CN101680878B - 幼稚白细胞分析用试剂及分析用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种幼稚白细胞分析用试剂，其包括损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损血细胞收缩的助溶剂及选自式(I)表示的色素和式(II)表示的色素中的至少1种核酸染色色素。

上述式(I)和(II)中，X^-是阴离子。

Description

幼稚白细胞分析用试剂及分析用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于对从生物体采集的试样中的白细胞进行分类并计数的试剂及试剂盒。

背景技术

血细胞在骨髓中产生，由未成熟细胞分化、成熟后移动到末梢血液。对于健康人，末梢血液中不会出现未成熟白细胞(幼稚白细胞)。另一方面，白血病、癌的骨髓转移、多发性骨髓瘤、重症感染症等患者的末梢血液中有时出现幼稚白细胞。因此，将生物试样中的成熟白细胞及幼稚白细胞分类并进行测定在这些疾病的诊断中具有非常重要的意义。

作为用于测定幼稚白细胞的试剂，已知日本特开平10-206423号(专利文献1)中公开的试剂。将混合该试剂和生物试样而得的测定试样导入流式细胞仪，照射特定波长的光，基于得到的光学信息，对检测体中的成熟白细胞和幼稚白细胞进行分类，并分别计数。另外，还可以将幼稚白细胞细分为原粒细胞、幼稚粒细胞等，并分别计数。专利文献1：日本特开平10-206423号公报

发明内容

发明要解决的技术问题

但是，在使用现有的试剂的血细胞分析中，应分类的幼稚白细胞中原粒细胞的信号区域和溶血的红细胞的碎片(红细胞影)的信号区域部分重叠。其结果，在散点图中在重叠区域检测出原粒细胞和红细胞的碎片，从而使原粒细胞的检测量比实际多。例如，在患有多发性骨髓瘤、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、肾小球肾炎、胸膜炎等特定疾病的患者的末梢血液中不含有原粒细胞。但是，如果使用现有的分析试剂对这些患者的血液试样进行分析，则会将红细胞的碎片的信号误认为是原粒细胞的信号，从而不能得到正确的血细胞分析结果。出现这种情况的原因被认为可能是：来自所述特定患者的试样中所含的红细胞与健康人及所述疾病以外的疾病患者的试样中的红细胞不同，不能顺利地溶血。如果在末梢血液中检测出比实际量多的原粒细胞，则可能不能进行正确的诊断和治疗。需要说明的是，在本说明书中，所谓“红细胞影”，是指血液试样与血液分析用试剂反应而丧失血红素、但没有充分收缩的红细胞。

因此，本发明的课题在于，提供一种即使为从所述特定疾病的患者采集的血液试样，也可以更准确地进行幼稚白细胞的分类及计数的试剂。

解决问题的技术方案

为了解决所述问题，本发明人等进行了反复研究，结果发现，通过使用含有选自下式(I)表示的色素及下式(II)表示的色素中的至少1种核酸染色色素的试剂，可以解决所述课题。[化I]

(式中，X^-为阴离子。)

[化2]

(式中，X^-为阴离子。)

因此，本发明的一个方面提供一种幼稚白细胞的分析用试剂，其中，包括损伤红细胞和成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂和使损伤的血细胞收缩的助溶剂和选自所述式(I)表示的色素及式(II)表示的色素中的至少1种的核酸染色色素。

另外，本发明的另一个方面提供一种幼稚白细胞的分析用试剂盒，其中，包括第1试剂和第2试剂，所述第1试剂含有损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂和使损伤的血细胞收缩的助溶剂，所述第2试剂含有选自所述式(I)表示的色素及式(II)表示的色素中的至少1种核酸染色色素。

发明效果

通过使用本发明的幼稚白细胞的分析用试剂及试剂盒，即使为患有多发性骨髓瘤、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、肾小球肾炎、胸膜炎等特定疾病的患者的生物试样，也可以进行比现有的试剂更准确的幼稚白细胞及成熟白细胞的分类和计数。

