CN101668863B

CN101668863B - 使经预处理的含木质纤维素的材料解毒

Info

Publication number: CN101668863B
Application number: CN200880013709.8A
Authority: CN
Inventors: 金绮明; 刘继银; 比约恩·L·P·A·卡斯兰德; 唐纳德·L·希金斯
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc; Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes Inc; Novozymes North America Inc
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: BRPI0810687A2; DK3219804T3; ES2748245T3; ES2390630T3; EP3219804A1; EP2140016B1; CN101668863A; CN104450795A; WO2008134259A1; EP2468876A1; DK2140016T3; US10023881B2; EP3219804B1; US20100273227A1; EP2140016A1; BRPI0810687B1; US20180273984A1

Abstract

本发明涉及使经预处理的含木质纤维素材料解毒的方法，其包括使经预处理的含木质纤维素材料经受一种或多种酚类化合物氧化酶的处理。

Description

使经预处理的含木质纤维素的材料解毒

发明领域

本发明涉及使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的方法。本发明还涉及使用发酵生物体由含木质纤维素的材料生成发酵产物的方法，其包括本发明的解毒方法。

发明背景

由于化石燃料有限的储量和对温室气体排放的担忧，人们越来越多地关注使用可再生能源。由含木质纤维素的材料生成发酵产物在本领域中已知，并且通常包括含木质纤维素的材料的预处理、水解和发酵。预处理导致例如酚类和呋喃由含木质纤维素的材料释放，所述材料在水解和发酵期间可以不可逆地结合加入的酶。这些化合物也可对于发酵生物体的代谢是有毒的，并且抑制发酵生物体的性能。

已经建议通过蒸汽气提而解毒，但是这是一个繁复而昂贵的额外处理步骤。还已经建议在水解前洗涤经预处理的含木质纤维素的材料。这需要大量的水，水需要再次去除，因此也是昂贵的。

因此，需要提供方法，用于使适合于发酵产物生产方法的、经预处理的含木质纤维素的材料解毒。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的方法，其包括使经预处理的含木质纤维素的材料经受一种或多种酚类化合物氧化酶和/或一种或多种表现出过氧化物酶活性的酶的处理。

在第二方面，本发明涉及用于由含木质纤维素的材料生成发酵产物的方法，包括步骤：

(a)预处理含木质纤维素的材料；

(b)水解；

(c)按照本发明的解毒方法进行解毒；和

(d)使用发酵生物体进行发酵。

本发明还涉及用于由含木质纤维素的材料生成发酵产物的方法，包括步骤：

(i)预处理含木质纤维素的材料；

(ii)按照本发明的发酵方法进行解毒；

(iii)水解；和

(iv)使用发酵生物体进行发酵。

附图简述

图1表示漆酶处理对于纤维素转化率的影响。

发明详述

在第一方面，本发明涉及使适合于生成发酵产物的、经预处理的含木质纤维素的材料解毒的方法。

含木质纤维素的材料

本文使用的术语“含木质纤维素的材料”指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。这种材料经常称为“生物质”。

木质纤维素的结构无法直接进行酶水解。因此，必须对木质纤维素进行预处理，例如，通过在合适的压力和温度条件下进行酸水解，从而使木质素的密封结构(seal)断裂并破坏纤维素的晶体结构。这可以引起半纤维素部分的溶解和糖化。然后可以将纤维素部分酶法水解，例如，通过纤维素酶(或纤维素水解酶)，以将糖聚合物转化成可发酵的糖，其可以发酵成为期望的发酵产物，如乙醇。任选地，在发酵后回收发酵产物，例如，通过蒸馏进行。

本发明包括任何含木质纤维素的材料。含木质纤维素的材料可以是包含木质纤维素的任何材料。在一个优选的实施方案中，含木质纤维素的材料包含重量百分比至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％的木质纤维素。应理解的是，含木质纤维素的材料还可以包含其他组分，如纤维素材料，包括纤维素和半纤维素，并且还可以包含其他组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。

通常在例如植物的茎、叶、壳、外皮和穗轴或树的叶、枝和木材中发现含木质纤维素的材料。含木质纤维素的材料还可以是，但不限于，草本植物材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸，和纸浆和造纸厂残余物。在本文应理解的是，含木质纤维素的材料可以是植物细胞壁材料的形式，其在混合的基体中包含木质素、纤维素和半纤维素。

在一个优选的实施方案中，含木质纤维素的材料是玉米纤维、稻草、松木、木屑(wood chip)、杨木、甘蔗渣、纸和纸浆(pulp)处理废物。

其他实例包括玉米秸(corn stover)，硬木，如杨木和桦木，软木，谷草(cerealstraw)，如麦秆(wheat straw)，柳枝稷(switchgrass)，城市固体废物(MSW)，工业有机废物，办公用纸，或它们的混合物。

在一个优选的实施方案中，含木质纤维素的材料是玉米秸。在另一个优选的实施方案中，材料是玉米纤维。

使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的方法

当预处理含木质纤维素的材料时，产生可能抑制酶和/或可能对于发酵生物体有毒的降解产物。这些降解产物严重降低了水解和发酵速率。

用于预处理含木质纤维素的材料的方法在本领域中公知。所包括的方法的实例在下面的“预处理”部分中描述。

本发明的发明人已经发现，能使用酚类化合物氧化酶使经预处理的含木质纤维素的材料解毒。在发酵过程中，由于发酵生物体的性能改善，发酵时间可以减少。换句话说，按照本发明进行的解毒可能使“含木质纤维素的材料至发酵产物”的方法时间更短。此外，在预处理含木质纤维素的材料后，可无需洗涤步骤来去除有毒化合物，和/或无需发酵生物体对培养基/培养液(broth)的适应。而且，发酵生物体的用量可以减少。

在一个优选的实施方案中，可以用纤维素酶(纤维素分解酶)和/或半纤维素酶(半纤维素分解酶)处理经预处理的含木质纤维素的材料。

解毒化合物的特定实例可以在下面的“解毒化合物”中找到。

在第一方面，本发明涉及用于使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的方法，包括使经预处理的含木质纤维素的材料经受一种或多种酚类化合物氧化酶和/或一种或多种表现出过氧化物酶活性的酶的处理。

经预处理的木质纤维素降解产物包括木质素降解产物、纤维素降解产物和半纤维素降解产物。经预处理的木质素降解产物可以是自然界中的酚类。

半纤维素降解产物包括来自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃，包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纤维素的实例包括木聚糖、半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan)、阿拉伯半乳聚糖、阿糖基葡萄糖醛酸基木聚糖(arabinoglucuronoxylan)、葡糖醛酸木聚糖，和它们的衍生物和组合。

抑制化合物(即，经预处理的木质纤维素降解产物)的实例，包括4-OH苯甲醇，4-OH苯甲醛，4-OH苯甲酸，三甲基苯甲醛，2-糠酸，香豆酸，阿魏酸，酚，愈创木酚，藜芦醚，连苯三酚(pyrogallollol)，连苯三酚单甲酯，香草醇，香草醛，异香草醛，香草酸，异香草酸，高香草酸(homovanillic acid)，藜芦醇，藜芦醛，藜芦酸，2-O-甲基五倍子酸，丁香醇，丁香醛，丁香酸，三甲基五倍子酸，高儿茶酚，乙基香草醛，木焦油醇，对甲基苯甲醚，茴香醛，茴香酸，糠醛，羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，甲酸，乙酸，乙酰丙酸，桂皮酸，松柏醛，异丁子香酚，对苯二酚，丁子香酚或它们的组合。其他抑制化合物可以在例如Luo等，2002，Biomass and Bioenergy 22：125-138中找到。

