CN101676405A - 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，用于结核分枝杆菌核苷酸片段的PCR扩增引物和探针序列。引物序列包括：由上游引物TBpf136序列和下游引物TBpr244序列组成的引物对，以及上游引物的互补序列和下游引物的互补序列，还包括上游引物TBpf136位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物TBpr244位置向3’及5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：由探针TBpb187序列及互补序列，向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。此方法可用于结核分枝杆菌定量检测，具有实际的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型结核分枝杆菌(M.tuberculosis)血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。
近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高。虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊；动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要。近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交。该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用。上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势。
荧光PCR是在普通PCR基础上，在扩增反应体系中加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为两端标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，从而检测不到该探针荧光基团所发出的荧光信号，而在PCR扩增时，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反映体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，此时可以检测到荧光报告基团的荧光信号，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比。
因此荧光PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得到了广泛应用，其特异性强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室。
发明内容
本发明目的在于提供一种精确简便的用于定量结核分枝杆菌的方法；本发明的另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于检测结核分枝杆菌核苷酸片段的引物及探针序列包括：
引物序列包括：由上游引物TBpf136序列为TGTGCTCCTTGAGTTCGCCAT和下游引物TBpr244序列为GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT组成的引物对，以及上游引物的互补序ATGGCGAACTCAAGGAGCACA和下游引物的互补序列GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT，还包括上游引物TBpf136位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物TBpr244位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。
探针序列包括：由探针TBpb187序列为ACACTTTGCGGGCACCGTAAA及互补序列TTTACGGTGCCCGCAAAGTGT，向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。
本发明采用以下技术方案：分析所有已报道的结核分枝杆菌的基因组序列，选择了一组高度保守的基因序列，并分别设计引物和荧光探针。在常规PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团(R)标记在探针的5’端，荧光淬灭基团(Q)标记在3’端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降解，荧光淬灭基团(Q)的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行结核分枝杆菌的检测。
本发明的优点：
1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000copies/ml，说明其具有良好的灵敏度。
2)本发明提供的引物和探针对于不含有结核分枝杆菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
3)由于本发明采用结核分枝杆菌高度保守的IS6110特异性基因作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。
4)由于本发明采用了荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
具体实施方式
1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的结核分枝杆菌基因组序列及进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(结核杆菌IS6110特异性基因，其序列见附录)，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内尽量避免有互补序列。最优引物、探针序列组合如下：
上游引物TBpf136：TGTGCTCCTTGAGTTCGCCAT
下游引物TBpr244：GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT
荧光探针TBpb187：ACACTTTGCGGGCACCGTAAA
2.反应体系的建立和优化：反应体系得建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：利用结核分枝杆菌减毒株作为待检样品，利用碱热裂解法的提取方法提取结核分枝杆菌DNA。
2.1引物浓度的优化 在反应体系中其他条件相同的情况下，将TB的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.0μmol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2μmol/L。
2.2探针浓度的优化 在反应体系中其他条件相同的情况下，将TB的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2μmol/L。
2.3镁离子浓度的优化 在反应体系中其他条件不变的前提下，将镁离子浓度从1.0mmol/L至4mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的镁离子浓度为3.0mmol/L。
2.4 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化 通过比较Taq酶用量(以单位U计)的优化试验结果，选定2U为最佳Taq酶用量。
2.5 dNTPs浓度的优化 在反应体系中，将dNTPs浓度从0.1mmol/L至1mmol/L以0.1mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的dNTPs浓度为0.3mmol/L。
