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CN101631569B - 低聚物-抗组胺剂偶联物 - Google Patents

低聚物-抗组胺剂偶联物 Download PDF

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CN101631569B CN2008800080850A CN200880008085A CN101631569B CN 101631569 B CN101631569 B CN 101631569B CN 2008800080850 A CN2008800080850 A CN 2008800080850A CN 200880008085 A CN200880008085 A CN 200880008085A CN 101631569 B CN101631569 B CN 101631569B
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Abstract

本发明提供由水溶性低聚物的共价连接来化学修饰的小分子药物。本发明的偶联物当通过许多施用途径中的任何一种来施用时，显示出不同于没有连接到水溶性低聚物的小分子药物的特征的特征。

Description

低聚物-抗组胺剂偶联物
相关申请的交叉引用
本申请根据35.U.S.C.§119(e)要求2007年3月12日提交的序列号为60/906,416的美国临时申请、2007年11月13日提交的序列号为61/002,970的美国临时申请和2007年11月20日提交的序列号为61/003,808的美国临时申请的优先权的权益，其中美国临时申请中的每一个据此通过引用整体并入。
发明领域
本发明提供了(除其他方面以外)化学修饰的抗组胺剂，其拥有超过缺少该化学修饰的抗组胺剂的某些优势。本文描述的化学修饰的抗组胺剂涉及和/或应用于(除其他以外)药物开发、药物疗法、生理学、有机化学和高分子化学领域。
发明背景
抗组胺剂是组胺-1(H1)受体的拮抗剂。也被称为“H1受体阻滞剂(receptor blocker)”的这些试剂导致平滑肌收缩的减少。此外，H1受体阻滞剂可以起到中和与超敏反应相关的组胺的大量释放的影响。在人类中，这种超敏反应包括一些人对花粉、蜂螫伤、某些食物等的变态反应。
苯海拉明和羟嗪代表“第一代”抗组胺剂的成员并保持为商业上可得到的最有效的抗组胺剂中的两种。当变态反应需要立即和有效的扭转组胺释放时，施用这些和其他第一代抗组胺剂。尽管它们的被证实的功效，但许多第一代抗组胺剂在治疗患有常见的变态反应的患者时，并不代表首选药物。由于抗组胺剂的副作用，所以临床医生和病人不会求助于这些抗组胺剂来解决日常的变态反应。这种副作用包括严重嗜睡以及共济失调的可能性、口干、通红的皮肤、不规则的心律、视力模糊、畏光、瞳孔放大、尿潴留、便秘、难以集中注意力、短期记忆力丧失、幻觉、意识错乱、勃起功能障碍和谵妄。
已可得的相对较新的抗组胺剂(如氯雷他定、阿司咪唑和特非那定)，被认为提供与第一代抗组胺剂相同的功效，但无嗜睡。然而，经验表明，这些较新的抗组胺剂缺乏第一代对应物的效力，或者，如果给予较高剂量以提供所需的效力，这些较新的抗组胺剂还会导致嗜睡的副作用。
因此，提供具有与第一代抗组胺剂相同的抗组胺活性的、但缺乏其导致嗜睡的副作用的抗组胺剂将是有益的。
本发明设法通过提供(除其他方面以外)水溶性的和非肽的低聚物与抗组胺剂的偶联物来解决本领域的这些和其他需要。
发明概述
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种化合物，所述化合物包含经由稳定的或可降解的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种化合物，所述化合物包含经由稳定的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基，其中所述抗组胺剂具有下式所包含的结构：
(式I)
其中：
(a)是0或1；
Z选自由N、CH和C(CH3)组成的组；
Ar1是含有芳烃的部分(优选地选自由
Figure G2008800080850D00022
Figure G2008800080850D00023
组成的组)；以及
Ar2是含有芳烃的部分(优选地选自由
Figure G2008800080850D00032
组成的组)，或Ar1-Z-Ar2结合形成含有芳烃的部分，如
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括：
(i)化合物，其包含经由稳定的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基；以及
(ii)可选择地，药学上可接受的赋形剂。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种剂型，所述剂型包括化合物，所述化合物包含经由稳定的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括将水溶性的和非肽的低聚物共价连接于抗组胺剂。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括施用化合物，所述化合物包含经由稳定的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基。
当连同以下详述一起阅读时，本发明的这些和其他目的、方面、实施方案和特征将变得更加完全地明显。
附图简述
图1是显示口服羟嗪及多种羟嗪偶联物的大鼠的血浆中偶联物的浓度的图。
图2是显示口服羟嗪及多种羟嗪偶联物的大鼠的血浆中游离的(未结合的)羟嗪的图。
图3是显示口服羟嗪及多种羟嗪偶联物的大鼠的血浆中游离的(未结合的)西替利嗪(cetirizine)的图。
图4是显示羟嗪及多种羟嗪偶联物在大鼠肝脏微粒体中的体外代谢速率的图。
图5是显示在施用羟嗪及多种羟嗪偶联物后由肝脏微粒体形成的代谢产物西替利嗪的产生速率的图。
图6是显示苯海拉明的PEG偶联物与人类H1组胺受体的结合的图[其中“PEG(5)-N-DPH”是mPEG(5)-N-苯海拉明；“PEG(6)-N-DPH”是mPEG(6)-N-苯海拉明；以及“PEG(7)-N-DPH”是mPEG(7)-N-苯海拉明]。
图7是显示苯海拉明的PEG偶联物与人类H1组胺受体的结合的图[其中“PEG-6-NH-DPH”是mPEG(6)-NH-苯海拉明，且“PEG-7-N-DPH”是mPEG(7)-N-苯海拉明]。
图8是显示PEG的大小对PEG-苯海拉明偶联物与人类H1组胺受体的结合的影响的图[其中“DPH”是苯海拉明；“PEG-3-DPH”是mPEG(3)-N-苯海拉明；“PEG-4-DPH”是mPEG(4)-N-苯海拉明；“PEG-5-DPH”是mPEG(5)-N-苯海拉明；“PEG-6-DPH”是mPEG(6)-N-苯海拉明；且“PEG-7-DPH”是mPEG(7)-N-苯海拉明]。
图9是显示在对大鼠静脉注射(IV)施用后DPH和PEG-N-DPH偶联物的血浆浓度-时间曲线的图。
图10是显示在对大鼠口服施用后DPH和PEG-N-DPH偶联物的血浆浓度-时间曲线的图。
发明详述
本说明书中所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个所指对象，除非上下文中明确地另外指出。
在描述和要求保护本发明时，将根据以下描述的定义来使用以下的术语。
