CN101675160A - 蛋白质水解产物稳定金属蛋白酶洗涤剂制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含金属蛋白酶和蛋白质水解产物抑制剂的组合物和制剂，其展示出升高的储存稳定性。在一个实施方案中，本发明提供了包含至少一种金属蛋白酶(例如，芽孢杆菌属中性金属蛋白酶)的液体洗涤剂制剂，其中所述至少一种金属蛋白酶通过在该洗涤剂制剂中包含的蛋白质水解产物来稳定。本发明也提供了通过用金属蛋白酶消化蛋白质底物来制备用于稳定洗涤剂制剂的蛋白质水解产物的方法。

Description

蛋白质水解产物稳定金属蛋白酶洗涤剂制剂的用途

与相关申请的交互参照

[01]本申请要求2007年4月30日提交的美国临时申请60/914,965号的优先权权益，其全文在此引入作为参考。

发明领域

[02]本发明涉及蛋白质水解产物抑制剂在储存条件下稳定含有金属蛋白酶的洗涤剂制剂中的用途。

发明背景

[03]酶在许多洗涤剂制剂中是关键活性成分。由于它们是催化剂，酶在降解污斑中可以是高效的组分。然而，由于它们是生物产品，酶也可能是最昂贵的组分之一。因此，在洗涤剂制剂的寿命中维持高酶活性对基于此类洗涤剂制剂的产品的成功是非常关键的。

[04]在此类制剂中应用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶、以及其它酶或它们的混合物。

[05]与在液体中储存期间(例如，使用前)维持酶稳定性相关的问题是公知的。一般而言，蛋白酶造成更大的稳定性问题，因为它们的催化活性降解制剂中的其它蛋白质，以及在自溶(即，自降解)过程中降解该蛋白酶自身。然而，由于丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)的稳定相对容易以及为增加稳定性的工程化突变的开发，这一类蛋白已在洗涤剂制剂中广泛应用。实际上，由于它们在洗涤剂中的应用，枯草杆菌蛋白酶是商业上最重要的蛋白酶之一。

[06]相反，金属蛋白酶在工业应用，诸如洗涤剂制剂中几乎没有或没有应用。金属蛋白酶包含更复杂的蛋白系统，所述系统绝对需要钙和金属离子分别用于稳定和功能。洗涤剂制剂和其它洗涤组合物一般包括活性成分的复杂组合，其极大地使维持金属蛋白酶稳定性及活性的问题复杂化。具体而言，洗涤剂制剂通常包括螫合钙和/或关键金属离子的化合物，其中所述的钙和/或关键金属离子使稳定性和催化活性的丧失降低。

[07]2006年10月12日提交的美国专利申请11/581,102号(在此引入作为参考)公开了中性金属蛋白酶，其克服了一些与在洗涤剂制剂中应用金属蛋白酶相关的困难。具体而言，已发现该来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NprE和PMN的中性金属蛋白酶耐受洗涤剂制剂条件并在锌离子以低于15mM的浓度存在时，在超过约4周展示出稳定性。此外，这些中性金属蛋白酶即使在低温下也展示出良好的清洁效果。具体而言，已显示来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的重组中性金属蛋白酶(NprE)展示出对Equest Grass(Warwick)的比其它洗涤剂制剂更好的洗涤表现。因此，如果足够稳定的话，中性金属蛋白酶具有制造改良的、具商业利益的工业洗涤剂的可能性。

[08]中性金属蛋白酶仍然面临自溶降解的普遍性的蛋白酶问题，所述自溶降解迅速地降低它们的活性并随之降低洗涤剂制剂的储存稳定性。应用金属蛋白酶(或任意酶)的相对高成本需要最小化使用前的活性损失，以使得它们作为洗涤剂组分具有商业利益。显然，任何用于最小化金属蛋白酶自溶降解的组合物和/或方法必须不再通过在使用期间抑制期望的酶活性(即，降解污斑蛋白成分)而增加太高的成本。因此，必须取得一个脆弱的平衡，以使得最小化洗涤剂储存期间的自溶活性，而不降低使用时的期望酶活性。因此，需要这样的方法、化合物、制剂和组合物，其能稳定中性蛋白酶不被降解，尤其是当将它们掺入洗涤剂制剂和其它洗涤组合物中时更时如此。

发明概述

[09]本发明提供了组合物和洗涤剂制剂，其包含金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂，并且其由此展示出针对降解的增加的稳定性。本发明还提供了用于制备这些抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物和洗涤剂制剂的方法。

[010]本文公开的组合物和洗涤剂制剂全部包含金属蛋白酶，并且增加的稳定性是由于包括金属蛋白酶抑制剂，其与所述酶结合并由此阻止所述酶的自溶降解。重要的是，这样制备这些抑制剂稳定的组合物的洗涤剂制剂，使得所述抑制剂在储存期间结合并有效地减少金属蛋白酶降解，但随后当使用该组合物或洗涤剂时，稀释后释放提供活性酶。本发明公开了蛋白质水解产物作为特别有效的金属蛋白酶抑制剂，用于针对降解进行稳定。在一个特别优选的实施方案中，通过金属蛋白酶自身水解蛋白质底物制备蛋白质水解产物抑制剂。可分离得到的水解产物并且其是对产生它的金属蛋白酶特别有效的竞争抑制剂。

[011]在一组优选的实施方案中，本发明提供了洗涤剂制剂(以及它们的制备方法)，其中金属蛋白酶抑制剂是蛋白质水解产物。本发明的蛋白质水解产物包含通过多种蛋白(例如，酪蛋白)的(酶的或非酶的)水解产生的肽片段。本发明中能用作抑制剂的蛋白质水解产物包括但不限于：小麦谷蛋白水解产物(例如，HyPep 4601^TM)、大豆蛋白酸水解产物(例如，Amisoy)、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物(例如，Amicase)以及来自植物蛋白的酶水解产物(例如，蛋白胨)。此外，本发明教导了通过用一种或多种金属蛋白酶(例如，目的金属蛋白酶本身)水解/消化制得的蛋白质水解产物抑制剂的用途。

[012]在优选的一组实施方案中，本发明提供了包含分离自芽孢杆菌属的中性金属蛋白酶、以及特别地分离自解淀粉芽孢杆的重组中性金属蛋白酶NprE的液体洗涤剂制剂。

[013]在一个实施方案中，本发明包括液体洗涤剂制剂，其包含：(a)约1％至约75％重量的表面活性剂；(b)约10％至约95％重量的水；(c)约0.01％至约5％重量的中性金属蛋白酶；以及(d)一定量的中性金属蛋白酶抑制剂，从而该抑制剂与至少约90％的中性金属蛋白酶分子结合，即，在活性部位结合或在除了活性部位的部位结合并在使用前阻止或抑制底物与该活性部位的催化相互作用，并且其中该洗涤剂制剂的合适的稀释导致该抑制剂自至少约25％的结合的中性金属蛋白酶分子解离。一般地，当将该液体洗涤剂制剂加入到大体积的洗涤水中导致该洗涤剂制剂200、400、500、600或甚至1000倍稀释时，则发生适当的稀释。

[014]在这一制剂的一个实施方案中，所述洗涤剂稀释后，超过或等于45％、65％、75％、85％或甚至95％的抑制剂结合的中性金属蛋白酶释放为其无抑制剂形式。在一个实施方案中，为该制剂选择的抑制剂在约pH 6.5至约pH 11，优选约pH 7.5至约pH 9.5以约5mM至约15mM的表观K_i竞争性地抑制所述中性金属蛋白酶。在一个优选的实施方案中，所述洗涤剂制剂包含在pH8.0具有约10mM的表观K_i的蛋白质水解产物抑制剂。

[015]尽管在制剂中所使用的抑制剂的绝对量可能会依据结合亲和力、酶浓度和其它因素而不同，但一般地，在适当的稀释之前抑制剂的量为液体洗涤剂制剂重量的约0.01％至约15％，约0.05％至约5％，约0.1％至约2.5％之间。

[016]在一个实施方案中，通过存在其它组分，包括聚丙二醇和/或钙离子(例如，CaCl₂)，从而进一步稳定所述液体洗涤剂制剂。在一些实施方案中，所述制剂是根据选自以下的通用HDL制剂而制得的HDL洗涤剂：DW-AA、DW-AF、DW-AK、DW-CR、DW-CS和DW-CT。在一些实施方案中，所述液体洗涤剂制剂不包含硼。

[017]在另一个实施方案中，本发明提供了抑制剂稳定的中性金属蛋白酶组合物，其包含：(a)约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶；以及(b)竞争性抑制剂，其中该竞争性抑制剂与至少约90％的所述中性金属蛋白酶分子结合。在一个优选的实施方案中，所述竞争性抑制剂是蛋白质水解产物。在另一优选实施方案中，所述中性金属蛋白酶来自芽孢杆菌属，并且特别的是来自解淀粉芽孢杆的NprE。这一抑制剂稳定的组合物可以是液体或干燥(例如，颗粒状)制备物。在一个实施方案中，该组合物被用作制备上面公开的本发明洗涤剂制剂的前体成分。在另一实施方案中，该抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物在包封的颗粒中。

[018]因此，在另一实施方案中，使用抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物用于通过以下方法制备洗涤剂制剂，所述方法为：将所述组合物与(a)水；(b)约0.1％至约75％重量的洗涤剂表面活性剂；(c)约5％至约15％重量的丙二醇；以及(d)约0.5nM至约5.0mM的Ca²⁺离子组合。

[019]本发明的另一实施方案是通过以下方法制备的液体洗涤剂制剂，所述方法组合了包含以下的组分(a)pH为约6.5至约8.5的含水缓冲液；(b)约0.1％至约75％重量的洗涤剂表面活性剂；(c)约0.01％至约5％重量的金属蛋白酶；以及(d)底物蛋白质，其中通过至少一种(即，一种或多种)金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生与至少约90％的所述金属蛋白酶分子结合的产物。在一个实施方案中，所述底物蛋白质选自：小麦谷蛋白、酪蛋白、大豆蛋白和植物蛋白。在一个实施方案中，所应用的底物蛋白质是约0.01％重量至约15％重量。和本文公开的其它制剂一样，在一些实施方案中，所述的金属蛋白酶是分离自芽孢杆菌属的中性金属蛋白酶，并且特别地是中性金属蛋白酶NprE。

[020]在另一实施方案中，本发明提供了用于制备抑制剂稳定的液体洗涤剂制剂的方法，其包括：(a)在约pH 6.5至pH 11的含水缓冲液中、在约22℃至约37℃的温度温育包含至少一种(即，一种或多种)中性金属蛋白酶和蛋白质底物的混合物，由此通过至少一种(即，一种或多种)中性金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生水解产物；(b)分离分子量少于约5000Da的水解产物；以及(c)将步骤(b)的水解产物与包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶的液体洗涤剂制剂合并。在另一实施方案中，本发明提供了用于制备抑制剂稳定的液体洗涤剂制剂的方法，其包括将蛋白质水解产物与包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶的液体洗涤剂制剂合并，其中如下制备所述的蛋白质水解产物：在约pH 6.5至pH 11的含水缓冲液中、在约22℃至约37℃的温度温育包含至少一种(即，一种或多种)中性金属蛋白酶和蛋白质底物的混合物，由此通过至少一种(即，一种或多种)中性金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生水解产物，并且其中在与所述中性金属蛋白酶合并前分离分子量少于约5000Da的水解产物。在一个实施方案中，所述温育混合物包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶和约5％至约20％重量的蛋白质底物。在一个优选的实施方案中，所述中性金属蛋白酶是NprE且所述蛋白质底物是牛奶酪蛋白。

[021]在一个实施方案中，本发明提供了包含中性金属蛋白酶基因和蛋白质底物基因的表达载体，其中通过所述中性金属蛋白酶基因产物将所述蛋白质底物基因产物酶转化为蛋白质水解产物抑制剂。在另一实施方案中，该表达载体还包含与蛋白质底物基因有效连接的启动子，其中该启动子增强蛋白质底物基因产物而非中性金属蛋白酶基因产物的表达。在一个实施方案中，所述中性金属蛋白酶基因来自芽孢杆菌属且所述蛋白质底物是酪蛋白。在一个优选的实施方案中，所述中性金属蛋白酶基因是来自解淀粉芽孢杆的NprE并且所述蛋白质底物是酪蛋白。

