％乙酸(75∶25)	保留时间：14.0mm理论板数：6776拖尾因子：1.058	保留时间：适中理论板数：较高吸收峰形：接近对称
				13	乙腈-水(50∶50)	保留时间：9.4min理论板数：1524拖尾因子：2.481	保留时间：稍偏短理论板数：很低吸收峰形：不对称
14	乙腈-0.02％磷酸(50∶50)	保留时间：15.4min理论板数：2680拖尾因子：1.571	保留时间：适中理论板数：较低吸收峰形：不对称
				15	乙腈-0.05％磷酸(50∶50)	保留时间：16.8min理论板数：3390拖尾因子：1.271	保留时间：适中理论板数：中等吸收峰形：不对称

结果表明：流动相以甲醇-稀磷酸(或甲酸、乙酸、硫酸)组成的混合溶剂具有最好分离效果；稀酸的适宜浓度为0.04％～0.30％，甲醇和稀酸的体积比在80∶20～70∶30之间均可，优化的流动相比例是75∶25。在优化条件下，HA对照品和竹红菌药材的HPLC图谱见图3、图4。药材分析图谱中HA吸收峰保留时间为13.42min，理论板数6910，拖尾因子1.031，分离度为2.731。

4.竹红菌药材供试液的制备

竹红菌甲素等苝醌类成分不溶于水，可溶于丙酮、氯仿、乙醇等有机溶剂，因此，从药材中提取竹红菌甲素不宜用水为溶剂，而应该用有机溶剂提取。不同提取方法测定结果比较见表二。

表二竹红菌药材的提取方法比较

No	溶剂	实验现象及结果
			1	丙酮(回流提取)	①测出含量3.38％。②溶解性好，提取完全。
2	丙酮(超声提取)	①测出含量3.01％。②溶解性好，提取完全。
			3	氯仿(回流提取)	①测出含量3.37％。②溶解性好，提取完全。
4	氯仿(超声提取)	①测出含量3.04％。②溶解性好，提取完全。
			5	乙醇(回流提取)	①测出含量3.07％。②溶解性好，提取不完全。
6	乙醇(超声提取)	①测出含量2.87％。②溶解性好，提取不完全。
			7	甲醇(回流提取)	①测出含量3.09％。②溶解性好，提取不完全。
8	甲醇(超声提取)	①测出含量2.83％。②溶解性好，提取不完全。

结果表明：丙酮、氯仿具有较好溶解性，乙醇、甲醇稍差；回流提取优于超声处理。由于氯仿有一定毒性而丙酮无毒，由此确定从药材中提取竹红菌甲素供试品的制备方法为：取药材，粉碎，加丙酮回流提取，滤过，即得。

5.测定的专属性

对照品加入：在竹红菌药材及其制剂的供试液中，混入对照品溶液进样测定，和供试液色谱对照，无新的吸收峰出现，竹红菌甲素吸收峰相对面积增大。吸收峰光谱扫描：以二极管阵列检测器(DAD)，扫描样品色谱中和对照品峰相同位置的吸收峰，峰纯度950以上，紫外光谱和对照品一致。以上试验证明：测定的吸收峰对应的物质是竹红菌甲素，该含量测定方法具有专属性。

6.测定的方法学考察

(1)稳定性试验

对照品、供试品溶液于放置后不同时间测定，结果表明：对照品溶液至少在48h内稳定(峰面积RSD＝0.57％，n＝7)，供试品溶液至少在48h内稳定(峰面积RSD＝0.41％，n＝7)，可满足含量测定需求。

(2)检测限和线性关系

精密称取竹红菌甲素对照品适量，用流动相制成1mg/ml储备液，不断稀释后测定最低检测限为0.4ng(信号/噪声＝3)，测定方法灵敏。在分别取储备液稀释为不同浓度，测定。以进样量和峰面积关系的回归方程：Y＝1317062X+7597(n＝7，r＝0.9999，Y：峰面积；X：进样量μg)，在进样量在0.04μg～4.0μg范围内，竹红菌甲素的量与峰面积呈良好的线性关系。

(3)重现性试验

精密称取同一批号的竹红菌药材粉末约1g，共5份，按上述竹红菌药材供试品溶液制备方法制备溶液，各进样20μl测定竹红菌甲素峰面积并计算含量。样品中竹红菌甲素平均含量为30.34mg/g，RSD＝0.14％，方法重现性符合要求。

(4)回收率试验

精密称取已知含量竹红菌药材(样品6)粉末6份，每份约1g，分成三组，分别加入3.6mg/mL的对照品溶液7mL，8.5mL，10mL，按照竹红菌药材供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，分别进样测定竹红菌甲素的含量，计算回收率。平均回收率为100.46％，RSD＝1.69％(表6)，符合要求。

7、分析方法耐用性试验

(1)流速变化对测定结果的影响

保持色谱柱、柱温、检测波长、流动相不变，流速设定为0.8、1.0、1.2ml/min分别进行测定。同一竹红菌药材样品含量为3.33％、3.34％、3.34％，结果表明流速改变达到±20％时，仍可准确测定样品中竹红菌甲素的含量。

(2)检测波长偏移对测定结果的影响

保持色谱柱、柱温、流动相、流速不变，检测波长设定为459、462、465nm分别测定。同一竹红菌药材样品含量为3.32％、3.32％、3.33％，结果表明当检测波长偏移达到±3nm时，仍可准确测定样品中竹红菌甲素的含量。

(3)流动相比例改变对测定结果的影响

保持色谱柱、柱温、检测波长、流速不变，适当改变流动相的组成比例进行试验(甲醇-0.08％磷酸＝72∶28、75∶25、78∶22)，结果表明流动相比例改变达到±3％的情况下，仍可准确测定样品中竹红菌甲素的含量。

