CN101695520B - 治疗糖尿病药物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病药物的制备方法，属于含有的原材料来源于传统中药的医用配置品的制备方法。本发明是将黄芪经纤维素酶处理后乙醇回流提取，黄连、金银花分别经纤维素酶、果胶酶处理后冷浸提取。本发明与传统的提取方法比较，黄芪总皂苷的提取率提高30～50％，小檗碱及总生物碱提取率均可提高20～40％，绿原酸得率分别提高了15～30％、30～50％，本发明提高植物药材中有效物质的转移率，能够充分利用药材资源。

Description

治疗糖尿病药物的制备方法

技术领域

本发明涉及含有的原材料来源于传统中药的医用配置品的制备方法，具体是应用生物酶解技术对原料药物进行提取的治疗糖尿病药物的制备方法。

背景技术

金芪降糖片作为一种纯中药制剂。主要由黄芪、金银花、黄连等组成，有清热益气的功能，用于消渴病气虚内热症。黄芪补气、使脾胃健运，有较好的降血糖作用；金银花具有清热解毒、止渴补气的功效以及提高免疫力、减少胆固醇吸收作用；黄连清热泻火去湿热，消渴，通过抑制糖元异生及促进糖酵解而产生降糖作用，同时有降低血脂的作用。现代药理实验已经表明：黄芪多糖和黄连中生物碱具有明显的降血糖作用，所以金芪降糖片中的多种化学组分从糖代谢、脂质代谢、抗氧化、免疫调节等多个环节，通过整体、细胞、分子等不同水平的作用，改善了机体对胰岛素的敏感性并增强机体免疫功能的作用，有益于糖尿病某些微血管并发症的防治。

中国专利155954公开了“一种治疗糖尿病药物及其制备方法”，该药物商品名称为金芪降糖片。它是以黄连、金芪、金银花为组方的原料提取工艺，其中黄连直接粉碎入药；黄芪的提取工艺为50％乙醇提取三次，时间4、2、2小时；金银花的提取工艺为总量1/6粉碎，5/6水温浸。

中国专利1965929A公开的是“一种治疗糖尿病药物的制备方法”，该药物商品名称为金芪降糖片。其是以黄连、黄芪、金银花为组方的原料提取工艺，其中黄连以50％乙醇提取、纯化；黄芪的提取工艺为75％乙醇提取二次，每次提取2小时；金银花的提取工艺为全部水温浸、醇沉。

但是，在上述原材料来源于植物的医用配置品制备过程中，由于植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质对植物细胞内有效成分的浸出形成一种屏障，阻碍细胞内成分的扩散，影响植物成分的提取效果，有效成分的浸出率低；而且，临床用药剂量大，患者服用不便，甚至造成药材资源浪费和耗能成本居高。

发明内容

本发明就是为了解决药物原料的提取工艺中，有效成分转移率低、制剂内在质量有待提高，以及缩小服用剂量的问题，而提供一种治疗糖尿病药物的制备方法。

本发明是按以下技术方案实现的。

一种治疗糖尿病药物的制备方法，包括按重量份配比的黄连10.3份，黄芪15.4份，金银花61.8份，分别提取药物有效成分后，加入2～4份辅料，制成颗粒，压制成片，包薄膜衣制成，其药物有效成分的提取步骤为：

①黄芪总皂苷提取物的提取步骤

a.黄芪加入3～8倍量pH 3.0～6.0的硫酸水，再加入黄芪用量0.1～1.0％的纤维素酶，35～60℃酶解，收集酶解液；

b.酶解液以氢氧化钠溶液调至pH中性后，加入60～80％乙醇回流提取，收集滤液，减压浓缩；

c.浓缩液上大孔吸附树脂柱以2～10倍树脂体积的蒸馏水洗脱，再以5～10倍树脂体积的60～80％乙醇洗脱，收集乙醇浓缩液；

d.于乙醇浓缩液中加入丙酮至无沉淀产生为止，过滤、收集、干燥沉淀剂，即得黄芪总皂苷提取物；

②黄连总生物碱提取物的提取步骤

a.将黄连剪切成段，加入3～5倍量pH 1.0～5.0的硫酸水，再加入黄连用量0.1～1.0％的纤维素酶，30～60℃温浸，分别收集酶解液和药渣；

b.药渣以8～16倍0.1～2.0％的硫酸水溶液浸泡，得酸水浸出液；

c.将酶解液与酸水浸出液合并、过滤，浓缩；

d.以盐酸调至pH 1～4，在搅拌下加入食盐，放置至黄色结晶析出；

e.抽滤收集沉淀，蒸馏水洗沉淀至pH4～6，烘干，即得黄连总生物碱；

③金银花提取物的提取步骤

a.向金银花中加入8～12倍量pH4.0～6.0的柠檬酸缓冲液，再加入金银花用量0.1～2.0％的果胶酶，收集酶解液；

b.酶解后金银花加8～15倍量水温浸提取，收集温浸液；

c.将酶解液与温浸液合并，过滤，60℃减压浓缩至相对密度1.10～1.20；

d.于浓缩液中加入2～4倍量的乙醇，静置醇沉，过滤，上清液减压浓缩即得金银花提取物。

所述治疗糖尿病药物的制备方法，向金银花中加入8～12倍量pH 4.0～6.0的柠檬酸缓冲液，再加入金银花用量0.1～2.0％的复合酶，收集酶解液，其中复合酶是由纤维素酶与果胶酶分别按1∶1、1∶2、2∶1的比例组成。