附图简述

[022]图1描述了一实验测试法数据的绘制图，其显示了具有添加的聚丙二醇(PPG)和CaCl₂的较高浓度NprE随着时间保持增加的AGLA活性。所有样本含有如图例所列浓度的NprE以及10％PPG和0.5mM CaCl₂。实心圆数据代表625ppm NprE且没有添加任何PPG或CaCl₂的对照。

[023]图2描述了稳态动力学数据，其显示了NprE产生的酪蛋白水解产物是NprE的竞争性抑制剂。图2A显示了NprE活性随着抑制剂的量增加的底物依赖性。图2B显示了双倒数图，其展示了共同的Y截距。图2C显示了针对抑制剂肽浓度重绘的表观K_m。图2D显示了针对增量的抑制剂肽浓度重绘的双倒数斜率。图2C和2D中的X截距表示大约10mM酪蛋白水解产物浓度的表观K_i。

[024]图3显示了在各种蛋白质水解产物的存在下随时间的推进NprE活性的实验测试法数据的绘制图。

发明详述

概述

[025]本发明提供了包含金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂的组合物和洗涤剂制剂，其显示了针对降解的增加的稳定性。本发明还提供了用于制备这些抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物和洗涤剂制剂的方法。

[026]本文公开的组合物和洗涤剂制剂均包含金属蛋白酶，并且所述增加的稳定性是由于包含与所述酶可逆结合并由此阻止该酶自溶降解的竞争性抑制剂。本文描述的抑制剂可以结合在活性部位并直接干扰底物与该酶在活性部位的相互作用。备选地，所述抑制剂可以结合在除活性部位的其它部位(即，对活性部位是非特异的)并阻止或抑制底物与所述酶的催化相互作用，例如，通过诱导三级或四级结构的改变，所述改变干扰或妨碍在活性部位的底物相互作用。重要的是，这样制备这些抑制剂稳定的组合物和洗涤剂制剂，使得所述抑制剂在储存期间结合金属蛋白酶并有效地减少金属蛋白酶降解，但随后当使用该组合物或洗涤剂时，稀释后释放提供活性酶。本发明公开了蛋白质水解产物作为特别有效的金属蛋白酶抑制剂，用于针对降解进行稳定。在特别优选的实施方案中，通过金属蛋白酶自身水解蛋白质底物制备蛋白质水解产物抑制剂。可分离得到的水解产物并且其是对产生它的金属蛋白酶特别有效的竞争抑制剂。

定义

[027]除非在本文中另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wileyand Sons，NY(1994)；以及Hale和Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了许多本文所用的属于的一般解释。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本文中所描述的本发明的实践，但本文中描述了示例性方法和材料。因此，通过作为一个整体参考该说明书更详细的描述了以下即将定义的术语。同样，如本文中所使用的，除非上下文明确另外指出，单数术语“一个”、“一种”和“该”包括对复数的提及。除非另外指出，分别地，核酸以5′至3′方向从左至右书写；氨基酸序列以从氨基至羧基的方向从左至右书写。应当理解，本发明不局限于描述的特定的方法、方案和试剂，因为取决于本领域技术人员使用它们的背景，它们可发生变化。

[028]在整个本说明书中给出的每一个最大的数值限都旨在包括每一个较小的数值限，就如同在本文中明确地写出了这些较小的数值限一样。在整个本发明书中给出的每一个最小的数值限都将包括每一个较大的数值限，就如同在本文中明确写出了这些较大的数值限一样。在整个本说明书中给出的每一个数值范围都将包括落在该较宽的数值范围内的每一个较窄的数值范围，就如同在本文中明确地写出了这些较窄的数值范围一样。

[029]所有引用的文献均在关联部分引入本文作为参考；对任何文件的引用均不能理解为承认其为本发明的现有技术。

[030]本文所用的术语“酶”是指催化化学反应的任何蛋白质。酶的催化功能构成其“活性”或“酶活性”。通常根据其执行的催化功能(例如，肽键的水解)对酶进行分类。

[031]本文所使用的术语“有效量的酶”是指对达到特定应用(例如，个人护理产品、洗涤组合物等)中所需酶活性所需要的酶量。此类有效量通过本领域技术人员及基于许多因素，诸如所应用的具体的酶变体、洗涤剂应用、洗涤剂的特定制剂等，能很容易地确定。

[032]本文所使用的术语“蛋白酶”或“蛋白水解酶”是指催化蛋白中肽键水解的任何酶。

[033]本文所使用的术语“金属蛋白酶”、“金属蛋白水解酶”或“金属肽酶”是指需要结合的金属离子以执行其催化活性的蛋白酶。

[034]本文所使用的术语“中性金属蛋白酶”是指对于催化活性而言在中性pH且需要锌离子才具最佳活性的金属蛋白酶。一般地，中性金属蛋白酶在30至40kDa的大小范围。本发明的中性金属蛋白酶也称为“中性金属内肽酶”且包括在EC 3.4.24.4类中的酶。

[035]本文所使用的术语“底物”是指酶在其上执行其催化活性以产生产物的物质(例如，化学化合物)。在金属蛋白酶的情况下，底物通常是蛋白质，尽管金属蛋白酶也可作用于肽或非蛋白类化合物中的酯键。因此，术语“蛋白质底物”是指这样的底物，所述底物是蛋白质。

[036]本文所使用的术语“活性部位”是指酶的这样的区域，其中底物结合在该区域并发生催化活性。在一些情况下，酶可能具有超过一个活性部位。一般地，金属蛋白酶具有单个活性部位。

[037]本文所使用的术语“抑制剂”是指降低酶活性率的任何物质。例如，抑制剂可以指蛋白质水解产物、多肽、蛋白质水解产物或多肽的天然或合成类似物。因此，抑制剂可以包括模拟蛋白质水解产物与中性金属蛋白酶活性部位结合能力的某些方面的合成化合物。

[038]本文所使用的术语“竞争性抑制剂”是指与酶可逆结合并由此阻止底物结合的抑制剂，即，所述抑制剂与底物竞争结合活性部位或所述抑制剂结合酶分子的其它部位并阻止或抑制催化底物与酶在活性部位的相互作用。

[039]本文所使用的术语“K_i”或“抑制常数”是指酶-抑制剂结合复合物的解离常数，即，游离酶浓度(即“[E]”)与抑制剂结合的酶(即“[E-I]”)的比例。可应用多数生物化学教科书(例如，参见，Fersht，“酶结构和机制(Enzyme Structure and Mechanism)”W.H.Freeman，第二版，1985)中描述的稳态酶动力学的公知技术确定K_i。简而言之，通过在具有已知底物的测试法中测量抑制剂的存在(即，抑制剂浓度)对酶稳态动力学常数(即，K_m和Kcat)的影响来确定抑制常数K_i。

[040]本文所使用的术语“表观K_i”是指当不能精确地确定实际抑制剂浓度时测得的K_i值。例如，当抑制剂是水解产物混合物(即，蛋白质片段的混合物)时，测得的K_i将是表观K_i，因为仅能(例如，基于肽浓度的化学分析)估计绝对抑制剂浓度。混合物中与酶分子结合并导致抑制的特定片段的实际浓度将比测得的浓度低得多。因此，“表观K_i”将比应用纯化的抑制剂可确定的K_i值更高。

[041]本文所使用的术语“自溶”是指组织或细胞通过其自己的酶溶解。在一个实施方案中，术语“自溶”是指酶水解其自身的多肽链，例如，通过蛋白酶的自身蛋白酶水解。

[042]本文所使用的就酶而言的术语“稳定性”是指其在一定环境条件下在一段时间内保持一定水平的功能活性的能力。可在许多提及所感兴趣的具体环境条件下的上下文中使用术语“稳定性”。例如，“自溶稳定性”是指酶抵挡自溶降解(即，自身蛋白酶解)的能力。通过与在不存在稳定剂(例如，抑制剂化合物)的情况下存在的酶活性相比，酶活性半寿期至少约5％或更多的升高或降低(多数实施方案中，优选升高)来证实稳定性的实质性改变。不旨在将该术语限定于应用任何具体的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。

[043]本文所使用的术语“酶转换”是指通过使底物或中间体与酶接触而将该底物或中间体变为产物。在一些实施方案中，通过使底物或中间体直接暴露于合适的酶而进行接触。在另一些实施方案中，接触包括分别使底物或中间体与表达和/或分泌该酶、和/或使期望的底物和/或中间体代谢为期望的中间体和/或终产物的生物体接触。

[044]本文所使用的术语“消化”是指通过蛋白酶将蛋白质底物酶转换为产物。

[045]本文所使用的术语“纯化的”和“分离的”是指从样本中移除污染物和/或移除与物质(例如，多肽或多核苷酸)天然相关的材料。

[046]本文使用的术语“水解产物”是指通过水解产生的任何物质。不预期在将该术语限定为通过任意特定的水解方法产生的物质。预期该术语包括通过酶以及非酶反应产生的“水解产物”。例如，任意已知的水解酶(例如，丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、水解酶等)均能够产生在本申请中如何使用该术语的意思范围内的水解产物。类似地，水解的非酶方法(例如，酸/碱水解等)也产生在本申请中如何使用该术语的意思范围内的水解产物。

[047]本文所使用的术语“蛋白质水解产物”是指通过水解任何类型或种类的蛋白质所产生的水解产物。可以水解任意已知的蛋白质以产生在本申请中如何使用该术语的意思范围内的蛋白质水解产物。可通过酶以及非酶方法产生“蛋白质水解产物”，并且其可包括大小在2至100或更多个氨基酸范围内的蛋白质片段(即，多肽)。此外，本文所使用的“蛋白质水解产物”不限于单个产物化合物，而是可包括水解产物(例如，多种蛋白质片段)的异质分布或混合物。其还可包括水解产物的同质化合物或纯化的级分。蛋白质水解产物的优选实施方案包括：HyPep 4601^TM(来自小麦谷蛋白的蛋白质水解产物)、Amisoy(大豆蛋白酸水解产物)、Amicase(来自牛奶的酪蛋白酸水解产物)、

蛋白胨(来自植物蛋白的酶水解产物)。

[048]本文中所使用的“蛋白质”是指由氨基酸组成的并且被本领域技术人员公认为蛋白质的任何组合物。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。当肽是蛋白质的一部分时，本领域技术人员理解该术语在上下文中的用法。应用术语“野生型”和“天然的”表示在自然界中发现的蛋白质。在一些实施方案中，野生型蛋白的序列是蛋白质工程方案的起始点。

[049]本文中所使用的术语“关联蛋白”或“同源蛋白”是指功能和/或结构相似(即，具有相似的作用和/或结构)的蛋白质。本发明意图使该术语包括获自不同物种的相同或类似的酶(即，就其结构和功能而言)。本发明无意局限于来源于任何特定来源或蛋白质相关进化的关联蛋白。此外，术语相关或同源蛋白包括三级结构同源物和一级序列同源物。因此，该术语包括具有相对于野生型序列的具有“变体”或“突变”序列的蛋白。

[050]本文所使用的术语“洗涤剂”、“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”是指预期在洗涤介质中应用以清洁固态物体的混合物。在一些实施方案中，在谈及洗涤织物和/或服装使用该术语(例如，“洗衣洗涤剂”)。在其它实施方案中，该术语指诸如那些用于清洁盘子、餐具等的洗涤剂(例如，“洗盘洗涤剂”)。一般而言，预期该术语包括制剂，所述制剂包括“重垢洗涤液(heavy duty liquid)”(“HDL”)，其包含例如金属蛋白酶、诸如蛋白质水解产物的金属蛋白酶抑制剂、诸如聚丙二醇的酶稳定剂、表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂(caking inhibitor)、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。不预期将本发明限定于任何具体的洗涤剂制剂或组合物。

[051]本文所使用的术语“表面活性剂”是指降低表面张力的表面活性化合物。这一术语意图包括所有公知类型的表面活性剂和表面活性剂系统，包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、和它们的混合物。

[052]本文所使用的短语“洗涤剂稳定性”是指洗涤剂组合物在特定环境条件和一定时间段内在洗涤介质中维持其清洁固态物之能力的能力。洗涤剂稳定性可用于指在其储存寿命期间(即，使用前)的稳定性，或在洗涤介质中使用期间的稳定性。应用不同类型的用于测量稳定性的清洁测试，洗涤剂稳定性可能会不同。此外，当这些特定组分对所述清洁测试作出实质性贡献时，洗涤剂稳定性可能与该洗涤剂制剂中特定活性成分的稳定性密切相关。