“水溶性非肽低聚物”指室温下在水中是至少35％(按重量计)可溶的、优选超过70％(按重量计)并更优选超过95％(按重量计)可溶的低聚物。通常，未过滤的“水溶性”低聚物的含水制剂透射相同溶液过滤后所透射的光量的至少75％、更优选至少95％。然而，非常优选的是，水溶性低聚物在水中至少95％(按重量计)可溶或完全可溶。关于是“非肽的”，当低聚物具有小于35％(按重量计)的氨基酸残基时，该低聚物是非肽的。
术语“单体”、“单体亚单元”和“单体单元”本文中可互换使用，并且指聚合物或低聚物的基本结构单元中的一个。在同低聚物的情况中，单一重复的结构单元形成低聚物。在共低聚物的情况中，两个或更多种结构单元以一方式或随机地重复以形成低聚物。本发明使用的优选的低聚物是同低聚物。水溶性非肽低聚物通常包含一种或多种单体，它们按顺序连接以形成单体链。低聚物可由单一单体类型(即为同低聚物)或由两个或三个单体类型(即为共低聚物)形成。
“低聚物”是具有从约2个至约50个单体、优选从约2个至约30个单体的分子。低聚物的结构可变。本发明中使用的具体低聚物包括那些具有诸如直链、支链或叉状的多种几何形状的低聚物，其在下文中更加详细地描述。
如本文所用，“PEG”或“聚乙二醇”意在包含任何水溶性聚(环氧乙烷)。除非另外指出，“PEG低聚物”(也称为低聚乙二醇)是其中基本所有(且更优选所有)单体亚单元是环氧乙烷亚单元的低聚物。然而，低聚物可含有不同的封端部分或官能团，例如用于偶联。通常，本发明中使用的PEG低聚物将包含以下两个结构之一：“-(CH2CH2O)n-”或“-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-”，这是根据例如在合成转化期间末端氧是否已经被置换。对于PEG低聚物，“n”从约2到50、优选从约2到约30变化，并且整个PEG的末端基团和构造可变。当PEG进一步包含用于连接到例如小分子药物的官能团A时，该官能团共价地连接于PEG低聚物时不会导致形成(i)氧-氧键(-O-O-，过氧化物键合)或(ii)氮-氧键(N-O，O-N)。
“封端基团”通常是连接于PEG低聚物的末端氧的无反应性含碳基团。示例性封端基团包括C1-5烷基(诸如甲基、乙基和苄基)，以及芳基、杂芳基、环、杂环以及类似基团。就本发明而言，优选的封端基团具有相对低的分子量，诸如甲基或乙基。封端基团还可包含可检测的标记物。这种标记物包括但不限于荧光剂、化学发光剂、酶标记中使用的部分、比色标记物(例如染料)、金属离子和放射性部分。
涉及低聚物的几何形状或总体结构时，“支链”指具有代表不同的“臂”的两个或更多个聚合物的低聚物，所述“臂”从一个支化点延伸。
涉及低聚物的几何形状或总体结构时，“叉状”指具有从一个支化点延伸的两个或更多个官能团(通常通过一个或多个原子)的低聚物。
“支化点”指包含一个或多个原子的分支点，此处低聚物由直链结构分支或分叉成一个或多个额外的臂。
术语“反应性的”或“活化的”指在有机合成的常规条件下容易地或以实际速率反应的官能团。这不同于不反应或需要强催化剂或不实际的反应条件以便反应的那些基团(即“无反应性”或“惰性”基团)。
涉及存在于反应混合物中的分子上的官能团时，“不容易反应”指在反应混合物中有效产生所需的反应的条件下，基团在很大程度上仍然是完整的。
“保护基”是防止或阻断分子中的特定化学反应官能团在某些反应条件下的反应的部分。保护基将根据所保护的化学反应基的类型以及所使用的反应条件和分子中额外的反应基或保护基的存在而变化。作为实例，可被保护的官能团包括羧酸基团、氨基、羟基、硫醇基、羰基以及类似官能团。羧酸的代表性保护基包括酯(诸如对甲氧苄酯)、酰胺和酰肼；氨基的代表性保护基包括氨基甲酸酯(诸如叔丁氧羰基)和酰胺；羟基的代表性保护基包括醚和酯；硫醇基团的代表性保护基包括硫醚和硫酯；羰基的代表性保护基包括缩醛和缩酮；以及类似的保护基。这种保护基对本领域技术人员来说是公知的，并且描述于例如T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，第三版，Wiley，New York，1999及其中所引用的参考文献。
“保护形式”的官能团指具有保护基的官能团。如本文所用，术语“官能团”或其任何同义词包含其保护形式。
“生理学上可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键是相对不稳定的键，其在普通生理条件下与水反应(即水解)。在普通生理条件下，键在水中水解的趋势将不仅依赖于连接两个中心原子的键合的一般类型，还依赖于连接于这些中心原子的取代基。本领域普通技术人员一般可识别这些键。合适的水解不稳定的或弱的键合包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽、寡核苷酸、硫酯和碳酸酯。
“可酶降解的键合”指在普通生理条件下经受一种或多种酶降解的键合。
“稳定的”键合或键指化学部分或键，通常指共价键，其在水中是基本稳定的，即在普通生理条件下，在持续的一段时间内，不经受任何可感知程度的水解。水解稳定键合的实例包括但不限于以下：碳-碳键(例如在脂族链中)、醚、酰胺、尿烷、胺以及类似的键合。一般来说，稳定的键合是表现出在普通生理条件下水解速率小于约每天1％-2％的键合。代表性的化学键的水解速率可见于大多数标准化学教科书。
在描述给定组合物中的低聚物的一致性的上下文中，“基本上”或“大体上”指几乎全部地或完全地，例如某一给定量的95％或更多、更优选97％或更多、又更优选98％或更多、甚至更优选99％或更高、又再更优选99.9％或更多、且最优选99.99％或更多。
“单分散”指这样的一种低聚物组合物：其中如色谱法或质谱法所确定，该组合物中基本上所有的低聚物具有明确的单一分子量和确定数量的单体。单分散低聚物组合物在某种意义上是纯的，即基本包括具有单一和可确定数量的单体而不是几种不同数量的单体(即具有三个或更多个不同低聚物大小的低聚物组合物)的分子。单分散低聚物组合物具有1.0005或更小的MW/Mn值、且更优选1.0000的MW/Mn值。通过扩展，由单分散偶联物组成的组合物指，组合物中基本上所有偶联物的所有低聚物具有单一和可确定数量(作为总数)的单体而没有分布，且如果低聚物没有连接于抗组胺剂的残基则将拥有1.0005的MW/Mn值、且更优选1.0000的MW/Mn值。然而，由单分散偶联物组成的组合物可包含一种或多种非偶联物质，诸如溶剂、试剂、赋形剂等等。
涉及低聚物组合物时，“双峰”指这样一种低聚物组合物：其中组合物中基本上所有的低聚物具有两个可确定的且不同数量(作为总数)的单体之一而没有分布，并且它们的分子量分布当被绘图为数量部分(number fraction)与分子量的关系曲线时表现为两个分离可辨的峰。优选地，对于本文描述的双峰低聚物组合物，每个峰通常是关于其平均值对称，尽管两个峰的大小可能不同。理论上，双峰分布中每个峰的多分散性指数Mw/Mn是1.01或更小、更优选1.001或更小、且甚至更优选1.0005或更小，并且是最优选1.0000的MW/Mn值。通过扩展，由双峰偶联物组成的组合物指，组合物中基本上所有偶联物的所有低聚物具有两个可确定的且不同数量(作为总数)的单体之一而没有大分布，且如果低聚物没有连接于抗组胺剂的残基则将具有1.01或更小、更优选1.001或更小、且甚至更优选1.0005或更小的MW/Mn值，并且具有最优选1.0000的MW/Mn值。然而，由双峰偶联物组成的组合物可包含一种或多种非偶联物质，诸如溶剂、试剂、赋形剂等等。