附图说明

图1是表示使用本发明的试剂或试剂盒对幼稚白细胞进行分析时可以使用的流式细胞仪的一例的模式图。图2表示实施例3中所得的散点图。图3表示实施例4中所得的散点图。图4表示实施例5中所得的散点图。图5表示实施例6中所得的散点图。图6表示实施例7中所得的散点图。

符号说明

6：喷嘴21：光源22：准直透镜23：流动池24：聚光镜25：针孔板26：前向散射光检测器27：聚光镜28：分色镜28’：滤光器29：侧向散射光检测器30：针孔板31：侧向荧光检测器32、33、34：放大器35：分析部

具体实施方式

使用本实施方式的幼稚白细胞的分析用试剂(以下也称为“试剂”)时，可以将生物试样中所含的白细胞分为成熟白细胞和幼稚白细胞，并分别计数。另外，可以将成熟白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等至少2种以上，并分别计数。进而，使用该试剂时，还可以将幼稚白细胞细分为幼稚粒细胞和原粒细胞，并进行精确计数。

在本说明书中，所谓“幼稚白细胞”，是指不存在于健康人的末梢血液中而只存在于骨髓中的未成熟白细胞。作为幼稚白细胞，例如可举出：原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞等。早幼粒细胞、中幼粒细胞及晚幼粒细胞有时统称为“幼稚粒细胞”。原粒细胞包含骨髓干细胞(CFU-GEMN)、嗜中性粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(CFU-GM)、嗜酸性粒细胞集落形成细胞(CFU-EOS)等白细胞系造血前体细胞。

作为使用本实施方式的试剂进行分析的生物试样，只要是含有白细胞的试样，就没有特别限定，可以例示血液、尿、骨髓穿刺液、通过血浆分离置换法采集的试样等。

本实施方式的试剂包含损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使损伤的血细胞收缩的助溶剂、选自所述式(I)及式(II)表示的色素中的核酸染色色素。混合生物试样和试剂时，由于表面活性剂的作用，试样中所含的血细胞的细胞膜受到损伤。该表面活性剂容易导致红细胞及成熟白细胞的细胞膜损伤，但难以使幼稚白细胞的细胞膜实质上损伤。红细胞及成熟白细胞等受损的血细胞在助溶剂的作用下收缩。另一方面，由于幼稚白细胞的细胞膜几乎不被损伤，因此，与红细胞及成熟白细胞相比，难以发生由助溶剂引起的细胞收缩。受损的血细胞中，由于核酸染色色素的作用，使白细胞核容易被强染色。但是，未受损的幼稚白细胞难以被染色。另外，由于红细胞不具有核，因此难以被所述核酸染色色素染色。因此，可以分别区分幼稚白细胞、成熟白细胞、红细胞。

由所述说明可知，通过使用含有选自所述式(I)及式(II)的色素中的至少1种核酸染色色素的试剂，即使是来自患有多发性骨髓瘤、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、肾小球肾炎、胸膜炎等特定疾病的患者的生物试样，也可以明确区分红细胞的碎片和应测定的血细胞。另外，即使是使用含有原粒细胞的血液试样的情况，也可以更明确地区分原粒细胞和红细胞的碎片。另外，即使是来自患有所述特定疾病以外的疾病的患者的生物试样，本试剂也可以与目前的试剂同样地明确区分幼稚白细胞与成熟白细胞。

在所述核酸染色色素的式(I)及式(II)中，作为X^-阴离子，可以举出：卤离子(氟、氯、溴或碘离子)、卤化硼离子(BF₄ ^-、BCl₄ ^-、BBr₄ ^-等)、磷化合物离子、卤氧酸离子、含氟硫酸离子、甲基硫酸离子、具有芳香环卤素或含卤素烷基作为取代基的四苯基硼化合物离子等。其中，优选碘离子。

所述色素在试剂中的浓度优选为0.01～500ppm，更优选为0.1～200ppm。

损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂优选至少2种表面活性剂。更优选使用2种表面活性剂。通过使用2种以上表面活性剂，可以更明确地区分幼稚白细胞及成熟白细胞。

