CN101657536B

CN101657536B - 软骨细胞制备方法

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Publication number: CN101657536B
Application number: CN200880002777.4A
Authority: CN
Inventors: 谷口英树; 小林真司
Original assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM
Current assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2028-01-23
Also published as: EP2119767A1; WO2008091013A1; JPWO2008091013A1; US9951312B2; KR101503939B1; CN101657536A; EP2119767B1; JP4748222B2; KR20090104833A; EP2119767A4; US20090324560A1

Abstract

本发明由软骨膜细胞制备软骨细胞。一种细胞，其是来自于软骨膜组织的细胞，能分化为软骨细胞。本发明提供所述细胞的制备方法与组合物。另外，本发明还提供软骨细胞的制备方法和用于该方法的培养基。

Description

软骨细胞制备方法

技术领域

本发明涉及软骨细胞的制备方法，更详细而言，涉及由软骨膜细胞制备软骨细胞的方法。

背景技术

如果人软骨先天缺损或者后天损伤或缺损时，通常不会再生。作为治疗人软骨疾病的现有方法，有从自身的其他部位采集软骨组织移植到缺损部位的方法，但存在采集部位和量有限的问题。为此，考虑了采集一部分自身的软骨细胞，在生物体外培养后，返回到病患部位的方法(非专利文献1～4)，也进行了临床应用(非专利文献5、6与7)。

但是，使用软骨细胞的方法存在2个问题。即，侵袭采集部位的问题与长期维持形态的问题。所谓第一个的侵袭采集部位的问题，是指采集用于培养软骨的软骨时，导致该部位缺损、凹陷等畸形或功能障碍。所谓第二个的长期维持形态的问题，是由培养的软骨再生的组织长期未被吸收，是否可以持续维持其形态的问题。

为了解决上述问题，考虑了另外寻求软骨细胞的供给源。也就是说，利用软骨细胞以外的细胞，使其在生物体外分化为软骨细胞，返回到生物体内。上述细胞中，可以举出胚性干细胞、间叶系干细胞、来自膝关节滑膜的细胞、脂肪细胞等(专利文献1～4)。确认了上述细胞均分化为软骨细胞。但是，从伦理的观点考虑，胚性干细胞难以进行临床应用，并且难以采集间叶系干细胞与来自膝关节滑膜的细胞，或者侵袭高、由脂肪细胞分化为软骨细胞还处于研究阶段，间叶系干细胞有采集的侵袭或分化效率的问题，所以均不能应用于临床。

目前，由生物体内外的研究能确认软骨膜形成软骨(非专利文献8～10)。上述研究中，不分离软骨膜，直接以软骨膜块的状态进行移植，还远远不能应用于临床。

非专利文献1：vanOschGJetal，PlastReconstrSurg107：433-440(2001)

非专利文献2：Brittbergetal，TheNewEnglandJournalofMedicine331：889-895(1994)

专利文献3：Tingetal，AnnalsofPlasticSurgery40：413-421(1998)

非专利文献4：Rodriguezetal，PlasticandReconstructiveSurgery103：1111-1119(1999)

非专利文献5：OchiMetal，JBoneJointSurg84：571-578(2002)

非专利文献6：YanagaHetal.AesthPlastSurg28：212-221(2004)

非专利文献7：YanagaHetal.Plast&ReconstrSurg117：2019-30(2006)

非专利文献8：OveEngkvistetal.，ScandJPlastReconstSurg.1979，13；275-280

非专利文献9：OveEngkvistetal.，ScandJPlastReconstSurg.1979，13；371-376

非专利文献10：Duynsteeetal.，PlasrandReconstSurg.2002，110(4).1073-1079

专利文献1：日本特开2005-511083号公报

专利文献2：日本特开2003-51875号公报

专利文献3：日本特开2005-500085号公报

专利文献4：日本特开2001-103965号公报

发明内容

本发明的目的在于提供制备对采集部位侵袭少的软骨细胞的方法。

本发明人等为了解决上述问题，开发了使用覆盖耳廓软骨或肋软骨的外侧的软骨膜的方法。本发明人等从软骨膜分离软骨膜细胞，使其增殖，在生物体内外分化成软骨细胞，由此成功制备了作为软骨细胞的特有基质的蛋白聚糖与II型胶原。

本发明的主旨如下所述。

(1)所述细胞，其是来自人软骨膜组织的细胞，能分化为软骨细胞。

(2)如(1)所述的细胞，其中，人软骨膜组织包括最外层与成纤维细胞层。

(3)如(1)所述的细胞，其中，人软骨膜组织包括最外层、成纤维细胞层和最内层。

(4)(1)所述的细胞的制备方法，该方法包括培养从人软骨膜组织分离的细胞的步骤。

(5)一种组合物，其含有(1)～(3)中任一项所述的细胞。

(6)如(5)所述的组合物，其中，所述组合物用于下述的细胞增殖，所述细胞来自人软骨膜组织，能分化为软骨细胞。

(7)如(5)所述的组合物，其中，所述组合物用于制备人软骨细胞。

(8)如(5)所述的组合物，其中，所述组合物用于细胞移植。

(9)如(8)所述的组合物，其中，细胞移植的目的在于治疗先天性耳廓畸形、治疗肋软骨缺损、治疗关节软骨损伤、治疗气管软骨缺损、隆鼻术、颏成形术、面部的小凹陷成形术、面部左右不对称的矫正术、眼睑周围的矫正术或面部的美容整形术中的任一种。