如果解毒与水解同时进行或者与水解和发酵同时进行，本发明的解毒方法可以优选在适合酚类化合物氧化酶和水解酶和/或发酵生物体的pH进行。在一个实施方案中，pH为2-7，优选3-6，特别是4-5。在一个优选的实施方案中，如果解毒与水解同时进行或与水解和发酵同时进行，解毒期间的温度是适合酚类化合物氧化酶和/或表现出过氧化物酶活性的酶和水解酶和/或发酵生物体的温度。在一个实施方案中，解毒期间的温度为25℃-70℃之间，优选30℃-60℃。当解毒与发酵同时进行时，温度将依赖于发酵生物体。对于用酵母进行的乙醇发酵，温度为26-38℃，如26-34℃或30-36℃，如约32℃。

合适的pH、温度和其他工艺条件可以由本领域的技术人员简单地确定。

解毒酶

解毒酶可以是任何来源，包括哺乳动物、植物和微生物来源，如细菌和真菌来源。

在一个优选的实施方案中，酚类化合物氧化酶可以属于下述EC类别中的任一个：儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)、邻氨基酚氧化酶(1.10.3.4)；和单酚单氧合酶(1.14.18.1)。

在一个优选的实施方案中，表现出过氧化物酶活性的酶可以属于下述EC类别中的任一个：过氧化物酶(EC 1.11.1.7)、卤素过氧化物酶(EC 1.11.1.8和EC 1.11.1.10)；木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)；锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)；和脂氧合酶(EC 1.13.11.12)。

本发明包括的解毒酶的实例可以在下面的“酶”部分中找到。

由含木质纤维素的材料生成发酵产物

在第二方面，本发明涉及由含木质纤维素的材料生成发酵产物的方法。将含木质纤维素的材料转化成发酵产物，如乙醇，具有大量原料现成可用的优势，所述原料包括木材、农业残余物、草本作物、城市固体废物，等。

木质纤维素的结构无法直接进行酶水解。因此，含木质纤维素的材料必须预处理，例如，通过在合适的压力和温度条件下酸水解来进行，以使木质素密封结构(lignin seal)断裂并破坏纤维素的晶体结构。这可引起半纤维素和纤维素部分的溶解。然后可以将纤维素和半纤维素酶促水解，例如，通过纤维素酶(纤维素分解酶)进行，以将糖聚合物转化成可发酵的糖，其可以发酵成为期望的发酵产物，如乙醇。任选地，可回收发酵产物，例如，通过蒸馏进行。

更精确地，本发明在这个实施方案中涉及用于由含木质纤维素的材料生成发酵产物的方法，其包括步骤：

(a)预处理含木质纤维素的材料；

(b)水解；

(c)解毒；和

(d)使用发酵生物体进行发酵。

其中解毒按照本发明的解毒方法进行。关于步骤的详细内容在下面的“预处理”、“水解”和“发酵”部分中描述。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于由含木质纤维素的材料生成发酵产物的方法，其包括步骤：

(i)预处理含木质纤维素的材料；

(ii)解毒；

(iii)水解；和

(iv)使用发酵生物体进行发酵。

其中解毒按照本发明的解毒方法进行。

可以在预处理步骤(i)之后，但是在水解步骤(iii)之前加入一种或多种解毒酶。可以在水解之前进行步骤(ii)中使预处理材料的解毒，但是解毒和水解也可以同时进行。解毒步骤(ii)可以与水解分开进行。进一步的水解步骤(iii)和发酵步骤(iv)可以同时或顺序进行。在一个实施方案中，步骤(i)中预处理含木质纤维素材料后，在解毒之前，可以由液体去除/分离固体(主要包含木质素和未转化的多糖)。去除的固体和解毒的液体可以在步骤(iii)中的水解或同时水解和发酵之前合并(combine)。

可以用本领域已知的任何合适的方法去除/分离固体。在合适的实施方案中，通过过滤或通过使用压滤机(filter press)和/或离心机等来去除固体。实施例4中测试了水解酶抑制作用的降低。

预处理

可以以任何合适的方式预处理含木质纤维素的材料。预处理可以在水解和/发酵前和/或期间进行。在一个优选的实施方案中，在发酵前和/或期间和/或解毒前和/或期间，将经预处理的材料水解，优选酶水解。预处理的目的是分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素，并且这种方式可以提高水解速率(rate of hydrolysis)。预处理方法如湿氧化和碱预处理针对(target)木质素，而稀酸和自水解针对半纤维素。蒸汽爆裂(steam explosion)是针对纤维素的预处理的实例。

根据本发明，步骤(a)或(i)中的预处理可以是使用本领域公知技术的常规预处理步骤。合适的预处理的实例在下文描述。在一个优选的实施方案中，预处理在含水浆料中发生。

预处理期间，含木质纤维素的材料可以以10-80重量％，优选20-70％，特别是30-60％，如约50％的量存在。

化学、机械和/或生物预处理

根据本发明，含木质纤维素的材料在水解和/或发酵前可以进行化学、机械和/或生物预处理。机械预处理(经常称作物理处理)可以单独使用或者与随后或同时进行的水解(特别是酶水解)组合使用。

优选地，在水解和/或发酵前进行化学、机械和/或生物预处理。或者，可以与水解同时进行化学、机械和/或生物预处理，如同时加入一种或多种纤维素酶(纤维素分解酶)或下述其他酶活性，以释放例如可发酵糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。

在本发明的实施方案中，经预处理的含木质纤维素的材料可以在解毒之前和/或之后洗涤。然而，洗涤不是必须的，在优选的实施方案中可以去除。

根据本发明的一个实施方案，可以在步骤(c)或(ii)中向经预处理的含木质纤维素的材料加入一种或多种解毒酶。解毒步骤(c)或(ii)和水解步骤(b)或(iii)可以同时或顺序进行。实施例2和3中显示对于发酵生物体的毒性作用降低。

在一个实施方案中，步骤可以在一个处理溶液(即，单浴(one bath))中完成。在一个实施方案中，同时向处理溶液中加入水解酶和解毒酶。在另一个实施方案中，在加入解毒酶之前加入水解酶。可为有利的是向处理溶液加入解毒酶之前，完成50％以上的水解，优选70％以上的水解，特别是90％以上的水解。如果将经预处理的含木质纤维素的材料酶促水解，有利的是在水解前和/或与水解同时进行解毒。然而，如果使用一种或多种酸进行水解，即，酸水解，优选在酸水解后和/或与酸水解同时进行解毒。

在另一个实施方案中，可以分别和水解步骤(b)或(iii)和发酵步骤(d)或(iv)分开进行解毒步骤(c)或(ii)，在一个实施方案中这些步骤可以同时进行。在另一个实施方案中，所有的步骤(b)、(c)和(d)，或(i)、(ii)、(iii)和(iv)分别同时或顺序进行。当解毒作为单独步骤进行时，通常进行1-24小时。

在一个优选的实施方案中，经预处理的含木质纤维素的材料未洗涤。

在一个实施方案中，酚类化合物氧化酶的剂量范围从大于0如0.01至1mg/g DS或者从大于0至100LACU/g DS。在一个实施方案中，表现出过氧化物酶活性的酶的剂量范围从大于0如0.01至10mg/g DS或者大于0如0.01至100PODU/g DS。

化学预处理

术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳处理。此外，湿氧化和控制pH的水热解(hydrothermolysis)也被认为是化学预处理。

在一个优选的实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地，连续的稀酸和/或弱酸(mild acid)处理，如，用硫酸处理，或者另一种有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或它们的混合物。也可以使用其他酸。弱酸处理指处理pH在1-5，优选1-3的范围内。在具体的实施方案中，酸浓度为0.1至2.0重量％的酸，优选硫酸。酸可以接触含木质纤维素的材料，并且混合物可以在160-220℃的温度，如165-195℃保持数分钟至数秒钟的时间，例如1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可以加入强酸，如硫酸，用于去除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。