所述表面活性剂中的至少1种优选为非离子表面活性剂。更优选所使用的所有种类的表面活性剂均为非离子表面活性剂。该非离子表面活性剂优选为聚氧乙烯系非离子表面活性剂，更优选为下式(III)表示的聚氧乙烯系非离子表面活性剂。R¹-R²-(CH₂CH₂O)_n-H(III)(式中，R¹为碳数9～25的烷基、烯基或炔基，R²为-O-、-COO-或下式[化3]表示的基团：[化3]

n表示10～40的整数)

作为所述式(III)表示的表面活性剂，可以举出：聚氧乙烯(15)油基醚、聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯(15)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚等。

本实施方式的试剂中使用的表面活性剂优选为聚氧乙烯油基醚及聚氧乙烯硬脂基醚，特别优选至少1种为聚氧乙烯油基醚。另外，该聚氧乙烯油基醚及聚氧乙烯硬脂基醚更优选具有n为15～20的式(III)。进一步优选所述聚氧乙烯油基醚为聚氧乙烯(15)油基醚或聚氧乙烯(20)油基醚。作为所述表面活性剂的组合，可以例示：聚氧乙烯(15)油基醚和聚氧乙烯(20)油基醚的组合、或聚氧乙烯(15)油基醚和聚氧乙烯(20)硬脂基醚的组合。

试剂中的表面活性剂的浓度可以根据表面活性剂的种类适当选择。1种或多种表面活性剂在试剂中的浓度优选合计为500～50000ppm，更优选为3500～35000ppm。表面活性剂中的至少1种为聚氧乙烯油基醚时，1种或多种表面活性剂在试剂中的浓度优选合计为500～50000ppm，更优选为3500～35000ppm。使用聚氧乙烯(15)油基醚和聚氧乙烯(20)油基醚作为所述表面活性剂时，它们在试剂中的浓度优选合计为500～50000ppm，更优选为3500～35000ppm。

使用多个表面活性剂时，这些表面活性剂的混合比可以根据表面活性剂的羟基值适当选择。例如，使用羟基值为64.8的聚氧乙烯(15)油基醚和羟基值为52.4的聚氧乙烯(20)油基醚时，优选混合比为1∶1。使用多个表面活性剂、且其至少1种为聚氧乙烯油基醚时，该聚氧乙烯油基醚优选以超过多个表面活性剂的总量的50％的量使用。由此，可以更明确地区分幼稚白细胞和成熟白细胞。

作为所述助溶剂，例如可举出：肌氨酸衍生物、胆酸衍生物、甲基葡聚糖酰胺等。可以使用选自它们中的1种或多种。作为肌氨酸衍生物，包含以下结构式所示的肌氨酸衍生物及其盐。具体可以举出：N-月桂酰基肌氨酸钠、月桂酰基甲基β-丙氨酸钠、月桂酰基肌氨酸等。作为胆酸衍生物，包含以下结构式所示的胆酸衍生物及其盐。具体可以举出：CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-丙磺酸)、CHAPSO([(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)等。作为甲基葡聚糖酰胺，可以举出：MEGA8(辛酰基-N-甲基葡糖酰胺)、MEGA9(壬酰基-N-甲基葡糖酰胺)、MEGA10(癸酰基-N-甲基葡糖酰胺)等。

肌氨酸衍生物具有以下结构式。[化4]

(式中，R₁为C_10-22的烷基，n为1～5。)

胆酸衍生物具有以下结构式。[化5]

(式中，R₁为氢原子或羟基。)

甲基葡聚糖酰胺具有以下结构式。[化6]

(式中，n为5～7。)

助溶剂在试剂中的浓度可以根据所使用的助溶剂的种类适当选择。使用肌氨酸衍生物作为助溶剂时，试剂中的助溶剂的浓度优选为50～3000ppm。使用胆酸衍生物时，优选为100～10000ppm。使用甲基葡聚糖酰胺时，优选为1000～8000ppm。

另外，作为助溶剂，还可以使用正辛基β-葡萄糖苷、蔗糖单癸酸酯、N-甲酰基甲基亮氨酰丙氨酸等。使用这些助溶剂时，其在试剂中的浓度优选为10～50000ppm。助溶剂可以单独使用也可以并用2种以上。