本文中广泛使用“抗组胺剂”来指通常具有小于约1000道尔顿(且通常小于500道尔顿)的分子量且具有一定程度的作为组胺-1受体的拮抗剂的活性的有机化合物、无机化合物或有机金属化合物。抗组胺剂还被称为H1受体阻滞剂或H1受体拮抗剂。
“生物膜”是通常由专门的细胞或组织制成的任何膜，其作为针对至少一些外源实体或其他不希望的材料的屏障。如本文所用，“生物膜”包括与生理保护性屏障和黏膜屏障相关的那些膜，所述生理保护性屏障包括例如：血-脑屏障(BBB)；血-脑脊液屏障；血-胎盘屏障；血-乳屏障；血-睾丸屏障；所述黏膜屏障包括阴道黏膜、尿道黏膜、肛门黏膜、颊黏膜、舌下黏膜、直肠黏膜等等。除非上下文明确地另外指出，否则术语“生物膜”不包含与中部胃肠道(例如胃和小肠)相关的那些膜。
如本文所用，“生物膜透过率”提供了化合物透过生物膜(诸如与血-脑屏障相关的膜)的能力的度量。多种方法可用于评价分子穿过任何给定的生物膜的转运。评价与任何给定的生物屏障(例如血-脑脊液屏障、血-胎盘屏障、血-乳屏障、肠屏障等等)相关的生物膜透过率的方法在本领域中是已知的，在本文和/或在相关文献中描述，和/或可由本领域普通技术人员确定。
涉及本发明时，“降低的代谢速率”指与没有连接水溶性低聚物的小分子药物(即小分子药物自身)或参照标准材料的代谢速率对比，水溶性低聚物-小分子药物偶联物的代谢速率的可测量的降低。在“降低的代谢首过率”的具体情况中，需要相同的“降低的代谢速率”，除非小分子药物(或参照标准材料)和对应的偶联物是口服施用。口服施用的药物从胃肠道被吸收到门脉循环中，且在到达体循环前必须通过肝。因为肝是药物代谢或生物转化的主要部位，大量的药物在任何时候到达体循环之前可以被代谢。首过代谢以及由此的其任何的降低的程度可通过许多不同的方法测量。例如，动物血液样本可以定时的间隔收集，并通过液相色谱/质谱法分析血浆或血清的代谢水平。测量与首过代谢和其他代谢过程相关的“降低的代谢速率”的其他技术在本领域中是已知的，在本文和/或在相关文献中描述，和/或可由本领域普通技术人员确定。优选地，本发明的偶联物可提供满足以下值中的至少一个的降低的代谢速率降低：至少约30％；至少约40％；至少约50％；至少约60％；至少约70％；至少约80％；以及至少约90％。“口服生物可利用的”化合物(诸如小分子药物或其偶联物)是当口服施用时优选具有超过25％、优选超过70％的生物利用度的化合物，其中化合物的生物利用度是以未代谢形式到达体循环的所施用的药物的部分。
“烷基”指通常长度范围为从约1个至20个原子的烃链。这种烃链优选地而非必须地是饱和的，且可以是支链或直链，尽管通常优选直链。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基以及类似的基团。如本文所用，当涉及三个或更多的碳原子时，“烷基”包括环烷基。“烯基”是具有至少一个碳-碳双键的2个至20个碳原子的烷基。
术语“取代的烷基”或“取代的Cq-r烷基”，其中q和r是标识烷基中含有的碳原子的范围的整数，该术语指由一、二或三个以下基团取代的以上烷基：卤(例如F、Cl、Br、I)、三氟甲基、羟基、C1-7烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、叔丁基等等)、C1-7烷氧基、C1-7酰氧基、C3-7杂环、氨基、苯氧基、硝基、羧基、羧基、酰基、氰基。被取代的烷基可以是用相同或用不同的取代基取代一次、两次或三次。
“低级烷基”指含有1个至6个碳原子的烷基，且可以是直链或支链，如由甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基所示例。“低级烯基”指具有至少一个碳-碳双键的2个至6个碳原子的低级烷基。
“无干扰取代基”指当存在于分子中时通常不与该分子中含有的其它官能团反应的那些基团。
“烷氧基”指-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C1-C20烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄基等等)，优选C1-C7。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”指可包含于本发明的组合物中以提供具有超过缺少这种组分的组合物的优势(例如更加适合于施用至患者)的组合物并且被认为不会对患者引起显著的不良毒理学影响的组分。
术语“芳基”指具有多达14个碳原子的芳香基。芳基包括苯基、萘基、联苯基、菲基、萘并萘基(naphthacenyl)以及类似的基团。“取代的苯基”和“取代的芳基”分别指用选自卤(F、Cl、Br、I)、羟基、羟基、氰基、硝基、烷基(例如C1-6烷基)、烷氧基(例如C1-6烷氧基)、苄氧基、羧基、芳基等等的一、二、三、四或五个(例如1-2、1-3或1-4个)取代基取代的苯基和芳基。
“含有芳烃的部分”是含有至少一个芳基和任选地一个或多个原子的原子集合。合适的含有芳烃的部分在本文中描述。
为简单起见，化学部分通篇主要定义为或称为单价化学部分(例如，烷基、芳基等等)。然而，在本领域技术人员清楚的适当结构环境下，这些术语还用于表达对应的多价部分。例如，尽管“烷基”部分通常指单价基团(例如CH3-CH2-)，但在某些情况下，二价连接部分可以是“烷基”，在此情况下，本领域技术人员将理解烷基为二价基团(例如-CH2-CH2-)，其等同于术语“亚烷基”。(相似地，在其中需要二价部分并将其陈述为“芳基”的情况下，本领域技术人员应理解，术语“芳基”指对应的二价部分，亚芳基)。应理解，所有的原子具有用于它们键形成的化合价的正常数(即碳为4，N为3，O为2，且S根据S的氧化态，为2、4或6)。
“药理学上有效量”、“生理学上有效量”和“治疗有效量”本文中可互换使用，指在血流或靶组织中提供活性剂和/或偶联物的阀值水平所需的，存在于组合物中的水溶性低聚物-小分子药物偶联物的量。精确的量将取决于许多因素，例如特定的活性剂、组合物的组分和物理特征、预期的患者群体、患者考量(patient consideration)以及类似的因素，并且可由本领域技术人员根据本文提供的以及相关文献中可用的信息容易地确定。
“双官能”低聚物是具有包含于其中，通常在其末端处的两个官能团的低聚物。当官能团相同时，低聚物被称为是同双官能的(homodifunctional)。当官能团不同时，低聚物被称为是异双官能的(heterobifunctional)。
本文描述的碱性反应物或酸性反应物包括中性的、带电的及其任何相应的盐形式。
术语“患者”指患有或易患可通过施用本文描述的偶联物预防或治疗的疾患的活体，并且包括人和哺乳动物，所述偶联物通常，但不必须是以水溶性低聚物-小分子药物偶联物的形式。
“任选的”或“任选地”指随后描述的情况可能但不需要必须发生，所以该描述包括其中该情况发生的实例和其中该情况不发生的实例。
如上所述，本发明涉及(除其他方面以外)包含经由稳定的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基的化合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种化合物，所述化合物包含经由稳定的或可降解的键合共价连接于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂的残基，其中所述抗组胺剂具有下式所包含的结构：
Figure G2008800080850D00121
(式I)
其中：
(a)是0或1；
Z选自由N、CH和C(CH3)组成的组；
Ar1是含有芳烃的部分(优选地选自由
Figure G2008800080850D00122
