CN101658670A

CN101658670A - 基于n1l和b8r基因缺失的痘苗病毒载体的艾滋病疫苗

Info

Publication number: CN101658670A
Application number: CN200810146353A
Authority: CN
Inventors: 邵一鸣; 黄薇; 刘颖; 刘明杰
Original assignee: Venereal Disease Aids Preventing Controlling Center China Disease Preventing Con
Current assignee: Venereal Disease Aids Preventing Controlling Center China Disease Preventing Con
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2008-08-25
Publication date: 2010-03-03

Abstract

本发明涉及表达人免疫缺陷病毒(HIV)抗原的复制型艾滋病活载体疫苗及其用途，所述疫苗基于复制型痘苗病毒如痘苗病毒天坛株而构建。本发明的复制型活载体疫苗能够诱导高水平的抗HIV的体液和细胞免疫应答。本发明提供了用于构建所述艾滋病疫苗的载体。本发明还涉及使用所述艾滋病疫苗的免疫接种方案。

Description

基于N1L和B8R基因缺失的痘苗病毒载体的艾滋病疫苗

技术领域

本发明涉及抗病毒免疫学领域。更具体地，本发明涉及一种复制型痘苗病毒载体、基于所述载体的重组艾滋病疫苗、及所述疫苗的制备方法和用途。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的一种传染性疾病。自1981年发现第一例病例以来，艾滋病一直以惊人的速度在全球蔓延，成为世界上危害人类生命和健康最严重的病毒性疾病之一。

HIV的全球流行导致了极高的致病率和病死率，为防治HIV的感染，传统的化学药物治疗、免疫治疗以及新的方法得以不断研究、发展。对多数HIV感染者进行高活性抗病毒治疗(HAART)，虽可有效抑制病毒血症，延缓病程，但不能清除潜伏的病毒。保护性的疫苗接种是解决防治HIV感染全球性问题的最佳途径。为此，科学家们开展了减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗以及各种活载体疫苗(例如以腺病毒、金丝雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、疱疹性口腔炎病毒、伤寒杆菌、链球菌等为载体的疫苗)的研究。虽然减毒活疫苗在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中被证实有效，但在初次免疫成年猕猴中存在一定致死率。被HIV感染的猩猩仍可被第二种不相关的HIV感染。由于减毒活疫苗的风险性以及有证据表明其无广泛保护性，减毒活疫苗的应用尚待进一步研究。研究表明，在猩猩模型中，灭活疫苗不能保护HIV攻击，不能诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应。病毒活载体疫苗和DNA疫苗都既可以诱导细胞免疫反应，又可以诱导体液免疫反应，表达HIV抗原的活载体疫苗和HIV DNA疫苗的联合免疫成为防治HIV感染的新的疫苗研究策略。

在活载体疫苗的研究中，以痘苗病毒(例如，痘苗病毒天坛株(vacciniavirus TianTan strain，VTT))为载体的活载体疫苗研究进行得最为深入和广泛。重组痘苗病毒疫苗具有效果好、对热稳定性好、接种方便、不需佐剂等优点，然而重组痘苗病毒疫苗接种人体后产生较重的局部反应，特别是在一定比例的免疫缺陷患者中可引起严重的并发症。表达某些免疫原的重组痘苗病毒疫苗未能达到理想的免疫效果，如何能在增强重组痘苗病毒疫苗的免疫原性同时进一步提高痘苗病毒载体的安全性，学者们作出了很多深入的研究。随着新的病毒性疾病不断出现，以及对宿主抗病毒免疫机理的深入了解，构建表达同一病原多种抗原、不同病原多种抗原的多价重组痘苗病毒载体，以及在重组痘苗病毒载体中寻找更多稳定有效的外源基因插入区意义重大。

发明内容

本发明提供了针对HIV感染的新的疫苗，其中该疫苗采用复制型痘苗病毒为载体构建。本发明还提供了应用本发明的疫苗的免疫接种方案。

本发明提供了一种表达HIV抗原的减毒艾滋病疫苗，其包含复制型痘苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的TK区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因组的N1L基因和B8R基因同时缺失。