也包括其他技术。已经显示，纤维素溶剂处理可将约90％的纤维素转化成葡萄糖。也已经显示，当木质纤维素结构破坏时能极大地增强酶水解。碱性H₂O₂、臭氧、有机溶胶(organosolv)(使用含水醇中的(Al)₂SO₄、Lewis酸、FeCl₃)、甘油、二噁烷(dioxane)、苯酚或乙二醇属于已知可破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686)。

本发明也包括用碱，例如NaOH、Na₂CO₃和/或氨等进行的碱性化学预处理。使用氨的预处理方法在例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO2006/110900和WO 2006/110901(通过提述并入本文)中描述。

湿氧化技术包括使用氧化剂，如：基于亚硫酸(sulphite)的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲基亚砜)等处理。化学预处理通常进行1至60分钟，如从5至30分钟，但是依赖于预处理的材料化学预处理可以进行更短或更长的时间。

合适的预处理方法的其他实例由Schell等，2003，Appl.Biochem and Biotechn.Vol.105-108：69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，和美国公开2002/0164730描述，所述文献通过提述全部并入本文。

机械预处理

术语“机械预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木质纤维素的材料分离和/或释放的任何机械(或物理)处理。例如，机械预处理包括各种类型的磨碎(milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆裂，和水热解。

机械预处理包括粉碎(机械减小尺度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆裂)。在本发明的一个实施方案中，高压指300至600psi，优选400至500psi，如约450psi范围内的压力。在本发明的一个实施方案中，高温指在约100至300℃，优选约140至235℃范围内的温度。在一个优选的实施方案中，机械预处理是分批工艺的蒸汽枪(steam gun)水解器系统，其使用如上所定义的高压和高温。为此可使用SundsHydrolyzer(由Sunds Defibrator AB(Sweden)提供)。

组合的化学和机械预处理

在一个优选的实施方案中，化学和机械预处理均进行。例如，预处理步骤可以包括稀酸或弱酸处理和高温和/或高压处理。化学和机械预处理可以如期望的顺序或同时进行。

因此，在一个优选的实施方案中，对含木质纤维素的材料进行化学和机械预处理，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在一个优选的实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆裂步骤进行。在另一个优选的实施方案中，预处理作为氨纤维爆裂步骤(或AFEX预处理步骤)进行。

生物预处理

如同本发明所使用的，术语“生物预处理”指可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木质纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，1996，Pretreatment ofbiomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomassfor Fuels Production，Himmel，Baker和Overend编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，Cao，Du和Tsao，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；及Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

水解

在发酵前和/或与发酵同时，可以将经预处理的含木质纤维素材料水解，以分解(break down)纤维素和半纤维素。

水解期间的干燥固体含量可在5-50重量％，优选10-40重量％，优选20-30重量％的范围内。在一个优选的实施方案中，水解可以作为补料分批方法进行，其中将经预处理的含木质纤维素的材料(底物)向例如包含酶的水解溶液中逐渐补料。

在本发明的一个实施方案中，在水解之前、期间和/或之后进行解毒。

在一个优选的实施方案中，水解以酶法进行。根据本发明，经预处理的含木质纤维素材料可以通过一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC 3类)水解，优选选自下组的一种或多种糖酶：纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶如α-淀粉酶、蛋白酶、产糖酶(carbohydrate-generating enzyme)如葡糖淀粉酶、酯酶如脂肪酶。在水解和/或发酵期间可存在α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等，因为含木质纤维素的材料可能包括一些淀粉。

用于水解的酶能直接或间接将糖聚合物转化成可发酵的糖，后者能发酵成为期望的发酵产物，如乙醇。

在一个优选的实施方案中，糖酶具有纤维素酶的活性。合适的糖酶在下面的“酶”部分中描述。

可通过半纤维素酶和/或酸水解分解半纤维素聚合物，以释放其五碳糖和六碳糖组分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，通过合适的发酵生物体(包括酵母)可容易地发酵成为，例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、富马酸等。优选用于乙醇发酵的是酿酒酵母菌种的酵母，优选对高水平乙醇，即，高至例如约10、12或15体积％乙醇或者更多，如20体积％乙醇有抗性的菌株。

在一个优选的实施方案中，使用半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或其组合水解经过预处理的含木质纤维素材料。

水解也可以在半纤维素酶和/或纤维素酶，任选地与下文“酶”部分中提及的一种或多种其他酶活性的组合存在的情况下进行。

在一个优选的实施方案中，水解和发酵作为同步水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这表示在适合所研究的发酵生物体的条件(例如，温度和/或pH)，优选最适条件下进行组合/同步水解和发酵。

在另一个优选的实施方案中，水解和发酵作为混合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同步水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤是酶法纤维素糖化步骤，通常在适合于所研究的水解酶的条件(例如，在更高的温度)，优选最适条件下进行。随后的同步水解和发酵步骤通常在适合于发酵生物体的条件(通常在低于单独水解步骤的温度)下进行。最后，水解和发酵也可作为单独的水解和发酵进行，其中在发酵启动前完成水解。这通常称作“SHF”。

可以在可由本领域技术人员容易确定的条件下，在合适的含水环境中进行酶处理。

在一个优选的实施方案中，在适于所述酶的条件(优选最适条件)下进行水解。

合适的工艺时间、温度和pH条件可由本领域的技术人员容易地确定。优选地，水解在25-70℃，优选40-60℃，特别是约50℃进行。优选地，该工艺在pH 3-8，优选pH 4-6，特别是约pH 5进行。

优选地，水解进行12-96小时，优选16-72小时，更优选24-48小时。

根据本发明，步骤(b)或(iii)中的水解和步骤(d)或(iv)中的发酵可以同时(SSF方法)或顺序(SHF方法)或作为混合水解和发酵(HHF)进行。

发酵

根据本发明，通过至少一种能将可发酵糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或间接发酵成为期望发酵产物的发酵生物体，来发酵经预处理(和水解)的含木质纤维素的材料。

发酵优选进行8至96小时，优选12至72小时，更优选从24至48小时。

在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH 3至6，优选约pH 4至5。

本发明包括同步水解和发酵(SSF)。在一个实施方案中，没有水解的单独保持阶段，意味着水解酶和发酵生物体一起加入。当发酵(例如，使用酵母属酵母的乙醇发酵)与水解同时进行时，温度优选为26℃-35℃，更优选30℃-34℃，如约32℃。根据本发明可以使用包含在不同温度的至少两个保持阶段的温度程序。

本发明的方法可以作为分批、补料分批或连续方法进行。

回收

发酵后，可以从发酵培养基/培养液(broth)分离发酵产物。可以蒸馏培养基/培养液以提取发酵产物，或者可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基/培养液提取发酵产物。或者可以通过气提(stripping)回收发酵产物。回收方法在本领域中公知。

发酵产物

本发明的方法可以用于产生任何发酵产物。特别期望的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。

其他期望的产物包括消费品醇工业产物，例如，啤酒和白酒；乳工业产品，例如发酵的乳制品；皮革工业产品和烟草工业产品。在一个优选的实施方案中，发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物，如乙醇，可以优选为燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况中，其还可以用作饮料乙醇。

发酵生物体

术语“发酵生物体”指适于产生期望的发酵产物的任何生物体，包括细菌和真菌生物体。根据本发明的特别合适的发酵生物体能发酵，即，将糖如葡萄糖，直接或间接转化成期望的发酵产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、Candida arabinofermentans、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其他期望的酵母包括汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株，特别是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)，和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

优选的细菌发酵生物体包括埃希氏菌属(Escherichia)的菌株，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)，发酵单孢菌属(Zymomonas)的菌株，特别是运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)，发酵杆菌属(Zymobacter)的菌株，特别是棕榈发酵杆菌(Zymobactor palmae)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)的菌株，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，明串珠菌属(Leuconostoc)的菌株，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，梭菌属(Clostridium)的菌株，特别是丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，肠杆菌属(Enterobacter)的菌株，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Micrbiol.Biotech.77：61-86)和产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)。