所述治疗糖尿病药物的制备方法，其黄芪总皂苷提取物中的黄芪浸膏收率为10～17％，黄芪总皂苷提取转移率为65～88％，其中黄芪甲苷含量占5～19％。

所述治疗糖尿病药物的制备方法，其黄连总生物碱提取物中的黄连总生物碱粗品得率为10～25％，黄连总生物碱提取转移率为70～90％，盐酸小檗碱提取转移率为50～90％。

所述治疗糖尿病药物的制备方法，其金银花提取物中金银花浸膏得率为15～40％，绿原酸提取转移率为50～90％。

这样，应用本发明制备的治疗糖尿病药物，其处方组分与剂型不变。由于生物酶解作用能够将植物组织中的纤维素、半纤维素等分解，破坏植物成分浸出的屏障作用，从而达到提高有效成分转移率的目的；酶反应具有反应条件温和、选择性强、反应效率高等特点。本发明不仅提高有效成分的浸出率，因为降低了提取温度和缩短提取时间，所以还降低了提取过程中耗能成本。该工艺操作简单易行，安全性高，更适合工业生产。

附图说明

图1是黄连总生物碱的提取流程图；

图2是黄芪总皂苷的提取流程图；

图3是金银花中绿原酸的提取流程图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

一、处方组成与提取工艺

1.1因为本发明是制备工艺改进，所以其处方用药量保持不变，剂型仍然为片剂。由于所得提取物重量变化致使药片规格改变，根据实验结果，以原服用生药量计算，片重约为0.50克。其组方与工艺如下表。

项目	现有技术工艺	本发明
			治疗糖尿病药物(金芪降糖片)处方组成	黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份	黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份
黄连	粉碎	酶解2小时，酸水溶液浸泡2次(24，24小时)
			黄芪	50％乙醇提取3次(4，2，2小时)	酶解2小时，70％乙醇提取2次(2，2小时)
金银花	总量1/6粉碎，5/6温浸	酶解2小时，全部水温浸、醇沉

服用剂量

7～10片

2～3片

1.2本制剂的提取工艺中，黄连具有清热泻火去湿热，消渴等功效，为处方中君药。药理实验证明，黄连中小檗碱及其生物碱通过抑制糖元异生及促进糖酵解而产生降糖作用，同时有降低血脂的作用，本研究中以小檗碱、药根碱、巴马汀含量为考察指标，采用正交实验法，优选了黄连总生物碱的提取工艺，同时对酶解的条件也进行了优选。采用了酶解-酸水常温浸渍法，该方法较原工艺黄连粉剂量大大缩小。小檗碱及总生物碱提取率可比单纯酸水浸渍法提高20～40％。

黄芪具有补气固表，利尿托毒等功效，用于内热消渴、糖尿病等治疗。黄芪中含有黄芪皂苷、黄酮等成分具有改善机体对胰岛素的敏感性并增强机体免疫功能、调节血糖等作用。所以，本研究中以黄芪甲苷和黄芪总皂苷为含量指标，采用了正交实验，优选了酶解与提取工艺条件。新的提取工艺，使黄芪总皂苷的提取率比未加酶的对照组高出30～50％。

金银花具有清热解毒功效，含有的绿原酸、黄酮等物质，现代药理实验表明：除了抗菌、消炎作用外，还可以降低血脂，保护胰腺B细胞及降血糖作用。因为上述有效成分对热较敏感，所以考虑降低提取温度而不降低绿原酸含量的原则。以绿原酸含量为指标，通过正交实验筛选了酶解与提取条件，由于增加酶解处理步骤，较常规水温浸法，金银花中绿原酸得率提高了30～50％。通过处方中的金银花全部采取提取，并结合醇沉的步骤，使得现工艺比原工艺的浸膏收率降低，绿原酸含量提高15～50％。

上述各药材均采用了酶辅助提取的方法，减弱了植物细胞对有效成分浸出的屏障作用，不仅提高有效成分的浸出率，因为降低了提取温度和缩短提取时间，所以还降低了提取耗能成本。该工艺操作简单易行，安全性高，更适合工业生产。