本发明的艾滋病疫苗中，所述复制型痘苗病毒例如是痘苗病毒天坛株。

优选地，在本发明的艾滋病疫苗中，所述至少一种编码HIV抗原的多核苷酸来源于中国HIV主要流行毒株B’/C型CN54株。可用于构建本发明的艾滋病疫苗的HIV抗原选自gag、pol和env中的一或多种。在一个优选的实施方式中，可以将gag、pol和env同时插入本发明的艾滋病疫苗。

本发明的艾滋病疫苗还可包含药用可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。

本发明还提供了一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和指示免疫程序的说明书，其中一个成份为本发明的上述艾滋病疫苗。

本发明还提供了艾滋病疫苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ，其于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCC 2431。

本发明还提供了转移质粒pSKN1LLacZ，包含其的大肠杆菌(Escherichia coli)于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 2432。

此外，本发明还提供了转移质粒pSKN1L，其构建图谱如图17中所示。

附图说明

图1A-图1D：显示VTT DNA、N1LL片段、N1LR片段、N1LLR片段、pE/L+p7.5+下游LacZ片段PCR扩增结果。泳道1、8、11为DNA分子量标记DL15000(Takara公司)；泳道2、5为DNA分子量标记DL2000(Takara公司)；泳道3、4为VTT DNA；泳道6为N1LL片段；泳道7为N1LR片段；泳道9为N1LLR片段；泳道10为pE/L+p7.5+LacZ片段。

图2A和图2B：显示质粒pSKN1L、pSKN1LLacZ酶切分析结果。泳道1、4为DNA分子量标记DL15000(Takara公司)；泳道2为pSKN1L/BglII；泳道3为pSKN1L/KpnI；泳道5为pSKN1LLacZ；泳道6为pSKN1LLacZ/KpnI；泳道7为pSKN1LLacZ/SalI。

图3A-图3C：显示PCR扩增检测N1L、B8R基因同时缺失的重组病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ的结果。泳道1、6为DNA分子量标记DL2000(Takara公司)；泳道4为DNA分子量标记DL15000(Takara公司)；泳道2为VTKgpe扩增产物(引物：SEQ ID NO.：7和8)；泳道3为VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ扩增产物(引物：SEQ ID NO.：7和8)；泳道5为VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ扩增产物(引物：SEQ ID NO.：1和4)；泳道7为VTKgpe扩增产物(引物：SEQ ID NO.：1和4)。

图4：显示PCR扩增检测重组病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ中的HIV-1外源基因的结果。泳道1为DNA分子量标记DL15000(Takara公司)；泳道5为DNA分子量标记DL2000(Takara公司)；泳道2为VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ扩增产物(引物：SEQ ID NO.：9和10)；泳道4为VTT扩增产物(引物：SEQ ID NO.：9和10)。

图5：显示Western blot检测重组病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ中的外源基因稳定表达结果。泳道1为CEF细胞；泳道2为预染蛋白质分子量标记(BENCHMARKTM Prestained protein Ladder)；泳道3为VTT感染的CEF细胞；泳道4为VTKgpe感染的CEF细胞；泳道5为VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ感染的CEF细胞。

图6A-图6D：显示重组病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ分别在CEF、TK-143、Vero、BHK细胞中生长曲线测定结果。

图7：显示重组病毒在小鼠足垫局部增殖检测结果。

图8：显示重组病毒的家兔皮内毒力实验结果。

图9：显示重组病毒的乳鼠脑内毒力实验结果。

图10：显示免疫小鼠脾细胞胞内IFN-γ染色流式细胞仪分析结果。

图11：显示免疫小鼠脾细胞胞内IL-2染色流式细胞仪分析结果。

图12：显示Elispot检测小鼠抗-HIV env T细胞产生IFN-γ的结果。

图13：显示Elispot检测小鼠抗-HIV gag T细胞产生IFN-γ的结果。

图14：显示Elispot检测小鼠抗-HIV pol T细胞产生IFN-γ的结果。

图15：显示各免疫组gag特异性IgG抗体滴度结果。

图16：显示各免疫组gp120特异性IgG抗体滴度结果。

图17：显示转移质粒pSKN1L、pSKN1LLacZ构建示意图。

具体实施方式

在一个优选的实施方式中，在本发明的艾滋病疫苗中作为载体的是痘苗病毒天坛株。

在一个优选的实施方式中，用于构建本发明的艾滋病疫苗的编码HIV抗原的多核苷酸来源于中国HIV主要流行毒株B’/C型CN54株。

在另一个优选的实施方式中，可用于构建本发明的艾滋病疫苗的HIV抗原选自gag、pol和env中的一或多种。在一个更优选的实施方式中，可以将gag、pol和env同时插入本发明的艾滋病疫苗。