商业上可用的酵母包括，例如，RED STAR^TM或ETHANOL RED^TM酵母(可由Fermentis/Lesaffre，USA获得)、FALI(可由Fleischmann’s Yeast，USA获得)、SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可由Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERM AFT和XR(可由NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA获得)、GERT STRAND(可由Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOL(可由DSM Specialties获得)。

酶

尽管本发明方法的上下文中未专门提及，但是应理解的是，酶(以及其他化合物)以“有效量”使用。例如，在酚类化合物氧化酶的上下文中，“有效量”指其与未加酚类化合物氧化酶的相应方法相比具有改进的效果。

酚类化合物氧化酶

优选的酚类化合物氧化酶属于下述EC类别的任一个：儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)、邻氨基酚氧化酶(1.10.3.4)；和单酚单氧合酶(1.14.18.1)。

漆酶

漆酶(EC 1.10.3.2)是含多个铜的酶，其催化酚类化合物的氧化。漆酶由植物、细菌以及各种真菌产生，包括子囊菌纲(Ascomycete)如曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)和柄孢壳菌属(Podospora)；半知菌纲(Deuteromycete)，包括葡萄孢菌属(Botrytis)，和担子菌纲(Basidiomycete)如金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)和丝核菌属(Rhizoctonia)的完全形式。已经分离了多种真菌漆酶。例如，Choi等(Mol.Plant-Microbe Interactions 5：119-128，1992)描述了编码栗子枯萎病(blight)真菌栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的漆酶的基因的分子表征和克隆。Kojima等(J.Biol.Chem.265：15224-15230，1990；JP2-238885)对白腐(white-rot)担子菌毛云芝菌(Coriolus hirsutus)漆酶的两种等位形式提供了描述。Germann和Lerch(Experientia 41：801，1985；PNAS USA 83：8854-8858，1986)报导了粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)漆酶基因的克隆和部分测序。Saloheimo等公开了来自真菌辐射射脉菌(Phlebia radiata)的漆酶基因的结构分析。

特别期望的漆酶包括衍生自下述菌株的漆酶：多孔菌属(Polyporus)，优选Polyporus pinsitus；Melanocarpus，优选Melanocarpus albomyces；毁丝霉属(Myceliophtora)，优选嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophila)；鬼伞属(Coprinus)，优选灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)；丝核菌属(Rhizoctonia)，优选立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)或Rhizoctonia praticola；柱顶孢霉属(Scytalidium)，优选嗜热柱顶孢(Scytalidium thermophilum)；梨孢属(Pyricularia)，优选稻梨孢(Pyricularia oryzae)。

在实施方案中，漆酶衍生自树木漆树(Rhus vernicifera)(Yoshida，1983，Chemistry of Lacquer(Urushi)part 1.J.Chem.Soc.43：472-486)。

在另一个实施方案中，漆酶衍生自嗜热毁丝霉，例如，WO 95/33836(Novozymes)中所述的漆酶。

在另一个实施方案中，漆酶衍生自Polyporus pinsitus，例如，WO 96/00290(Novozymes)中所述的漆酶。

等，1998，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：691-697也描述了衍生自变色多孔菌(Polyporus versicolar)的合适的漆酶。

其他漆酶包括衍生自例如Muralikrishna等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(12)：4374-4377中涉及的稻梨孢的漆酶，或者衍生自嗜热柱顶孢的漆酶，其在Papers American Chemical Society vo1.209，no.1-2，1995的摘要中公开。

漆酶也可以是衍生自灰盖鬼伞的漆酶，例如Schneider等，1999，Enzymeand Microbial Technology 25：502-508中涉及的。

其他合适的漆酶包括衍生自Waleithner等，Curr.Genet.，1996，29：395-403中涉及的立枯丝核菌的那些，或者衍生自Kiiskinen等，2004，Microbiology 150：3065-3074中涉及的Melanocarpus albomyces的漆酶。

合适的细菌漆酶包括衍生自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的那些，例如由Machczynski等在Protein Science，2004，13：2388-2397中所公开的。

表现出过氧化物酶活性的酶

根据本发明，可以使用表现出过氧化物酶活性的任何酶。

表现出过氧化物酶活性的酶可以选自下组：过氧化物酶(EC 1.11.1.7)、卤素过氧化物酶(EC 1.11.1.8和EC 1.11.1.10)、木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)；和脂氧合酶(EC 1.13.11.12)。

过氧化物酶

表现出过氧化物酶活性的酶可为划分为EC 1.11.1.7的任何过氧化物酶。

适用于本发明方法的过氧化物酶可以是植物(例如，辣根或大豆过氧化物酶)，或微生物来源，如真菌或细菌来源。实例包括源自半知菌亚门、丝孢纲的如下真菌的过氧化物酶：例如镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Tricoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝孢属(Verticillum)、Arthromyces、Caldariomyces、单格孢属(Ulocladium)、蠕孢属(Embellisia)、枝孢属(Cladosporium)或Dreschlera，特别是尖镰孢(Fusarium oxysporum，DSM 2672)、特异腐质霉(Humicola insolens)、里氏木霉(Trichoderma reesii)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucana，IFO 6113)、黑白轮枝孢(Verticillum alboatrum)、大丽轮枝孢(Verticillum dahlia)、Arthromyces ramosus(FERM P-7754)、Caldariomycesfumago、纸单格孢(Ulocladium chartarum)、Embellisia alli或Dreschlera halodes。

其他合适的过氧化物酶衍生自真菌，包括担子菌亚门、担子菌纲的菌株，例如，鬼伞属、平革菌属(Phanerochaete)、革盖菌属(Coriolus)或栓菌属，特别是灰盖鬼伞f.微孢(IFO 8371)、长根鬼伞(Coprinus macrorhizus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium，例如，NA-12)或栓菌属(原先称作多孔菌属)，例如，变色栓菌(T.versicolor，例如，PR428-A)。

其他过氧化物酶可以衍生自真菌，包括属于接合菌亚门、毛霉纲的菌株，例如，根霉属(Rhizopus)或毛霉属(Mucor)，特别是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。

细菌过氧化物酶可以衍生自放线菌目的菌株，例如，类球形链霉菌(Streptomyces spheroides，ATTC 23965)、热紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus，IFO 12382)或Streptoverticillum verticillium ssp.Verticillium；短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus，ATCC 12905)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红单胞菌(Rhodomonas palustri)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、Pseudomonaspurrocinia(ATCC 15958)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，NRRLB-11)；粘球菌属(Myxococcus)，例如变绿粘球菌(M.virescens)。

在WO 92/16634中描述了衍生自鬼伞属菌种，特别是长根鬼伞或灰盖鬼伞的重组产生的过氧化物酶。WO 94/12621中描述了它们的变体。

卤素过氧化物酶

表现出过氧化物酶活性的酶可以是任何卤素过氧化物酶。卤素过氧化物酶在自然界中广泛存在，已知可由哺乳动物、植物、藻类、地衣、细菌和真菌产生。有三类卤素过氧化物酶，根据其对卤素离子的特异性分类为：氯过氧化物酶(EC 1.11.1.10)，其催化化合物的氯化、溴化和碘化；溴过氧化物酶，其表现出对于溴和碘离子的特异性；和碘过氧化物酶(E.C.1.11.1.8)，其专一催化碘离子氧化。

卤素过氧化物酶包括来自弯孢属(Curvularia)，特别是糙壁弯孢(C.verruculosa)，如糙壁弯孢CBS 147.63或糙壁弯孢CBS 444.70的卤素过氧化物酶。弯孢属卤素过氧化物酶及其重组产生在WO97/04102中描述。已经从藻类分离了溴过氧化物酶(参见美国专利No.4,937,192)。在美国专利6,372,465(Novozymes A/S)中也描述了卤素过氧化物酶。