2.1黄连总生物碱提取物的提取步骤：

a.将黄连挑选并除去泥土、杂物，烘干后，适当剪切成段；

b.向黄连中加入3～5倍量、pH 1.0～5.0的硫酸水，再加入纤维素酶，其用量为黄连重量的0.1～1.0％，于30～60℃下温浸0.5～4小时，分别收集酶解液和药渣；

c.经酶解处理后的药渣以0.1～2.0％的硫酸水溶液浸泡2～4次，每次12～48小时，硫酸水溶液加入量为药材的8～16倍，收集酸水浸出液；

d.将酶解液与酸水浸出液合并、过滤，将过滤后的提取液浓缩至原体积的1/4～1/2；

e.以盐酸调pH 1～4，使硫酸盐转为溶解度较小的盐酸盐，在搅拌下加入食盐，其加入量为提取液体积的6～15％，放置12～48小时，至黄色结晶完全析出为止；

f.抽滤收集沉淀，用少量蒸馏水洗沉淀至pH4～6，将洗涤后的沉淀于50～80℃下烘干，即得黄连总生物碱产品。

2.2黄芪总皂苷提取物：

a.将黄芪根茎原料适当碾压，加入3～8倍量、pH 3.0～6.0的硫酸水，再加入纤维素酶，其用量为生药重量的0.1～1.0％，于35～60℃下酶解0.5～4小时；

b.将上述酶解液以氢氧化钠调至pH中性后，加入乙醇至含醇量60～80％，回流提取2次，每次2小时，过滤，减压浓缩；

c.浓缩液上AB-8或D-101大孔吸附树脂柱，先以2～10倍树脂体积的蒸馏水洗脱糖类等水溶性杂质，再以2～10倍树脂体积的60～80％乙醇洗脱，收集乙醇液并进行适当浓缩；

d.于乙醇浓缩液中加入丙酮至无沉淀产生，过滤、收集干燥沉淀剂，即得黄芪总皂苷提取物。

2.3金银花提取物(金银花提取方法1)，以绿原酸为代表成分作为考察工艺的标准，它包括以下步骤：

a.向银花中加入8～12倍量、pH 4.0～6.0的柠檬酸缓冲液，再加入金银花重量的0.1～2.0％果胶酶，于30～60℃下温浸0.5～4小时，收集酶解液；

b.酶解后药材加水于40～70℃温浸提取两次，每次1～3小时，加水量为药材重量的8～15倍量，收集提取温浸液；

c.将酶解液与温浸液合并，过滤，60℃滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.20；

d.上述浓缩液中加入2～4倍量的乙醇静置12～48小时进行醇沉，过滤，上清液经减压浓缩、干燥即得到金银花的有效部位。

2.4金银花提取物(金银花提取方法2)，以绿原酸为代表成分作为考察工艺的标准，它包括以下步骤：

a.向金银花中加入8～12倍量、pH 4.0～6.0的柠檬酸缓冲液，再加入金银花重量的0.1～1.0％复合酶，所述复合酶是由纤维素酶与果胶酶，分别按1∶1、1∶2、2∶1的比例组成，于30～60℃下温浸0.5～4小时，收集酶解液；

b.酶解后药材加水于40～70℃温浸提取两次，每次1～3小时，加水量为药材重量的8～15倍量，收集温浸液；

c.将酶解液与温浸液合并，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.20(60℃)；

d.于上述浓缩液中加入2～4倍量的乙醇静置12～48小时进行醇沉，过滤，上清液经减压浓缩、干燥即得到金银花的有效部位。

二.制剂与质量标准

1、制剂

本发明中三种药材均采取提取物的形式成型，其中黄连是以总生物碱入药，黄芪总皂苷提取物、金银花是以浸膏粉的形式压片，所以选用了流动性强、可压性好的药用辅料，以利于片剂的崩解问题。依据文献与原处方，选用了微晶纤维素、预胶化淀粉、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁等辅料进行配比筛选，确定制剂。

称取按各自重量份配比制备的黄连总生物碱、黄芪总皂苷提取物、金银花浸膏粉三者的混合物6～8重量份，再加入辅料2～4份，制成颗粒，压制成片，包薄膜衣，即得。上述辅料是预胶化淀粉0.7～1.5份，微晶纤维素1.0～1.8份，交联羧甲基纤维素钠0.1～0.2份，羧甲基淀粉钠0.1～0.3份，硬脂酸镁0.1～0.2份组成。

2、质量标准

2.1原料、辅料质量

原料、辅料质量按照《中国药典》2005版标准，金银花、黄芪原料的质量按照《中国药典》2005版标准，黄连原料的质量以自定HPLC法测定含量，其中黄芪总皂苷选择紫外法测定