在一个优选的实施方式中，本发明的艾滋病疫苗还可包含药用可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。合适的佐剂、载体和赋形剂是本领域中所已知的。

本发明还提供了一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和指示免疫程序的说明书，其中一个成份为本发明的艾滋病疫苗。

在一个优选的实施方式中，在母本毒株VTKgpeΔB8R(中国专利申请公开号：CN 1560248A；为B8R基因缺失、不带LacZ选择标记及TK区插入HIV B’/C型CN54株HIV-1 gag、pol、env基因的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗)的基础上，进一步缺失N1L基因，获得艾滋病疫苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ，其于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 2431。

在一个实施方式中，本发明提供了一种痘苗病毒的通用转移载体pSKN1LLacZ，该转移质粒于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 2432。

在一个实施方式中，本发明还提供了带有痘苗病毒天坛株N1L基因左右侧同源序列的转移质粒pSKN1L，其构建图谱如图17中所示。

本发明的针对艾滋病的疫苗是基于复制型痘苗病毒载体而构建的，其不同于目前常规使用的如MVA(modifed vaccinia Ankara)株、NYVAC(NewYork Vaccinia virus)株和ALVAC(canarypox virus)株等非复制型痘苗病毒载体。

术语“人免疫缺陷病毒”(Hmuan Immunodeficiency Virus)简称“HIV”，是一种逆转录病毒，其进入人体血液后主要攻击和破坏激活免疫反应的CD4+淋巴细胞，使其失去原有的正常免疫功能。HIV感染在人类引起获得性免疫缺陷综合征(简称艾滋病)。

术语“复制型痘苗病毒载体”是指可以在人体内复制的痘苗病毒载体。在本发明的一个优选的实施方式中，所述复制型痘苗病毒载体是痘苗病毒天坛株(vaccinia virus TianTan strain，VTT)。痘苗病毒天坛株(例如可购自北京生物制品所)由中国科学家自上世纪二十年代分离后，曾作为天花疫苗在中国广泛接种，并最终在中国消灭了天花。天坛株的接种人数达十多亿，其安全性在实践中得到了长期和充分验证。天坛株疫苗的副反应发生率明显低于国际上使用的其它天花疫苗毒株，包括美国近年在生物反恐中使用的纽约株。天坛株载体安全性高，免疫原性好，可在体内诱导较强的体液免疫和细胞免疫，而且免疫反应的持续时间也远长于非复制型载体。

术语“TK区”指痘苗病毒基因组的胸苷激酶的编码基因区段，痘苗病毒正常功能的表达并不需要这个区段，当其被外源DNA取代之后不会影响病毒基因组的复制能力。在本发明的减毒艾滋病疫苗中，作为载体的复制型痘苗病毒的基因组的TK区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸。

“B8R基因”广泛存在于痘苗病毒中，其编码可溶性IFN-γ受体的同源蛋白，可竞争性结合IFN-γ受体基因，中和IFN-γ在抗病毒及免疫调节方面的生物学活性。

本发明人惊讶地发现，同时缺失B8R和N1L基因可以提高表达HIV抗原的艾滋病疫苗的安全性，并诱导强烈的免疫应答。N1L基因(一种NF-κB激活信号传导途径抑制因子)是痘苗病毒生长的非必需基因，其编码13.8kD的高度保守的蛋白质。本发明人发现可以缺失痘苗病毒基因组中的N1L基因，用作外源基因插入区。

可以选择合适的HIV抗原基因用于构建本发明的疫苗，例如，可以根据具体的流行病学研究结果，选择作为当地的主要流行株的HIV的抗原基因。在本发明的一个具体实施方式中，根据中国分子流行病学研究结果，选择中国HIV主要流行毒株B’/C型CN54株作为设计艾滋病疫苗的病原模型，该毒株例如可获自中国疾病预防控制中心艾滋病预防控制中心。在本发明的疫苗的一个实施方式中，在复制型痘苗病毒的胸苷激酶(TK)区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸，优选地，所插入的多核苷酸是编码HIV-1抗原env、gag和pol的多核苷酸。