Figure G2008800080850D00123
组成的组)；以及
Ar2是含有芳烃的部分(优选地选自由
Figure G2008800080850D00124
组成的组)，或Ar1-Z-Ar2结合形成含有芳烃的部分，如
Figure G2008800080850D00126
特定的抗组胺剂的实例包括选自由以下组成的组的那些抗组胺剂：阿伐斯汀、阿利马嗪、安他唑啉、阿司咪唑、阿扎他定、氮卓斯汀、巴米品、溴苯海明、溴苯那敏、溴苯海拉明、布克立嗪、卡比沙明、西替利嗪、氯环嗪、氯吡拉敏、氯苯吡胺、氯苯沙明、桂利嗪、氯马斯汀、赛克利嗪、赛庚啶、地普托品、地氯雷他定、右溴苯那敏、右氯苯那敏、二甲茚定、苯海拉明、二苯拉林、多西拉敏、茶苯海明、依巴斯汀、希司咯定、羟乙基异丙嗪、羟嗪、异西喷地、酮替芬、氯雷他定、左西替利嗪、美海洛林、美克洛嗪、美吡拉敏、美喹他嗪、美沙吡林、甲地拉嗪、咪唑斯汀、尼普拉嗪、奥索马嗪、奥沙米特、苯茚胺、非尼拉敏、匹美噻吨、异丙嗪、扑敏宁、吡拉明、吡咯他敏、卢帕他定、他拉斯丁、特非那定、宋齐拉敏、异丁嗪和曲吡那敏。
认为本发明的偶联物的一个优势是它们保留了某些程度的抗组胺活性而不引起临床意义的嗜睡的能力。尽管不希望受理论束缚，但由低聚物引入的额外尺寸——相对于未偶联的“原始的”抗组胺剂——降低了化合物穿过血脑屏障的能力。这样，偶联物的抗组胺效应可以在神经末梢区域内起作用，同时避免在中枢神经系统中起作用(且从而避免中枢神经系统介导的副作用)。
使用低聚物(例如，从低聚物的单分散性的或双峰的组合物，不同于相对不纯的组合物)形成本发明的偶联物可以有利地改变与相应的小分子药物相关的某些特性。例如，本发明的偶联物，当通过许多合适的施用途径中的任一种(如胃肠外的、口服的、透皮的、口腔的、肺部的或鼻的)施用时，展现出穿过血脑屏障的减弱的渗透。如欲口服给药，优选的是，偶联物展现放慢的、极少的或实际上没有穿过血脑屏障，同时仍然穿过胃肠道(GI)壁并进入体循环。此外，相比于不含所有低聚物的化合物的生物活性和生物利用度(bioavailablity)，本发明的偶联物以其偶联形式保持一定程度的生物活性以及生物利用度。
关于血脑屏障(“BBB”)，这一屏障限制了药物从血液到大脑的传送。这一屏障由通过紧密连接结合的独特的内皮细胞的连续层组成。脑毛细血管，构成大于95％的BBB的总表面积，代表着多数溶质和药物进入中枢神经系统的主要途径。
对于不容易知道其穿过血脑屏障能力的程度的化合物，这种能力可以使用合适的动物模型来确定，如本文所描述的原位大鼠脑灌注(“RBP”)模型。简单地说，RBP技术包括颈动脉套管插入术，之后在受控条件下用化合物溶液灌注，随后是冲洗阶段，以去除残留在血管空间内的化合物。(这种分析可以由例如合同研究组织(contractresearch organization)如Absorption Systems，Exton，PA进行)。更具体地说，在RBP模型中，将套管放置在左侧颈动脉，而侧枝被结扎。在一个单向灌注实验中，将含有分析物的生理缓冲剂(通常但不一定在5微摩尔的浓度水平)以约10毫升/分钟的流速灌注。30秒之后，停止灌注，并且使用不含化合物的缓冲剂冲洗脑血管内容物额外的30秒。然后，脑组织被取出并通过液相色谱仪串联质谱检测(LC/MS/MS)分析化合物的浓度。可选择地，血脑屏障通透性可根据化合物的分子极性表面积(“PSA”)的计算来估计，分子极性表面积被定义为分子中极性原子(通常是氧、氮和相连的氢)的表面贡献(surfacecontribution)的总和。已经表明PSA与化合物的运输特性如血脑屏障运输相关。用于确定化合物的PSA的方法可以，例如在Ertl，P.等人，J.Med.Chem.2000年，43，3714-3717以及Kelder，J.等人，Pharm.Res.，1999，16，1514-1519中找到。
关于血脑屏障，水溶性非肽低聚物-小分子药物偶联物与未连接于水溶性非肽低聚物的小分子药物的穿过率相比，表现出降低的血脑屏障穿过率。当与未连接于水溶性低聚物的小分子药物的血脑屏障穿过率相比时，本文所述的化合物的血脑屏障穿过率的优选的示例性的降低包括降低了：至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％或至少约90％。偶联物的血脑屏障穿过率的优选的降低为至少约20％。
如上所述，本发明的化合物包括抗组胺剂的残基。用于确定给定化合物(不论化合物是否是以偶联形式)是否可以阻滞H1抗组胺剂受体的测定在下文中描述。
在某些情况下，抗组胺剂可从商业来源获得。此外，抗组胺剂可通过化学合成获得。用于制备抗组胺剂的合成方法在文献以及在例如美国专利第2,421,714、2,427,878、4,525,358、4,219,559、2,567,245、2,676,964、3,061,517、2,785,202、2,951,082、4,282,233、2,709,169、2,899,436、2,406,594和2,502,151号中描述。
这些(和其他)抗组胺剂中的每一个可(直接地或通过一个或多个原子)共价连接于水溶性的和非肽的低聚物。
本发明中有用的小分子药物一般具有小于1000Da的分子量。小分子药物的示例性的分子量包括以下分子量：小于约950；小于约900；小于约850；小于约800；小于约750；小于约700；小于约650；小于约600；小于约550；小于约500；小于约450；小于约400；小于约350；以及小于约300。
如果本发明中使用的小分子药物是手性的，那么该小分子药物可以是以外消旋混合物，或旋光形式，例如单一旋光对映体，或对映体的任何组合或比例(即非外消旋混合物(scalemic mixture))。此外，该小分子药物可具有一个或多个几何异构体。就几何异构体而言，组合物可包括单一几何异构体，或两个或更多个几何异构体的混合物。用于本发明的小分子药物可以是以其通常的活性形式，或可具有某种程度的修饰。例如，在低聚物的共价连接之前或之后，小分子药物可具有连接于其的靶向剂(targeting agent)、标记物或运载体(transporter)。可选地，小分子药物可具有连接于其的亲油部分，诸如磷脂(例如二硬酯酰磷脂酰乙醇胺或“DSPE”、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或“DPPE”等等)或小的脂肪酸。然而，在一些实例中，优选的是，小分子药物部分不包括至亲油部分的连接。
用于偶联于水溶性的和非肽的低聚物的抗组胺剂具有适合于共价连接于低聚物的游离羟基、羧基、硫代、氨基或类似的基团(即“柄(handle)”)。此外，可通过引入反应基，优选地通过将其现存的官能团之一转化为适合于在低聚物和药物之间形成稳定的共价键合的官能团，来修饰抗组胺剂。两种方法都阐述于实验部分中。
水溶性的和非肽的低聚物通常包含顺次连接以形成单体链的一个或多个单体。低聚物可由单一单体类型形成(即为同低聚物的)，或由两种或三种单体类型形成(即为共低聚物的)。优选地，每种低聚物是两种单体的共低聚物(co-oligomer)，或更优选，是同低聚物(homo-oligomer)。
因此，每种低聚物主要由至多三种不同的单体类型组成，所述单体类型选自由以下单体类型组成的组：环氧烷，诸如环氧乙烷或环氧丙烷；烯醇，诸如乙烯醇、1-丙烯醇或2-丙烯醇；乙烯基吡咯烷酮；羟烷基甲基丙烯酰胺或羟烷基甲基丙烯酸酯，其中烷基优选是甲基；α-羟酸，诸如乳酸或乙醇酸；磷腈、噁唑啉、氨基酸、糖类诸如单糖、糖类或甘露醇；以及N-丙烯酰吗啉。优选的单体类型包括环氧烷、烯醇、羟烷基甲基丙烯酰胺或羟烷基甲基丙烯酸酯、N-丙烯酰吗啉和α-羟酸。优选地，每种低聚物独立地是选自该组的两种单体类型的共低聚物，或更优选地，是选自该组的一种单体类型的同低聚物。