利用上述引物、探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光定量PCR反应体系为50μL，所需各组分及相应浓度见表1。
表1 优化后的PCR反应体系
| 组分 | 终浓度 |
| 10×PCR反应缓冲液 | 1× |
| 上游引物浓度 | 0.2μmol/L |
| 下游引物浓度 | 0.2μmol/L |
| 探针浓度 | 0.2μmol/L |
| 镁离子浓度 | 3.0mmol/L |
| dNTPs浓度 | 0.3mmol/L |
| Taq酶用量 | 2U |
| 模板 | 3μL |
| 补水至 | 50μL |
注：1)在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整；
2)使用的仪器不同时，应将反应参数作适当调整。
3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
4.PCR反应条件如下：
93℃→2分钟，1个循环
93℃ 40秒→56℃ 45秒，10个循环
93℃ 30秒→55℃ 40秒，30个循环。(采集荧光信号)
5.检测步骤
5.1选取引物和探针；
5.2制备待测模板，可采用碱热裂解方法提取结核分枝杆菌DNA；
5.3反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定最佳探针浓度；c、确定最佳镁离子浓度；d、确定最佳Taq使用量；e、确定最佳dNTPs浓度；
5.4选择仪器的检测方式
5.5上机检测。
6.实施例1----结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
选取引物对TBpf136/TBpr244和探针TBpb187，将待检的结核杆菌减毒株培养物用碱热裂解方法提取基因组DNA。具体步骤如下：
1)将待检的结核分枝杆菌减毒株培养物充分混匀，取0.5ml转至1.5ml干净离心管；
2)加入等体积4％NaOH，充分混匀，室温放置10min；
3)12,000rpm离心5分钟，弃上清；
4)沉淀加30μl核酸提取液(DNA)，充分混匀；
5)最后100℃处理10分钟，12,000rpm离心5分钟；
6)取上清液3μl做PCR反应。
在50μl荧光PCR反应体系中，加入以上提取的结核杆菌基因组DNA 3μl，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待测培养物中含有结核分枝杆菌则显示阳性扩增曲线(见图1)，其检测灵敏度可达1×103copies/ml。若待检样本中不含结核分枝杆菌则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度及特异性(灵敏度试验结果见图2，特异性试验结果见图3)。
实施例2----临床检测
用上述方法对135例临床样本进行检测，其中结核分枝杆菌患者63例，检出阳性率99％，准确率98.4％，并且能够对结核分枝杆菌进行准确定量分析，远远优于酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对结核分枝杆菌进行快速定量检测。此外结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是结核分枝杆菌阳性扩增曲线图
图2是灵敏度试验结果图
图3是特异性试验结果图
附录
结核分枝杆菌IS6110特异性基因
1 TTGCGGTGGG GTGTCGAGTC GATCTGCACA CAGCTGACCG AGCTGGGTGT GCCGATCGCC
61 CCATCGACCT ACTACGACCA CATCAACCGG GAGCCCAGCC GCCGCGAGCT GCGCGATGGC
121 GAACTCAAGG AGCACATCAG CCGCGTCCAC GCCGCCAACT ACGGTGTTTA CGGTGCCCGC
181 AAAGTGTGGC TAACCCTGAA CCGTGAGGGC ATCGAGGTGG CCAGATGCAC CGTCGAACGG
241 CTGATGACCA AACTCGGCCT GTCCGGGACC ACCCGCGGCA AAGCCCGCAG GACCACGATC
301 GCTGATCCGG CCACAGCCCG TCCCGCCGAT CTCGTCCAGC GCCGCTTCGG ACCACCAGCA
361 CCTAACCGGC TGTGGGTAGC AGACCTCACC TATGTGTCGA CCTGGGCAGG GTTCGCCTAC
421 GTGGCCTTTG TCACCGACGC CTACGCTCGC AGGATCCTGG GCTGGCGGGT CGCTTCCACG
481 ATGGCCACCT CCATGGTCCT CGACGCGATC GAGCAAGCCA TCTGGACCCG CCAACAAGAA
541 GGCGTACTCG ACCTGAAAGA CGTTATCCAC CATACGGATA GGGGATCTCA GTACACATCG
601 ATCCGGTTCA GCGAGCGGCT CGCCGAGGCA GGCATCCAAC CGTCGGTCGG AGCGGTCGGA
661 AGCTCCTATG ACAATGCACT AGCCGAGACG ATCAACGGCC TATACAAGAC CGAGCTGATC
721 AAACCCGGCA AGCCCTGGCG GTCCATCGAG GATGTCGAGT TGGCCACCGC GCGCTGGGTC
781 GACTGGTTCA ACCATCGCCG CCTCTACCAG TACTGCGGCG ACGTCCCGCC GGTCGAACTC
841 GAGGCTGCCT ACTACGCTCA ACGCCAGAGA CCAGCCGCCG GCTGA
序列表
<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司
<120>结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
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<170>PatentIn version 3.3
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Claims (4)
1.一种用于结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒与结核分枝杆菌荧光PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物TBpf136序列为TGTGCTCCTTGAGTTCGCCAT和下游引物TBpr244序列为GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT组成的引物对，以及上游引物的互补序列ATGGCGAACTCAAGGAGCACA和下游引物的互补序列GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT。
2.根据权利要求1所述的用于结核分枝杆菌荧光PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物TBpf136位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物TBpr244位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。
3.一种用于结核分枝杆菌荧光PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针TBpb187序列为ACACTTTGCGGGCACCGTAAA，以及其互补序列TTTACGGTGCCCGCAAAGTGT。
4.根据权利要求3所述的用于结核分枝杆菌荧光PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列由探针TBpb187向3’端方向延伸10个碱基，向5’向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100324 |