[053]除非另外指出，如本文中所使用的“清洁组合物”和“清洁制剂”是指用于从待清洁的物品诸如织物、餐具、隐形眼镜、其他固体基质、头发(洗发香波)、皮肤(皂和膏)、牙齿(漱口剂、牙膏)等上除去不期望的化合物的组合物。该术语包括选择用于期望的特定类型的清洁组合物和产品形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)的任何材料/化合物，只要该组合物与应用于该组合物中的金属蛋白酶及其他酶相容即可。通过考虑待清洁的表面、物体或织物，以及对于应用过程中应用的清洁条件而言期望的组合物形式，本领域技术人员可容易地具体选择清洁组合物材料。

[054]术语“清洁组合物”和“清洁制剂”还指适用于对任何物体和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。该术语意在包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体洗衣洗涤剂和精细织物洗涤剂；诸如用于玻璃、木头、陶瓷和金属工作台面和窗户等的硬表面清洁制剂；地毯清洁剂；炊具清洁剂；织物清新剂(freshener)；织物软化剂；纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)以及餐具洗涤剂)。

[055]此外，除非另外指出，本文中使用的术语“清洁组合物”和“清洁制剂”包括颗粒或粉末形式的通用洗涤剂或重垢洗涤剂，特别地清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用洗涤剂，特别地称为重垢洗涤剂液体(HDL)类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，特别地高泡型的那些；机用餐具洗涤剂，包括家庭和公共场所使用的各种片剂、颗粒剂、液体和漂清助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗细菌手洗类型、清洁棒、漱口剂、假牙清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；头发香波和护发素；胶状沐浴乳和泡沫浴及金属清洁剂；以及清洁助剂诸如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。

[056]本文中所使用的“织物”包括任何纺织品材料。因此，该术语意在包括衣物、以及织物、纱、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织品材料。

[057]本文所使用的术语“重组DNA分子”是指包括通过分子生物学技术的方法连接在一起的DNA片段的DNA分子。

[058]术语“重组寡核苷酸”是指应用分子生物学操作产生的寡核苷酸，所述操作包括但不限于：连接两个或多个通过限制性酶消化多核苷酸序列而产生的寡核苷酸序列、合成寡核苷酸(例如，合成引物或寡核苷酸)等。

[059]本文所使用的术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进有效连接的编码区转录起始的调控元件。其它的调控元件包括剪接信号、多腺苷酸信号和终止信号。

[060]术语“启动子/增强子”表示含有能够提供启动子和增强子功能两者的序列的DNA片段(例如，逆转录病毒的长末端重复含有启动子和增强子功能)。该启动子/增强子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。内源启动子/增强子是在基因组中与给定基因天然连接的启动子/增强子。外源(异源)启动子/增强子是通过遗传操作方法(即，分子生物学技术)将其与基因毗连放置的启动子/增强子。

[061]本文所使用的“表达载体”是指DNA构建体，其含有与合适的控制序列有效连接的DNA序列，所述的控制序列能够影响所述DNA在合适宿主中的表达。此类控制序列包括影响转录的启动子、控制此类转录的可选操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合部位的序列以及控制转录和翻译终止的序列。所述载体可以是质粒、噬菌体粒子、或仅是潜在的基因组插入片段。一旦转化至合适的宿主，所述载体可以独立于宿主基因组复制和发挥功能，或在某些情况下可以整合到基因组本身中。

[062]术语“质粒”、“表达质粒”和“载体”在本文中可与当前最常用的载体形式质粒互换使用。然而，本发明意图包括此类其它形式的表达载体，所述载体提供等价的功能且是或变得本领域公知的。

[063]在将核酸序列插入到细胞的上下文中的术语“引入”的意思是转化、转导或转染。转化的方法包括本领域公知的原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA等(参见，Chang和Cohen，MoI.Gen.Genet.，168：111-115[1979]；Smith等，Appl.Env.Microbiol.，51：634[1986]；以及Ferrari等在Harwood，Bacillus，Plenum Publishing Corporation，第57-72页[1989]中的综述文章)。

[064]本文所使用的“宿主细胞”通常是可以使用本领域内已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达期望的蛋白质变体。在编码蛋白质变体的前体形式或前原形式(prepro-form)的载体的情况下，当表达时，此类变体通常从宿主细胞分泌入宿主细胞培养基。

中性金属蛋白酶

[065]金属蛋白酶是在细菌、真菌及高等生物中发现的不同类型的蛋白酶。在金属蛋白酶活性部位结合的金属离子允许水分子的催化活性。然后水分子作为亲核试剂起作用以切割肽键的羧基。在该类中存在大量不同的序列和结构，但是大多数金属蛋白酶包括结合在活性部位的锌离子。在一些金属蛋白酶中，锌离子可被另一金属离子，诸如钴或镍取代而不丧失活性。如当前所理解的那样，金属蛋白酶的催化机制包括通过攻击被该酶切割的键的羧基上的锌结合水分子而形成的非共价四面体中间产物。

[066]中性金属蛋白酶(即，中性金属内肽酶，EC 3.4.24.4)属于绝对需要锌离子用于催化活性的蛋白酶类。这些酶在中性pH及在30至40kDa大小范围内具最佳活性。中性金属蛋白酶结合2至4个钙离子，所述钙离子有助于该蛋白的结构稳定性。中性金属蛋白酶家族包括细菌酶嗜热菌蛋白酶、和其它类嗜热菌蛋白酶的蛋白酶(“TLPs”)以及羧肽酶A(消化酶)、以及催化参与组织重建和降解的反应的基质金属蛋白酶。

[067]就功能和稳定性而言，最佳表征的中性金属蛋白酶可能是嗜热菌蛋白酶和TLP。许多研究集中于工程化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)嗜热菌蛋白酶，以增加它们的热稳定性(例如，参见Vriend等，In，Tweel等(编辑)，Stability and Stabilization of Enzymes，Elsevier，pp.93-99[1993])。已进行了许多的努力以通过改变可阻止局部解折叠过程的结构决定因素(通过分子建模确定)来增加TLP的稳定性，所述的局部解折叠过程增强了在高温下的自溶和变性。(例如，参见van den Burg等，在Hopsu-Havu等，(编辑)，Proteolysis in Cell Functions Manipulating the Autolvtic Pathway of aBacillus Protease.Biomedical and Health Research，卷13，IOS Press[1997]p.576.)。已报道钙离子能够帮助阻止中性金属蛋白酶自溶。已通过添加钙稳定了嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)中性蛋白酶对抗自溶和蛋白酶水解降解(参见

等，FEBS J.，272：1523-1534[2005])。

[068]2006年10月12日提交的美国专利申请11/581,102(在此通过引文并入本文作为参考)提供了工程化具有改良特性的中性金属蛋白酶(包括NprE)的组合物和方法。美国专利申请11/581,102号尤其提供了适于工程化不依赖于钙的中性金属蛋白酶以维持它们结构稳定性的组合物和方法。在其提供的其它实施方案中，中性金属蛋白酶的工程化阻止了在特定二级结构元件中的局部解折叠，其可能阻止蛋白水解。

[069]在美国专利申请11/581,102号中描述的稳定的中性金属蛋白酶中，有来自解淀粉芽孢杆的野生型金属蛋白酶(例如，纯化的MULTIFECT

Neutral；“PMN”)和称为NprE的重组中性金属蛋白酶(例如，克隆至枯草芽孢杆菌的解淀粉芽孢杆中性金属蛋白酶)。

[070]除了来自解淀粉芽孢杆的中性金属蛋白酶外，本发明考虑了使用来自其它来源尤其是芽孢杆菌属的相关酶，包括但不限于获自蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、蜡状芽孢杆菌E33L、热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)、短小芽孢杆菌(B.pumulis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌淀粉糖化亚种(B subtilis amylosacchariticus)、Brevibacillus brevis、Paenibacillus polymyxa(多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa))、嗜热脂肪杆菌(B.stearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和S.aureus的金属蛋白酶同源物(homologs)，以及aureolysin、胞外弹性蛋白酶和中性蛋白酶B。

[071]可通过移除溶液或制备物中不是金属蛋白酶的污染蛋白质和其它化合物而纯化在本发明实施方案中有用的金属蛋白酶。在一些实施方案中，在细菌和真菌宿主细胞中表达重组金属蛋白酶，并且通过移除其它宿主细胞组分而纯化这些重组金属蛋白酶；由此增加样本中重组金属蛋白酶多肽的百分比。在特别优选的实施方案中，按照本发明使用的金属蛋白酶基本上纯化为至少约99％的蛋白质组分，如SDS-PAGE或其它本领域公知的标准方法确定的那样。在备选的优选实施方案中，本发明的金属蛋白酶包含组合物的至少约99％的蛋白酶组分。在再其它备选的实施方案中，金属蛋白酶以总蛋白和/或蛋白酶的至少约90-95％的范围存在。

[072]可通过任意合适的方法完成野生型和变体金属蛋白酶的功能性表征，并且其优选基于评估感兴趣的特征。例如，在本发明的一些实施方案中确定了pH和/或温度、以及洗涤剂和/或氧化稳定性。实际上，预期在本发明的上下文中可应用在一个或多个这些特征(蛋白水解或自溶稳定性、洗涤剂稳定性、pH、温度和/或氧化稳定性)中具有不同稳定性程度的金属蛋白酶。

[073]一个改善用于酶对洗涤剂制剂稳定性的方法是改变酶自身的结构，即开发在洗涤剂制剂条件下展示出升高的活性、和/或特异性的具有变体氨基酸序列的酶。例如，本领域公开了许多蛋白酶变体。例如，参见EP0130756，其相应于美国再公告专利34,606号(Genencor)；EP 0214435(Henkel)；WO 87/04461(Amgen)；WO 87/05050(Genex)；EP 0260105(Genencor)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 95/27049(Solvay)；WO 95/30011(Procter & Gamble)；WO 95/30010(Procter &Gamble)；WO 95/29979(Procter & Gamble)；美国专利号5,543,302(Solvay)；EP 0251446(Genencor)；WO 89/06279(Novozymes A/S)；WO91/00345(Novozymes A/S)；EP 0525610Al(Solvay)。

[074]变体蛋白可以与亲本蛋白和其它变体蛋白之间有少量氨基酸残基的不同。不同的氨基酸残基的数目可以是一个或多个，优选1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，变体之间不同的氨基酸数目是1至10个。在一些特别优选的实施方案中，相关蛋白质和特别地变体蛋白包含至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

[075]本领域已知若干种方法适于产生本发明酶的变体，包括但不限于点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、位点定向诱变和定向进化、以及各种其它的重组方法。

[076]2006年10月12日提交的美国专利申请11/581,102号(在此引入本文作为参考)描述了许多中性金属蛋白酶变体序列。这些变体酶与野生型酶可能有程度不同的功能特征差异。然而，到任何此类变体中性金属蛋白酶具有自溶活性且还通过蛋白质水解产物竞争性抑制的程度，其可根据本文公开的制剂和方法被应用。因此，可应用任何本文描述的抑制剂稳定的金属蛋白酶实施方案，不仅是野生型中性金属蛋白酶，而且包括大量活性突变体和其它变体。

[077]在一个实施方案中，本发明预期应用位点定向诱变以工程化中性金属蛋白酶活性部位，其中特定蛋白质水解产物将在该位点展示出抑制剂结合特性，其对改善在洗涤剂制剂中的稳定性更有利。用于产生突变体的中性金属蛋白酶“位点评价文库”(SEL)公开于2006年10月12日提交的美国专利申请11/581,102号，其在此通过引物并入本文作为参考。按照本发明，可以应用这些SEL以产生中性金属蛋白酶的活性位点突变体文库，然后可针对改良的蛋白质水解产物(或其它抑制剂)结合特征筛选该文库，其改善了应用这些抑制剂以在洗涤剂制剂和清洁组合物中针对自溶降解进行稳定的能力。