8、测定方法

按照上述研究确定的分析方法，制备竹红菌甲素对照品溶液，含竹红菌甲素的中药材及其制剂的供试溶液。精密吸取对照品溶液、供试溶液，注入液相色谱仪，测定，根据峰面积计算，即得。

与现有技术比较，本发明具以下的有益效果：

(1)经过系统的比较研究，建立了一种测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法，可用于测定含竹红菌甲素的药材、制剂中竹红菌甲素的含量。

(2)该分析方法具有分离效果好，测定准确、灵敏，专属性强，测定快速等技术特点。含竹红菌甲素的药材、制剂中竹红菌甲素的吸收峰可在30分钟内全部流出色谱柱，完成分析工作。

(3)和目前已公开的分析方法比较，本发明确定了不同的流动相组成，选定了不同的检测波长，避免了已公开分析方法的缺陷，可直接应用于实际生产过程及含竹红菌甲素的中药材、制剂产品的质量分析。

附图说明

图1是竹红菌甲素的化学结构式；

图2是竹红菌甲素的紫外-可见吸收曲线；

图3是竹红菌甲素对照品的HPLC图谱；

图4是竹红菌药材的HPLC图谱。

具体实施方式

以下的具体实施例可进一步说明本发明及其应用，但并不构成对本发明权利要求所保护的范围的限制。

工作原理和过程：供试液注入液相色谱仪，流动相载着竹红菌甲素等成分进入色谱柱并分离后依次到达检测器被识别；检测器测定样品中竹红菌甲素吸收峰的响应值，并根据响应值和竹红菌甲素标样的比较来计算样品中竹红菌甲素的含量。

实施例1：竹红菌药材中竹红菌甲素的含量测定

取竹红菌药材，粉碎，过60目筛网，精密称取1g，置100ml圆底烧瓶中，准确加入丙酮50ml，称重，水浴回流提取1小时，放冷，以丙酮补足减失的重量，过滤，即得供试溶液。取竹红菌甲素适量，精密称定，以无水甲醇溶解制成每1ml含有30μg竹红菌甲素的对照品溶液。

按照本发明研究确定的方法，精密吸取对照品溶液、供试溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。其中，色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，检测波长为462nm，流动相为甲醇和质量百分比为0.08％稀磷酸组成的混合溶液，甲醇和稀磷酸组成的体积比为75∶25。不同产地的竹红菌药材中竹红菌甲素含量测定的结果见表三。

表三不同产地竹红菌药材中竹红菌甲素含量测定结果

实施例2：竹红菌药材中竹红菌甲素的含量测定

取竹红菌药材(宁蒗县产，批号20071201)，粉碎，过60目筛网，精密称取1g，置100ml圆底烧瓶中，准确加入丙酮50ml，称重，水浴回流提取1小时，放冷，以丙酮补足减失的重量，过滤，即得供试溶液。取竹红菌甲素适量，精密称定，以无水甲醇溶解制成每1ml含有30μg竹红菌甲素的对照品溶液。

采用以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，462nm检测波长，分别以表四中的混合溶剂为流动相，进行竹红菌甲素含量分析。精密吸取对照品溶液、供试溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。分别使用不同流动相测定同一份竹红菌药材(宁蒗县产，批号20071201)中竹红菌甲素结果如表四。

表四用不同流动相测定竹红菌药材中竹红菌甲素的含量

流动相组成	HA含量mg/g	流动相组成	HA含量mg/g
				甲醇-0.04％磷酸(75∶25)	30.22	甲醇-0.08％磷酸(80∶20)	30.01
甲醇-0.08％磷酸(75∶25)	30.17	甲醇-0.08％硫酸(75∶25)	30.23
				甲醇-0.12％磷酸(75∶25)	30.23	甲醇-0.30％甲酸(75∶25)	30.13
甲醇-0.08％磷酸(70∶30)	30.25	甲醇-0.30％乙酸(75∶25)	30.19

实施例3：竹黄药材中竹红菌甲素的含量测定

方法同实施例1，测定的药材为竹黄，不同产地竹黄药材中竹红菌甲素的含量测定结果见表五。

表五不同产地竹黄药材中竹红菌甲素含量测定结果

实施例4：竹红菌软膏中竹红菌甲素的含量测定

精密称区竹红菌软膏1g，置于磨口三角瓶中，再加约2g硅藻土搅散软膏，然后精确加入无水甲醇50mL，称重，于水浴上回流提取1小时，放冷，用无水甲醇补足减失的重量，再密封后置于4℃冰箱中放置过夜，取出，上清液滤过，取续滤液，过0.45um滤膜，即得供试品溶液。余下的分析操作步骤同实施例1、2。不同厂家、批号的竹红菌软膏中竹红菌甲素含量测定结果见表六。

表六不同厂家、批号的竹红菌软膏中竹红菌甲素含量测定结果

Claims

1.一种测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱(HPLC)方法，其特征是HPLC条件为：色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-稀磷酸或甲醇-稀甲酸或甲醇-稀乙酸或甲醇-稀硫酸组成的混合溶剂，甲醇与稀磷酸或稀甲酸或稀乙酸或稀硫酸的体积比为80∶20～70∶30，检测波长为462nm。

2.根据权利要求1所述的测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱(HPLC)方法，其特征是流动相中稀酸的适宜浓度为质量百分比0.04％～0.30％。

3.根据权利要求1所述的测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱(HPLC)方法，其特征是流动相为甲醇和质量百分比为0.08％稀磷酸组成的混合溶液，甲醇和稀磷酸组成的体积比为75∶25。