在一个具体的实施方式中，本发明的痘苗病毒通用转移载体pSKN1LLacZ是含有LacZ基因筛选标记的转移质粒。该转移质粒载体含有以下元件：①两个筛选标记：Amp抗性基因、LacZ基因。由p7.5启动子启动的LacZ基因用于重组痘苗病毒的蓝白斑筛选。②同源臂N1LL和N1LR序列：N1LL和N1LR是痘苗病毒N1L基因的部分片段，是痘苗病毒和转移质粒发生分子间同源重组的同源序列。③痘苗病毒的早晚期启动子pE/L。④多克隆位点，位于启动子pE/L的下游。

采用本发明的通用转移载体pSKN1LLacZ，可将LacZ标记的目的基因重组到痘苗病毒基因组DNA的N1L区中，并使得痘苗病毒基因组中含有选择标记基因。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及在构建天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗基础上，先用HIV DNA疫苗初始免疫(刘颖等，表达HIV多价抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫效果的研究.病毒学报2003，Vol19(3)：205-209)，再用本发明的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗进行加强免疫的免疫方案(即Prime-boost策略)，能够成功诱导机体产生高水平的体液和细胞免疫反应及高滴度中和抗体。

本发明的复制型痘苗病毒载体能够显著降低载体的毒力，可以用于构建表达同一病原多种抗原的多价重组痘苗病毒艾滋病疫苗。本发明的重组痘苗病毒艾滋病疫苗能诱导高水平的抗人免疫缺陷病毒的体液和细胞免疫应答，并有效提高重组痘苗病毒艾滋病疫苗的安全性及免疫原性。本发明的复制型痘苗病毒载体还可以用于构建表达不同病原多种抗原的重组疫苗。

以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1：转移质粒的构建

1、转移质粒pSKN1L的构建

采用PCR技术分别以痘苗病毒天坛株(购自北京生物制品所)DNA为模板扩增痘苗病毒天坛株N1L基因左侧同源序列N1LL片段(引物：SEQID NO.：1和2)和右侧同源序列N1LR片段(引物：SEQ ID NO.：3和4)，将N1LL片段和N1LR片段分别用Bgl II酶切消化后进行连接，以连接产物为模板进行PCR扩增(引物：SEQ ID NO.：1和4)将N1L基因左右侧同源序列连接成大片段，称作N1LLR。将大片段N1LLR、载体质粒pBR-SK(酶切图谱见图17)分别以KpnI/SalI共酶切，酶切后将两者以T4DNA连接酶连接构建带有痘苗病毒天坛株N1L基因左右侧同源序列的转移质粒pSKN1L。

1.1痘苗病毒天坛株N1L基因左、右侧同源序列N1LL、N1LR的PCR扩增

在本实验中，使用如下引物序列：

对于N1LL

正向引物：5′-cgtggtacctcgtaggcgatagaac-3′(SEQ ID NO.：1)

反向引物：5′-gatagatctatatggtgaaaataataaaat-3′(SEQ ID NO.：2)

对于N1LR

正向引物：5′-ctaagatctagagtccttatg-3′(SEQ ID NO.：3)

反向引物：5′-tacgtcgacgtagtagcatgg-3′(SEQ ID NO.：4)

用Pyrobest DNA聚合酶(购自Takara公司)分别扩增N1LL、N1LR，反应体系如下：

痘苗病毒天坛株DNA 5μl

正、反向引物各1μl

10×Pyrobest缓冲液 5μl

dNTP混合物(各2.5mM) 5μl

Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl

ddH₂O 32.5μl

PCR反应条件：94℃、2min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，共20个循环；72℃，7min；4℃。

1.2大片段N1LLR的制备

将经Bgl II分别完全消化的N1LL片段和N1LR片段按1∶1的摩尔比混合，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。

1.3大片段N1LLR的PCR扩增

大片段N1LLR的PCR扩增采用前述正向引物SEQ ID NO.：1、反向引物SEQ ID NO.：4及Pyrobest DNA聚合酶(购自Takara公司)，反应体系如下：