2.2中间体质量标准

根据实验结果，分别进行各原料提取中间过程中黄芪、金银花浸膏的相对密度、指标有效成分的收率检测与含量限度检查。

2.3成品质量标准

鉴别：以盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、绿原酸、黄芪甲苷为对照，对成品做TLC鉴别，与原工艺产品的TLC进行比较，上述检测成分基本一致。

检查：重金属检测按照《中国药典》2005版标准一部附录检查。结果5批样品中铅含量＜5ppm，砷含量＜2ppm，符合常规口服制剂的要求，故该2项未纳入常规检查标准中。

含量测定：以HPLC法对成品中的黄连、黄芪、金银花中的指标成分小檗碱、药根碱、巴马汀、绿原酸、黄芪甲苷的含量进行检测。

黄连，原质量标准的黄连是以生药粉直接入药，仅对小檗碱的含量进行了测定，新工艺中对黄连实行了酸水浸渍，其质量标准也做了相应调整。采用HPLC法分别测定了小檗碱、药根碱、巴马汀3种生物碱的的含量，制定的含量限度为：每片小檗碱的含量不小于15mg。

黄芪，本发明制备的成品也按照《中国药典》2005版黄芪药材的质量标准，采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量，在生产的中间过程还对黄芪总皂苷进行了检测。制定的含量限度为：每片黄芪甲苷的含量不小于0.20mg。

金银花，金银花中绿原酸对热较敏感，所以在提取工艺考察中尽可能降低温度，以提高绿原酸的稳定性。本发明制备的成品也按照《中国药典》2005版金银花药材的质量标准，采用HPLC法测定绿原酸的含量，制定的含量限度为：每片绿原酸的含量不小于20mg。

本发明由于在提取工艺中增加了酶解辅助浸取的过程，有效成分浸出的细胞壁屏障作用减弱，使得提取温度降低，时间缩短，因此使各味药材中的指标成分含量均有不同程度的提高，因此，制定成品的质量标准也随之提高，从而新工艺制剂比原工艺产品的内在质量提高了。

三、应用本发明制备的治疗糖尿病药物片剂(金芪降糖片)的药效学实验：

1.两种工艺制备的金芪降糖片对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响

1.1四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立

将昆明种小鼠(♂♀兼用，由人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，24±2g，许可证号SCXK-军2002-001)，实验前在室温22±2℃、相对湿度65％～70％饲养1周，适应环境。然后禁食，不禁水约12h后，尾静脉注射新配制的四氧嘧啶(Sigma公司，A17413)溶液(1.4mg/mL)，剂量为70mg/kg。于60h后再禁食12h，眼静脉丛取血，离心分离血清。采用血糖试剂盒(中生北控生物科技有限公司，240181)以葡萄糖氧化酶(GOD)法测血糖值，大于11.1mmol/l为合格的实验性糖尿病小鼠模型。

1.2分组给药

挑选合格的模型小鼠140只，按血糖值均匀分成10组，每组14只，分别为本发明(实施例5方法提取)与原工艺金芪降糖片的高剂量组(4.20生药g/kg)、中剂量组(2.10生药g/kg)、低剂量组(1.05生药g/kg)、正常给药组(2.10生药g/kg)、正常对照组及模型组(自来水10ml/kg)。另取30片苯乙双胍(25mg/片)，研碎，以煮沸过的蒸馏水溶解，配成7.5mg/ml的水溶液，作为苯乙双胍阳性对照组(75mg/kg)、每天灌胃一次，连续给药14天

1.3血糖测试结果

末次给药后禁食(不禁水)12小时。眼静脉丛取血，离心分离血清。GOD法测定葡萄糖值，并进行t检验，结果见表1、表2。

表1 本发明金芪降糖片对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影响(x±S)

*与模型组比较p＜0.05；**与模型组比较p＜0.01；^△△与正常对照组比较p＜0.01；

从表1知，四氧嘧啶糖尿病小鼠各组经本发明金芪降糖片治疗14天后，比给药前空腹血糖相比均有不同程度的下降(-25.25％～-40.33％)。给药后，本发明金芪降糖片各剂量组与模型组比较空腹血糖也显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，并且各给药组在降血糖作用上呈现一定的量效关系与时效关系。

正常小鼠给药组同正常对照组及同组给药前比较均无统计学意义，说明本发明金芪降糖片对正常小鼠的血糖水平不产生影响。

表2 两种工艺金芪降糖片对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的比较(x±S)

注：*与模型组比较P＜0.05；**模型组比较P＜0.01；

^▲本发明金芪降糖片与原工艺金芪降糖片同剂量组比较P＜0.05；

从表2知，四氧嘧啶糖尿病小鼠各组经给药后，两种工艺金芪降糖片各剂量组与模型组比较空腹血糖均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，并且各给药组在降血糖作用上呈现一定的量效关系与时效关系。两种工艺金芪降糖片分别在低、中同剂量空腹血糖比较具有显著性差异(P＜0.05)，由血糖值知本发明金芪降糖片在低、中剂量给药时降血糖效果优于原工艺，而在高剂量时两种提取工艺的产品对四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖无显著性差异。