(10)如(5)～(9)中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还含有(1)所述的细胞所产生的基质。

(11)如(5)～(10)中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还含有支架。

(12)软骨细胞的制备方法，其中，包括使(1)所述的细胞分化为软骨细胞的步骤。

(13)如(12)所述的方法，其中，通过离心管培养(1)所述的细胞来形成细胞块。

(14)如(12)所述的方法，其中，利用平板培养将(1)所述的细胞重迭。

(15)如(12)～(14)中任一项所述的方法，其中，在含有血清的培养基中使(1)所述的细胞增殖和/或分化。

(16)如(15)所述的方法，其中，血清为牛血清。

(17)如(15)所述的方法，其中，血清为自身血清。

(18)如(12)～(17)中任一项所述的方法，其中，在含有DEME/F12、血清、抗生素以及抗真菌剂的培养基中使(1)所述的细胞分化为软骨细胞。

(19)如(18)所述的方法，其中，培养基还含有地塞米松和/或L-抗坏血酸。

(20)如(18)或(19)所述的方法，其中，培养基还含有胰岛素样生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子。

(21)一种软骨细胞，其是由(12)～(20)中任一项所述的方法制备而成的。

(22)一种组合物，其含有(21)所述的软骨细胞和/或该细胞所形成的软骨组织。

(23)如(22)所述的组合物，其用于移植治疗。

(24)如(23)所述的组合物，其中，移植治疗的目的在于治疗先天性耳廓畸形、治疗肋软骨缺损、治疗关节软骨损伤、治疗气管软骨缺损、隆鼻术、颏成形术、面部的小凹陷成形术、面部左右不对称的矫正术、眼睑周围的矫正术或面部的美容整形术中的任一种。

(25)如(22)～(24)中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还含有(21)所述的软骨细胞产生的基质。

(26)如(22)～(25)中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还含有支架。

(27)一种方法，其将(1)～(3)中任一项所述的细胞移植到生物体内。

(28)一种方法，其将(21)所述的软骨细胞和/或该细胞所形成的软骨组织移植到生物体内。

(29)(1)～(3)中任一项所述的细胞在细胞移植中的应用。

(30)(21)所述的软骨细胞和/或该细胞所形成的软骨组织在移植治疗中的应用。

(31)软骨细胞产生的基质的制备方法，其包括使(1)所述的细胞分化为软骨细胞的步骤和使该软骨细胞产生基质的步骤。

(32)如(31)所述的方法，其中，所述基质为II型胶原和/或蛋白聚糖。

本发明的软骨细胞制备方法由于无需采集软骨组织，所以可以将对采集部位的侵袭抑制到最小限。

另外，通过使用含有软骨的干·前体细胞的软骨膜细胞，能长期维持再生的组织的形态。

本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请、特愿2007-012160的说明书和/或附图所记载的内容。

附图说明

[图1]采集人软骨膜时的组织学研究。

软骨组织被阿辛兰染为蓝色，但软骨膜未被染色。软骨膜可以仅采集最外层和成纤维细胞层，也可以采集最外层、成纤维细胞层及最内层(与软骨基质的过渡部)。a：采集前箭头：软骨膜b：仅剥离软骨膜的过程中c：剥离软骨膜后d：也能进一步采集软骨膜最内层(与软骨基质的过渡部)。e：仅由最外层与成纤维细胞层采集的软骨膜组织阿辛兰染色倍率200倍

[图2]软骨膜细胞的离心管培养。

软骨膜细胞块与软骨细胞块相同地通过离心管形成软骨组织。a：由软骨膜细胞再生的软骨组织b：由软骨细胞再生的软骨组织阿辛兰染色Bar：200μm

[图3]在体外，将软骨膜细胞与软骨细胞同样地重迭，由此提高基质(蛋白聚糖)产生能力。

a：明视野b：阿辛兰染色

[图4]在体外，将软骨膜细胞与软骨细胞同样地重迭，由此提高基质(蛋白聚糖)产生能力，其产生能力与软骨细胞同等。

a：单层化培养的软骨膜细胞b：重迭化(3层化)的软骨膜细胞c：单层化的软骨细胞d：重迭化(3层化)的软骨膜细胞阿辛兰染色

[图5]软骨膜细胞与软骨细胞的重迭培养中的RT-PCR。

软骨膜细胞通过重迭，I型胶原减少，II型胶原增加。

[图6]软骨膜细胞与软骨细胞的重迭化培养中用即时PCR进行定量化。

软骨膜细胞通过重迭，有I型胶原减少、II型胶原增加的倾向。

[图7]在体外，通过重迭在上清中产生蛋白聚糖。

软骨膜细胞的蛋白聚糖产生能力与软骨细胞基本同等。

[图8]在体内，培养人软骨膜细胞形成软骨组织。

移植于NOD/SCID小鼠背部皮下的培养软骨膜细胞移植后2个月的状态。阿辛兰染色a：倍率200倍b：倍率400倍

[图9]在体内，培养人软骨膜细胞产生I型胶原与II型胶原，形成软骨组织。

移植于NOD/SCID小鼠背部皮下的培养软骨膜细胞移植后2个月的状态。I型胶原(红)与II型胶原染色(绿)a倍率100倍b倍率400倍

[图10]表示弹性软骨或玻璃软骨等软骨膜与软骨的层构成。

[图11]补充图1。

人软骨膜组织分为最外层以及成纤维细胞层与最内层这2层进行采集。

其它为软骨组织。a：最外层与成纤维细胞层b：最内层c：软骨组织阿辛兰染色倍率200倍

[图12]人软骨膜细胞的增殖能力。在显微镜下比较软骨膜细胞与软骨细胞的菌落形成能力。

与人软骨细胞相比，人软骨膜细胞在培养1个月后形成较大的菌落。

人软骨细胞(虚线箭头)人软骨膜细胞(实线箭头)比例尺：500μm

[图13]人软骨膜细胞的增殖能力。人软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞的菌落形成能力比较。