大片段N1LLR 1μl

正、反向引物各1μl

10×Pyrobest缓冲液 5μl

dNTP混合物(各2.5mM) 5μl

Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl

ddH₂O 37.5μl

1.4质粒pSKN1L的构建与鉴定

大片段N1LLR扩增产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物用KpnI/SalI(购自Takara公司)共酶切。将pBRSK质粒载体(由本实验室构建，CN1560248)用KpnI/SalI(购自Takara公司)共酶切，将酶切产物用Omega公司的E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收。将经共酶切的大片段N1LLR扩增产物及回收的pBRSK质粒载体用T4DNA连接酶(购自Takara公司)连接，转化感受态大肠杆菌Top10，用转化后的大肠杆菌涂含氨苄青霉素的LB平板，然后于37℃培养12-16小时。提取质粒，用限制性内切酶BglII和KpnI酶切鉴定。将正确重组克隆命名为pSKN1L。

结果如图1、2所示。

2、转移质粒pSKN1LLacZ的构建

以质粒pSC65(CGMCC NO.1097)为模板扩增痘苗病毒启动子序列pE/L+p7.5+下游LacZ序列(引物：SEQ ID NO.：5和6)。

在本实验中，使用如下引物序列：

正向引物：5′-tctttcggatccttgttgaattagatcg-3′(SEQ ID NO.：5)

反向引物：5′-gtttgccatacgctcacagaag-3′(SEQ ID NO.：6)

pE/L+p7.5+下游LacZ的PCR扩增反应采用Pyrobest DNA聚合酶(购自Takara公司)进行，反应体系如下：

质粒pSC65 1μl

正、反向引物各1μl

10×Pyrobest缓冲液 5μl

dNTP混合物(各2.5mM) 5μl

Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl

ddH2O 37.5μl

PCR反应条件：94℃、2min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、90s，共20个循环；72℃、7min；4℃。

将pE/L+p7.5+下游LacZ的PCR扩增产物用Omega公司的E.Z.N.A

Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物用BamHI(购自Takara公司)酶切。转移质粒pSKN1L用BglII(购自Takara公司)酶切，酶切产物用Omega公司的E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收。然后将二者用T4DNA连接酶(购自Takara公司)连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16小时。提取质粒，用限制性内切酶BglII、SalI和KpnI酶切鉴定。正确重组克隆命名为pSKN1LLacZ(CGMCC 2432)，其带有痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5和p7.5下游的LacZ序列以及N1L基因左右两侧的同源序列。

图1和图2分别显示了N1LL片段、N1LR片段、N1LLR片段、pE/L+p7.5+下游LacZ片段的PCR扩增结果；以及质粒pSKN1L、pSKN1LLacZ的分析结果。

实施例2：本发明的插入HIV-1 gag、pol、env基因，并缺失B8R和N1L基因的重组痘苗病毒的构建

1、通过转染制备本发明的重组痘苗病毒

以重组痘苗病毒VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失、不带LacZ选择标记、TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gag、pol、env基因的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗，参见CN1560248)感染80-90％成片的鸡胚成纤维细胞(CEF，购自北京实验动物中心)(MOI＝0.01～0.1)，37℃吸附1小时后，弃去培养物上清液，并用无血清Eagle’s培养基(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所)漂洗细胞2次。利用Invitrogen公司的转染试剂盒(LipofectinReagent Cat.18292-011)，根据该试剂盒说明书的指示用转移质粒pSKN1LLacZ转染上述经重组痘苗病毒VTKgpeΔB8R感染的CEF细胞。转染结束后，将转染混合液冻融三次后收获重组病毒液。

2、本发明的重组痘苗病毒的筛选

取10μl重组痘苗病毒液接种80％成片的CEF细胞，48小时后用营养琼脂(含10mg/mL X-gal、1％中性红、1％低熔点琼脂糖的Eagle’s)铺斑，随机挑取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代。

3、本发明的重组痘苗病毒的鉴定

3.1扩增重组痘苗病毒的B8R、N1L及TK区特异性片段

提取重组痘苗病毒的基因组DNA，并以其为模版PCR扩增重组痘苗病毒的B8R、N1L及TK区特异性片段。

在该实验中，使用如下引物序列：

对于N1L区

正向引物：5′-cgtggtacctcgtaggcgatagaac-3′(SEQ ID NO.：1)

反向引物：5′-tacgtcgacgtagtagcatgg-3′(SEQ ID NO.：4)

对于B8R区

正向引物：5′-gtaataggtaccgtagcatcctattcg-3′(SEQ ID NO.：7)