在一个优选的实施方案中，卤素过氧化物酶是氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)。本领域中已知的氯过氧化物酶可以从金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、荧光假单胞菌、Caldariomyces fumago、不等弯孢(Curvularia inaequalis)和珊瑚藻(Corallinaofficinalis)获得。优选的氯过氧化物酶是来自Caldariomyces fumago的氯过氧化物酶(可由SIGMA，C-0278获得)。

已知包含钒辅基(prosthetic group)的卤素过氧化物酶包括来自不等弯孢(van Schijndel等，1993，Biochimica Biophysica Acta 1161：249-256；Simons等，1995，European Journal of Biochemistry 229：566-574；WO 95/27046)和疣状弯孢(Curvularia verruculosa，WO 97/04102)的至少两类真菌氯过氧化物酶，或Phaeotrichoconis crotalariae卤素过氧化物酶(WO 2001/079461)。

脂氧合酶(LOX)

表现出过氧化物酶活性的酶可以是任何脂氧合酶(LOX)。脂氧合酶分类为EC 1.13.11.12，它是催化多不饱和脂肪酸，特别是顺，顺-1，4-二烯，例如亚油酸的氧合并产生过氧化氢的酶。还可以氧化其他底物，例如，单不饱和脂肪酸。微生物脂氧合酶可以衍生自，例如，酿酒酵母、普通嗜热放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、尖镰孢、串珠镰孢(Fusarium proliferatum)、细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)、稻梨孢和地霉属(Geotrichum)的菌株。在WO02/20730的实施例3-4中描述了衍生自禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)的脂氧合酶的制备。WO 02/086114的实施例2中描述了衍生自稻小球腔菌(Magnaporthe salvinii)的脂氧合酶在米曲霉(Aspergillus oryzae)中的表达，并且这种酶能使用标准方法纯化，例如，如WO 02/20730的实施例4中所述。

也可以从植物种子，如大豆、豌豆、鹰嘴豆和蚕豆中提取脂氧合酶(LOX)。或者，可以从哺乳动物细胞例如兔网织红细胞(reticulocyte)获得脂氧合酶。

纤维素酶或纤维素分解酶

本文使用的术语“纤维素酶”或“纤维素分解酶”应理解为包含纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

为了有效果，纤维素和半纤维素的消化可需要几种类型的酶共同作用。至少三种酶对应将纤维素转化成葡萄糖是重要的：随机剪切纤维素链的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；从纤维素链末端切割纤维二糖基单元的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)和将纤维二糖和可溶的纤维糊精转化成葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。在这三种与纤维素的生物降解有关的酶中，纤维二糖水解酶是降解天然结晶纤维素的关键酶。术语“纤维二糖水解酶I”在本文中定义为纤维素1，4-β-纤维二糖糖苷酶(也称作外切葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或1，4-β-纤维二糖水解酶)活性，如酶类EC 3.2.1.91中所定义的，其通过从链的非还原末端释放纤维二糖来催化纤维素和纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键的水解。术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义相同，只是纤维二糖水解酶II从链的还原末端进行攻击。

内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中1，4-β-D-糖苷键、混合β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和包含纤维素部分的其他植物材料中的β-1，4键的内水解。经审定的名称为内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-β-D-glucan4-glucano hydrolase)，但是在本说明中使用缩写术语内切葡聚糖酶。

纤维素酶或纤维素分解酶可以包含糖-结合模块(CBM)，其增强酶与含纤维素纤维的结合，并增加酶催化活性部分的功效。CBM定义为糖-活性酶中的相连的(contiguous)氨基酸序列，所述酶具有糖-结合活性的谨慎(discreet)折叠。要了解CBM的进一步信息，可以参见例如CAZy互联网服务器(见上文)或Tomme等(1995)于Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler和Penner编)，Cellulose-binding domains：classification and properties.142-163页，American Chemical Society，Washington。

在一个优选的实施方案中，纤维素酶活性可以源自真菌来源，如木霉属菌株，优选里氏木霉菌株；或腐质霉属菌株，如特异腐质霉菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。

在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶制备物可以是如共同未决申请美国临时申请no.60/941,251中涉及的组合物，所述文献通过提述并入本文。在一个优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解酶制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽，优选GH61A家族多肽，优选WO2005/074656(Novozymes)中公开的制备物。纤维素分解酶制备物可以进一步包含β-葡糖苷酶，如源自木霉属、曲霉属或青霉属(Penicillium)的菌株的β-葡糖苷酶，包括美国临时申请no.60/832,511(PCT/US2007/074038)(Novozymes)中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白质。在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制备物还可以包含CBH II酶，优选土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在另一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制备物还可以包含纤维素分解酶，优选源自里氏木霉或特异腐质霉的制备物。

在特定的实施方案中，纤维素分解酶制备物还可以包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；来自土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)的CBH II；和β-葡糖苷酶(美国临时申请no.60/832,511(或PCT/US2007/074038)中公开的融合蛋白质)，和源自里氏木霉的纤维素分解酶。

在另一个特定的实施方案中，纤维素分解酶制备物还可以包含WO2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(美国临时申请no.60/832,511(或PCT/US2007/074038)中公开的融合蛋白质)，和源自里氏木霉的纤维素分解酶。

在优选的实施方案中，纤维素酶或纤维素分解制备物是公开于美国临时申请no.60/941,251中分别在实施例1和4中使用的纤维素分解制备物A和B。

在一个实施方案中，纤维素酶是商业上可用的产品1.5L或CELLUZYME^TM(Novozymes A/S，Denmark)或ACCELERASE^TM 1000(来自Genencor Inc.，USA)。

可以加入纤维素酶或纤维素分解酶以水解经过预处理的含木质纤维素材料。纤维素酶的剂量可为0.1-100FPU每克总固体(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS的范围。

半纤维素酶

可以通过半纤维素酶和/或酸水解分解半纤维素，以释放它的五碳糖和六碳糖组分。在本发明的实施方案中，可以用一种或多种半纤维素酶处理木质纤维素衍生材料。

可以使用适用于水解半纤维素的任何半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，内切或外切阿拉伯糖酶，外切半乳聚糖酶，或其中两种或多种的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外-作用半纤维素酶，并且更优选地，半纤维素酶是具有在低于pH 7(优选pH3-7)的酸性条件下水解半纤维素的能力的外-作用半纤维素酶。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYME^TM(由Novozymes A/S，Denmark提供)。

阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)催化α-L-阿拉伯糖苷中末端非还原α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。

半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)，即，阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶，催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-D-半乳糖苷键的内水解。

果胶酶(EC 3.2.1.15)催化果胶酸和其他聚半乳糖醛酸中的1，4-α-D-半乳糖苷酸键的水解。

木葡聚糖酶催化木葡聚糖的水解。

可以以对与水解半纤维素有效的量加入半纤维素酶，如，以总固体(TS)的约0.001至0.5重量％，更优选TS的0.05至0.5重量％的量加入。

α-淀粉酶

根据本发明，可使用α-淀粉酶。在优选实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”表示以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5范围的pH具有最优活性。

细菌α-淀粉酶

根据本发明，细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属(Bacillus)。

在优选实施方案中，芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株，但是还可以源自其它芽孢杆菌属菌种。期望的α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中SEQ ID NO：5所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO 99/19467中SEQ ID NO：3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在本发明的实施方案中，α-淀粉酶与WO 99/19467中SEQ ID NO：1、2或3分别显示的任一个序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同一性程度。

芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355中所述的(所有文献通过提述并入本文)。特别期望的α-淀粉酶变体在美国专利6,093,562、6,297,038或6,187,576中公开(通过提述并入本文)，而且包括在R179至G182位置缺失一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873中公开的双缺失——参见例如，第20页，第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO：3所列出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或缺失氨基酸R179和G180，使用WO 99/19467中SEQ ID NO：3的编号方式(通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有对应于Δ(181-182)的双缺失，而且与WO 99/19467中SEQID NO：3所列出的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比还包含N193F取代(也表示为I181^*+G182^*+N193F)。