使用软骨膜、软骨膜-软骨过渡部、软骨细胞培养14天，比较由50个细胞以上的菌落形成的菌落数时，可知软骨膜细胞具有高菌落形成能力。因此，可知软骨膜细胞具有有限的高增殖能力。

(在直径为3.5cm的细胞皿中分别接种500个细胞，2周后，数出形成的菌落。1个菌落为50个以上。)

^*：P＜0.001(MannWhitneyU-TestwithBonferronicorrection)n＝27(patientNo.＝3)。

[图14]人软骨膜细胞的增殖能力。比较人软骨膜、软骨-软骨膜过渡部、软骨细胞的长期增殖能力。

使用人软骨膜、软骨-软骨膜过渡部、软骨细胞，比较长期培养中的增殖能力时，可知软骨膜细胞具有高增殖能力。

^*：P＜0.001(MannWhitneyU-TestwithBonferronicorrection)n＝5(patientNo.＝5)

[图15]在体外分化诱导为脂肪和骨。

研究在体外的多分化能力时，A：脂肪分化诱导：软骨膜细胞形成脂肪滴，被作为脂肪染色的Oilred0染色，但软骨细胞不形成脂肪滴，未被染色。B：骨分化诱导：软骨膜细胞确认大量Ca沉积，被茜素红染色，但软骨细胞未见Ca沉积，未被茜素红染色。因此，确认软骨膜细胞有分化为脂肪或骨的多分化能力。

[图16]在体外分化为软骨的分化诱导。

A人软骨膜细胞的软骨分化诱导。

使用分化诱导培养基，使人软骨细胞重迭为(A)1层、(B)2层、(C)3层进行培养，由此细胞外基质产生能力提高。用I型胶原(红)、II型胶原(绿)、DAPI(蓝)进行染色时，也使其重迭为(D)1层、(E)2层、(F)3层进行培养，由此可以确认细胞外基质产生能力升高。不使用分化诱导培养基进行培养时，使细胞重迭为(G)1层、(H)2层、(I)3层进行培养，未产生细胞外基质。

A-C，G-I：阿辛兰染色D-F：I型胶原染色(红)、II型胶原染色(绿)、DAP染色I(蓝)比例尺：200μm

B人软骨细胞的软骨分化诱导。

使用分化诱导培养基，使人软骨细胞重迭为(A)1层、(B)2层、(C)3层进行培养，由此细胞外基质产生能力提高。用I型胶原(红)、II型胶原(绿)、DAPI(蓝)进行染色时，也使其重迭为(D)1层、(E)2层、(F)3层进行培养，由此可以确认细胞外基质产生能力上升。

不适用分化诱导培养基进行培养时，使人软骨细胞重迭为(G)1层、(H)2层、(I)3层进行培养，也未产生细胞外基质。比例尺：200μm

因此，在体外，软骨膜细胞与软骨细胞大致相同地分化为软骨。

[图17]在体内由人软骨膜、软骨细胞再生的软骨组织的组织学研究。

A：移植1个月后的人软骨膜、来自软骨细胞的再生软骨(A-D：来自软骨膜细胞的软骨组织、E-H：来自软骨细胞的软骨组织)

来自人软骨膜细胞的再生软骨被I型胶原覆盖，但来自软骨细胞的再生软骨未被I型胶原覆盖。

B：移植3个月后的人软骨膜、来自软骨细胞的再生软骨(A-D：来自软骨膜细胞的软骨组织、E-H：来自软骨细胞的软骨组织)

来自人软骨膜细胞的组织在移植后1个月同样被I型胶原覆盖，但来自软骨细胞的再生软骨未被I型胶原覆盖。

A，E：HE染色B，F：阿辛兰染色C，G：ElasticavanGieson染色D，H：I型胶原染色(红)、II型胶原染色(绿)、DAP染色I(蓝)比例尺：200μm

显示软骨膜细胞与软骨细胞相同地再生软骨。来自软骨膜细胞的再生软骨与来自软骨细胞的再生软骨不同，被软骨膜覆盖。这提示来自软骨膜细胞的再生软骨长期形态维持能力优异。

[图18]在体内再构成的软骨的每1mm²的细胞数。

移植后第1个月与第3个月摘出的组织软骨部的每1mm²的细胞数。

来自软骨膜细胞的组织在移植后第1个月、第3个月也未见细胞数变化，而来自软骨细胞的组织在移植后第3个月可见细胞数减少。

^*：p＜0.05、^**：p＜0.01(MannWhitneyU-Test)

显示软骨膜细胞的长期形态维持能力比软骨细胞优异。

[图19]比较用10％人自身血清培养基得到的人软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞的菌落形成能力。

人软骨膜细胞与人软骨细胞相比，在培养第9天形成较大的菌落。倍率为40倍

[图20]在显微镜下比较用10％人自身血清培养基得到的人软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞。