试剂的渗透压没有特别限定，优选为10～600mOsm/kg。试剂的渗透压可以通过加入糖类、氨基酸、氯化钠等方式进行适当调节。另外，还可以通过调节缓冲剂的浓度的方式来调节。作为糖类，没有特别限定，可以举出：单糖类(例如葡萄糖、果糖等)、多糖类(例如阿拉伯糖等)、糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、核醣醇等)等。糖类更优选使用选自木糖醇、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露醇糖、山梨糖醇、核醣醇中的至少1种。

试剂中的糖类的浓度可以根据所期望的渗透压适当选择。例如使用木糖醇时，优选在试剂中为0～75g/L，更优选为20～50g/L。

作为所述氨基酸，可以举出：缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸等。氨基酸优选使用选自缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸及丙氨酸中的至少1种，更优选使用甘氨酸及丙氨酸中的任一种或两种。

试剂中的氨基酸的浓度可以根据所期望的渗透压适当选择。例如使用甘氨酸时，优选在试剂中为0～50g/L，更优选为10～30g/L。

为了如上所述调节渗透压，本实施方式的试剂还可以含有氯化钠。但是，如果试剂中含有大量的氯化钠，则试剂和生物试样混合后，反应时间越长或反应温度越高，越会促进幼稚白细胞中原粒细胞的损伤，导致原粒细胞核被染色。原粒细胞被染色后，检测出的荧光强度与成熟白细胞的荧光强度相同，从而使成熟白细胞和原粒细胞的分类的精度降低。因此，为了不给测定带来不良影响，试剂中的氯化钠的浓度优选为0.01～3g/L，更优选为0g/L(不含有)。

本实施方式的试剂的pH优选为5.0～9.0。试剂的pH可以通过添加缓冲剂来调节。作为缓冲剂，例如可以使用HEPES等性能良好的缓冲剂、磷酸缓冲剂等和氢氧化钠等pH调节剂等。

本实施方式的试剂可以通过使所述表面活性剂、助溶剂、核酸染色色素和根据需要选择的任意成分以至所述浓度的方式溶解于适当的溶剂中而得到。作为所述适当的溶剂，只要是可以溶解所述成分的溶剂，就没有特别限定，可以举出：水、乙醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)及这些溶剂的混合溶液等。

可以将所述表面活性剂、助溶剂及核酸染色色素如上所述以单独的试剂与生物试样混合而进行幼稚白细胞的分析。或者，可以以包括含有表面活性剂和助溶剂的第1试剂及含有核酸染色色素的第2试剂的试剂盒使用，用于幼稚白细胞的分析。因此，本发明还提供一种包含第1试剂和第2试剂的幼稚白细胞的分析用试剂盒，其中，所述第1试剂含有损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂和使损伤的血细胞收缩的助溶剂，所述第2试剂含有选自所述式(I)表示的色素及式(II)表示的色素中的至少1种核酸染色色素。

所述第1试剂中的表面活性剂及助溶剂的浓度，为在与第2试剂混合时，至所述幼稚白细胞的分析用试剂中所述的浓度即可。该第1试剂可以通过将表面活性剂及助溶剂溶解于如上所述的适当的溶剂中而得到。

所述第2试剂中的核酸染色色素的浓度，为在与第1试剂混合时，至所述幼稚白细胞的分析用试剂中所述的浓度即可。第2试剂由于可以提高色素的保存稳定性，因此，优选将核酸染色色素溶解于乙二醇等有机溶剂中而得的试剂。

所述试剂及试剂盒可以通过与生物试样混合，制备测定用试样，并供给到流式细胞仪中，从而进行幼稚白细胞的分析。生物试样与该试剂或试剂盒的第1试剂和第2试剂的总和的混合比(容量比)优选为1∶10～1∶1000。另外，试剂盒中，第1试剂与第2试剂的混合比(容量比)优选为1000∶1～10∶1。