2.两种工艺金芪降糖片对STZ诱导糖尿病大鼠血糖、血脂的影响

2.1糖尿病大鼠模型的建立

SD雄性大鼠，SPF级，220-240g，由人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，140-170g，许可证号SCXK-(军)2002-001。以普通饲料适应性喂养5天，按体重随机分为正常对照组和造模组。其中正常对照组给予基础饲料喂养，造模组给予高糖高脂饲料(由天津医科大学动物实验中心提供)，连续8周。8周后，禁食、不禁水12h，造模组按30mg/kg剂量一次性静脉注射，给予小剂量2％链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，053K3869)溶液，建立2型糖尿病模型。STZ注射一周后，测动物空腹血糖(FBG)，选择空腹血糖≥11.1mmol/L的动物为合格模型动物。

2.2分组给药

挑选建模合格的大鼠，按血糖值和体重均匀分成10组。分别为两种工艺金芪降糖片高剂量(3.6生药g/kg)、中剂量(1.8g生药/kg)、低剂量组(0.9g生药/kg)、盐酸二甲双胍(天津中新药液集团股份有限公司，4105478)阳性对照组(92.5mg/kg)、模型对照组以及正常对照组和正常给药组，正常对照组给予蒸馏水(10ml/kg)，正常给药组(1.8g生药/kg)，每组11只。以上各组每日灌胃1次，连续灌胃10周。用药治疗期间各组糖尿病大鼠每日饲以高糖高脂饲料，正常对照组和正常给药组给予普通饲料。

于用药治疗第10周，末次给药后12h，禁食(不禁水)，眼静脉丛取血，离心10min后，分离血清分装于1.5ml离心管中，20℃冰箱冷贮待检血糖以及血脂等相关生化指标，结果见表3～表6。

2.3测试结果

2.3.1两种工艺金芪降糖片对实验性糖尿病大鼠空腹血糖影响

利用美国强生One Touch Ultra型血糖仪，分别于给药前、给药后4周、6周、8周、10周后禁食不禁水12h，检测血糖变化，采用SPSS16.0统计软件，运用单因素方差分析进行各组间比较，计算数据，结果见表2。

从表3知，各组糖尿病大鼠经本发明金芪降糖片治疗4周、6周后，高剂量组、阳性对照组与模型组比较，空腹血糖均有明显下降(P＜0.05)，至给药8、10周时，本发明金芪降糖片各剂量组、阳性对照组与模型组比较空腹血糖显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，并且给药各组在降血糖作用上呈现一定的剂量相关。正常大鼠给药组同正常对照组相比，以及自身给药前后比较均无显著性差异，说明本发明金芪降糖片对正常大鼠的血糖水平影响不明显。

从表4知，各组糖尿病大鼠经本发明金芪降糖片治疗4周后，仅高剂量组与模型组比较，空腹血糖均有明显下降(P＜0.05)；至给药8、10周时，本发明金芪降糖片各剂量组、阳性对照组与模型组比较空腹血糖均显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，而原工艺金芪降糖片仅中、高剂量与模型组比较，空腹血糖明显下降(P＜0.05，P＜0.01)；两种工艺金芪降糖片低剂量空腹血糖比较具有显著性差异(^▲P＜0.05)，说明本发明金芪降糖片在低、中剂量给药时降血糖效果优于原工艺，而在高剂量时两种工艺的产品对高糖、高脂的糖尿病大鼠的空腹血糖无显著性差异。

表4 两种工艺金芪降糖片对实验性糖尿病大鼠空腹血糖影响的比较(x±S)

*与模型组比较p＜0.05；**与模型组比较p＜0.01；

^▲本发明金芪降糖片与原工艺金芪降糖片同剂量组比较P＜0.05；

2.3.2两种工艺金芪降糖片实验性糖尿病大鼠的血脂影响

按照总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒(中生北控生物科技有限公司)说明书的具体操作，检测大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。结果见表5、表6。

表5 本发明金芪降糖片对实验性糖尿病大鼠血脂的影响(x±S)

组别	n	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)	LDL-C(mmol/L)	HDL-C(mmol/L)
						空白对照组	10	1.98±0.28**	1.36±0.48**	0.51±0.07**	0.89±0.19**
正常给药组	10	2.03±0.31**	1.41±0.46**	0.46±0.08**	1.04±0.16**
						模型对照组	9	5.65±0.84△△	2.35±0.87△△	0.94±0.50△△	0.54±0.29△△
本发明低剂量组	10	4.61±1.23*△△	1.56±0.65**△	0.79±0.24*△△	0.66±0.19**△△
						本发明中剂量组	10	4.02±0.63*△△	1.59±0.39**△	0.61±0.25**△△	0.79±0.21**
本发明高剂量组	10	3.86±0.71**△△	1.29±0.45**	0.53±0.19**	0.86±0.23**
						阳性对照组	10	3.89±1.26**△△	1.35±0.58**	0.55±0.24*	0.94±0.24**