与10％牛血清培养基相比，10％人自身血清培养基中的各细胞更快形成汇合。倍率为40倍

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

目前，为了再生人软骨，以块的形式采集软骨组织，将其用胶原酶等酶处理，从基质成分中分离软骨细胞，培养该分离的软骨细胞，用于移植治疗、特别是自身移植。

但是，本发明中，可以不采集存在于基质中的软骨细胞，而采集包围该软骨细胞的非常薄的软骨膜。

例如，弹性软骨或玻璃软骨等软骨膜与软骨由4层形成(图10)。即，1)最外层(包括毛细血管)、2)成纤维细胞层(主要为软骨膜细胞)(图10中记为“软骨膜细胞层”)、3)最内层(与软骨基质的过渡部)、4)成熟软骨层(被软骨基质包围)这4层(例如，参见BairatiA，ComazziM，GioriaM.etal.，TissueCell28：455-68.(1996)，TonnaLabor.etal.，Invest31：609-632(1974)，Ellenderetal.，J.Anat158：173-187(1988))。“最外层”包括作为表达I型胶原、且不表达II型胶原的层的最上层的毛细血管。“成纤维细胞层”是表达I型胶原、且不表达II型胶原的层，由不含最外层的所有软骨膜细胞构成。“最内层”包括“成纤维细胞层”和表达II型胶原与蛋白聚糖的软骨基质。“成熟软骨层”是表达II型胶原与蛋白聚糖、并且不表达I型胶原的层。

至今为止的软骨采集方法是采集1)～4)全部，或3)和4)，或仅采集4)的方法。用该现有方法进行采集时，采集部位的软骨组织缺损或不恢复，在表观上有时确认凹陷或变形等畸形。

本发明中，可以使用镊子或剪刀等锋利的器具采集含有1)和2)，或1)～3)的组织。另外，也可以使用剥离器等钝器。还可以采集存在占有大部分软骨组织的软骨细胞的4)层。因此，能以最小限的侵袭进行采集，没有软骨组织的缺损，不产生畸形，这是较大的优点。在一定条件下利用胶原酶等分离由上述方式得到的组织(例如，0.1-0.3％胶原酶、37℃、1-3小时)。这是软骨膜细胞特有的分离方法。或者，采集所有的1)～4)，利用胶原酶等分离所得的组织时，也可以分离软骨膜细胞与软骨细胞。例如，使胶原酶作用时，软骨膜细胞在3小时以内分离，但分离软骨细胞时花费10-16小时左右，所以利用该时间差，可以分离软骨膜细胞与软骨细胞。

将分离得到的细胞接种在培养皿中，用增殖用培养基培养1小时左右。然后，用分化诱导培养基进行离心管培养、单层化培养或重迭培养，由此软骨膜细胞可以分化为软骨细胞。

本发明中，通过培养由不包括人软骨的人软骨膜得到的人软骨膜细胞，可以将软骨膜细胞分化为软骨细胞。

本发明能提供来自软骨膜组织，并能分化为软骨细胞的细胞。认为本发明的来自软骨膜组织的细胞是软骨干和/或前体细胞。软骨膜组织是构成耳廓或肋软骨等软骨组织的组织的一部分，其是含有软骨膜的部分。具体而言，是含有最外层及成纤维细胞层(软骨膜细胞层)的组织，含有最外层、成纤维细胞层(软骨膜细胞层)及最内层的组织。来自本发明细胞的人软骨膜组织可以包括最外层及成纤维细胞层，也可以包括最外层、成纤维细胞层及最内层。软骨膜组织可以从人、特别是需要软骨移植的患者采集。

来自软骨膜组织的细胞可以为从软骨膜组织中分离的细胞，也可以为将该细胞进行继代培养得到的细胞。

为了得到本发明的细胞，可以采集软骨膜组织，从采集的组织中分离细胞。软骨膜组织的采集可以使用镊子与剪刀等锋利的器具，也可以使用剥离器等钝器。从软骨膜组织中分离细胞时，可以在一定条件下将软骨膜组织进行胶原酶处理(例如0.1～0.3％胶原酶、37℃、1～3小时)，然后进行离心分离(例如1500rpm/5min2次)。上述处理条件可以适当变更，该变更后的方案也在本发明的范围内。通过培养从软骨膜组织分离的细胞，可以使细胞增殖，进而分化为软骨细胞。

将从软骨膜组织中分离的细胞进行初代培养与继代培养时，可以在添加有血清(例如10％的胎牛血清(FBS)、来自移植对象患者的血清)的Dulbecco’sModifiedEagles’sMedium/NutrientMixtureF12(DMEM/F12)或NutrientMixtureF-12Ham(F-12Ham)中，于约37℃下进行培养。培养基可以每隔2-4天进行更换。

为了使其增殖，软骨细胞难以长期培养，与软骨细胞相比，软骨膜细胞能进行长期的增殖培养。

使从软骨膜组织中分离的细胞分化为软骨细胞时，可以在含有血清的培养基例如DEME/F12、血清(例如10％的FBS、来自成为移植对象的患者的血清)，含有抗生素与抗真菌剂的培养基中，于约37℃下进行培养。作为含有抗生素与抗真菌剂这两者的药剂，可以使用抗生素-抗真菌溶液(antibioticantimycoticsolution)SIGMAA5955等。可以在培养基中进一步添加40～60μg/ml的地塞米松(Dexamethasone)和/或30～60μg/ml的L-抗坏血酸(L-ascorbicacid)。另外，也可以进一步添加胰岛素样生长因子(例如5～10ng/ml的胰岛素样生长因子-1(Insulinlikegrowthfactor-1)(IGF-1)、5～10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicFibroblastgrowthfactor(bFGF))等。此外，也可以添加5～10ng/ml的胰岛素(Insulin)等。可以每隔2-3天进行培养基交换。