作为抑制剂和稳定剂的蛋白质水解产物

[078]当储存于溶液中时，诸如NprE的中性金属蛋白酶随着时间会经历显著的活性损失。多数这些酶活性的损失是由于自溶，即中性金属蛋白酶分子催化蛋白水解其它金属蛋白酶分子或甚至其自身。自溶能够不可逆地损害酶折叠结构，使得极大地削弱或完全破坏其功能和活性。一般地，洗涤剂制剂所暴露的在洗涤条件中通常应用的较高温度使这一活性的自溶损失恶化。因此，这一酶活性的损失导致洗涤剂稳定性的直接损失。

[079]理想地，为最小化自溶，应当阻断每一中性金属蛋白酶分子的催化活性，直到准备应用。酶的抑制剂可阻断其活性，然而与酶活性部位结合的抑制剂通常非常紧密且不可逆。例如，所谓的“自杀抑制剂”化学地改变酶活性部位，使得其不可能重新获得任何催化活性。

[080]已知通过添加诸如基于硼的抑制剂化合物(例如，硼酸和各种烷基或芳基取代的硼酸(boronic acid))的抑制剂改良丝氨酸蛋白酶在洗涤剂制剂中储存稳定性的方法。已知这些基于硼的抑制剂可逆地抑制丝氨酸蛋白酶。例如，Molecular & Cellular Biochemistry 51，1983，第5-32页提供了通过烷基或芳基取代的硼酸抑制丝氨酸蛋白酶枯草杆菌蛋白酶的讨论。然而这些基于硼的抑制剂不会强烈地抑制金属蛋白酶，金属蛋白酶与丝氨酸蛋白酶通过不同的催化机制起作用。此外，一些管理机构已经开始提出关于基于硼的化合物的安全性的问题并且考虑限制它们进入环境的释放。

[081]为了本发明的目的，期望以可逆方式阻断金属蛋白酶自溶活性的金属蛋白酶抑制剂。当储存金属蛋白酶时，所述抑制剂应该紧密但可逆地结合，并且当需要其催化功能时，其然后从酶分子解离，由此允许所述酶重获其活性。此外，当该酶是洗涤剂制剂或其它清洁组合物中的组分时，这一可逆抑制应当与环境条件相容。

[082]因此，在一个实施方案中，本发明提供了抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物，其包含：(a)约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶；以及(b)竞争性抑制剂，其中该竞争性抑制剂与至少约90％的所述中性金属蛋白酶分子结合。这一抑制剂稳定的组合物可以是液体或干燥(例如，颗粒状)制备物。在一个实施方案中，该组合物被用作制备下面详细描述的本发明洗涤剂制剂的前体成分。在另一实施方案中，该抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物在包封的颗粒中，如下面更详细的描述的那样。

[083]已知丝氨酸蛋白酶在较高浓度储存时重获较高的活性。据信这是由于当酶在较高浓度时自溶产物与丝氨酸蛋白酶活性部位的结合。换而言之，自溶产物的解离率被极大地降低。实际上，较高的总酶浓度引起自溶产物作为抑制剂起作用。当降低浓度时(通过稀释)，自溶产物能很容易地解离且自溶反应继续进行。

[084]如在下面实施例1中所讨论的那样，当在较高浓度储存时，中性金属蛋白酶展示出升高的稳定性(即，随时间保持较高的活性)。和丝氨酸蛋白酶一样，这一随浓度升高的稳定性似乎表明金属蛋白酶的自溶产物作为抑制剂起作用。

[085]因此，本发明的一个实施方案中包含稳定的中性金属蛋白酶制剂，其包含中性金属蛋白酶溶液，其中中性金属蛋白酶的浓度为至少约500ppm、1000ppm、2500ppm、5000ppm、10000ppm或甚至更高。在一个实施方案中，该中性金属蛋白酶溶液还包含至少约10％丙二醇。在另一实施方案中，该中性金属蛋白酶溶液还包含至少约0.5mM，例如约0.5mM至约5mM的钙离子(例如，氯化钙、甲酸钙、柠檬酸钙、抗坏血酸钙、醋酸钙或磷酸钙)。在一个实施方案中，该中性金属蛋白酶溶液包含约0.5mM至约5mM的CaCl₂。

[086]诸如NprE的中性金属蛋白酶在高浓度下经历自溶的产物抑制的观察提示其它水解产物能作为抑制剂以针对自溶进行稳定。因此，本发明的一个实施方案包含含有中性金属蛋白酶的制剂(或组合物)，其包含中性金属蛋白酶和蛋白质水解产物。在一个实施方案中，通过该中性金属蛋白酶自身产生蛋白质水解产物。例如，如在以下实施例2中所公开的那样，用活性金属蛋白酶(诸如NprE)处理牛蛋白(诸如奶酪蛋白)，以酶催化产生蛋白质水解产物混合物。一般地，这一酶催化产生的蛋白质水解产物是各种大小的肽产物的异质混合物，例如，从NprE催化消化酪蛋白产生的肽。在一个实施方案中，可以如原样地将这一酶催化产生的蛋白质水解产物组合物用作抑制剂。在其它实施方案中，可进一步分离和/或纯化这一混合物，以便产生更浓缩和/或同质的蛋白质水解产物组合物。

[087]在本发明的一个实施方案中，使中性金属蛋白酶产生的蛋白质水解产物通过5000Da MW截止膜以产生低分子量混合物。然后将这一低MW混合物加入到含有中性金属蛋白酶的制剂中，以在储存期间针对自溶降解来稳定中性金属蛋白酶。

[088]根据本发明，所述金属蛋白酶抑制剂应当是竞争性抑制剂。通过应用可逆结合的竞争性抑制剂，在洗涤剂制剂或其它清洁组合物中可应用实质上更少的金属蛋白酶。在选择用于产生抑制剂稳定的金属蛋白酶的竞争性抑制剂当中考虑的因素是：应当选择具有这样的K_i的金属蛋白酶抑制剂，和/或应当足量地添加该抑制剂，使得储存期间(即，使用前)洗涤剂制剂(或清洁组合物)中至少约90％的酶分子与该抑制剂结合；以及(2)还应当这样选择抑制剂，使得在使用期间，当将洗涤剂制剂(或清洁组合物)用水(或其它合适的液体)稀释约10倍至约10,000倍，或约10倍至约100,000倍时，至少约25％、50％、75％、95％或更多的结合抑制剂从酶分子释放。

[089]在一个实施方案中，竞争性抑制剂以这样的量存在，使得稀释前其与至少约90％的金属蛋白酶分子结合，并且用水(或其它合适的液体)稀释约10倍至约10,000倍，或约10倍至约100,000倍后，抑制剂从至少约25％、50％、75％、95％或更多的结合的酶分子处解离，并且这些酶分子以催化活性形式释放。

[090]在本发明的任一个抑制剂稳定的金属蛋白酶实施方案中，所选择的金属蛋白酶抑制剂可以是蛋白质水解产物。在本发明一个优选的实施方案中，所述金属蛋白酶抑制剂是通过金属蛋白酶水解蛋白质所制备的蛋白质水解产物。在一个实施方案中，金属蛋白酶是NprE，并且所述抑制剂是通过NprE产生的牛奶酪蛋白的水解产物。在另一个实施方案中，金属蛋白酶是NprE且抑制剂是选自以下的蛋白质水解产物：小麦谷蛋白水解产物(例如，HyPep 4601^TM)、大豆蛋白酸水解产物(例如，Amisoy)、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物(例如，Amicase)以及来自植物蛋白的酶水解产物(例如，

蛋白胨)、和它们的任意组合。

[091]许多其它蛋白质水解产物混合物是商业可获得的。例如，Sigma化学目录列举了以下蛋白质水解产物：白蛋白水解产物；酪蛋白酸水解产物无维生素；酪蛋白水解产物；酪蛋白水解产物肉汤；酪蛋白镁肉汤；酪蛋白酵母镁琼脂；酪蛋白酵母镁肉汤；Edamin

K；明胶酶水解产物；来自玉米的谷蛋白酶水解产物；Hy-Case P；Hy-Case

M；乳白蛋白水解产物；肝水解产物；N-Z-Amine

B；N-Z-Amine

BT；N-Z-Amine

YTT；蛋白胨；来自酪蛋白，酸消化的蛋白胨；来自乳白蛋白，酶消化，容易溶解的蛋白胨；来自肉，肽消化的蛋白胨；来自奶固形物的蛋白胨；来自鲑的蛋白胨；蛋白胨Hy-Soy

T；蛋白胨N-Z-SoyBL 4；Primatone；蛋白质水解产物Amicase；蛋白质水解产物N-Z-Amine

AS；

蛋白胨；大豆蛋白酸水解产物；胰蛋白胨；胰蛋白

；以及植物水解产物2号。

[092]所有的这些蛋白质水解产物混合物均共有这样的共同特征：包括来自蛋白质水解的肽片段的混合物。基于这些共同特征，本领域技术人员将认识到每一蛋白质水解产物混合物均代表金属蛋白酶的潜在抑制剂。根据本发明的教导，本领域技术人员能够针对它们抑制(并对抗自溶进行稳定)目的金属蛋白酶的能力筛选这些蛋白质水解产物。实际上，许多这些蛋白质水解产物混合物基于共有蛋白质(例如，酪蛋白)的水解。因此，有理由预计该混合物包括类似结构的多肽片段并且因此能够类似地作为金属蛋白酶抑制剂起作用。如在下面进一步解释的那样，可应用公知的酶动力学技术很容易地确定蛋白质水解产物的功能。

[093]在一个实施方案中，在本发明中有用的金属蛋白酶抑制剂是基于它们与所感兴趣的金属蛋白酶的观察到的K_i值选择的竞争性抑制剂。因此，在一个实施方案中，可应用标准的、公知的稳态酶动力学技术测量本发明蛋白质水解产物的表观K_i。在NprE产生的具有少于约5000Da MW的酪蛋白水解产物的情况下，稳态动力学分析产生约10mM的表观K_i。

[094]如以下实施例2所示，中性金属蛋白酶产生的酪蛋白水解产物组合物作为酶的竞争性抑制剂起作用。在一个实施方案中，本发明预期应用展示出小于约15mM、约10mM、约5mM、约0.5mM或更低的表观K_i的蛋白质水解产物。测量表观K_i值是因为酶产生的水解产物组合物的这样的性质，即它们是肽的异质混合物，并且一些肽似乎作为弱抑制剂起作用或完全不抑制酶。

[095]在相对纯化、相对同质的蛋白质水解产物组合物的情况下，预期测量的K_i低约100倍至1000倍，在K_i～1-10μM的范围。

[096]一般地，本发明预期当金属蛋白酶在这样浓度抑制剂存在中时发生最佳的抑制，其中所述抑制剂浓度是用所述金属蛋白酶测量的该抑制剂K_i值的约5倍至约10倍，约5倍至约100倍或更高。

[097]基于蛋白质水解产物在洗涤剂制剂中作为金属蛋白酶抑制剂的作用，本发明还预期了抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物，其可用作制备液态洗涤剂制剂的前体，或用于涉及清洁组合物的其它应用。在这一实施方案中，本发明提供了抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物，其包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶，其中竞争性抑制剂结合至少约90％的所述中性金属蛋白酶分子。这一抑制剂稳定的组合物可以是液体或干燥(例如，颗粒)制备物。在另一实施方案中，抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物在包封的颗粒中。

[098]干燥组合物的制备包括首先通过使溶液中的酶与蛋白质底物(如酪蛋白)或与蛋白质水解产物(例如，Amisoy)接触来制备抑制剂结合的酶，所述蛋白质底物或蛋白质水解产物的浓度将导致至少约90％的金属蛋白酶分子与水解产物抑制剂结合。然后干燥这一溶液，例如通过冻干、冷冻干燥和/或其它蛋白质制剂领域公知的技术。然后任选地储存这一得到的干燥的抑制剂结合的酶组合物，用于通过用水和其它洗涤剂制剂组分重构制备抑制剂稳定的金属蛋白酶液体洗涤剂制剂中的随后应用。

[099]备选地，该抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物可用于制备包封的颗粒制剂。

[0100]因此，在另一实施方案中，抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物用于通过以下方法制备洗涤剂制剂，所述方法为将所述组合物与(a)水；(b)约0.1％至约75％重量的洗涤剂表面活性剂；(c)约5％至约15％重量的丙二醇；以及(d)约0.5mM至约5.0mM的Ca²⁺离子组合。