共低聚物中的两种单体类型可以是相同的单体类型，例如两种环氧烷，诸如环氧乙烷和环氧丙烷。优选地，低聚物是环氧乙烷的同低聚物。尽管不是必须的，但通常封住低聚物的没有共价连接于小分子的一个末端(或多个末端)以使其不起反应。可选地，末端可包含反应基。当末端是反应基时，选择反应基使得其在形成最终低聚物的条件下或在低聚物共价连接于小分子药物期间不起反应，或必要时将其保护。一种常见的末端官能团是羟基或-OH，尤其是对于低聚环氧乙烷(oligoethylene oxide)来说。
水溶性非肽低聚物(例如在本文提供的各种结构中的“POLY”)可具有许多不同几何形状中的任何一个。例如它可以是直链的、支链的或叉状的。最常见地，水溶性非肽低聚物是直链的或是支链的，例如具有一个支化点。尽管本文讨论的许多聚焦于作为示例性低聚物的聚(环氧乙烷)，但本文中提供的讨论和结构可被容易地延伸以包含以上描述的水溶性非肽低聚物中的任何一个。
不包括连接体(linker)部分的水溶性非肽低聚物的分子量，通常是相对较低的。水溶性聚合物的分子量的示例性值包括：低于约1500；低于约1450；低于约1400；低于约1350；低于约1300；低于约1250；低于约1200；低于约1150；低于约1100；低于约1050；低于约1000；低于约950；低于约900；低于约850；低于约800；低于约750；低于约700；低于约650；低于约600；低于约550；低于约500；低于约450；低于约400；低于约350；低于约300；低于约250；低于约200；和低于约100道尔顿。
水溶性非肽低聚物(不包括连接体)的分子量的示例性范围包括：从约100至约1400道尔顿；从约100至约1200道尔顿；从约100至约800道尔顿；从约100至约500道尔顿；从约100至约400道尔顿；从约200至约500道尔顿；从约200至约400道尔顿；从约75至1000道尔顿；以及从约75至约750道尔顿。
优选地，水溶性非肽低聚物中的单体数量落在以下范围中的一个或多个中：在约1和约30之间(含)；在约1和约25之间；在约1和约20之间；在约1和约15之间；在约1和约12之间；在约1和约10之间。在某些实例中，低聚物(及其对应的偶联物)中连续的单体的数量是1、2、3、4、5、6、7或8中的一个。在其他的实施方案中，低聚物(及其对应的偶联物)包含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体。在又进一步的实施方案中，低聚物(及其对应的偶联物)具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续的单体。因此，例如，当水溶性非肽低聚物包括CH3-(OCH2CH2)n-时，则“n”是整数，该整数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且可落在以下范围中的一个或多个中：在约1和约25之间；在约1和约20之间；在约1和约15之间；在约1和约12之间；在约1和约10之间。
当水溶性非肽低聚物具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单体时，这些值分别对应具有约75、119、163、207、251、295、339、383、427和471道尔顿的分子量的甲氧基封端的低聚(环氧乙烷)。当低聚物具有11、12、13、14或15个单体时，这些值分别对应具有相当于约515、559、603、647和691道尔顿的分子量的甲氧基封端的低聚(环氧乙烷)。
当水溶性的和非肽的低聚物连接于抗组胺剂(与逐步加入一种或多种单体以使低聚物有效地“生长”到抗组胺剂上不同)时，优选的是，含有活化形式的水溶性非肽低聚物的组合物是单分散的。然而，在其中使用双峰组合物的那些实例中，组合物将具有以单体的以上数量中的任何两个为中心的双峰分布。理论上，双峰分布中的每个峰的多分散性指数Mw/Mn是1.01或更小，并更优选为1.001或更小，并更优选为1.0005或更小。最优选，每个峰具有1.0000的Mw/Mn值。例如，双峰低聚物可具有单体亚单元的以下示例性组合中的任何一个：1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10等等；2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10等等；3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10等等；4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10等等；5-6、5-7、5-8、5-9、5-10等等；6-7、6-8、6-9、6-10等等；7-8、7-9、7-10等等；以及8-9、8-10等等。
在一些实例中，含有活化形式的水溶性非肽低聚物的组合物将是三峰的(trimodal)或甚至是四峰的(tetramodal)，其具有如先前描述的一系列单体单元。具有非常明确的低聚物的混合物的低聚物组合物(即为双峰、三峰、四峰等等)可通过混合纯化的单分散低聚物来制备，以获得所需特征的低聚物(仅单体数量不同的两种低聚物的混合物是双峰的；仅单体数量不同的三种低聚物的混合物是三峰的；仅单体数量不同的四种低聚物的混合物是四峰的；)，或可选地，可通过回收“中间馏分(center cut)”从多分散低聚物的柱色谱法获得，以获得所需的和确定的分子量范围的低聚物的混合物。
优选的是，从优选地是单分子或单分散的组合物获得水溶性非肽低聚物。即组合物中的低聚物具有相同的不连续的分子量值，而不是分子量的分布。一些单分散低聚物可从商业来源购买，诸如可获自Sigma-Aldrich的那些，或可选地，可直接从商业上可获得的起始物料(诸如Sigma-Aldrich)制备。可如Chen Y.，Baker，G.L.，J.Org.Chem.，6870-6873(1999)、WO 02/098949和美国专利申请公布2005/0136031中所描述的来制备水溶性非肽低聚物。
当存在时，间隔部分(水溶性非肽聚合物通过它们连接于抗组胺剂)可以是单键、单个原子诸如氧原子或硫原子、两个原子或多个原子。间隔部分的性质通常但不必须是直链的。间隔部分“X”优选地是水解稳定的，并优选还是酶促稳定的。优选地，间隔部分“X”是具有小于约12个原子，且优选小于约10个原子，且甚至更优选小于约8个原子，且甚至更优选小于约5个原子的链长的键合，由此长度指单链中不计算取代基的原子的数量。例如，脲键合诸如这个R低聚 物-NH-(C＝O)-NH-R′药物，被认为是具有3个原子(-NH-C(O)-NH-)的链长。在选择的实施方案中，间隔部分键合不包括另外的间隔基团(spacer group)。
在一些实例中，间隔部分“X”包括醚、酰胺、尿烷、胺、硫醚、脲或碳-碳键。诸如下文中讨论的和实施例中示例的那些官能团，通常用于形成键合。间隔部分还可较不优选地包括(或邻接于或侧面连接于)间隔基团，如下文进一步描述的。
更加具体地，在选择的实施方案中，间隔部分X可以是以下中的任何一个：“-”(即在小分子抗组胺剂的残基和水溶性非肽低聚物之间的可以是稳定的或可降解的共价键)、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二价环烷基、-N(R6)-，R6是H或选自由以下基团组成的组的有机基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