通过将来自软骨膜组织的细胞进行离心管培养，由此可以形成细胞块。例如，在含有5ng/ml的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、40ng/ml的地塞米松、L-抗坏血酸、1％的抗生素-抗真菌溶液、Insulin·Transferrin·Serine(ITS)的DMEM/F12的无血清培养基中，在约37℃下用离心管培养培养2-4周时，形成细胞块。

另外，可以将来自软骨膜组织的细胞用平板培养进行单层化或重迭。例如，使用DMEM/F12中含有10％FBS与1％抗生素-抗真菌溶液的培养基或DMEM/F12中含有10％FBS、1％抗生素-抗真菌溶液、5ng/ml的IGF-1、5ng/ml的bFGF、40ng/ml的地塞米松的培养基，进行平板培养，每隔1周进行重迭时，基质(例如蛋白聚糖)产生能力提高。重迭的次数因用途或所需组织的大小等而不同，但理想为3～5次。

上述培养基的组成与成分含量可以适当变更，其变更后的方案也包括在本发明的范围内。

因此，本发明提供能分化为软骨细胞的细胞的制备方法，其包括将从软骨膜组织中分离细胞进行培养的步骤。

另外，本发明提供软骨细胞的制备方法，其包括使来自软骨膜组织的细胞分化为软骨细胞的步骤。通常，软骨膜细胞与软骨细胞产生的物质不同。已知软骨膜细胞存在于I型胶原中，而软骨细胞存在于II型胶原与蛋白聚糖中，来产生上述物质。软骨膜细胞与软骨细胞可以根据上述产生物质的不同来区分。

进而，本发明也提供软骨细胞，其是通过将来自软骨膜组织的细胞分化为软骨细胞而制备的。

通过将来自软骨膜组织的、能分化为软骨细胞的所述细胞移植到生物体内，由此可以进行治疗先天性耳廓畸形、治疗肋软骨缺损、治疗关节软骨损伤(例如变形性膝关节症)、治疗气管软骨缺损、隆鼻术、颏成形术、面部的小凹陷成形术、面部左右不对称的矫正术、眼睑周围的矫正术、面部的美容整形术等。移植细胞时，进一步可以添加上述细胞产生的基质(例如I、II型胶原、软骨可聚蛋白多糖等蛋白聚糖)等。另外，也可以添加来自软骨组织的软骨细胞。软骨组织可以从人、特别是需要软骨移植的患者采集。为了得到软骨细胞，可以采集软骨组织，由采集的组织分离细胞。由软骨组织分离细胞时，可以将软骨组织在一定条件下进行胶原酶处理(例如0.1-0.2％胶原酶、37℃、10-16小时)。为了增加初代培养的细胞数，将软骨细胞添加于其他培养体系或软骨细胞时，由于原本初代培养的细胞数多，所以可以以较短时间的培养准备移植所需的细胞数。移植时可以不添加任意物质进行移植，或者也可以添加I、II型胶原或蛋白聚糖等。

用注射器将来自软骨膜组织的、能分化软骨细胞的所述细胞注入患部，由此来进行细胞移植。

通过将来自软骨膜组织的、能分化为软骨细胞的所述细胞与支架(scaffold)(软骨治疗材料)一起培养，由此可以形成具有三维结构的软骨组织。作为支架材料，可以举出胶原、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚物以及聚乙烯等非吸收性材料等。

另外，使用通过使来自软骨膜组织的细胞分化为软骨细胞而制得的软骨细胞和/或该软骨细胞所形成的软骨组织，可以进行目的在于治疗先天性耳廓畸形、治疗肋软骨缺损、治疗关节软骨损伤(例如变形性膝关节症)、治疗气管软骨缺损、隆鼻术、颏成形术、面部的小凹陷成形术、面部左右不对称的矫正术、眼睑周围的矫正术、面部的美容整形术等的移植治疗。移植治疗时，还可以添加上述软骨细胞所产生的基质(例如I、II型胶原、蛋白聚糖、软骨可聚蛋白多糖)。另外，也可以添加来自软骨组织的软骨细胞。得到软骨细胞的方法与添加软骨细胞的优点如上所述。进而，在细胞培养中，将吸收性或非吸收性材料放置在培养器的底部，由此可以将软骨膜细胞放入材料中。可以直接移植到患部。

移植软骨细胞可以通过用注射器将细胞注入患部来进行。

使用材料等支架的软骨组织的移植可以通过外科移植手术来进行。例如，可以使用隆鼻术、耳廓成形术的手术等外科方法。

进而，本发明提供软骨细胞所产生的基质的制备方法，其中，该方法包括使软骨膜细胞分化为软骨细胞的步骤以及使该软骨细胞所产生基质的步骤。作为软骨细胞所产生的基质，可以举出II型胶原、蛋白聚糖。上述基质可以用于化粧品、食品、健康食品、医药品等。

以下，通过实施例具体说明本发明。本发明的范围不限定于下述实施例。

[实施例1]

以下，所谓采集时的软骨膜组织，是指组织学上的最外层与成纤维细胞层，软骨膜-软骨过渡部组织是指最内层。

软骨膜细胞的采集

为了从耳廓或肋软骨等软骨组织(使用获得本人或父母同意，由手术时所剩余的人耳廓软骨得到的软骨膜。获得神奈川县立儿童医疗中心与横浜市立大学医学部附属医院的伦理委员会的同意)采集软骨膜组织，使用镊子与剪刀等锋利的器具。另外，可以使用剥离器等钝器。使用锋利的器具时，为了确认是否仅采集软骨膜，用组织切片对每个个体进行确认(图1)。