细菌杂合α-淀粉酶

特别期望的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示)的445个C末端氨基酸残基，和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/194676中SEQ ID NO：3所示)的37个N末端氨基酸残基，其具有下述取代中的一种或更多，特定地包含全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有下述突变中的一个或多个的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的相应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或176和179位置之间的两个残基的缺失，优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467中SEQ IDNO：5中的编号方式)。

真菌α-淀粉酶

真菌α-淀粉酶包括源自曲霉菌属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉、黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillis kawachii)α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl-样α-淀粉酶，其优选源自米曲霉菌株。根据本发明，术语“Fungamyl-样α-淀粉酶”表示与WO 96/23874中SEQID NO：10所示氨基酸序列的成熟部分显示高度同一性，即高于70％，高于75％，高于80％，高于85％，高于90％，高于95％，高于96％，高于97％，高于98％，高于99％，或者甚至100％同一性的α-淀粉酶。

另一种优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在一个优选实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的α-淀粉酶，其在Swiss-prot/TeEMBL数据库中以“AMYA ASPNG”公开，初级登录号为P56271，在WO 89/01969(实施例3)中描述。商业上可以获得的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。

其他期望的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(WO 2004/055178，其通过提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)的菌株的α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，α-淀粉酶源自川地曲霉，由Kaneko等，1996，J.Ferment.Bioeng.81：292-298，“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii″公开；还作为EMBL：#AB008370公开。

真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。

真菌杂合α-淀粉酶

在一个优选实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括WO 2005/003311或美国公开2005/0054071(Novozymes)或美国临时申请60/638,614(Novozymes)中公开的酶，所述文献通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，和任选的接头。

期望的杂合α-淀粉酶的具体实例包括美国临时申请60/638,614中实施例的表1至5公开的酶，其中包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD(美国临时申请60/638,614中的SEQ ID NO：100)的Fungamyl变体，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(美国临时申请60/638,614中的SEQ ID NO：101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD(作为氨基酸序列SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：96的组合在美国申请11/316,535的表5中公开，并进一步在本文作为SEQ ID NO：13公开)的微小根毛霉α-淀粉酶或作为WO 2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD(美国临时申请US 60/638,614中SEQ ID NO：102)的巨多孔菌α-淀粉酶。其他特别期望的杂合α-淀粉酶是列于美国申请11/316,535和WO 2006/069290(通过提述并入本文)的实施例4中表3、4、5和6中列出的酶。

期望的杂合α-淀粉酶的其它具体实例包括美国公开2005/0054701中公开的那些酶，包括在15页表3中公开的那些酶，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

还包括与上述任何α-淀粉酶表现出高同一性，即，与成熟酶序列具有多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或者甚至100％同一性的α-淀粉酶。

酸性α-淀粉酶可以根据本发明以0.1至10AFAU/g DS，优选0.10至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS的量加入。

商业α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括DSM的MYCOLASE，BAN^TM、TERMAMYL^TM SC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TM X和SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TM FRED、SPEZYME^TM AA和SPEZYME^TM DELTA AA(GenencorInt.)，和商品名为SP288的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。

糖-源产生酶

术语“糖-源产生酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生产者)。糖-源产生酶能产生糖，所述糖能由所述发酵生物体用作能量来源，例如，当用于本发明产生发酵产品(如乙醇)的方法时。产生的糖可以直接或间接转化成期望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用糖-源产生酶的混合物。特别期望的混合物是至少由葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)组成的混合物。在本发明的一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)和葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比例(AFAU/AGU)可为至少0.1，特别是至少0.16，如在0.12至0.50的范围内或者更高。或者在本发明的一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)和葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比例(即，FAU-F/AGU)为0.1-100AGU/FAU-F，特别是在2-50AGU/FAU-F，如在10-40AGU/FU-F的范围内。

葡糖淀粉酶

根据本发明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合适的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136、WO 01/04273和WO03/029449中公开的酶(来自Novozymes，Denmark)；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4)：941-949)，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括热稳定性增强的变体：G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Engng.8：575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301：275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35：8698-8704)；和在A435和S436位置引入脯氨酸残基(Li等，1997，Protein Engng.10，1199-1204)。

其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(过去称作罗耳伏革菌，Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参见美国专利4,727,026和Nagasaka，Y等，1998，Purification andproperties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii，ApplMicrobiol Biotechnol 50：323-330)、踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别地，源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利Re.32,153)、Talaromyces duponti和Talaromycesthermophilus(美国专利4,587,215)。

期望的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135,138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)和WO 2006/069289(通过提述并入本文)中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)的葡糖淀粉酶。

本发明还包括杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例公开于WO2005/045018中。具体的实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(所述杂合体通过提述并入本文)。

还包括与上述任何葡糖淀粉酶表现出较高同一性，即与成熟酶序列具有多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或者甚至100％同一性的葡糖淀粉酶。

商业上可用的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TM B4U和AMG^TM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM300(来自Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990ZR(来自Genencor Int.)。

在实施方案中，葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/gDS的量加入，特别是1-5AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量加入。

β-淀粉酶

至少根据本发明，β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是传统赋予外-作用产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。以分步的方式从非还原链末端连续地去除麦芽糖单元，直至分子降解或，对于支链淀粉，直至到达分支点。释放的麦芽糖具有β异头构型，因此命名为β-淀粉酶。

已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，1979，Progress in Industrial Microbiology 15：112-115)。这些β-淀粉酶的特征为具有40℃至65℃范围的最适温度和4.5至7范围的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶是来自Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYM^TMWBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYME^TM BBA 1500。

产麦芽糖淀粉酶

淀粉酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶由Novozymes A/S在商业上提供。在美国专利4,598,048，4,604,355和6.162,628中描述了产麦芽糖α-淀粉酶，所述文献通过提述并入本文。

在一个优选的实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白质/克DS或0.05-5MANU/g DS的量加入。

蛋白酶

根据本发明，蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一个优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源，优选真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，通过在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。

期望的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属、毛霉属、根霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳菌属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别期望的是源自黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan 28：216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan 28：66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977，Agric.Biol.Chem.42(5)：927-933)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)，或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucorpusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

还包括中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。对于本发明特别期望的蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌，并且序列可以以登录号P06832在Swissprot获得。还包括与以登录号P06832在Swissport获得的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特别是至少99％同一性的蛋白酶。

此外还包括与WO 2003/048353中以SEQ ID NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特别是至少99％同一性的蛋白酶。

还包括木瓜蛋白酶-样蛋白酶，如E.C.3.4.22.^*(半胱氨酸蛋白酶)中的蛋白酶，如E.C.3.4.22.2(木瓜蛋白酶)，EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)，EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶)，EC 3.4.22.14(奇异果蛋白酶)，EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)，EC3.4.22.25(甘氨酰-内肽酶)和EC 3.4.22.30(caricain)。

可以以0.1-1000AU/kg dm，优选1-100AU/kg DS和最优选5-25AU/kg DS的量加入蛋白酶。

用途

在第三方面，本发明涉及一种或多种酚类化合物氧化酶和/或表现出过氧化物酶活性的酶用于使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的用途。

在一个优选的实施方案中，用于使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的酚类化合物氧化酶可以选自下组：儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、漆酶(EC1.10.3.2)、邻氨基酚氧化酶(1.10.3.4)；和单酚单氧合酶(1.14.18.1)。

在另一个优选的实施方案中，用于使经预处理的含木质纤维素的材料解毒的表现出过氧化物酶活性的酶选自下组：过氧化物酶(EC 1.11.1.7)、卤素过氧化物酶(EC 1.11.1.8和EC 1.11.1.10)；木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)；锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)；和脂氧合酶(EC 1.13.11.12)。