使用所述试剂盒时，试剂盒的各试剂与生物试样的混合顺序没有特别限定，优选将第1试剂及第2试剂混合后，再与生物试样混合。

所述试剂或试剂盒与生物试样的混合优选在20～40℃的温度下进行3～15秒。反应温度高时，可以使反应时间变短，反应温度低时，可以使反应时间变长。

在所述分析中使用流式细胞仪时，对在流动池中流动的测定试样中的血细胞照射光，获得散射光及荧光等的光学信息，以此为基础，可以测定血细胞的种类及数目。

具体而言，所述分析可以使用如图1所示的流式细胞仪进行。以下，基于图1，对作为本实施方式的一例的原粒细胞的测定进行详细说明。由喷嘴6喷出的测定用试样流过流动池23的孔部。此时，试样中的血细胞排成一列通过孔部。从光源21发出的光经由准直透镜22照射流过流动池23的血细胞。通过对血细胞照射光，产生侧向散射光、侧向荧光及前向散射光。侧向散射光经由聚光镜27和分色镜28入射到侧向散射光检测器(光电倍增管)29中。侧向荧光经由聚光镜27、分色镜28、滤光器28’和针孔板30入射到侧向荧光检测器(光电倍增管)31中。前向散射光经由聚光镜24和针孔板25入射到前向散射光检测器(光电二极管)26中。

由前向散射光检测器26输出的前向散射光信号、由侧向散射光检测器29输出的侧向散射光信号和由侧向荧光检测器31输出的侧向荧光信号分别由放大器32、放大器33及放大器34放大后输入到分析部35中。

分析部35根据收到的前向散射光信号、侧向散射光信号及侧向荧光信号计算出前向散射光强度、侧向散射光强度及荧光强度。分析部35制作以前向散射光强度及荧光强度为二轴的第一个二维分布图，并在该二维分布图上确定试样中的总白细胞出现的区域(总白细胞区域)。再对出现在该总白细胞区域的细胞制作以侧向散射光强度及荧光强度为二轴的第二个二维分布图。在该二维分布图上设定成熟白细胞出现的区域(成熟白细胞区域)、淋巴细胞出现的区域(淋巴细胞区域)、单核细胞出现的区域(单核细胞区域)、粒细胞出现的区域(粒细胞区域)。进而，确定原粒细胞出现的区域(原粒细胞区域1)及幼稚粒细胞出现的区域(幼稚粒细胞区域)。

接着，制作以侧向散射光及前向散射光为二轴的第三个二维分布图，在该二维分布图上确定原粒细胞出现的区域(原粒细胞区域2)。将在原粒细胞区域1及原粒细胞区域2中出现的细胞数作为试样中所含的原粒细胞数进行计数，将在幼稚粒细胞区域中出现的细胞数作为试样中所含的幼稚粒细胞数进行计数。需要说明的是，由于原粒细胞的细胞尺寸大，为单核，因此，前向散射光强度强而侧向散射光强度弱。另外，由于如上所述几乎未被染色，因此荧光强度弱。由于幼稚粒细胞的细胞尺寸大，核分叶，因此，前向散射光强度及侧向散射光强度强。另外，由于如上所述几乎未被染色，因此荧光强度弱。

实施例

下面通过实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于以下实施例。(实施例1)制备以下组成的第1试剂及第2试剂。<第1试剂>聚氧乙烯(15)油基醚(日光Chemicals)    12500ppm聚氧乙烯(20)油基醚(日光Chemicals)    12500ppmN-月桂酰基肌氨酸钠(市售品)    750ppm木糖醇(市售品)                35.5g/LHEPES(市售品)                 30mM纯化水                        1L将所述各成分混合后添加NaOH，将pH调节至7.0。第1试剂的渗透压为300mOsm/kg，导电度为0.59mS/cm。

<第2试剂>核酸染色色素                    50ppm乙二醇                          1L将色素溶解于乙二醇中，制备第2试剂。需要说明的是，核酸染色色素使用表1所示的式表示的色素(NK-321)。

将第1试剂980μL、第2试剂20μL及从多发性骨髓瘤患者上采集的不含原粒细胞的血液试样20μL混合，在35℃下反应7秒，得到测定用试样。使用得到的测定用试样，用图1所示的流式细胞仪测定侧向散射光强度、前向散射光强度及荧光强度。需要说明的是，光源使用红光半导体激光。