从所得的组织中除去位于脂肪组织等软骨膜上的所有组织。然后，使用剪刀等锋利的器具，用手采集软骨膜。

用作为软骨基质特有染色的阿辛兰染色对各个个体确认采集的软骨膜组织。采集的软骨膜组织完全没有被阿辛兰染色所染色，软骨膜-软骨过渡部组织的一部分与软骨组织全部被染色(图11)。

软骨膜细胞的分离

使用剪刀、手术刀等剪断所得的软骨膜，在0.1-0.3％胶原酶中于37℃下振荡1-3小时。然后，进行离心(在1500rpm/5min下2次)，回收沉淀物。由此可以分离软骨膜细胞。

软骨膜细胞的初代培养

将由上述得到的软骨膜细胞在Dulbecco’ModifiedEagls’sMedium/NutrientMixtureR12(DMEM/F12)与10％胎牛血清(FBS)中于37℃下进行平板培养，培养基每周换2次。2周以内细胞增殖并密集，将其用于继代培养。7-10天细胞增殖并密集。继代培养至少可以持续6个月。

软骨膜细胞向软骨的分化

a)将软骨膜细胞进行离心(在1500rpm/5min下2次)，使其沉淀，形成细胞块，将该细胞块在含有5ng/ml的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、40ng/ml的地塞米松、30～60μg/ml的L-抗坏血酸、1％抗生素-抗真菌溶液(Antibioticantimicoticsolution)、1％Insulin·Transferrin·Serine(ITS)的DMEM/F12的无血清培养基中培养3-4周。将所得到的白色用阿辛兰染色，此时细胞外基质染成蓝色，提示存在作为软骨标记的软骨可聚蛋白多糖。与用相同的方法得到的软骨细胞形成的细胞块相比，基本相同(图2)。

软骨细胞使用剥离器等钝器采集。然后，通过离心(在1500rpm/5min下2次)使其沉淀，形成细胞块。将细胞块在含有5ng/ml的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、40ng/ml的地塞米松、30～60μg/ml的L-抗坏血酸、1％抗生素-抗真菌溶液、1％Insulin·Transferrin·Serine(ITS)的DMEM/F12的无血清培养基中培养3-4周。

b)在平板培养的密集状态的软骨膜细胞上进一步接种软骨膜细胞。培养基使用在DMEM/F12中含有10％FBS与1％抗生素-抗真菌溶液的培养基，或在DMEM/F12中含有10％FBS、1％抗生素-抗真菌溶液、5ng/ml的IGF-1、5ng/ml的bFGF、40ng/ml的地塞米松的培养基。

使用后者的培养基，将培养第1周的细胞和培养第3周的软骨膜细胞及软骨细胞进行阿辛兰染色(图3，4)、逆转录扩增(Reversetranscription-PolymerasechainReaction)(RT-PCR)(图5)以及定量PCR(图6)，进行比较。在福尔马林固定后基于组织切片进行阿辛兰染色。结果，在阿辛兰染色中，细胞皿上被染色为蓝色。用于RT-PCR与定量PCR时，由软骨膜细胞与散骨细胞提取RNA。RNA的提取使用RAeasy(QIAGEN公司)，根据其操作规程进行。由所得的RNA，使用RNAPCRkit(Takara公司)得到cDNA。RT-PCR的引物为I型胶原F：atgctcagctttgtggatacgcgg(序列号1)、R：aggaaagccacgagcaccctgtgg(序列号2)、II型胶原F：catcattgacattgcacccatg(序列号3)、R：ttagtttcctgtctctgccttg(序列号4)、软骨可聚蛋白多糖F：caggtgaagactttgtggacatcc(序列号5)、R：cctcctcaaaggtcagcgagtagc(序列号6)。另外，定量PCR的引物使用TaqmanGeneExpressionAssays(由生物系统公司提供(AppliedBiosystems))的I型胶原：Hs00266273_ml，II型胶原：Hs00164099_ml，软骨可聚蛋白多糖：Hs00202971_ml。

结果提示，作为软骨膜标记的I型胶原减少，作为软骨标记的II型胶原增加，软骨膜细胞分化为软骨细胞。另外，采集细胞皿的上清，使用Blyscan(Biocolor公司)，用酶免疫测定法(ELISA：EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)定量测定软骨细胞产生的蛋白聚糖，结果显示软骨膜细胞具有与软骨细胞同等的蛋白聚糖产生能力(图7)。

由以上内容提示，软骨膜细胞与软骨细胞向软骨细胞的分化未出现较大差异，软骨膜细胞具有与软骨细胞基本同等的软骨分化能力。

软骨膜细胞的移植

通过细胞铲(Celllifter)回收由上述培养b得到的细胞，移植于重症免疫功能不全小鼠(三協、日本)的背部皮下。2个月后采集，进行组织学研究。为了将采集的组织进行组织学研究，薄切，制作组织标本。相对于此，为了将作为软骨组织特有的基质的蛋白聚糖染色而进行阿辛兰染色。另外，对覆盖作为软骨组织的基质的II型胶原与软骨周围的I型胶原进行免疫染色。结果，软骨组织的细胞外基质经阿辛兰染色染成蓝色，提示存在作为软骨标记的蛋白聚糖(图8)。另外，软骨组织的细胞外基质被II型胶原染色，软骨周围组织被I型胶原染色(图9)。因此，确认移植培养得到的软骨膜细胞，形成软骨组织。