解毒可以是本发明的发酵产物产生方法的一部分。

材料与方法

酶：

漆酶PpL：源自WO 1996/000290(Novozymes)公开的Polyporus pinsitus的漆酶。

漆酶MtL：源自WO 1995/033836(Novozymes)公开的嗜热毁丝霉的漆酶。

漆酶CcL：源自WO 97/08325(Novozymes)公开的灰盖鬼伞的漆酶。

过氧化物酶CcP：源自Petersen等，1994，FEBS Letters 339：291-296公开的灰盖鬼伞的过氧化物酶。

纤维素分解制备物A：纤维素组合物，包含WO 2005/074656公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(美国临时申请60/832,511中公开的融合蛋白)，土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)，和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物。纤维素酶制备物A在美国临时申请60/941,251中公开。

纤维素分解制备物B：纤维素组合物，包含WO 2005/074656公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(美国临时申请60/832,511中公开的融合蛋白)；和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物。纤维素酶制备物A在美国临时申请60/941,251中公开。

酵母：可从Red Star/Lesaffre，USA获得的RED STAR^TM

经预处理的玉米秸：经稀酸催化的蒸汽爆裂玉米秸(28.6％DS)由NREL(National Renewable Research Laboratory，USA)获得。

同一性的确定

参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

两个氨基酸序列之间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定，使用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分(gap penalty)为10和缺口长度罚分(gap length penalty)为10。配对比对参数是K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝5，并且对角线(diagonals)＝5。

两个核苷酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定，使用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10。配对比对参数是K元组＝3，缺口罚分＝3，和窗口＝20。

漆酶活性(LACU)的测定

根据有氧条件下丁香醛连氮(syringaldazin)的氧化而确定漆酶活性。在530nm测定产生的紫色(violet)的吸光度。分析条件为19mM丁香醛连氮，23.2mM乙酸(盐)缓冲液，pH 5.5，30℃，反应时间1分钟。

1个漆酶单位(LACU)为在这些条件下每分钟催化1.0微摩尔丁香醛连氮转化的酶量。

过氧化物酶活性(PODU)的测定

将一个过氧化物酶单位(PODU)定义为在标准条件下(即，pH 7.0；温度30℃；反应时间3分钟)每分钟催化1微摩尔过氧化氢转化的酶量。使用基于以(2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为生色团的试验来确定活性，在418nm测定产生的蓝绿色的吸光度。更详细描述这种分析方法的文件夹AF 279/2可从Novozymes A/S，Denmark应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为37℃、pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸(盐)0.1M，反应时间为5分钟。

可以使用自动分析系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶，以将存在的任何α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖反应形成NADH，使用光度计在340nm处测定形成的NADH，作为起始葡萄糖浓度的量度(measure)。

AMG温育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸(盐)0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		葡萄糖脱氢酶(GlucDH)：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可从NovozymesA/S，Denmark应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

α-淀粉酶活性(KNU)

可以使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。这种方法基于经改性的马铃薯淀粉通过酶的分解，通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成蓝黑色，但是在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，逐渐变成红褐色，其与彩色玻璃标准物比较。

将一千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；和pH 5.6)将5260mg可溶的淀粉干物质Merck Amylum糊精化的酶量。

更详细地描述了这种分析方法的文件夹EB-SM-009.02/01可从Novozymes A/S，Denmark应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

酸性α-淀粉酶活性

根据本发明使用时，酸性α-淀粉酶的活性以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F(真菌α-淀粉酶单位)测量。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品测定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时分解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，内切-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1，4-糖苷键，以形成不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色强度和淀粉浓度成正比(directly proportional to)。使用反向比色法确定在特定的分析条件下淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。

λ＝590nm

蓝色/紫色 t＝23秒脱色

标准条件/反应条件：(每分钟)

底物：可溶性淀粉，约0.17g/L

缓冲液：柠檬酸，约0.03M

碘(I₂)： 0.03g/L

CaCl₂： 1.85mM

pH： 2.50±0.05

温育温度： 40℃

反应时间： 23秒

波长： 590nm

酶浓度： 0.025AFAU/mL

酶的作用范围： 0.01-0.04AFAU/mL

更详细地描述此分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从NovozymesA/S应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

FAU-F的测定

相对于强度已知的酶标准品确定FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)。

更详细地描述此标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从NovozymesA/S应要求获得，所述文件夹通过提述并入本文。

使用滤纸试验(FPU试验)测量纤维素酶活性

1.方法来源

1.1在Adney和Baker，1996，Laboratory Analytical Procedure，LAP-006，National Renewable Energy Laboratory(国家可再生能源实验室)(NREL)的题为“Measurement of Cellulase Activities(纤维素酶活性的测量)”的文件中公开了所述方法。该方法基于用来测量纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose，1987，Measurement of Cellulase Activities，Pure & Appl.Chem.59：257-268)。

2.步骤

2.1如Adney和Baker，1996，见上文所述实施此方法，只是使用96孔板以在显色后读出吸光度值，如下所述。

2.2酶试验管：

2.2.1向试管(13X 100mm)底部加入一个卷曲的滤纸条(#1Whatman；1X6cm；50mg)。

2.2.2向管中加入1.0mL 0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.80)。

2.2.3将包含滤纸和缓冲液的管在循环水浴中50℃(±0.1℃)温育5分钟。

2.2.4温育后，向管中加入用柠檬酸缓冲液中的0.5mL酶稀释液。设计酶稀释物，以产生略高于和低于2.0mg葡萄糖目标值的数值。

2.2.5通过温和地涡漩震荡3秒钟，将管内容物混合。

2.2.6漩涡震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。

2.2.7在60分钟温育后，立即将管从水浴中取出，并在每个管中加入3.0mL DNS试剂以终止反应。将管漩涡震荡3秒钟以进行混合。

2.3空白与对照

2.3.1通过向试管中加入1.5mL柠檬酸缓冲液来制备试剂空白。

2.3.2通过将一个卷曲的滤纸条放于试管底部并加入1.5mL柠檬酸缓冲液而制备底物对照。

2.3.3通过将1.0mL柠檬酸缓冲液与0.5mL适当的酶稀释液混合，为每种酶稀释液制备酶对照。

2.3.4以与酶试验管同样的方法测试试剂空白、底物对照和酶对照，并与酶试验管一起进行。

2.4葡萄糖标准

2.4.1制备100mL葡萄糖的保存溶液(10.0mg/mL)，并将5mL等分试样冷冻。在使用前，将等分试样解冻并漩涡震荡以进行混合。

2.4.2如下在柠檬酸缓冲液中产生保存溶液的稀释液：

G1＝1.0mL保存溶液+0.5mL缓冲液＝6.7mg/mL＝3.3mg/0.5mL

G2＝0.75mL保存溶液+0.75mL缓冲液＝5.0mg/mL＝2.5mg/0.5mL

G3＝0.5mL保存溶液+1.0mL缓冲液＝3.3mg/mL＝1.7mg/0.5mL

G4＝0.2mL保存溶液+0.8mL缓冲液＝2.0mg/mL＝1.0mg/0.5mL

2.4.3通过向1.0mL柠檬酸缓冲液加入0.5mL每种稀释液以制备葡萄糖标准管。

2.4.4以与酶试验管同样的方法测试葡萄糖标准管，并与酶试验管一起进行。

2.5显色

2.5.160分钟温育并加入DNS后，将全部管一起在水浴中煮沸5分钟。

2.5.2煮沸后，立即在冰/水浴中冷却。

2.5.3冷却时，将管短暂漩涡震荡，使浆液静置。然后通过从管中向96孔板中的200微升ddH₂O加入50微升将每个管稀释。混合每个孔，并在540nm读出吸光度。

2.6计算(在NREL文件中给出实例)