*与模型组比较p＜0.05；**与模型组比较p＜0.01；

^△与空白对照组比较p＜0.05；^△△与空白对照组比较p＜0.01；

由表5知，给药10周后，本发明金芪降糖片各剂量组的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)浓度与模型组比较均显著降低，有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)；并且随着本发明金芪降糖片剂量的增加，总胆固醇水平的均值呈现逐步降低的趋势，降血脂作用呈现一定的量效相关性。各给药组可以部分纠正糖尿病造成的甘油三酯水平异常，使糖尿病大鼠的甘油三酯浓度达到正常大鼠的水平。正常给药组大鼠同空白对照组比较无显著性差异，说明本发明金芪降糖片对正常大鼠的总胆固醇和甘油三酯水平影响不明显。

从表5试验结果知，给药10周后，本发明金芪降糖片各剂量组的LDL-C浓度与模型组比较均显著下降，有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；随着本发明金芪降糖片剂量的增加，其LDL-C水平逐步降低。并且本发明金芪降糖片高剂量组LDL-C浓度与空白对照组比较无显著性差异(P＜0.05)，说明本发明金芪降糖片可以纠正糖尿病造成的LDL-C水平异常，使糖尿病大鼠的LDL-C浓度达到正常大鼠的水平。

本发明金芪降糖片各剂量组的HDL-C浓度与模型组比较均显有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，各剂量组升高HDL-C的作用呈现一定的量效相关性。并且本发明金芪降糖片各剂量组HDL-C浓度与空白对照组比较无显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，说明本发明金芪降糖片可以使糖尿病大鼠的HDL-C浓度达到正常大鼠的水平。正常给药组同空白对照组LDL-C、HDL-C比较均无显著性差异，说明本发明金芪降糖片对正常大鼠的LDL-C和HDL-C水平影响不明显。

表6 两种工艺金芪降糖片对实验性糖尿病大鼠血脂的影响的比较(x±S)

组别	n	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)	LDL-C(mmol/L)	HDL-C(mmol/L)
						本发明低剂量组	10	4.61±1.23*	1.56±0.65**▲	0.79±0.24*▲	0.66±0.19**▲
本发明中剂量组	10	4.02±0.63*	1.59±0.39**	0.61±0.25**	0.79±0.21**
						本发明高剂量组	10	3.86±0.71**	1.29±0.45**	0.53±0.19**	0.86±0.23**
模型对照组	9	5.65±0.84	2.35±0.87	0.94±0.50	0.54±0.29
						原工艺低剂量组	9	4.73±0.81*	1.93？±0.32*	0.89±0.35	0.56±0.15
原工艺中剂量组	10	3.97±0.78**	1.64±0.49**	0.68±0.28**	0.72±0.23**
						原工艺高剂量组	10	4.04±1.06**	1.36±0.58**	0.64±0.20**	0.89±0.29**

*与模型组比较p＜0.05；**与模型组比较p＜0.01；

^▲本发明金芪降糖片与原工艺金芪降糖片同剂量组比较P＜0.05；

从表6知，各组糖尿病大鼠经本发明金芪降糖片治疗10周后，各剂量组与模型组比较，其TC、TG、LDL-C、HDL-C值均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；而原工艺金芪降糖片各剂量组与模型组比较其TC、TG有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；但是LDL-C、HDL-C水平仅中、高剂量与模型组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。本发明与原工艺金芪降糖片比较，低剂量的TG、LDL-C、HDL-C水平具有显著性差异(^▲P＜0.05)，而在中、高剂量给药时两种工艺提取的产品对糖尿病大鼠的血脂的代谢无显著性差异。说明本发明金芪降糖片在低剂量给药时降血脂效果优于原工艺金芪降糖片，也正说明新的提取工艺在提高有效成分的基础上也显示较好地降血脂效果。

综上，本发明与原来金芪降糖片对正常小鼠的空腹血糖影响不明显。两种工艺下的金芪降糖片均可以降低四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠的血糖值，本发明金芪降糖片在低、中剂量给药时降血糖效果优于原工艺，而在高剂量时两种工艺的产品降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖作用相当。两种工艺金芪降糖片对高脂饲料喂养，并注射链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠，通过降低血清TC、TG、LDL-C，升高HDL-C水平，调节血脂的代谢作用，中、高剂量给药时本发明与原工艺工艺金芪降糖片对糖尿病大鼠的血脂的调节作用相当，在低剂量时本发明金芪降糖片的降血糖与降血脂作用优于原工艺金芪降糖片。研究表明，长期应用该制剂可以明显抑制糖尿病模型动物的血糖、血脂升高，而对正常机体血糖、血脂无明显影响。本发明的降血糖制剂与原工艺比较有效成分含量、药效作用均有所增强，且本发明制剂的剂型缩小，更便于生产保管与临床服用。