比较体外的软骨膜细胞与软骨细胞的菌落

对所得的软骨膜细胞与软骨细胞进行菌落分析。将各细胞在35mm边缘设计型(EASYGRIP)细胞培养皿中调整成1cells/cm²进行接种。使用含有10％胎牛血清(fetalbovineserum)、1％抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco’smodifiedEaglemediumandHam′sF-12medium，在气相条件设定为37℃、CO²浓度为5％的培养箱内培养细胞。从接种24小时后每3天进行1次培养基更换。培养1个月后，在显微镜下确认形成的菌落，拍摄照片。结果，软骨膜细胞的菌落比软骨细胞的菌落大(图12)。

比较人软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞的菌落形成能力

对所得的软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞进行菌落分析。将各细胞在35mm边缘设计型细胞培养皿中调整成52cells/cm²，进行接种。使用含有10％胎牛血清、1％抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco′smodifiedEaglemediumandHam’sF-12medium，在气相条件设定为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱内培养细胞。在接种24小时后每3天进行1次培养基交换。培养14天后，计数菌落数。以50个以上的细胞基团作为1个菌落。比较菌落数的结果表明，按照软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞的顺序，具有高菌落形成能力(图13)。

^*：p＜0.001(MannWhitneyU-testwithBonferronicorrection)n＝27(patientNo，＝3)。

比较人软膜、软骨-软骨膜过渡部、软骨细胞的长期增殖能力

对所得的软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞研究长期的增殖能力。将各细胞在35mm边缘设计型细胞培养皿中以120cells/cm²进行接种。使用含有10％胎牛血清、1％抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco’smodifiedEaglemediumandHam’sF-12medium，在气相条件设定为37℃、CO²浓度为5％的培养箱内培养细胞。在接种24小时后每3天进行1次培养基交换。培养约14天后，细胞形成汇合，使用含有0.2％胶原酶型II的Hank’s平衡盐溶液剥离细胞，使用血细胞计算板，计数细胞数后，在35mm边缘设计型细胞培养皿中以1200cells/cm²接种。反复进行该操作。经182天进行14继代，结果确认软骨膜细胞比软骨膜-软骨过渡部细胞或软骨细胞具有明显更高的增殖能力(图14)。另外，确认软骨膜-软骨过渡部细胞具有比软骨细胞高的增殖能力(图14)。

^*：P＜0.001(MannWhitneyU-TestwithBonferronicorrection)n＝5(patientNo，＝5)

在体外向脂肪与骨的分化诱导

将软骨膜细胞与软骨细胞分化为骨与脂肪的分化诱导进行3周。骨分化诱导培养基使用hMSCOsteogenicSingleQuots(注册商标)。脂肪分化诱导培养基使用hMSCAdipogenicinductionSingleQuots(注册商标)。结果，软骨膜细胞形成脂肪滴，被OilredO染色，软骨细胞未形成脂肪滴(图15A)。进而，软骨膜细胞可见大量Ca沉积，被茜素红染色，而软骨细胞未见Ca沉积，未被茜素红染色(图15B)。

在体外向软骨分化诱导

利用重迭培养将导软骨膜细胞与软骨细胞分化诱导为软骨细胞。将各细胞调整为2.5×10⁴cells/cm²，进行接种。培养7天后，使用含有0.2％胶原酶型II的Hank’s平衡盐溶液，剥离细胞。然后，将细胞调节为2.5×10⁴cells/cm²，在培养7天后的细胞上重迭，进行接种。使用含有10％胎牛血清、1％抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco′smodifiedEaglemediumandHam′sF-12medium培养直至接种后48小时，48小时后使用含有10％胎牛血清、1％抗生素-抗真菌溶液、L-抗坏血酸2-磷酸酯、地塞米松、胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子的Dulbecco’smodifiedEaglemediumandHam’sF-12medium进行培养。使用该培养基培养4天后，进一步在培养基上接种2.5×10⁴cells/cm²的细胞，同样进行培养。每周进行该操作计2次。在气相条件设定为37℃、CO²浓度为5％的培养箱内进行培养，每3天进行1次培养基更换。在该操作中每1周进行组织学研究至3周。结果，在细胞皿上软骨膜细胞与软骨细胞同样地被阿辛兰染色，被II型胶原染色(图16A，B)。

在体内由人软骨膜、软骨细胞再生的软骨组织的组织学研究

用Celllifter剥离使用分化诱导培养基分化诱导为软骨的来自软骨膜细胞与来自软骨细胞的软骨细胞。剥离的细胞回收于安装有23G注射针(泰尔茂、都市名Japan)的2.5ml注射器(泰尔茂、Japan)。在进行了背部除毛的重症免疫功能不全小鼠(三協、日本)的背部皮下注入平均1ml注射器内的细胞，进行移植。移植后，在第1个月与第3个月进行摘出，进行组织学研究。分别进行苏木素-伊红、阿辛兰、ElasticavanGieson、I型、II型胶原的染色。结果，来自软骨膜细胞与软骨细胞的组织均被阿辛兰、ElasticavanGieson染色(图17A，B均为B，C，F，G)。并且，来自软骨膜细胞的组织被I型胶原、II型胶原染色(图17A，B均为D)。另一方面，来自软骨细胞的组织被II型胶原染色，但未被I型胶原染色(图17A，B均为H)。