2.6.1通过描绘四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)相对于A₅₄₀而制备葡萄糖标准曲线。使用线性回归(Prism Software)拟合，并使用拟合线的公式确定每个酶试验管产生的葡萄糖。

2.6.2制备产生的葡萄糖(mg/0.5mL)相对于总酶稀释度(total enzymedilution)的图线，Y轴(酶稀释度)为对数刻度。

2.6.3在产生的葡萄糖刚刚为2.0mg以上时的酶稀释度和产生的葡萄糖刚刚为所述量以下时的酶稀释度之间画一条线。根据这条线，确定产生的葡萄糖恰好为2.0mg时的酶稀释度。

2.6.4如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)：

FPU/mL＝0.37/产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度

蛋白酶试验方法-AU(RH)

可以以变性的血红蛋白作为底物，确定蛋白质分解活性。在用于确定蛋白质分解活性的Anson-血红蛋白方法中，消化变性的血红蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，所述酚试剂遇酪氨酸和色氨酸显蓝色。

一个Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件(即，25℃，pH 5.5和10分钟反应时间)下以初始速率消化血红蛋白的酶量，所述速率使每分钟释放的TCA可溶产物的量与酚试剂显现的颜色和一个毫当量的酪氨酸产生的颜色相同。

AU(RH)方法在EAL-SM-0350中描述，并可以从Novozymes A/S应要求获得。

实施例

实施例1

酶水解期间漆酶对于乙醇收率的影响

由NREL获得稀酸催化蒸汽爆裂预处理的玉米秸。在存在和不存在漆酶PpL(20-30LACU/g DS)的情况下，用纤维素分解制备物A(5FPU/g DS)在pH4.5，50℃将经预处理的玉米秸(15％DS)水解75小时。开盖进行酶处理，使得在处理期间提供一致的空气流量。根据重量损失，通过每天补水而控制蒸发。使用经酶处理的样品在32℃在盖子上插入针头的密闭容器中进行长达88小时的乙醇发酵，酵母(RED STAR^TM)初始量为0.2g/L。发酵混合物还包含YPU(5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨和10g/L尿素)。25小时发酵后，经漆酶处理的样品得到10g/L乙醇产量，同时未用漆酶处理的样品未产生乙醇。使用1.6g/L的初始酵母量，25小时发酵后，观察到漆酶处理样品的乙醇产量是大约10倍(漆酶处理样品为18.87g/L，而未用漆酶处理的样品为1.83)。

实施例2

发酵期间漆酶对于乙醇收率的影响

使用的经预处理的玉米秸(28.6％DS)与实施例1相同。在不存在漆酶的情况下，闭盖用纤维素分解制备物A(5FPU/g DS)在pH 4.5，50℃将经预处理的玉米秸(15％DS)水解75小时。酶水解后，在酵母(RED STAR^TM)量为1.6g/L、存在和不存在漆酶PpL(20-30LACU/g DS)的情况下，材料在32℃在盖子上插有针头的密闭容器中进行长达88小时的发酵。发酵混合物还包含YPU(5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨和10g/L尿素)。25小时后，发酵期间存在漆酶时，样品中乙醇的产量加倍(经漆酶处理为4.59g/L，而未用漆酶处理为1.83)。

实施例3

在水解和酵母发酵之间进行过氧化物酶处理的影响

使用的经预处理的玉米秸(28.6％DS)与实施例1相同。在不存在漆酶的情况下，闭盖用经预处理的玉米秸(15％DS)在pH 4.5，50℃进行72小时酶水解。氧化还原酶处理在50℃进行一或两小时，然后在32℃在盖子上插有针头的密闭容器中用0.5g/L量的酵母(RED STAR^TM)发酵(长达48小时)。氧化还原酶处理期间，每20分钟开盖一次。发酵混合物还包含YPU(5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨和10g/L尿素)。使用漆酶PpL(4.5-30LACU/g DS)观察到乙醇产量增加高达40％。使用漆酶MtL(0.5-30LACU/g DS)观察到乙醇产量增加高达27％。使用漆酶CcL(36LACU/g DS)观察到乙醇产量增加约27％。在存在5％H₂O₂时，使用过氧化物酶CcP观察到乙醇产量增加约40％。

实施例4

PCS酶水解的漆酶介导的改进

预处理液的收集：

从中性、蒸汽爆裂玉米秸和酸性、蒸汽爆裂玉米秸中收集液体。通过在环境温度混合1小时，将每种PCS在去离子水中形成浆料，最终的总固体(TS)水平为15重量％。每种浆料在4℃保存16-20小时。然后在环境温度将浆料混合1小时，通过玻璃纤维滤纸(Whatman GF/D)，由真空过滤收集液体。加入叠氮钠至终浓度为0.02重量％。每种液体的pH调至5.0。在环境温度混合1小时后，通过0.2微米膜真空过滤液体，并在4℃保存。

漆酶处理

将所有PCS液调至pH 5.0。向PCS液中加入漆酶MtL至终浓度100ppm。将包含漆酶的液体与阴性对照液一起在50℃，150rpm搅拌下温育18小时。进一步表征前，通过在3000rpm离心10分钟而去除任何沉淀物质。

用于酚类物质的Folin-Ciocalteu(FC)方法：

根据公开的方法(Singleton，Orthofer和Lamuela-Raventos，1999，MethodsEnzymol.299：152-178)修正方法。在去离子水中制备儿茶酚(Sigma#135011)校准标准品和样品稀释液。将五十微升稀释样品或儿茶酚校准标准品转移至微孔板的孔中。向每个孔中加入去离子水(50微升)，然后加入50微升/孔的FC试剂(Sigma#F9252)。在环境温度将板温育5分钟。然后向每个孔中加入碳酸钠(15％w/v，100微升)，并在黑暗中在环境温度将板温育30分钟。在770nm测定每个孔的吸光度。在Microsoft Excel中通过线性回归，由儿茶酚标准曲线计算未知的总酚类物质浓度。

PCS水解和葡萄糖监测

在合适的PCS液中将洗涤的PCS固体以终浓度4％总固体形成浆料，并加入纤维素分解制备物B(3mg蛋白质/g纤维素)。在50℃震荡(150rpm)下温育水解反应液48小时。使用酶-偶联的葡萄糖试验，随时间变化监测葡萄糖浓度。

表1：如通过FC法测量的漆酶处理对于可溶性酚类物质的影响

结论

通过用漆酶处理PCS液促进了PCS的酶解。对于中性或酸性PCS液的漆酶处理使纤维素转化率提高8-10％。

本申请中所描述的和要求保护的发明并不局限于本申请所公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围之内。事实上，从前面的说明中可知，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

本文引用了许多参考文献，其中公开的全部内容通过提述并入。

Claims

1.用于由含木质纤维素材料生成乙醇的方法，包括步骤：

(i)预处理含木质纤维素材料；

(ii)解毒，包括使经预处理的含木质纤维素材料经受漆酶的处理；

(iii)用纤维素酶水解；和

(iv)使用酵母进行发酵；

其中所述解毒与水解同时进行。

2.权利要求1的方法，其中在解毒前从液体中去除/分离步骤(i)中预处理含木质纤维素材料后的固体。

3.权利要求2的方法，其中在步骤(iii)的水解前将去除的固体和解毒的液体合并。

4.权利要求1的方法，其中在步骤(i)中将含木质纤维素的材料进行化学、机械和/或生物预处理。

5.权利要求1的方法，其中以同步水解和发酵步骤、混合水解和发酵、或单独的水解和发酵方法进行水解和发酵。

6.权利要求1的方法，其中酵母是酵母属(Saccharomyces)的菌株。

7.权利要求6的方法，其中酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中漆酶为源自Polyporus pinsitus的漆酶；源自嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophila)的漆酶；或源自灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)的漆酶。