基于得到的前向散射光强度及荧光强度，制作以前向散射光强度及荧光强度为二轴的第一个二维分布图(未图示)。基于该第一个二维分布图，确定总白细胞区域(未图示)。将在所确定的总白细胞区域中出现的细胞数作为试样中所含的总白细胞数进行计数。以在所确定的总白细胞区域中出现的细胞为对象，制作以侧向散射光强度及荧光强度为二轴的第二个二维分布图(散点图)。在该散点图中，可以将侧向散射光强度小、荧光强度小的区域确定为原粒细胞区域。所得的散点图如表1所示。在表1中，散点图的横轴表示侧向散射光强度，纵轴表示荧光强度。另外，散点图中的“Ly”表示淋巴细胞出现的区域，“Mo”表示单核细胞出现的区域，“Gran”表示粒细胞出现的区域，“BL”表示原粒细胞出现的区域，“IG”表示幼稚粒细胞出现的区域。在实施例1中，在散点图上，在原粒细胞区域几乎检测不到信号。

(实施例2)除将第2试剂的核酸染色色素变更为表1所示的式表示的色素以外，与实施例1同样操作，进行分析。得到的散点图如表1所示。

[表1]

(比较例1～23)除将第2试剂的色素变更为表2所示的色素以外，与实施例1同样操作，进行分析。得到的散点图如表2所示。

(表2-1)

(表2-2)

(表2-3)

(表2-4)

由上述结果可知，在实施例1及实施例2中，通过使用含有上述特定的色素的幼稚白细胞的分析用试剂时，即使为从多发性骨髓瘤患者上采集的血液，也可以将原粒细胞和溶血的红细胞的碎片(红细胞影)分类，并计数。另一方面，使用比较例的试剂时，可知，原粒细胞的信号和红细胞影的信号或其它细胞的信号在散点图中重叠，不能明确区分。

(实施例3)除实施例1中所述的第1试剂和将核酸染色色素的浓度变更为100ppm以外，制备与实施例1相同的第2试剂。将第1试剂980μL、第2试剂20μL及以下任一种检测体20μL混合，在35℃下反应7秒，得到测定用试样，与实施例1同样操作，制作散点图。作为检测体，使用含有原粒细胞的白血病患者的血液(以下也称为“原粒细胞试样”)、或不含有原粒细胞的多发性骨髓瘤患者的血液(红细胞发生溶血不良)(以下也称为“溶血不良试样”)。

基于得到的散点图，按照以下步骤计算相对总白细胞数的原粒细胞的比率(原粒细胞比率＝原粒细胞/总白细胞数×100)。基于测定试样中的颗粒的前向散射光强度及荧光强度，制作以前向散射光强度及荧光强度为二轴的第一个二维分布图(散点图)。基于该第一个散点图，确定总白细胞区域。将在所确定的总白细胞区域中出现的细胞数作为试样中所含的总白细胞数进行计数。以在总白细胞区域中出现的细胞为对象，制作以侧向散射光强度及荧光强度为二轴的第二个散点图和以侧向散射光强度及前向散射光强度为二轴的第三个散点图。在第二个散点图上设定原粒细胞区域1，在第三个二维分布上图设定原粒细胞区域2。并且，将所设定的原粒细胞区域1和原粒细胞区域2两个区域中出现的细胞数作为试样中所含的原粒细胞数进行计数。计算相对总白细胞数的原粒细胞的比率(原粒细胞比率＝原粒细胞/总白细胞数×100)。

得到的散点图及相对总白细胞数的原粒细胞的比率(以下称为“BL区域”)如图2所示。图2中显示了使用(A)原粒细胞试样、(B)溶血不良的试样时的结果。由这些结果可知，在使用本发明的分析用试剂测定原粒细胞试样的结果和测定溶血不良的试样的结果中，原粒细胞区域和红细胞影区域在散点图上没有重叠。另外可知，在原粒细胞试样中检测出原粒细胞，在溶血不良的试样中，原粒细胞的比率极低。即，使用本发明的分析用试剂时，即使为来自像多发性骨髓瘤这样的疾病的患者的血液，在散点图上在原粒细胞区域中也不出现红细胞影，因此，可以将原粒细胞从红细胞影中明确区别开，从而可以准确测定幼稚白细胞。