[0101]因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含中性金属蛋白酶和抑制剂的抑制剂稳定的中性金属蛋白酶制剂，其中所述的抑制剂是由所述酶产生的蛋白质水解产物，并且制剂中的抑制剂浓度是该蛋白质水解产物与该中性金属蛋白酶的表观K_i的至少约5倍。在一个实施方案中，表观K_i是约5mM至约15mM，并且在制剂中使用的蛋白质水解产物浓度是至少约25mM，约35mM，约50mM或更高。

[0102]在本发明的制剂或组合物中所使用的抑制剂的绝对量可以依据抑制剂的结合亲和力(即，K_i)、抑制剂分子量、酶浓度和其它因素而不同。然而，一般地，在与应用该制剂用于洗涤相关的任意稀释之前，本发明液体洗涤剂制剂实施方案中应用的抑制剂的量为约0.01％至约15％，约0.05％至约5％，或约0.1％至约2.5％重量。

[0103]在一个备选的实施方案中，可工程化特定的蛋白质底物(例如，应用位点定向诱变)，使得一旦经历通过特定中性金属蛋白酶的酶转化，其提供具有更合适的抑制特性的水解产物。可应用这一变体蛋白质底物制备抑制剂稳定的中性金属蛋白酶组合物。

共表达蛋白质底物以稳定中性金属蛋白酶的载体和宿主细胞

[0104]在一个实施方案中，本发明提供了包含中性金属蛋白酶基因和蛋白质底物基因的表达载体，其中通过所表达的中性金属蛋白酶将该蛋白质底物基因产物酶促转化以产生蛋白质水解产物抑制剂。然后可将包含中性金属蛋白酶基因和蛋白质底物基因的克隆载体引入到宿主细胞中(通过细胞转化或转染领域的公知技术)，并用于共表达该两种蛋白基因产物。

[0105]由于蛋白质底物与中性金属蛋白酶共表达，该蛋白质底物能立即被金属蛋白酶酶促转化，由此产生蛋白质水解的产物(即，蛋白质水解产物)。如本文所描述的那样，产生的蛋白质水解产物然后能够抑制中性金属蛋白酶，导致对于新表达的酶的针对自溶降解的较大的保护。

[0106]在这一实施方案中，共表达载体包含对于有效基因表达的必要元件(例如，与感兴趣的基因有效连接的启动子)。在一些实施方案中，如果其能被识别的话(例如，被宿主转录)，这些必要元件可作为该基因自身同源的启动子提供，转录终止子(对于真核宿主细胞的多腺苷酸化区)是异源的，或由该中性金属蛋白酶基因的内源终止子区提供。在一些实施方案中，还可包括选择基因，诸如使得通过在含有抗生素的培养基上生长而持续培养维持质粒感染的宿主细胞的抗生素抗性基因。

[0107]在一个优选的实施方案中，使控制蛋白质底物产生的遗传元件有效地与独立的启动子连接，使得该独立的启动子仅增强蛋白质底物而非中性金属蛋白酶蛋白的产量。结果，该载体在合适宿主中的表达导致蛋白质底物基因产物比金属蛋白酶更高量的产量。在发酵肉汤中这一增加的蛋白质底物对金属蛋白酶的比值导致蛋白质水解产物量的升高，由此增强了其与金属蛋白酶分子结合并抑制自溶降解的能力。

[0108]在另一实施方案中，控制中性金属蛋白酶和蛋白质底物产生的遗传元件在转化至单个宿主的分开的载体(例如，质粒)上。在这一实施方案中，也优选蛋白质底物基因与这样的启动子有效的连接，其中所述启动子使得其比金属蛋白酶产生更大的量。

[0109]在一个实施方案中，选择宿主细胞和载体使得共表达的蛋白质分泌到细胞外发酵肉汤中。

[0110]在一个实施方案中，共表达载体是在宿主细胞中复制的质粒。在一个实施方案中，所使用的质粒包括公知的质粒复制所必须元件。备选地，可设计质粒以整合至宿主染色体中。

[0111]2006年10月12日提交的美国专利申请11/581,102(在此引入作为参考)公开了将来自解淀粉芽孢杆的中性金属蛋白酶NprE重组克隆至质粒载体，并引入到枯草芽孢杆菌宿主中表达和发酵的技术。在本发明的一个实施方案中，使这一NprE表达系统适于共表达NprE酶的蛋白质底物。在一个优选的实施方案中，共表达蛋白质底物是酪蛋白。

洗涤剂制剂和清洁组合物

[0112]本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物可用于配制各种洗涤剂制剂和清洁组合物。这些制剂和组合物可有利地用于例如，洗衣店应用、硬表面清洁、自动碟洗应用、以及化妆品应用，诸如假牙、牙齿、头发和皮肤。然后，由于本发明的中性金属蛋白酶在较低温度的溶液中升高的效果以及较高的颜色安全特征，该抑制剂稳定的组合物理想地适于洗衣店应用。

[0113]除了本文公开的之外，2006年10月12日提交的美国专利申请11/581,102号(引物本文作为参考)公开了适于与本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶应用的大量洗涤剂制剂和清洁组合物。

[0114]除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平均根据该组分或组合物的活性水平指出，并且排除可能存在于可商购源中的杂质，例如残余溶剂或副产品。酶组分重量基于总活性蛋白。除非另外指出，所有百分比和比值均通过重量计算。除非另外指出，所有的百分比和比值均基于总组合物计算。

[0115]在示范性的洗涤剂制剂和清洁组合物中，将酶水平表达为纯酶占总组合物的重量，并且除非另外明确说明，按照占总组合物的重量表达洗涤剂成分。

[0116]在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂和清洁组合物至少包含：(1)表面活性剂，优选非离子或阴离子表面活性剂；(2)基于重量的约10％至约95％的水；(3)金属蛋白酶；以及(4)金属蛋白酶抑制剂。

[0117]在另一实施方案中，这一简单的洗涤剂制剂还可包含选自以下的各种附加物质(即，辅助材料)：额外的表面活性剂、增效助剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉淀助剂、分散剂、额外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合分散剂、粘土除去/抗再沉积剂、光亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构伸缩剂、织物柔软剂、载剂、水溶增溶剂、加工助剂和/或颜料。

[0118]在一个实施方案中，本发明提供了液体洗涤剂制剂，其包含：(a)约1％至约75％重量的表面活性剂；(b)约10％至约95％重量的水；(c)约0.01％至约5％重量的中性金属蛋白酶；以及(d)一定量的中性金属蛋白酶抑制剂，使得在使用前该抑制剂与至少约90％的中性金属蛋白酶分子结合，并且其中该洗涤剂制剂的合适的稀释导致该抑制剂自至少约25％的结合的中性金属蛋白酶分子解离。一般地，当将该液体洗涤剂制剂加入到大体积的洗涤水中导致该洗涤剂制剂200、400、500、600或甚至1000倍稀释时，则发生适当的稀释。

[0119]在这一液体洗涤剂制剂的另一个实施方案中，所述洗涤剂稀释后，超过或等于45％、65％、75％、85％或甚至95％的抑制剂结合的中性金属蛋白酶释放为其无抑制剂形式。在一个实施方案中，为该制剂选择的抑制剂在约pH 6.5至约pH 11，优选约pH 7.5至约pH 9.5以约5mM至约15mM的表观K_i竞争性地抑制所述中性金属蛋白酶。在一个优选的实施方案中，所述液体洗涤剂制剂包含在pH8.0具有约10mM的表观K_i的蛋白质水解产物抑制剂。

[0120]在本发明提供的液体洗涤剂制剂的一个实施方案中，所选择的金属蛋白酶抑制剂是蛋白质水解产物。在一个优选的实施方案中，金属蛋白酶抑制剂是通过金属蛋白酶水解蛋白质制备的蛋白质水解产物。在另一实施方案中，金属蛋白酶是NprE，并且所述抑制剂是通过NprE产生的牛奶酪蛋白水解产物。在另一个实施方案中，抑制剂是选自以下的蛋白质水解产物：小麦谷蛋白水解产物(例如，HyPep 4601^TM)、大豆蛋白酸水解产物(例如，Amisoy)、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物(例如，Amicase)、来自植物蛋白的酶水解产物(例如，蛋白胨)、和它们的任意组合。

[0121]用本发明的蛋白质水解产物抑制剂稳定的中性金属蛋白酶制剂特别适于在重垢液态(HDL)洗涤剂制剂中应用。

[0122]在一个实施方案中，可将本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物整合至HDL洗涤剂制剂中，其中该HDL洗涤剂制剂包含：约30％至60％重量的水；分别为约45％至约15％重量的活性物质；以及其中HDL洗涤剂制剂与抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物的比值是体积比约9比1。

[0123]在一些实施方案中，该HDL制剂包含约33％至53％，约35％至51％、约36％至44％重量的水。在一些实施方案中，该HDL制剂包含低至40％、38％、36％、34％、32％、30％或更低％重量的水。

[0124]在一个实施方案中，本发明的HDL洗涤剂制剂还包含约5％至15％、约7.5％至12.5％或至少约10％的聚丙二醇。

[0125]在一个实施方案中，本发明的HDL洗涤剂制剂包含约20％至约50％重量的表面活性剂。在一些实施方案中，该HDL制剂包含选自以下的表面活性剂的混合物：C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4)、烷基苯磺酸钠(例如，Nacconol 90G)、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(例如，Steol CS-370)、和它们的任意组合物。在一些实施方案中，该HDL制剂包含选自烷基苯磺酸盐、烷基醚硫酸盐和烷基聚氧乙烯醚的一种或多种表面活性剂。

[0126]在一个实施方案中，本发明的HDL洗涤剂制剂包含约35％至约52％重量的水，以及约24％至约40％重量的表面活性剂，其中所述的表面活性剂包含：Nacconol 90G、Alfonic 1012-6和Steol CS-370。在另一实施方案中，HDL制剂(假设总共90份)中水和表面活性剂的具体体积比为约：30份水、17份Nacconol 90G、13份Alfonic 1012-6和10份SteolCS-370。本领域技术人员将能立即认识到可应用类似量的等同表面活性剂制备本发明中有用的备选的HDL制剂。

[0127]表1-5(如下)列出了可在本发明中应用的一系列示范性通用HDL制剂的配方。这些一般的制剂具有不同量的水和其它活性成分的量，并且被配制用于90份的洗涤剂对10份的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物。在一个优选的实施方案中，液体洗涤剂制剂包含抑制剂稳定的金属蛋白酶(优选地，蛋白质水解产物稳定的金属蛋白酶)以及如表1-5所列出配方相同比例的任一个通用HDL洗涤剂制剂的组分。

表1：通用HDL洗涤剂制剂：DW-CR、DW-CS和DW-CT

¹包括Hetoxol LA7、Hetoxol LA4、Nacconol 90G和Steol CS370，全部均被认为是100％活性。

²包括除了在硼砂、硼酸、乙醇和Steol CS370中存在的水之外添加的水。从Na₂B₄O₅(OH)₄·8H₂O计算来自硼砂和硼酸的水。

表2：通用HDL洗涤剂制剂：DW-AA、DW-AF和DW-AK

¹包括Hetoxol LA7、Hetoxol LA4、Nacconol 90G和Steol CS370，全部均被认为是100％活性。

²包括除了在硼砂、硼酸、乙醇和Steol CS370中存在的水之外添加的水。从Na₂B₄O₅(OH)₄·8H₂O计算来自硼砂和硼酸的水。

表3：通用HDL洗涤剂制剂：DW-CO、DW-CP和DW-CQ

¹包括Hetoxol LA7、Hetoxol LA4、Nacconol 90G和Steol CS370，全部均被认为是100％活性。

²包括除了在硼砂、硼酸、乙醇和Steol CS370中存在的水之外添加的水。从Na₂B₄O₅(OH)₄·8H₂O计算来自硼砂和硼酸的水。

³“TSP”＝十二水合正磷酸三钠，0.25M氢氧化钠。

表4：通用HDL洗涤剂制剂：DW-BL、DW-BN和DW-BP

¹包括Hetoxol LA7、Hetoxol LA4、Nacconol 90G和Steol CS370，全部均被认为是100％活性。

²包括除了在硼砂、硼酸、乙醇和Steol CS370中存在的水之外添加的水。从Na₂B₄O₅(OH)₄·8H₂O计算来自硼砂和硼酸的水。

³“TSP”＝十二水合正磷酸三钠，0.25M氢氧化钠。

表5：通用HDL洗涤剂制剂：DW-BV和DW-CF

¹“TSP”＝十二水合正磷酸三钠，0.25M氢氧化钠。

[0128]上表中公开的通用HDL制剂配方不预期是限制性的。在一个实施方案中，它们的任一个均可用作制备包括各种额外辅助材料的商业HDL制剂的基础。然而，可将本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物整合至本领域已知的任意其它适合的HDL制剂。此类HDL制剂可以包括缓冲液、表面活性剂和/或其它辅助材料的各种不同组合。