在体内再构成的软骨的每1mm ² 的细胞数

计测上述在体内由人软骨膜、软骨细胞再生的软骨组织的组织学研究得到的移植后第1个月与第3个月摘出的组织软骨部中每1mm²的细胞数。来自软骨膜细胞的组织在移植后第1个月、第3个月均未见细胞数变化，相对于此，来自软骨细胞的组织在移植后第3个月可见细胞数减少(图18)。

^*：p＜0.05、^**：p＜0.01(MannWhitneyU-Test)

人自身血清的制作方法

使用人自身血清，其如下得到：将由采集了软骨的同一患者得到的人自身血液在室温下静置20分钟后，以3000转离心分离10分钟，将上清部分作为人自身血清回收。培养中在37℃下固定30分钟，用0.45μm的过滤器过滤灭菌，使用人自身血清。

比较10％人自身血清培养基得到的人软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞的菌落形成能力

对于所得的软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞，进行菌落分析。将各细胞调整成每个35mm边缘设计型细胞培养皿为500cells进行接种。使用含有10％人自身血清、1％抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco’smodifiedEaglemediumandHam’sF-12medium，在气相条件设定为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱内培养细胞。从接种24小时后每7天进行1次培养基交换。培养9天后，拍摄菌落的照片(图19)。与人软骨细胞比较，人软骨膜细胞在培养第9天形成较大的菌落。

在显微镜下比较用10％人自身血清得到的人软骨膜细胞、软骨膜-软骨过渡部细胞、软骨细胞

对于所得的软骨膜细胞、软骨膜·软骨过渡部细胞、软骨细胞，将各细胞调整成24孔细胞培养板每孔为5000cells进行接种。使用含有10％人自身血清、1％抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco’smodifiedEaglemediumandHam’sF-12medium，在气相条件设定为37℃、CO²浓度为5％的培养箱中培养细胞。在接种24小时后每3天进行1次培养基交换。培养10天后，拍摄照片(图20)。与10％牛血清培养基比较，在10％人自身血清培养基中的各细胞更快地形成汇合。

本说明书中所引用的所有出版物、专利与专利申请直接作为参考引用入本说明书中。

产业上的可利用性

通过本发明，使人软骨膜细胞增殖·分化，能培养人软骨细胞。进而，通过离心管培养、将人软骨膜细胞用胶原凝胶等进行的三维培养或重迭培养，可以得到人软骨细胞块。另外，将所得的人软骨细胞块直接或包埋在胶原凝胶等软骨治疗材料中，进行移植，由此可以用于与软骨相关的疾病(例如先天性耳廓奇形、肋软骨缺损、变形性膝关节症等关节软骨损伤(例如变形性膝关节症)、气管软骨缺损等)。另外，在用于改善在美容整形领域中的审美的治疗、例如隆鼻术、颏成形术、面部的小凹陷成形术、面部左右不对称的矫正术、眼睑周围的矫正术或面部的美容整形术的软骨移植的治疗中也有用。

配列表freetext

<序列号1>

序列号1表示I型胶原的RT-PCR正向引物的碱基序列。

<序列号2>

序列号2表示I型胶原的RT-PCR反向引物的碱基序列。

<序列号3>

序列号3表示II型胶原的RT-PCR正向引物的碱基序列。

<序列号4>

序列号4表示II型胶原的RT-PCR反向引物的碱基序列。

<序列号5>

序列号5表示软骨可聚蛋白多糖的RT-PCR正向引物的碱基序列。

<序列号6>

序列号6表示软骨可聚蛋白多糖的RT-PCR反向引物的碱基序列。

<110>公立大学法人横滨市立大学

<120>软骨细胞制备方法

<130>FP-103PCT

<150>JPP2007-012160

<151>2007-01-23

<160>6

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Primer

<400>1

atgctcagctttgtggatacgcgg24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Primer

<400>2

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<212>DNA

<213>Artificial

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<400>3

catcattgacattgcacccatg22

<210>4

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<213>Artificial

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<210>6

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<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Primer

<400>6

cctcctcaaaggtcagcgagtagc24

Claims

1.一种软骨细胞的制备方法，其中，

包括在含有DEME/F12、血清、抗生素、胰岛素样生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子、以及抗真菌剂的培养基中且在体外使来自人软骨膜组织的最外层和/或成纤维细胞层的人软骨膜细胞分化为软骨细胞的步骤，所述最外层表达I型胶原、且不表达II型胶原，并且，所述成纤维细胞层表达I型胶原、且不表达II型胶原。

2.如权利要求1所述的方法，其中，

通过离心管培养人软骨膜细胞来形成细胞块。

3.如权利要求1所述的方法，其中，

利用平板培养将人软骨膜细胞重迭。

4.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，其中，

血清为牛血清。

5.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，其中，

血清为自身血清。

6.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，其中，

培养基还含有地塞米松和/或L-抗坏血酸。

7.一种软骨细胞产生的基质的制备方法，

其包括在含有DEME/F12、血清、抗生素、胰岛素样生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子、以及抗真菌剂的培养基中且在体外使来自人软骨膜组织的最外层和/或成纤维细胞层的人软骨膜细胞分化为软骨细胞的步骤以及使该软骨细胞产生基质的步骤，

所述最外层表达I型胶原、且不表达II型胶原，所述成纤维细胞层表达I型胶原、且不表达II型胶原。

8.如权利要求7所述的方法，其中，

所述基质为II型胶原和/或蛋白聚糖。