反向引物：5′-attcgtggatccattgtaacaagatatc-3′(SEQ ID NO.：8)

对于TK区

正向引物：5′-atatcctcatcaacgaaccgagtc-3′(SEQ ID NO.：9)

反向引物：5′-cgtgctaatctagcgtgtgaagacg-3′(SEQ ID NO.：10)

分别在50μl PCR反应体系中采用Pyrobest DNA聚合酶(购自Takara公司)扩增B8R、N1L及TK区特异性片段，反应体系如下：

重组痘苗病毒的基因组DNA 3μl

正、反向引物各1μl

10×Pyrobest缓冲液 5μl

dNTP混合物(各2.5mM) 5μl

Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl

ddH₂O 34.5μl

PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃、10s，55℃、30s，72℃、300s(对于N1L区)或60s(对于B8R区)或400s(对于TK区)，共30个循环；72℃、7min；4℃。

分别取5μl PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示本发明的重组痘苗病毒分别特异性扩增出4560bp的N1L区、1244bp的B8R区及7000bp的TK区特异性片段，证实本发明的重组痘苗病毒在VTKgpeΔB8R的基础上于N1L区插入了LacZ基因(即成功缺失了N1L基因)，B8R基因稳定缺失，原HIV抗原基因gagpolΔ和mgp140TM仍旧保留，如图3、4所示。由此筛选到的阳性重组痘苗病毒命名为VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ。

3.2重组痘苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ的进一步纯化

将通过凝胶电泳初筛得到的阳性重组痘苗病毒再经过三轮噬斑纯化，每轮都用抗体染色法或PCR法检测。

3.3Western Blotting检测VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ中HIV基因的表达

以上述纯化的重组病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ以0.1～0.01pfu/细胞的病毒量感染CEF细胞，培养48小时后收获细胞，向细胞中加入1ml的蛋白质提取缓冲液(1％SDS、1mmol/L PMSF、20mmol/L Tris-Cl pH7.0、1％β-巯基乙醇)，立即混匀，反复冻融三次，该处理后的样品待用于电泳及电转移。

将上述处理后的样品用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳并利用Hybond-C硝酸纤维素膜(Amersham公司)转膜。

用5％的脱脂奶按1∶100稀释一抗(一抗是HIV阳性儿童的血清)。于室温孵育转移后的硝酸纤维素膜2h。PBS洗膜3次，每次10min。加入用5％的脱脂奶按1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(二抗是HRP标记的羊抗人IgG，购自中山生物技术公司)，室温孵育1h。PBS洗膜3次，每次10min。DAB显色后，蒸馏水漂洗终止反应。

结果如图5所示：VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ表达的Gag蛋白分子量约为55KDa，此外还有一条约41KDa的条带，此为Gag蛋白加工不完全的产物。VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ表达的gp140TM蛋白的大小则在80～140KDa范围之间，这显示了gp140TM蛋白从未糖基化到完全糖基化不同阶段的不同分子量。表明最终获得了N1L基因缺失为标记基因LacZ所替换的重组病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ，且该病毒能够正确表达HIV目的蛋白。因此VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ被确定为重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗。

4、重组病毒在细胞中的生长增殖测定

将VTKgpe(TK区插入B’/C型CN54株HIV-1gag、pol、env基因的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗，CN101020052)、VTKgpeΔB8R、VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ以0.001PFU/细胞的病毒量分别感染大方瓶培养的单层细胞(CEF、TK-143、Vero和BHK)，吸附1h后，漂洗2次。于37℃，在5％CO₂浓度的培养箱中培养，分别于24、48h后收获细胞，冻融3次，同时在各细胞中测定病毒滴度并绘制生长曲线(图6)。结果显示：N1L、B8R基因缺失对重组痘苗病毒在体外细胞中的增殖复制没有显著影响。

5、VTT、VTKgpe、VTKgpeΔB8R、VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ在小鼠足垫的局部增殖

分别在小鼠足垫接种1X10⁵pfu以上各病毒，5天后取样分离病毒并测定病毒增殖滴度，实验表明VTKgpeΔB8R、VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ在小鼠足垫局部组织的增殖滴度低于VTKgpe，VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ在小鼠足垫局部组织的增殖滴度最低，VTT增殖滴度最高。结果如图7所示。