[0129]本发明的洗涤剂制剂、清洁组合物和清洁添加物需要有效量的金属蛋白酶。在一些实施方案中，通过添加一种或多种金属蛋白酶达到酶的所需水平。一般地，基于100％活性的酶，本发明的洗涤剂制剂应当包含洗涤之前(即，储存形式)的洗涤剂制剂的约0.0001-10％重量、更优选约0.001-5％重量、以及最优选约0.01-2.0％重量的金属蛋白酶量。当制备符合本发明的任意制剂时，应当考虑酶的活性。

[0130]在一些优选的实施方案中，一般地如此配制本文提供的洗涤剂制剂和清洁组合物，使得在水性清洁操作中使用时，洗涤水具有约5.0至约11.5的pH，或在备选的实施方案中，甚至是约6.0至约10.5。在一些优选的实施方案中，一般地配制液体产品制剂以具有约3.0至约9.0的净pH，而在一些备选的实施方案中，该制剂具有约3至约5的净pH。在一些实施方案中，一般地配制颗粒洗衣店产品以具有约8至约11的pH。将pH控制在推荐使用水平的技术包括应用缓冲液、碱和酸等，并且是本领域公知的。

包封的颗粒制剂

[0131]在一些实施方案中，抑制剂稳定的中性金属蛋白酶可应用于颗粒组合物或液体中，其中与抑制剂复合的中性金属蛋白酶以包封的颗粒的形式以在储存期间保护其不与其它组分接触。包封提供了在清洁过程期间控制抑制剂稳定的中性金属蛋白酶利用率的其它方式，并且可以增强抑制剂稳定的中性金属蛋白酶的功效。预期本发明的包封的抑制剂稳定的中性金属蛋白酶可用于各种环境。还预期可应用本领域已知的任何合适的包封材料和方法包封抑制剂稳定的中性金属蛋白酶。

[0132]在一些优选的实施方案中，包封材料一般地至少包封一部分抑制剂稳定的中性金属蛋白酶。在一些实施方案中，包封材料是水可溶的和/或水可分散的。在一些额外的实施方案中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。(更多有关玻璃化转变温度的信息例如参见，WO97/11151，尤其是从第6页25行至第7页第2行)。

[0133]在一些实施方案中，包封材料选自：碳水化合物、天然或合成树胶、几丁质和脱乙酰壳多糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡、和它们的组合物。在包封材料是碳水化合物的一些实施方案中，其选自：单糖、寡糖、多糖、和它们的组合。在一些实施方案中，包封材料是淀粉(对于一些示范性的合适淀粉，例如参见EP 0922499、US 4,977,252、US 5,354,559和US 5,935,826)。

[0134]在其它实施方案中，包封材料包含制备自塑料的微球体(例如，热塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、和它们的混合物；可用的商业可获得的微球体包括但不限于：EXPANCEL

[CascoProducts，Stockholm，Sweden]、PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、EXTENDOSPHERES

和Q-CEL

[PQ Corp.，Valley Forge，PA]、LUXSIL

和SPHERICELl

[Potters Industries，Inc.，Carlstadt，NJ andValley Forge，PA])。

清洁添加物制剂

[0135]本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物可用于清洁物添加制剂。当期望附加的漂白效果时，包括至少一种本发明的酶的清洁添加产品理想地适于包含在洗涤程序中。此类情况包括但不限于低温溶液清洁应用。该添加物产品以其最简单的形式可以是一种或多种如本发明提供的抑制剂稳定的中性金属蛋白酶。在一些实施方案中，以剂量形式包装该添加物用于添加至清洁程序中，其中应用了过氧化物源并且期望增加的漂白效果。在一些实施方案中，所述的单剂量形式包含：丸剂、片剂、软胶囊或其它单剂量形式(包括预计量的粉末和/或液体)。

[0136]在一些实施方案中，包括填充剂和/或载体材料，以增加此类组合物的体积。合适的填充剂或载体材料包括但不限于：各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石粉、粘土等。在一些实施方案中，用于液体组合物的填充剂和/或载体材料包括水和/或低分子量伯醇或仲醇，包括多元醇和二醇。此类醇的实例包括但不限于：甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物包含约5％至约90％的此类材料。在其它的实施方案中，应用酸性填充剂以降低组合物的pH。在一些备选的实施方案中，所述清洁添加物包括至少一种如下所描述的活化的过氧化物(peroxygen)源和/或如下面更详细描述的辅助剂组分。

制备和应用洗涤剂制剂和清洁组合物的方法

[0137]本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物可以配制为任何合适的洗涤剂制剂或清洁组合物，并且可应用配制者选择的任意合适的方法。此类配制方法时本领域公知的。例如，参见U.S.5,879,584、U.S.5,691,297、U.S.5,574,005、U.S.5,569,645、U.S.5,565,422、U.S.5,516,448、U.S.5,489,392、U.S.5,486,303、U.S.4,515,705、U.S.4,537,706、U.S.4,515,707、U.S.4,550,862、U.S.4,561,998、U.S.4,597,898、U.S.4,968,451、U.S.5,565,145、U.S.5,929,022、U.S.6,294,514和U.S.6,376,445，每一个均在此引入作为参考。

[0138]在优选的实施方案中，本发明的洗涤剂制剂和清洁组合物可用于洗涤织物和/或表面。在一些实施方案中，所述表面和/或织物的至少一部分与本发明至少一个实施方案的清洁组合物(以净形式或稀释于洗涤溶液中)接触，并且然后任选地洗涤和/或漂洗该表面和/或织物。为本发明的目的，“洗涤”包括但不限于：擦洗和机械搅拌。可通过本发明的制剂清洁的织物包含能够在普通消费者使用条件下洗涤的任何织物。

[0139]在优选的实施方案中，以在溶液中约500ppm至约15,000ppm的浓度使用本发明的洗涤剂制剂和清洁组合物。在其中洗涤溶剂是水的一些实施方案中，水温一般为约5℃至约90℃。在一些用于织物清洁的实施方案中，水与织物的质量比一般为约1∶1至约30∶1。

对本发明有用的辅助材料

[0140]尽管对本发明的目的不重要，但在一些实施方案中，本文描述的辅助剂的非限制性列表适用于本发明的清洁组合物中。实际上，在一些实施方案中，将辅助剂整合到本发明的清洁组合物中。在一些实施方案中，辅助材料协助和/或增强清洁功效、处理待清洁的底物、和/或修饰清洁组合物的美观(例如，香料、着色剂、染料等)。应当理解，将此类辅助剂添加至包含本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶组合物的制剂和组合物中。这些额外组分的确切性质、其掺入水平取决于组合物的物理形式和待应用其的清洁操作性质。

[0141]合适的辅助材料包括但不限于：表面活性剂、增效助剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉淀助剂、分散剂、额外的酶、和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合分散剂、粘土移除/抗再沉积剂、光亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构伸缩剂、织物柔软剂、载体、水溶增溶剂、加工助剂和/或颜料。

[0142]除了本文明确提供的那些之外，其它的辅助材料是本领域公知的(例如参见，美国专利号5,576,282、6,306,812B1和6,326,348B1)。在一些实施方案中，前述的辅助剂成分构成了本发明制剂和组合物的平衡。

[0143]表面活性剂-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂或表面活性剂系统，其中所述的表面活性剂选自：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、和它们的混合物。可用于本发明的抑制剂稳定的金属蛋白酶洗涤剂制剂的示范性表面活性剂，单独地或以混合物形式包括：C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4)、烷基苯磺酸钠(例如，Nacconol 90G)、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(例如，Steol CS-370)。

[0144]在一些低pH清洁组合物实施方案(例如，具有约3至约5净pH的组合物)中，该组合物一般不含有烷基乙氧基化物硫酸盐，因为据信在此类酸性条件下，这一类表面活性剂可被该组合物水解。

[0145]在一些实施方案中，表面活性剂以清洁组合物重量的约0.1％至约75％重量的水平存在，而在备选的实施方案中，该水平是约1％至约50％，在其它实施方案中，该水平是约5％至约40％。

[0146]增效助剂-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂增效助剂或增效助剂系统。在一些掺入至少一种增效助剂的实施方案中，该清洁组合物包含清洁组合物重量的至少约1％、约3％至约60％，甚至约5％至约40％的增效助剂。

[0147]增效助剂包括，但不限于：多磷酸的碱金属盐、铵盐和烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐增效助剂聚羧酸酯化合物、醚羟基聚羧酸酯、马来酐和乙烯或乙烯基甲醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸、和羧甲氧琥珀酸，聚乙酸的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐，诸如乙二胺四乙酸和氨三乙酸、和聚羧酸酯，诸如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧联二琥珀酸、聚苹果酸、苯1，3，5-三羧酸、羧甲氧基琥珀酸及其可溶盐。实际上，预期任意适合的增效助剂都可应用在本发明不同的实施方案中。

[0148]螯合剂-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。适当的螯合剂包括但不限于：铜、铁和/或锰螯合剂、和它们的混合物。在应用了至少一种螯合剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含目标清洁组合物的约0.1％至约15％或甚至约3.0％至约10％重量的螯合剂。

[0149]沉淀助剂-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种沉淀助剂。合适的沉淀助剂包括但不限于：聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸酯、土壤释放聚合物诸如聚对苯二甲酸、粘土诸如高岭石、蒙脱石、活性白土、伊利石、斑脱土、埃洛石、和它们的混合物。

[0150]染料转移抑制剂-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合染料转移抑制剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。

[0151]在其中应用了至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包括该清洁剂组合物的约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或甚至约0.1％至约3％重量的染料转移抑制剂。

[0152]分散剂-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种分散剂。合适的水溶性有机分散剂材料包括但不限于：同-或共-聚合酸或它们的盐，其中多聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此隔开的羧基。

[0153]酶-在一些实施方案中，除了本文所述的金属蛋白酶外，本发明的清洁组合物还包含一种或多种洗涤剂酶，其提供清洁功效和/或织物护理益处。合适的酶的实例包括但不限于：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、单宁分解酶、戊聚糖酶、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。在一些实施方案中，酶的组合(即“鸡尾酒”(混合物))包含与所应用的淀粉酶联合应用的通常可应用的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶。

[0154]酶稳定剂-在本发明的一些实施方案中，稳定本发明的洗涤剂制剂中使用的酶。预期各种酶稳定技术均可用于本发明。例如，在一些实施方案中，通过在提供此类离子给酶的已完成的组合物中存在的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)的水溶性源稳定本文应用的酶，以及其它金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))。

[0155]催化金属复合物-在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化金属复合物。在一些实施方案中，应用含有金属的漂白催化剂。在一些优选的实施方案中，所述金属漂白催化剂包含这样的催化系统，所述催化系统包含确定金属催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、几乎不具有或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)以及具有用于催化和辅助金属阳离子的明确的稳定常数的隔离物，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)和其可水溶盐。(例如参见U.S.4,430,243)。

[0156]在一些实施方案中，通过锰化合物的方式催化本发明的清洁组合物。此类化合物和使用水平是本领域公知的(例如参见U.S.5,576,282)。在其它的实施方案中，在本发明的清洁组合物中使用钴漂白催化剂。各种钴漂白催化剂是本领域公知的。(例如参见U.S.5,597,936和U.S.5,595,967)。通过已知方法能很容易地制备此类钴催化剂(例如参见：U.S.5,597,936和U.S.5,595,967)。

[0157]在其它实施方案中，本发明的清洁组合物包括大的多环刚性配体(“MRL”)的过渡金属复合物。作为实用物质，并且不以限制性的方式，在一些实施方案中，调节本发明提供的组合物和清洁过程以在水性洗涤介质中提供约至少一亿分之一的活性MRL物质，并且在一些优选的实施方案中，在洗涤水溶液中提供约0.005ppm至约25ppm、更优选约0.05ppm至约10ppm、以及最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。