四、实施例

实施例1：黄芪总皂苷提取物的提取方法。

称取中药材黄芪1kg，碾压后剪成2～3cm长，加入5g纤维素酶，再加入4000ml pH 4.5的硫酸水，于45℃酶解2小时，调pH至中性后，加入7000ml乙醇(含醇量约60％)，回流提取两次，每次2小时。过滤、减压浓缩至无醇味，加水10000ml到已处理好的AB-8或D101大孔吸附树脂柱上(约500g树脂)，以3000ml蒸馏水洗脱糖类等水溶性杂质，以4000ml的80％乙醇洗脱黄芪皂苷，收集洗脱液，浓缩至原体积的1/4后，加入丙酮至无沉淀产生，过滤，干燥沉淀，即得黄芪总皂苷提取物。经测定，该工艺条件下黄芪的浸膏收率为15％，黄芪总皂苷的提取转移率为87％，其中黄芪甲苷占19％。实验显示通过酶解辅助提取的黄芪总皂苷比未加酶的对照组高出35％。

实施例2：黄连总生物碱提取物的提取方法。

称取中药材黄连1kg，剪切成段，长2～3cm，加入3g纤维素酶，再加入4000ml pH 4.5的硫酸水，于35℃酶解2.5小时后，过滤，收集滤液，药渣再用8倍量、0.3％硫酸水溶液冷浸提取两次，每次24小时，合并滤液，减压浓缩至3升，然后以盐酸调节pH 1～2，在搅拌下加入溶液体积8％的食盐进行盐析，静置12小时，抽滤，得沉淀物于60℃下烘干、研碎，即可得到黄连总生物碱盐酸盐成品。经测定，该工艺条件下黄连碱提取物收率达到18％，小檗碱及总生物碱提取转移得率分别为85％和87％，与传统的冷浸法相比，小檗碱及总生物碱提取率分别提高了32％和31％。

实施例3：金银花提取物的提取方法1。

称取中药材金银花1kg，加入果胶酶5g、pH 6.0柠檬酸缓冲液10000ml，于40℃酶解1.5小时后，收集酶解液，再将药材用水于70℃进行温浸提取两次，每次1小时，水的用量依次为8000ml、6000ml。合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(60℃)，待温度降低至室温，于浓缩液中加入3倍量乙醇，静置过夜，过滤，减压浓缩，干燥即得到金银花提取物。经测定，金银花的浸膏得率为20％，绿原酸的提取转移率达到73％。增加酶解辅助提取工艺方法较常规温浸法，可使绿原酸得率提高了27％。

实施例4：金银花提取物的提取方法2

称取中药材金银花1kg，加入复合酶(纤维素酶-果胶酶1∶1)2g、pH 6.0柠檬酸缓冲液10000ml，于40℃酶解1.5小时后，收集酶解液，再将药材用水于70℃进行温浸提取两次，每次1小时，水的用量依次为8000ml、6000ml。合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(60℃)，待温度降低至室温，于浓缩液中加入3倍量乙醇，静置过夜，过滤，减压浓缩，干燥即得到金银花提取物。经测定，金银花的浸膏得率为24％，绿原酸的提取转移率达到82％。与传统温浸法相比，绿原酸得率提高了34％。

实施例5：应用本发明制备的治疗糖尿病药物片剂

组分及配比：黄连343g、黄芪513g、金银花2058g、预胶化淀粉65g、微晶纤维素70g、交联羧甲基纤维素钠5.5g、羧甲基淀粉钠9g，硬脂酸镁2.5g。

制备方法：

1.将黄连挑选并除去泥土、杂物，适当剪切成段，长2～3cm，于343g黄连中加入4倍量硫酸水(pH4.5)1372ml，再加入黄连重量0.5％的纤维素酶1.715g，于50℃下温浸酶解2小时，收集温浸提取液；于酶解后的药渣加入12倍量的0.1％的硫酸水浸泡2次，每次24小时，合并酶解液与酸水浸出液、调至中性，过滤，将滤液减压浓缩至原体积的1/3；以盐酸调pH 2，搅拌下加入滤液体积8％的食盐，放置12小时，至黄色结晶析出为止，过滤、蒸馏水洗沉淀至pH6，80℃下烘干，即得黄连总生物碱产品。

2.将黄芪513g根茎碾压，加入4倍量、pH 5.0的硫酸水2052ml及生药量1.0％的纤维素酶5.13g，于40℃下酶解2小时后调至中性，再加入70％乙醇回流提取两次，每次2小时，收集滤液，减压浓缩；浓缩液上AB-8或D-101大孔吸附树脂柱，先以5倍树脂体积的蒸馏水洗，再以5倍树脂体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇液并减压浓缩至原体积的1/5；加入丙酮至无沉淀产生，过滤、收集沉淀、干燥，即得黄芪总皂苷提取物。