实施例3：缺失N1L和B8R基因对HIV-1天坛株重组疫苗的安全性的影响的研究

1、兔皮肤毒力实验

新西兰家兔(购自北京开源兔业养殖场)(2kg)6只，背部剃毛，每只兔背分别经皮内注射同时接种1×10⁶PFU的VTT、VTKgpe、VTKgpeΔB8R、VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ。连续14天观察记录皮肤注射部位红肿情况，并用卡尺测其浸润直径和坏死直径。

结果显示VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ皮肤发痘浸润毒力比VTKgpe降低100倍，且其形成的皮肤表面瘢痕显著小于VTKgpe、VTKgpeΔB8R(结果如图8和表1)，表明在VTKgpeΔB8R基础上缺失N1L基因可显著降低疫苗的皮肤毒力。

表1

2、乳鼠脑内毒力实验

将20μl 1X10⁶pfu/ml VTKgpe、VTKgpeΔB8R、VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ重组病毒分别脑内接种四组9-10日龄C57BL/6(每组6只，购自中国医学科学院动物研究所)，连续观察，记录乳鼠死亡数，结果显示VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ组生存时间最长，VTKgpeΔB8R组次之，VTKgpe组生存时间最短(实验结果见图9和表2)。表明在VTKgpeΔB8R基础上缺失N1L基因可有效降低疫苗的神经毒力。

表2

实验结果证实，本发明构建的重组痘苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ，能有效降低重组痘苗病毒毒力，显示较现有技术中的疫苗有更好的安全性。

实施例4：重组痘苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ在动物体内诱导HIV特异性免疫的效力

本实施例中使用6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19-25克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明疫苗的效力。给每只实验小鼠胫骨前肌分别注射DNA疫苗pcDNA-syngag、pcDNA-syngp120及pcDNA-syngpol(由本实验室以pcDNA3.1为载体构建，分别表达HIV CN54gag、gp120和pol合成基因)50μg。每间隔2周以相同剂量加强免疫2次。第18周，分别用重组痘苗病毒(免疫剂量10⁷PFU)经腹腔注射接种实验组小鼠(用VTKgpeΔB8R加强免疫为DNA+VTKgpeΔB8R组；用VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ加强免疫为DNA+VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ组)。按照与实验组小鼠相同的免疫程序及剂量，用pcDNA空载体免疫三次、不插入目的基因的痘苗病毒天坛株VTT(天花疫苗，由北京生物制品所惠赠)加强一次获得载体对照组(即，pcDNA+VTT组)。

检测小鼠脾细胞内IFN-γ和IL-2的分泌：第20周，取小鼠脾脏制备单细胞悬液。调整细胞浓度至5×10⁶(个/ml)，96孔板每孔加入细胞悬液100μl。用如下表3所列刺激肽(终浓度5μg/ml)刺激1h后，加入BFA(终浓度10μg/ml)继续培养18h。对CD8分子、CD3分子、细胞内IFN-γ、细胞内IL-2分别用PE、PE-cy5、FITC、FITC染色后用流式细胞仪进行检测，检测分泌IFN-γ和IL-2的CD8⁺T淋巴细胞占脾脏总CD8⁺T淋巴细胞的比率。结果表明，DNA+VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ组的HIV特异性的分泌IFN-γ和IL-2的CD8⁺T淋巴细胞占脾脏总CD8⁺T淋巴细胞的平均百分比数均高于DNA+VTKgpeΔB8R组(0.2＞p＞0.05)，且与对照组有显著性差异(实验结果见图10、11)。

表3

HIV表位肽名称	表位肽位置	基于中国流行株的表位肽的氨基酸序列	表位特征
HIV表位肽名称	表位肽位置	基于中国流行株的表位肽的氨基酸序列	表位特征	Gag P24肽	P24	AMQILKDTI(SEQ ID NO.：11)	小鼠(H-2^d)
env肽		GKEVHNVWATHACVPTDPNP(SEQ ID NO.：12)SELYKYKVVEIKPLGIAPTA(SEQ ID NO.：13)QQSNLLRAIEAQQHLLQLTV(SEQ ID NO.：14)	小鼠(H-2^d)	Gag P24肽	P24	AMQILKDTI(SEQ ID NO.：11)	小鼠(H-2^d)
env肽			小鼠(H-2^d)	Pol-1肽	Pol	GTVLVGPTPVNIIGR(SEQ ID NO.：15)VGPTPVNIIGRNLLT(SEQ ID NO.：16)VHGVYYDPSKDLIAE(SEQ ID NO.：17)YYDPSKDLIAEIQKQ(SEQ ID NO.：18)	小鼠(H-2^d)