然而，对于本发明来说，当一组原子直接邻接于低聚物部分，且该组原子与低聚物的单体相同，以致该组将表示低聚物链的纯粹的延伸时，该组原子并不被认为是间隔部分。
水溶性非肽低聚物和小分子之间的键合“X”通常通过低聚物(或当需要使低聚物“生长”到抗组胺剂时的一个或多个单体)的末端上的官能团和抗组胺剂中的对应官能团的反应来形成。示例性反应在下文中简要描述。例如，低聚物上的氨基可与小分子上的羧酸或活化的羧酸衍生物反应以形成酰胺键合，或反之亦然。可选地，低聚物上的胺与药物上活化的碳酸酯(例如琥珀酰亚胺碳酸酯或苯并三唑基碳酸酯)反应形成氨基甲酸酯键合，或反之亦然。低聚物上的胺与药物上的异氰酸酯(R-N＝C＝O)反应形成脲键合(R-NH-(C＝O)-NH-R′)，或反之亦然。此外，低聚物上的醇(醇盐)基团与药物中的卤代烷或卤化物基团反应形成醚键合，或反之亦然。在又一个偶联方法中，具有醛官能的小分子通过还原性胺化偶联于低聚物的氨基，导致在低聚物和小分子之间形成仲胺键合。
一种特别优选的水溶性非肽低聚物是含有醛官能团的低聚物。在这一点上，低聚物将具有以下结构：CH3O-(CH2-CH2-O)n-(CH2)p-C(O)H，其中(n)是1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的一个，且(p)是1、2、3、4、5、6和7中的一个。优选的(n)值包括3、5和7，且优选的(p)值包括2、3和4。此外，-C(O)H部分α位的碳原子可任选地用烷基取代。
通常，包封不含有官能团的水溶性非肽低聚物的末端以使其不起反应。当低聚物在末端处的确包含除了预期用于形成偶联物的官能团之外的另外的官能团时，选择该基团以使其在形成键合“X”的条件下不起反应，或在形成键合“X”期间保护该基团。
如上所述，偶联前，水溶性非肽低聚物包括至少一个官能团。根据小分子中含有的反应基或引入到小分子中的反应基，该官能团通常包括用于共价连接于小分子的亲电子基团或亲核基团。可存在于低聚物或小分子中的亲核基团的实例包括羟基、胺、肼(-NHNH2)、酰肼(-C(O)NHNH2)和硫醇。优选的亲核体包括胺、肼、酰肼和硫醇，特别是胺。用于共价连接于低聚物的大多数小分子药物将具有游离的羟基、氨基、硫代、醛基、酮基或羧基。
可存在于低聚物或小分子中的亲电子官能团的实例包括羧酸、羧酸酯特别是酰亚胺酯、原酸酯、碳酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛、酮、硫酮、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、马来酰亚胺、二硫化物、碘代、环氧、磺酸酯、硫代磺酸酯、硅烷、烷氧基硅烷和卤代硅烷。这些基团的更加具体的实例包括琥珀酰亚胺基酯或琥珀酰亚胺基碳酸酯、咪唑基(imidazoyl)酯或咪唑基碳酸酯、苯并三唑酯或苯并三唑碳酸酯、乙烯基砜、氯乙基砜、乙烯基吡啶、吡啶基二硫化物(pyridyl disulfide)、碘乙酰胺、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙基磺酸酯(tresylate)(2，2，2-三氟乙烷磺酸酯)。
还包括这些基团中的几种的硫类似物诸如硫酮、硫酮水合物、酮缩硫醇、2-噻唑烷硫酮等等，以及以上部分中的任何一个的水合物或被保护的衍生物(例如，醛水合物、半缩醛、缩醛、酮水合物、半缩酮、缩酮、酮缩硫醇、硫缩醛)。
羧酸的“活化衍生物”指容易地与亲核体反应的羧酸衍生物，其通常远比未衍生化的羧酸更加容易地反应。例如，活化的羧酸包括酰基卤(诸如酰基氯)、酸酐、碳酸酯和酯。这种酯包括通式-(CO)O-N[(CO)-]2的亚胺酯；例如，N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯或N-羟基邻苯二甲酰亚胺基酯。还优选的是咪唑基酯和苯并三唑酯。特别优选的是活化的丙酸酯或丁酸酯，如在共有的美国专利第5,672,662号中所描述的。这些包括式-(CH2)2-3C(＝O)O-Q的基团，其中Q优选地选自N-琥珀酰亚胺、N-磺基琥珀酰亚胺、N-邻苯二甲酰亚胺、N-戊二酰亚胺、N-四氢邻苯二甲酰亚胺、N-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺、苯并三唑、7-氮杂苯并三唑和咪唑。
其他优选的亲电子基团包括琥珀酰亚胺基碳酸酯、马来酰亚胺、苯并三唑碳酸酯、缩水甘油醚、咪唑基碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯、丙烯酸酯、三氟乙基磺酸酯、醛和邻吡啶基二硫化物。
这些亲电子基团经受与亲核体例如羟基、硫代或氨基的反应以产生不同的键类型。本发明优选的是有利于形成水解稳定的键合的反应。例如，羧酸及其活化的衍生物，包括原酸酯、琥珀酰亚胺基酯、咪唑基酯和苯并三唑酯，分别与以上类型的亲核体反应以形成酯、硫酯和酰胺，其中酰胺是水解上最稳定的。碳酸酯，包括琥珀酰亚胺基碳酸酯、咪唑基碳酸酯和苯并三唑碳酸酯，与氨基反应以形成氨基甲酸酯。异氰酸酯(R-N＝C＝O)分别与羟基或氨基反应以形成氨基甲酸酯(RNH-C(O)-OR′)或脲(RNH-C(O)-NHR′)键合。醛、酮、乙二醛、二酮和它们的水合物或醇加合物(即醛水合物、半缩醛、缩醛、酮水合物、半缩酮和缩酮)优选地与胺反应，随后必要时，还原产生的亚胺以提供胺键合(还原性胺化)。
亲电子官能团中的几种包括亲电子双键，可向该亲电子双键加入亲核基团诸如硫醇以形成，例如硫醚键。这些基团包括马来酰亚胺、乙烯基砜、乙烯基吡啶、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和丙烯酰胺。其他的基团包括可由亲核体置换的离去基团；这些基团包括氯乙基砜、吡啶基二硫化物(其包括可裂解的S-S键)、碘乙酰胺、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硫代磺酸酯和三氟乙基磺酸酯。环氧化物通过由亲核体开环反应以形成，例如醚键或胺键。将涉及低聚物和小分子上的互补反应基(诸如以上提到的那些反应基)的反应用于制备本发明的偶联物。
在一些实例中，抗组胺剂可能不具有适合于偶联的官能团。在这一实例中，可以修饰“原始的”抗组胺剂，使得其具有所需的抗组胺剂。例如，如果抗组胺剂具有酰胺基，但需要胺基时，可通过Hofmann重排、Curtius重排(在酰胺被转化为叠氮化物时)或Lossen重排(在酰胺被转化为羟酰胺(hydroxamide)，随后用亚苄基(tolyene)-2-磺酰氯/碱处理时)将酰胺基修饰成胺基。
可制备含有羧基的小分子抗组胺剂的偶联物，其中含有羧基的小分子抗组胺剂偶联于氨基末端的低聚乙二醇，以提供具有将小分子抗组胺剂共价连接于低聚物的酰胺基的偶联物。例如，这可通过在偶联试剂(诸如二环己基碳二亚胺或“DCC”)存在下，在无水有机溶剂中，将含有羧基的小分子抗组胺剂与氨基末端的低聚乙二醇混合来进行。
此外，可制备含有羟基的小分子抗组胺剂的偶联物，其中含有羟基的小分子抗组胺剂偶联于低聚乙二醇卤化物，以产生醚(-O-)连接的小分子偶联物。例如，这可通过使用氢化钠将羟基去质子化，随后与卤化物末端的低聚乙二醇反应来进行。
在另一个实例中，通过首先还原酮基以形成对应的羟基，可制备含有酮基的小分子抗组胺剂的偶联物。此后，现在含有羟基的小分子抗组胺剂可如本文描述的来偶联。