[0158]在瞬时过渡金属漂白催化剂中优选的过渡金属包括但不限于：锰、铁和铬。优选的MRL还包括但不限于桥联的特殊极端刚性配体(例如，5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷)。通过已知方法可很容易地制备合适的过渡金属MRL。(例如，参见WO 00/32601和U.S.6,225,464)。

实施例

[0159]提供以下的实施例以阐明和进一步说明本发明的一些优选实施方案和方面，并且不能理解为是对本发明范围的限制。

[0160]在以下的实验公开中，应用了以下简写：℃(摄氏度)；rpm或RPM(每分钟转速)；Da(道尔顿)，kDa(千道尔顿)；g(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；OD₂₈₀(在280nm的光密度)；OD₄₀₅(在405nm的光密度)；OD₆₀₀(在600nm的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N，N，N′N′-四乙酰乙二胺)；MES(2-吗啉代甲磺酸；一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671))；CaCl₂(氯化钙，无水；f.w.110.99；Sigma#C-4901)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺，f.w.73.09，d＝0.95)；w/v(重量比体积)；v/v(体积比体积)；NprE(中性金属蛋白酶)；PMN(纯化的MULTIFECT金属蛋白酶)。

[0161]在下述实施例中使用了以下测试法。

A.用于NprE浓度确定的应用96孔微量滴定板(MTP)的布来得福特测试法(Bradford assay)。

[0162]在96孔MTP板中开发了布来得福特测试法，并且用于确定在以下实施例中应用的样本中的NprE蛋白酶浓度。

[0163]在这一布来得福特测试法系统中，应用了以下化学物质和试剂溶液：快速启动布来得福特染料试剂(BIO-RAD，#500-0205)；稀释缓冲液：10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％TWEEN

-80。

[0164]所使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman)和SpectraMAX(340型)MTP读数器；MTP来自Costar(9017型)。

[0165]在测试中，将200μl布来得福特染料试剂吸至每一孔中，然后吸入15μl稀释溶液。最后加入10μl过滤的培养肉汤至孔中。

[0166]充分混合后，在室温下温育该MTP至少10分钟。吹去可能的气泡，并且在595nm处测量孔的OD。

[0167]为确定蛋白质浓度，从样本读数减去背景读数(即，来自对照孔)。得到的OD₅₉₅值提供了样本中蛋白质含量的相对测量。NprE校准线在0至5μg之间的线性使得能够应用OD₅₉₅nm值作为蛋白质含量的相对测量。因为在上清液中NprE的预期含量是200-300μg/ml，在测试中应用的10μl样本体积含有少于5μg蛋白，使得值在线性范围。

B.AGLA测试法用于确定NprE活性和抑制动力学

[0168]以下描述的“AGLA”测试法产生可重复的中性金属蛋白酶活性(例如，NprE)。尽管可使该测试法适于给定的实验室条件，然而通过改良方法获得的任何数据应当与通过原始方法产生的结果一致。

[0169]中性金属蛋白酶切割Abz-AGLA-Nba(2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苄基酰胺；f.w.583.65；可作为#H-6675从BaChem AG，Bubendorf，Switzerland获得，或作为目录号#100040-598从VWR获得)的甘氨酸和亮氨酸之间的肽键。溶液中游离的2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酸(Abz-AG)在340nm的最大激发下在415nm处具有最大的荧光发射。Abz-AG的荧光被完整Abz-AGLA-Nba分子中的硝基苄基酰胺淬灭。

[0170]在这些实验中，通过荧光光谱学(λ_eXC＝340nm/λ_emis＝415nm)监测通过蛋白酶切割Abz-AGLA-Nba的Abz-AG的释放。Abz-AG的出现率是蛋白水解活性的测量。在非底物限制的初始速率条件下进行测试法。

测试法设备

[0171]对于可重复的测试法结果，具有温度控制的微量板混合器(例如，Eppendorf Thermomixer)是所需的。在加入酶之前，将测试溶液在微量板混合器中温育至期望的温度(例如，25℃)。将酶溶液加入到混合器中的板中，剧烈混合并迅速转移至板读数器上。

[0172]应用了具有连续记录数据、线性回归分析以及温度控制能力的分光荧光计，例如，SpectraMax M5、Gemini EM(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。使读数器总是维持在期望的温度(例如，25℃)。将该读数器设置为顶部读出荧光检测，并且将激发设置为350nm以及将发射设置为415nm，不使用截止滤片。将PMT设置为中度敏感和每孔5次读数。打开自动校准，但仅在第一次读数前校准。根据选择待监测孔的数量以最小的读数间隔测量测试法3分钟。设置读数器以计算毫RFU/分钟比率(每分钟千分之一相对荧光单位)。用于计算比率的读数数量(V_max点)设置为等于2分钟的数量，如通过读数间隔确定的那样(例如，每10秒读数将使用12个点以计算该比率)。将最大RFU设置为50,000。

[0173]用正位移移液管(Rainin Microman)进行酶和底物储存溶液的所有移液。通过单或多通道空气排代移液管(Rainin LTS)从试管、试剂储存容器或储存微量板移液缓冲液、测试法和酶工作溶液。当使用很少的孔时，应用中继移液管(Eppendorf)以转移测试溶液至微量板孔中，以最小化试剂损失。还可应用自动移液仪器诸如Beckman FX或Cybio Cybi-well用于从工作储存微量板转移酶溶液至测试法微量板，以同时起始整个微量板。

试剂和溶液

[0174]储存MES缓冲液-52.6mM MES/NaOH、2.6mM CaCl₂、pH 6.5：将MES酸(10.28g)和292mg无水CaCl₂溶解于约900ml纯化的水中。用NaOH滴定该溶液至pH6.5(在25℃，或用温度校正pH探针)。将该调节了pH的缓冲液调节为1L总体积。使终溶液过滤通过0.22μm消毒滤器并在室温下保持。

[0175]酶稀释缓冲液-50mM MES，2.5mM CaCl₂，pH 6.5：通过向95mL储存MES缓冲液终加入5mL纯净水生产这一缓冲液。

[0176]酶储存溶液：用酶稀释缓冲液将纯化的NprE酶稀释至约1ppm(1μg/mL)的浓度。将MULTIFECT

中性金属(野生型NprE)稀释至低于6ppm(6μg/mL)的浓度。优选系列稀释。溶液在室温下稳定1小时，但对于更长时间的储存，在冰上维持该溶液。

[0177]底物储存溶液-在DMF中48mM Abz-AGLA-Nba：将约28mg的Abz-AGLA-Nba置于小管中。将其溶解于约1mL DMF中(根据Abz-AGLA-Nba质量，体积将不同)并且漩涡震荡若干分钟。将该溶液避光储存于室温。将Abz-AGLA-Nba溶解于DMF中并且在其制备当天使用。

[0178]底物稀释缓冲液-50mM MES、2.5mM CaCl₂、5％DMF、pH6.5：将5mL纯DMF加入到95mL储存MES缓冲液中。应用这一缓冲液以确定动力学参数。

[0179]测试溶液-50mM MES，2.5mM CaCl₂，5％DMF，2.4mMAbz-AGLA-Nba pH 6.5：将1mL底物储存溶液加入到19mL底物稀释缓冲液中并蜗旋震荡。避光室温保存溶液。

测试法过程

[0180]制备所有的缓冲液、储存液和工作溶液。除非另外指出，一式三份地测试每一酶稀释液。当不完全满时，从板的左边开始以满竖列排列酶工作溶液储存微板(以适应板读数器)。类似地设置相应的测试板。如之前描述的那样设置微板荧光分光计。

[0181]首先，将200μL等分测试溶液置于96孔微量板的孔中。在控制温度的微量板混合器中避光在25℃温育该板10分钟。通过将10μL工作酶溶液从储存微板转移至混合器中的测试微量板中开始该测试。最佳地使用96孔移液或使用8孔多通道移液管从最左边一列开始转移。使溶液剧烈混合15秒(在Eppendorf Thermomixer中900rpm)。马上将测试微量板转移至微量板荧光分光计上并开始在350nm激发和415nm的发射的荧光测量的记录。荧光分光计软件对毫RFU/分钟的线性回归线计算每一孔荧光增加的反应比率。在一些实施方案中，当读取第一块板时，将第二块板置于微量板混合器中用于温度平衡。

[0182]初始速率就直至0.3mM产物的产物浓度(即，释放的2-氨基苯甲酰荧光)而言是线性的，其相应于约22,000RFU的背景荧光下的以2.3mM Abz-AGLA-Nba开始的溶液中的约50,000RFU。

实施例1在较高储存浓度下升高的NprE稳定性

[0183]这一实施例证实当在较高浓度下和/或10％丙二醇(PPG)和CaCl₂的存在下维持中性金属蛋白酶时，发生了该酶稳定性的升高。

[0184]以在pH8.0的10mM HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸))缓冲液中625至10000ppm的浓度范围，制备含有中性金属蛋白酶NprE的样本。除了625ppm NprE浓度的一个对照之外，所有的样本包括10％PPG和0.5mM CaCl₂。在32℃的温度温育所有的样本超过6小时。在不同的时间点应用AGLA活性测试法测量样本的NprE活性。

结果

[0185]如图1所示，具有625ppm NprE且没有添加PPG和CaCl₂的对照样本在开始的2小时内几乎丧失了其全部活性。相反，其它样本的NprE活性维持了多数与较高蛋白质浓度相关的活性。在10,000μg/mL(或ppm)NprE的浓度下，在丧失活性前，该酶几乎维持完全活性达1.5小时。与之相比，625、1250和2500ppm的蛋白质样本显示出降低的活性(在1.5hr时约60％)。与对照样本相比，高浓度样本显示出储存稳定性的显著升高。

[0186]显示升高的NprE稳定性与升高浓度相关的这些结果与通过产物抑制的稳定性一致。

实施例2通过酪蛋白水解产物的NprE抑制

[0187]这一实施例证实了应用中性金属蛋白酶以产生蛋白质水解产物，然后应用该水解产物以通过竞争性抑制稳定该金属蛋白酶。

材料和方法

[0188]在32℃在摇动的温育设备上，在10mL缓冲液(50mM MES，2.5mM CaCl₂，pH 6.5)中用0.4mg/mL中性金属蛋白酶NprE温育100mg/mL的来自牛奶酪蛋白的酪蛋白(目录号#C 7078；Sigma Chemical，St.Louis，MO)。在4℃用装备有SM-24固定角转子的Sorvall RC-5B Plus离心机(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham MA)上以18,000rpm离心得到的消化混合物30分钟，以移除任何未反应的颗粒。离心后，应用Vivaspin 20离心过滤装置(Sartorius AG，德国)使上清液过滤通过5K MWCO膜。收集流过的材料，其应当仅包括分子量低于约5000Da的水解产物(本文中也称为“酪蛋白肽”)。

[0189]应用三硝基苯磺酸(TNBS)测试法定量酪蛋白水解产物，所述测试法应用游离氨基酸作为标准品比色地确定混合物中肽上存在的游离胺。一般地，使10μL样本与60μL在120mM硼酸盐缓冲液(pH9)中的1.2mg/mL TNBS混合，并在50℃温育15分钟。然后用140μL 500mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中和该反应混合物。在420nm处监测颜色变化，针对氨基酸标准品(目录号#AAS18；Sigma Chemical，St.Louis，MO)校准。应用该定量的酪蛋白水解产物混合物以产生储存溶液，用于进行以下的NprE抑制动力学研究。

[0190]应用上述通用的GALA活性测试法进行通过酪蛋白水解产物混合物的NprE抑制剂动力学，但是在测试混合物中存在各种浓度的酪蛋白水解产物。制备标准米氏(Michaelis-Menten)酶促速率图，用于产生酪蛋白水解产物的各种动力学常数，包括表观K_i。测试溶液是具有2.5mMCaCl₂和0.005％Tween 80的在室温pH 6.5的50mM MES缓冲液。

结果

[0191]图2显示了通过上述产生并分离的酪蛋白水解产物对NprE的抑制。图2A-2D显示了针对荧光AGLA底物的酪蛋白水解产物抑制作用的标准米氏动力学图。图2B显示了共有共同的y-截距的双倒数图，其表明蛋白质水解产物作为NprE的竞争性抑制剂起作用。图2C和2D分别描述了表观K_m和双倒数图斜率图。