通过固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测脾细胞体外经HIV抗原刺激后分泌IF N-γ的细胞计数：取前面制备的小鼠脾脏单细胞悬液，96孔板每孔加入200μl所述单细胞悬液至每孔含1×10⁵个细胞，用如表3所列刺激肽(终浓度4μg/ml)刺激36小时后，产生IFN-γ的细胞经读板计数。结果显示DNA+VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ组较DNA+VTKgpeΔB8R组激发了更为强烈的HIV特异性的T细胞应答，组间无显著性差异，且与对照组有显著性差异。实验结果见图12、13、14。表明VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ能在小鼠体内诱导较VTKgpeΔB8R为强的HIV特异性细胞免疫。

体液免疫的检测：在最后一次免疫后三周取实验小鼠血清，用Gag P55和Env gp120抗原包被酶标板，间接ELISA法分别进行Gag和Env特异性IgG抗体水平的检测，结果显示DNA+VTKgpeΔB8R组、DNA+VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ组激发了强烈的HIV抗Gag和抗Env特异性的体液免疫，且组间无显著性差异，各免疫组Gag特异性抗体IgG2a/IgG1比值均大于2(实验结果见图15和表4)，而各免疫组gp120特异性抗体IgG2a/IgG1比值均小于1(实验结果见图16和表5)，说明本发明所构建的重组痘苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ表达的Gag抗原可诱导Th1倾向的免疫反应，而Env抗原可成功诱导特异性的体液免疫。

表4

表5

实验结果证实，本发明构建的重组痘苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ，能在BALB/c(H-2d)雌性小鼠体内诱导HIV特异性的细胞免疫和体液免疫，特别是在经DNA疫苗初始免疫之后，重组痘苗病毒的加强免疫能显著提高免疫反应的强度。

以上实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域人员可以对本发明作出多种改动和变化，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心

<120>基于N1L和B8R基因缺失的痘苗病毒载体的艾滋病疫苗

<130>I200701735CB

<160>18

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>1

cgtggtacct cgtaggcgat agaac 25

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>2

gatagatcta tatggtgaaa ataataaaat 30

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>3

ctaagatcta gagtccttat g 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>4

tacgtcgacg tagtagcatg g 21

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>5

tctttcggat ccttgttgaa ttagatcg 28

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>6

gtttgccata cgctcacaga ag 22

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>7

gtaataggta ccgtagcatc ctattcg 27

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>8

attcgtggat ccattgtaac aagatatc 28

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>9

atatcctcat caacgaaccg agtc 24

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer

<400>10

cgtgctaatc tagcgtgtga agacg 25

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>11

Ala Met Gln Ile Leu Lys Asp Thr Ile

1 5

<210>12

<211>20

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>12

Gly Lys Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr

1 5 10 15

Asp Pro Asn Pro

20

<210>13

<211>20

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>13

Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Glu Ile Lys Pro Leu Gly Ile

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ala

20

<210>14

<211>20

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>14

Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Val

20

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>15

Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg

1 5 10 15

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>16

Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr

1 5 10 15

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>17

Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu

1 5 10 15

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>18

Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln

1 5 10 15

Claims

1、一种表达HIV抗原的减毒艾滋病疫苗，其包含复制型痘苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的TK区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因组的N1L基因和B8R基因同时缺失。

2、权利要求1的艾滋病疫苗，其中所述复制型痘苗病毒是痘苗病毒天坛株。

3、权利要求1或2的艾滋病疫苗，其中所述至少一种编码HIV抗原的多核苷酸来源于HIV B’/C型CN54株。

4、权利要求1或2的艾滋病疫苗，其中所述HIV抗原选自gag、pol和env中的一或多种。

5、权利要求1或2的艾滋病疫苗，其还包含药用可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。

6、一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和指示免疫程序的说明书，其中一个成份为权利要求1-5中任一项的艾滋病疫苗。

7、艾滋病疫苗病毒VTKgpeΔB8RΔN1LLacZ，其于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC2431。

8、转移质粒pSKN1LLacZ，其于2008年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 2432。

9、转移质粒pSKN1L，其构建图谱如图17中所示。