(实施例4～7)制备以下的表3所示的组成的第1试剂及第2试剂。

将第1试剂980μL、第2试剂20μL及白血病患者的血液试样20μL混合，在35℃下反应13秒(实施例4为7秒)，得到测定用试样，与实施例1同样操作，制作散点图。各实施例中的A和B，使用从同一患者上采集的血液作为试样。需要说明的是，各实施例中使用了分别来自不同白血病患者的血液。

实施例4～7中所得的的散点图分别示于图3～6。在这些图中，(A)及(B)为分别相当于各实施例的A及B的试样的结果。在这些散点图中，横轴表示侧向散射光强度，纵轴表示荧光强度。另外，图3～6中，将与实施例3同样操作计算得到的相对总白细胞数的原粒细胞比率作为“BL区域”表示。在各图中，散点图的横轴表示侧向散射光强度，纵轴表示荧光强度。

由实施例4～7的结果可知，即使本发明的分析用试剂中的表面活性剂的合计浓度、或2种表面活性剂的混合比改变，也不会引起试样中的红细胞的溶血不良，可以确定原粒细胞区域。

本申请与2007年6月25日申请的日本专利申请特愿2007-166639号有关，其专利权利要求范围、说明书、附图及摘要均作为参考并入本说明书中。

Claims (13)

1.一种幼稚白细胞的分析用试剂，其中，包括损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂、使受损的血细胞收缩的助溶剂、及选自下式(I)表示的色素及下式(II)表示的色素中的至少1种核酸染色色素，

式中，X^-为阴离子，

式中，X^-为阴离子，

其中，所述表面活性剂为聚氧乙烯系非离子表面活性剂，所述助溶剂为选自肌氨酸衍生物、胆酸衍生物及甲基葡聚糖酰胺中的至少1种。

2.权利要求1的分析用试剂，其中，所述表面活性剂为至少2种表面活性剂。

3.权利要求1的分析用试剂，其中，所述聚氧乙烯系非离子表面活性剂为下式(III)表示的聚氧乙烯系非离子表面活性剂，

R¹-R²-(CH₂CH₂O)_n-H    (III)

式中，R¹为碳数9～25的烷基、烯基或炔基，R²为-O-、-COO-或[化3]表示的基团，n为10～40的整数，

[化3]

4.权利要求3的分析用试剂，其中，所述聚氧乙烯系非离子表面活性剂为聚氧乙烯油基醚或聚氧乙烯硬脂基醚。

5.权利要求4的分析用试剂，其中，所述聚氧乙烯油基醚是具有n为15～20的式(III)的聚氧乙烯油基醚。

6.权利要求1的分析用试剂，其中，所述表面活性剂为聚氧乙烯(15)油基醚和聚氧乙烯(20)油基醚的组合或聚氧乙烯(15)油基醚和聚氧乙烯(20)硬脂基醚的组合。

7.权利要求1的分析用试剂，其中，pH为5.0～9.0。

8.权利要求1的分析用试剂，其中，还含有糖类。

9.权利要求8的分析用试剂，其中，糖类为选自木糖醇、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、核醣醇中的至少1种。

10.权利要求1的分析用试剂，其中，还含有氨基酸。

11.权利要求10所述的分析用试剂，其中，所述氨基酸为选自缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸及丙氨酸中的至少1种。

12.一种幼稚白细胞的分析用试剂盒，其中，包括第1试剂及第2试剂，所述第1试剂含有损伤红细胞及成熟白细胞的细胞膜的表面活性剂和使受损的血细胞收缩的助溶剂，所述第2试剂含有选自下式(I)表示的色素及下式(II)表示的色素中的至少1种核酸染色色素，

式中，X^-为阴离子，

式中，X^-为阴离子，

其中，所述表面活性剂为聚氧乙烯系非离子表面活性剂，所述助溶剂为选自肌氨酸衍生物、胆酸衍生物及甲基葡聚糖酰胺中的至少1种。

13.权利要求12的分析用试剂盒，其中，所述第1试剂至少含有2种表面活性剂。

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