在又一个实例中，可制备含有胺基的小分子抗组胺剂的偶联物。在一个方法中，将含有胺基的小分子抗组胺剂和含有醛的低聚物溶解于合适的缓冲液中，之后加入合适的还原剂(例如NaCNBH3)。还原后，结果是在含有胺基的小分子抗组胺剂的胺基和含有醛的低聚物的羰基碳之间形成胺键合。
在用于制备含有胺基的小分子抗组胺剂的偶联物的另一个方法中，通常在偶联试剂(例如DCC)存在下，将含有羧酸的低聚物与含有胺基的小分子抗组胺剂混合。结果是在含有胺基的小分子抗组胺剂的胺基和含有羧酸的低聚物的羰基之间形成酰胺键合。
式I的抗组胺剂的示例性的偶联物包括具有以下结构的那些偶联物：
Figure G2008800080850D00241
式I-Ca
其中(a)、Z、Ar1和Ar2中的每一个如先前关于式I所定义的，且X是间隔部分，且POLY是水溶性的和非肽的低聚物。关于式I-Ca，优选的“POLY”包括
Figure G2008800080850D00242
(CH2CH2O)nCH3，其中(n)是1到20。还关于式I-Ca，优选的X是稳定的共价键合(即“-”)。
抗组胺剂的进一步示例性的偶联物包括具有以下结构的那些偶联物：
Figure G2008800080850D00243
式I-Cb
其中(a)、Z、Ar1和Ar2中的每一个如先前关于式I所定义的，且X是间隔部分，且POLY是水溶性的和非肽的低聚物。关于式I-Cb，优选的“POLY”包括
Figure G2008800080850D00244
(CH2CH2O)nCH3，其中(n)是1到20。还关于式I-Cb，优选的X是稳定的共价键合(即“-”)。
抗组胺剂的更进一步示例性的偶联物包括具有以下结构的那些偶联物：
式I-Cc
其中(a)、Z、Ar1和Ar2中的每一个如先前关于式I所定义的，且X是间隔部分，且POLY是水溶性的和非肽的低聚物。关于式I-Cc，优选的“POLY”包括
Figure G2008800080850D00246
(CH2CH2O)nCH3，其中(n)是1到20。还关于式I-Cc，优选的X是稳定的共价键合(即“-”)。
本发明的偶联物可展现减少的血脑屏障穿过率。此外，偶联物保持了未修饰的母体小分子药物的生物活性的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。
尽管认为本文所公开的偶联物的全部范围都已被叙述，但最佳大小的低聚物可按如下所述确定。
首先，将从单分散的或双峰的水溶性低聚物获得的低聚物偶联于小分子药物。优选地，药物是口服可生物利用的，并独立地表现出不可忽视的血脑屏障穿过率。接下来，使用适当的模型确定偶联物穿过血脑屏障的能力，并与未修饰的母体药物的能力比较。如果结果是有利的，也就是说，例如，如果穿过率大大降低，那么偶联物的生物活性就被进一步评估。优选地，根据本发明的化合物相对于母体药物保持很大程度的生物活性，即大于母体药物的生物活性的约30％，或者甚至更优选地，大于母体药物的生物活性的约50％。
使用具有相同单体类型但有不同数量亚单元的低聚物重复进行上述步骤一次或多次，并比较结果。
与非偶联的小分子药物相比，对于穿过血脑屏障的能力降低的每种偶联物，其口服生物利用度接下来被评估。根据这些结果，也就是说，根据比较不同大小的低聚物与给定的小分子在小分子的给定的位置或部位处的偶联物，可以确定最有效地提供具有在穿过生物膜的减少、口服生物利用度和生物活性之间的最佳平衡的偶联物的低聚物的大小。低聚物的小尺寸使这种筛选变得可行，并允许人们有效地量身定做(tailor)所产生的偶联物的特性。通过在低聚物大小上进行小的、递增的改变，并利用实验设计方法，技术人员可以有效地鉴别具有在生物膜穿过率的减少、生物活性和口服生物利用度之间的良好平衡的偶联物。在某些情况下，如本文所述的低聚物的连接对于实际增加药物的口服生物利用度是有效的。
例如，本领域普通技术人员使用常规实验，通过首先制备具有不同重量和官能团的一系列低聚物，且然后通过将偶联物施用于患者，并进行定期的血液和/或尿采样来获得所需的清除率特征，可确定用于改善口服生物利用度的最合适的分子大小和键合。一旦获得每种测试偶联物的一系列清除率特征，则可鉴别合适的偶联物。
动物模型(啮齿动物和狗)还可以用于研究口服药物转运。此外，非体内方法包括啮齿动物外翻肠离体组织和Caco-2细胞单层组织培养模型。此外，实验提供了测试口服药物转运的另外的方法。这些模型对于预测口服药物生物利用度是有用的。
为了确定式I的抗组胺剂或抗组胺剂与水溶性的和非肽的聚合物的偶联物是否具有对组胺-1受体的结合活性，可以测试这种化合物。在这点上，下文的实验包括确定化合物对组胺-1受体的结合活性的讨论。
关于抗组胺活性，可以确定式I的抗组胺剂或抗组胺剂与水溶性的和非肽的聚合物的偶联物是否具有作为组胺-1受体拮抗剂的活性。在一个方法中，体外豚鼠回肠测试是有用的。简单地说，将豚鼠回肠的一段分离的部分在张力(500mg)下固定在10ml组织浴(tissuebath)中的固定座和传感器之间，并浸没在不含镁的Tyrode溶液中，且在30℃的温度下恒定通气。传感器的输出(output)被放大。放大的输出又被送到平板记录器(flat bed recorder)。将被测量的量的组胺添加到组织浴中，使得组胺浓度逐步增加，直到收缩力达到最大值。冲洗组织浴，并使其充满新鲜的含有感兴趣化合物的不含镁的Tyrode溶液。使溶液与组织接触8分钟，并再次添加被测量的量的组胺，直到记录到最大收缩。增加被测化合物的浓度重复该测定，并记录给出50％最大收缩的组胺的剂量。剂量比(DR)可通过比较在缺乏拮抗剂和存在拮抗剂下产生50％最大响应所需的组胺浓度来计算。制作LogDR-1对LogD(所测化合物的浓度)的曲线图，且与Log(DR-1)纵坐标的交点被看作是活性的测量值(pA2值)。
本发明还包括药物制剂，其包括与药物赋形剂组合的如本文提供的偶联物。一般来说，偶联物自身将是固体形式(例如沉淀物)，其可与合适的药物赋形剂组合，该药物赋形剂可以是固体或液体形式。
示例性的赋形剂包括但不限于，选自由糖类、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合组成的组的那些赋形剂。
糖类，诸如糖、衍生的糖诸如糖醇、糖醛酸、酯化的糖和/或糖聚合物，可提供为赋形剂。具体的糖类赋形剂包括，例如：单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖以及类似的单糖；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖以及类似的二糖；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉以及类似的多糖；以及糖醇，诸如甘露醇，木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨醇(pyranosyl sorbitol)、肌醇以及类似的糖醇。
赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，诸如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。
制剂还可包括用于防止或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合于本发明的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、西吡氯铵、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)及其组合。