3.于2058g金银花中加入10倍量、pH5的柠檬酸缓冲液20580ml，再加入金银花重量的0.2％纤维素酶与果胶酶(1∶1)混合物4.116g，50℃下温浸2小时，过滤，收集酶解液；再于药材中分别加10、8倍量水20580ml、16464ml于60℃温浸提取2次(2，2小时)，收集提取液；合并酶解液与温浸提取液，过滤，减压浓缩滤液至相对密度1.10～1.20(60℃)；于上述浓缩液(冷至40℃)中加入3倍量的乙醇静置12小时，过滤，上清液经减压浓缩、干燥粉碎备用，即得到金银花的有效部位。

取上述3种粉末，加入预胶化淀粉65g，微晶纤维素70g，交联羧甲基纤维素钠5.5g，羧甲基淀粉钠9g，硬脂酸镁2.5g混合的辅料，制粒，压制成1000片，包薄膜衣，即得本发明制备的制剂。

Claims (5)

1.一种治疗糖尿病药物的制备方法，包括按重量份配比的黄连10.3份，黄芪15.4份，金银花61.8份，分别提取药物有效成分后，加入辅料，制成颗粒，压制成片，包薄膜衣制成，其特征在于药物有效成分的提取步骤为:

①黄芪总皂苷提取物的提取步骤

a.黄芪加入3～8倍量pH 3.0～6.0的硫酸水，再加入黄芪用量0.1～1.0%的纤维素酶，35～60℃酶解，收集酶解液；

b.酶解液以氢氧化钠溶液调至pH中性后，加入60～80%乙醇回流提取，收集滤液，减压浓缩；

c.浓缩液上AB-8型大孔吸附树脂柱以2～10倍树脂体积的蒸馏水洗脱，再以5～10倍树脂体积的60～80%乙醇洗脱，收集乙醇浓缩液；

d.于乙醇浓缩液中加入丙酮至无沉淀产生为止，过滤、收集、干燥沉淀剂，即得黄芪总皂苷提取物；

②黄连总生物碱的提取步骤

a.将黄连剪切成段，加入3～5倍量pH 1.0～5.0的硫酸水，再加入黄连用量0.1～1.0%的纤维素酶，30～60℃温浸，分别收集酶解液和药渣；

b.药渣以8～16倍0.1～2.0%的硫酸水溶液浸泡；得酸水浸出液；

c.将酶解液与酸水浸出液合并、过滤，浓缩；

d.以盐酸调至pH 1～4，在搅拌下加入食盐，放置至黄色结晶析出；

e.抽滤收集沉淀，蒸馏水洗沉淀至pH4～6，烘干，即得黄连总生物碱。

③金银花提取物的提取步骤

a.向金银花中加入8～12倍量pH4.0～6.0的柠檬酸缓冲液，再加入金银花用量0.1～2.0%的果胶酶，收集酶解液；

b.酶解后金银花加8～15倍量水温浸提取，收集温浸液；

c.将酶解液与温浸提取液合并，过滤，60℃减压浓缩至相对密度1.10～1.20；

d.于浓缩液中加入2～4倍量的乙醇，静置醇沉，过滤，上清液减压浓缩即得金银花提取物。

2.根据权利要求1所述治疗糖尿病药物的制备方法，其特征在于向金银花中加入8～12倍量pH4.0～6.0的柠檬酸缓冲液，再加入金银花用量0.1～2.0%的复合酶，收集酶解液，其中复合酶是由纤维素酶与果胶酶分别按1∶1、1∶2、2∶1的比例组成；酶解后金银花加8～15倍量水温浸提取，收集温浸液；将酶解液与温浸提取液合并，过滤，60℃减压浓缩至相对密度1.10 ～1.20；于浓缩液中加入2～4倍量的乙醇，静置醇沉，过滤，上清液减压浓缩即得金银花提取物。

3.根据权利要求1所述治疗糖尿病药物的制备方法，其特征在于黄芪总皂苷提取物中的黄芪浸膏收率为10～17%，黄芪总皂苷提取转移率为65～88%，其中黄芪甲苷含量占5～19%。

4.根据权利要求1所述治疗糖尿病药物的制备方法，其特征在于黄连总生物碱提取物中的黄连总生物碱粗品得率为10～25%，黄连总生物碱提取转移率为70～90%，盐酸小檗碱提取转移率为50～90%。

5.根据权利要求1所述治疗糖尿病药物的制备方法，其特征在于金银花提取物中金银花浸膏得率为15～40%，绿原酸提取转移率为50～90%。

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