[0192]这些结果表明由NprE消化奶酪蛋白产生的酪蛋白水解产物混合物也是具有～10mM表观Ki的NprE的蛋白质水解产物抑制剂。

实施例3在液体洗涤制剂中升高的NprE稳定性

[0193]这一实施例证实了应用一系列蛋白质水解产物以稳定含有中性金属蛋白酶的洗涤剂制剂。

材料

[0194]从Sigma Chemical(St.Louis，MO)获得以下蛋白质水解产物，并且不经过进一步纯化即使用：来自小麦谷蛋白的HyPep 4601^TM蛋白质水解产物(目录号#H 6784)；Amisoy，大豆蛋白酸水解产物(目录号#S 1674)；Amicase，牛奶酪蛋白酸水解产物(目录号#A 2427)，以及

蛋白胨，来自植物蛋白的酶水解产物(目录号#P 0431)。来自牛奶的酪蛋白(目录号#C7078；Sigma Chemical，St.Louis，MO)用于通过NprE水解。

蛋白质水解产物储存溶液

[0195]应用商业获得的试剂以在10mM HEPES(pH 8.0)中70mg/ml的浓度制备蛋白质水解产物储存溶液。

[0196]通过用在具有2.5mM CaCl₂的50mM MES缓冲液(pH 6.5)中的8mg/mL NprE在37℃消化酪蛋白产生牛奶酪蛋白水解产物。通过离心、随后通过用MWCO 5kDa膜透析移除未消化的材料。收集流过的材料，分装并储存于-20℃用于进一步应用。通过三硝基苯磺酸(TNBS)肽测试法(如实施例2)确定酪蛋白水解产物为～90mM肽。

重垢液体(HDL)洗涤剂制备

[0197]在这一实施例中使用的HDL洗涤剂制剂是：DW-CT。这一制剂具有37％的水含量并且设计以占有90％体积，有10％的空间(体积)以添加诸如稳定剂或酶的组分。根据如上表1所示配方制备。

[0198]应用10％DW-CT洗涤剂制剂进行测试法，通过使5mLDW-CT(如表1配制)、1mL 500mM HEPES(pH 8.0)、44mL蒸馏水混合而制备所述制剂。

稳定性测试法样本制备

[0199]应用5种不同的候选蛋白质水解产物制备稳定性测试法样本，以及以没有加入抑制剂作为对照。

[0200]一般而言，用10μL 50mg/mL NprE储存溶液与20μL抑制剂储存溶液预混合。然后，将220μL在10mM HEPES中的10％DW-CT洗涤剂制剂加入到每一样本中，使得终NprE浓度为2mg/mL。在32℃在Thermomixer(Eppendorf)中的微量滴定板中温育样本。

[0201]每一样本中酶的终浓度为2mg/mL NprE。在它们相应样本中的抑制剂终浓度分别为5.6mg/mL Amisoy、Amicase、HyPep 4601或

蛋白胨；或7.2mM酪蛋白水解产物混合物(基于12.5倍稀释)。DW-CT洗涤剂制剂的最终稀释为9％。

剩余的AGLA活性分析

[0202]应用通用AGLA活性测试法(除了所应用的测试溶液是50mMMES、2.5mM CaCl₂、0.005％Tween 80，pH 6.5之外)在不同的时间点测量每一个稳定性测试样本(如上制备)的剩余NprE活性。发现在超过9000倍稀释范围内剩余AGLA活性测试是线性的。

稳定性测试法样本的SDS-PAGE

[0203]作为通过抑制剂提供的抗NprE自溶的保护水平的独立测量，对每一稳定性测试样本进行SDS-PAGE分析以确定剩余的完整NprE对自溶产物的相对量。

[0204]在稳定性测试法温育期间的终点(t＝200min)，取10μL每一样本并用200μL 1N HCl淬灭。马上加入200μL 5％TCA。在冰上进行TCA沉淀20分钟。通过离心收集沉淀并且进一步用冰冷的90％丙酮洗涤。然后将该沉淀重悬于1.5×样本上样缓冲液中，并在95℃加热5分钟。然后将样本上样至4-12％SDS-PAGE凝胶。应用本领域公知的SDS-PAGE标准方案进行电泳以及用考马斯蓝染料进行的凝胶可视化。

结果

[0205]如图3所示，当在HDL洗涤剂制剂DW-CT中温育时，金属蛋白酶NprE在约一个小时内丧失了其最初活性的超过80％。往相同的NprE洗涤剂制剂中加入蛋白质水解产物抑制剂显著地改善了该酶的稳定性。例如，含有Amisoy(大豆蛋白酸水解产物)、NprE消化的酪蛋白水解产物、HyPep 4601^TM(小麦谷蛋白水解产物)、Amicase(酪蛋白酸水解产物)和

蛋白胨(植物蛋白水解产物)的洗涤剂制剂全部都显示出显著的剩余NprE活性。Amisoy导致最稳定的NprE HDL洗涤剂制剂，其3小时后有超过50％的剩余活性。加入了酪蛋白水解产物的制剂也表现非常好，3小时后仍然展示出40％活性。

[0206]在200分钟处的稳定性测试样本的SDS-PAGE结果表明蛋白质水解产物Amisoy和酪蛋白水解产物提供了最强的抗洗涤剂制剂中NprE自溶的保护。这些蛋白质水解产物稳定的能力得到了以下事实的证实：这些样本的SDS-PAGE显示了单条强NprE条带，没有可检测的表明自溶产物的低分子量条带。实际上，该NprE条带强度与没有温育的对照NprE样本是相当的。相比而言，没有用任何抑制剂温育的NprE样本的SDS-PAGE显示几乎没有可检测的NprE条带，表明在该洗涤剂制剂中200分钟后，未保护的NprE几乎全部降解。HyPep 4601蛋白质水解产物样本也显示出单条强NprE条带，很少或没有可见的低分子量产物，尽管该条带没有Amisoy和酪蛋白水解产物的那么强。蛋白质水解产物Amicase和

蛋白胨在SDS-PAGE上显示了NprE条带，但仅比没有抑制剂温育的样本中的NprE条带稍微更亮。因此，SDS-PAGE结果与应用AGLA测试法测量的剩余NprE活性一致(如图3所示)。

[0207]在本说明书中提到的所有专利和申请指示本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利和申请均在此引入作为参考，就如同具体地指出每一申请并且个别地表明引入作为参考的同样的程度。

[0208]尽管阐明并描述了本发明的特定实施方案，然而本领域技术人员显而易见地是，在不背离本发明精神和范围的情况下，可以进行各种其它的改变和修饰。因此，预期在所附权利要求中覆盖所有此类在本发明范围内的改变和修饰。

[0209]本文中举例说明地描述的本发明可以适宜地在本文中未具体公开的任何元件、限制条件不存在的情况下实施。已使用的术语和表述用作描述性而不是限定性术语，并且在此类术语和表述的使用中无意排除所显示的和描述的特征的任何等同物或其部分，但承认各种改变可能落入所要求保护的本发明的范围内。因此，应当理解，虽然本发明已参考一些实施方案和任选特征进行具体地公开，但本领域技术人员可采取本文中公开的概念的改变和变化形式，此类改变和变化被认为落入所附权利要求界定的本发明的范围内。

[0210]本发明已在本文中进行了广泛和一般性地描述。落在该上位描述中的每一个较窄的下位和次上位概念也形成本发明的一部分。这包括带有从中去除任何主题的条件或负面限制的本发明的上位描述，无论该去除的主题是否在本文中曾有过具体述及。

Claims (30)

1.液体洗涤剂制剂，其包含：

(a)约1％至约75％重量的表面活性剂；(b)约10％至约95％重量的水；(c)约0.01％至约5％重量的中性金属蛋白酶；以及(d)一定量的中性金属蛋白酶抑制剂，使得在使用前该抑制剂与至少约90％的中性金属蛋白酶分子结合，并且其中该洗涤剂制剂的合适稀释导致该抑制剂从至少约25％的结合的中性金属蛋白酶分子解离。

2.权利要求1的制剂，其中所述洗涤剂制剂的合适稀释导致所述抑制剂从至少约45％的结合的中性金属蛋白酶分子解离。

3.权利要求1的制剂，其中抑制剂的量为约0.01％至约15％重量之间。

4.权利要求1的制剂，其中所述的抑制剂在约pH 7.5至约pH 9.5之间以约5mM至约15mM的表观K_i竞争性地抑制所述中性金属蛋白酶。

5.权利要求1的制剂，其中所述的中性金属蛋白酶分离自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

6.权利要求5的制剂，其中所述的中性金属蛋白酶是NprE。

7.权利要求1的制剂，其中所述的抑制剂是蛋白质水解产物。

8.权利要求7的制剂，其中所述的蛋白质水解产物选自小麦谷蛋白水解产物、大豆蛋白酸水解产物、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物、来自植物蛋白的酶水解产物、和它们的任意组合。

9.权利要求1的制剂，其中所述的抑制剂包含通过用至少一种中性金属蛋白酶消化蛋白质产生的水解产物。

10.权利要求9的制剂，其中所述的水解产物包含少于约5000Da的蛋白质片段。

11.权利要求9的制剂，其中所述的蛋白质是酪蛋白。

12.权利要求1的制剂，其中所述的洗涤剂制剂包含重垢洗涤液体(HDL)制剂。

13.权利要求1的制剂，其中所述液体洗涤剂制剂还包含约5％至约10％的聚丙二醇。

14.权利要求1的制剂，其中所述的液体洗涤剂制剂还包含约0.5mM至约5mM钙离子。

15.权利要求1的制剂，其中所述的液体洗涤剂制剂不包含硼。

16.抑制剂稳定的中性金属蛋白酶组合物，其包含：(a)约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶；以及(b)竞争性抑制剂，其中该竞争性抑制剂与至少约90％的所述中性金属蛋白酶分子结合。

17.权利要求16的组合物，其中所述的竞争性抑制剂是蛋白质水解产物。

18.权利要求17的组合物，其中所述的蛋白质水解产物选自小麦谷蛋白水解产物、大豆蛋白酸水解产物、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物、来自植物蛋白的酶水解产物、和它们的任意组合。

19.权利要求17的组合物，其中所述的蛋白质水解产物是通过用至少一种中性金属蛋白酶消化蛋白质产生的水解产物。

20.权利要求19的组合物，其中所述的水解产物包含少于约5000Da的蛋白质片段。

21.权利要求19的组合物，其中所述的蛋白质是酪蛋白。

22.权利要求16的组合物，其中所述的组合物在包封的颗粒中。

23.权利要求16的组合物，其中所述的抑制剂在约pH 7.5至约pH 9.5之间以约5mM至约15mM的表观K_i竞争性地抑制所述中性金属蛋白酶。

24.权利要求16的组合物，其中所述的中性金属蛋白酶分离自芽孢杆菌属。

25.权利要求16的组合物，其中所述的中性金属蛋白酶是NprE。

26.用于制备抑制剂稳定的液体洗涤剂制剂的方法，其包括：(a)在约pH 6.5至约pH 11的含水缓冲液中、在约22℃至约37℃的温度温育包含至少一种中性金属蛋白酶和蛋白质底物的混合物，由此通过所述中性金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生水解产物；(b)分离分子量少于约5000Da的水解产物；和(c)将步骤(b)的水解产物与包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶的液体洗涤剂制剂合并。

27.权利要求26的方法，其中所述的温育混合物包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶和约5％至约20％重量的蛋白质底物。

28.权利要求26的方法，其中所述中性金属蛋白酶是NprE且蛋白质底物是酪蛋白。

29.权利要求26的方法，其中所述洗涤剂制剂包含HDL洗涤剂制剂。

30.用于制备抑制剂稳定的液体洗涤剂制剂的方法，其包括将蛋白质水解产物与包含约0.001％至约10％重量的中性金属蛋白酶的液体洗涤剂制剂合并，其中如下制备所述的蛋白质水解产物：在约pH 6.5至约pH 11的含水缓冲液中、在约22℃至约37℃的温度温育包含至少一种中性金属蛋白酶和蛋白质底物的混合物，由此通过所述至少一种中性金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生水解产物，并且其中在与所述中性金属蛋白酶合并前分离分子量少于约5000Da的水解产物。

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