抗氧化剂也可存在于制剂中。抗氧化剂用于防止氧化，从而防止偶联物或制剂的其他组分的变质。用于本发明的合适的抗氧化剂包括，例如抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁对甲氧酚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、一硫代甘油(monothioglycerol)、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及其组合。
表面活性剂可作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨酯诸如“吐温20”和“吐温80”，以及聚氧丙烯诸如F68和F88(两者都可从BASF，Mount Olive，New Jersey获得)；脱水山梨醇酯；脂质，诸如磷脂，诸如卵磷脂和其他的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选不以脂质体的形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇，诸如胆固醇；以及螯合剂，诸如EDTA、锌和其他这类合适的阳离子。
在制剂中，药学上可接受的酸或碱可作为赋形剂存在。可使用的酸的非限制性实例包括选自由以下的酸组成的组的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合。合适的碱的实例包括但不限于选自由以下的碱组成的组的碱：氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、醋酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、丁烯二酸钾(potassium fumerate)及其组合。
组合物中偶联物的量将根据许多因素而变化，但当组合物被储存于单位剂量容器中时，将最佳为有效治疗剂量。可通过重复施用递增量的偶联物，以便确定哪个量产生了临床所需终点，来实验确定治疗有效剂量。
组合物中的任何单种赋形剂的量将根据赋形剂的活性和组合物的特定需要而变化。通常，任何单种赋形剂的最佳量将通过常规实验确定，即通过制备含有变化量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其他参数，且然后确定获得最佳性能且没有显著副作用的范围。
然而，一般来说，赋形剂将以按重量计约1％至约99％，优选地按重量计约5％-98％，更优选地按重量计约15％-95％的赋形剂的量存在于组合物中，且最优选浓度小于按重量计30％。
这些上述的药物赋形剂连同其他的赋形剂和关于药物组合物的一般教导描述于“Remington：The Science & Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践)”，第19版，Williams & Williams，(1995)；“Physician′s Desk Reference(医师案头参考)”，第52版，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)和Kibbe，A.H.，Handbook ofPharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)，第三版，AmericanPharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。
药物组合物可采用许多形式，且在这一方面本发明不受限制。示例性的制剂最优选以适合于口服施用的形式，诸如片剂、囊片(caplet)、胶囊、凝胶胶囊(gel cap)、锭剂、分散体、悬浮液、溶液、酏剂、糖浆、糖锭、透皮贴片、喷雾剂、栓剂和粉末。
对于口服活性的那些偶联物，口服剂型是优选的，且包括片剂、囊片、胶囊、凝胶胶囊、悬浮液、溶液、酏剂和糖浆，且还可包括被任选地包封的多种颗粒、小珠、粉末或小丸。这种剂型使用药物配制领域的技术人员所知的常规方法来制备，并且描述于相关的教科书中。
例如，可使用标准片剂加工过程和设备来制备片剂和囊片。当制备含有本文描述的偶联物的片剂或囊片时，优选直接压制和制粒技术。除了偶联物之外，片剂和囊片一般将含有无活性的药学上可接受的载体材料，诸如粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、稳定剂、表面活性剂、着色剂以及类似物。粘合剂用于向片剂提供粘聚性(cohesivequality)，并因此确保片剂保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉(包括玉米淀粉和预胶凝淀粉)、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖和乳糖)、聚乙二醇、蜡以及天然的和合成的树胶例如阿拉伯树胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素聚合物(包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素以及类似的纤维素)和硅酸镁铝。润滑剂用于促进片剂制备，提供粉末流动，并且防止当释放压力时颗粒顶裂(即颗粒破裂)。有用的润滑剂是硬脂酸镁、硬脂酸钙和硬脂酸。崩解剂用于促进片剂的崩解，且通常是淀粉、粘土、纤维素、褐藻胶、树胶或交联聚合物。填充剂包括例如，诸如二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、滑石、高岭土、粉状纤维素和微晶纤维素的物质以及诸如甘露醇、脲、蔗糖、乳糖、右旋糖、氯化钠和山梨醇的可溶物质。如本领域所公知的，稳定剂用于抑制或延迟药物分解反应，药物分解反应包括，作为实例，氧化反应。
胶囊还是优选的口服剂型，在这种情况下，可以包封液体或凝胶(例如在凝胶胶囊的情况下)或固体(包括诸如颗粒、小珠、粉末或小丸的微粒)形式的含有偶联物的组合物。合适的胶囊包括硬胶囊和软胶囊，并通常由明胶、淀粉或纤维素材料制成。两件式(two-piece)硬明胶胶囊优选地，诸如用明胶带或类似物密封。
包括基本干燥形式的胃肠外制剂(通常为冻干物或沉淀物，其可以是粉末或饼的形式)，以及制备用于注射的制剂，该制剂通常是液体，并需要重新构建干燥形式的胃肠外制剂的步骤。用于注射前重新构建固体组合物的合适稀释剂的实例包括用于注射的抑菌水，5％右旋糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、盐水、无菌水、去离子水及其组合。
在一些情况下，预期用于胃肠外施用的组合物可采用非水溶液、悬浮液或乳剂的形式，每个通常都是无菌的。非水溶剂或媒介物的实例是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油和玉米油的植物油、明胶和可注射有机酯诸如油酸乙酯。
本文描述的胃肠外制剂还可包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过加入杀菌剂、通过除菌滤器的过滤、辐射或加热，使制剂无菌。
还可使用常规透皮贴片或其他透皮传递系统，通过皮肤施用偶联物，其中偶联物被包含在作为药物传递设备的、将固定于皮肤的层状结构中。在这样一种结构中，偶联物被包含在上部支持层(backinglayer)下面的层或“储库(reservoir)”中。层状结构可含有单个储库，或其可含有多个储库。
偶联物还可被配制成用于直肠施用的栓剂。关于栓剂，偶联物与栓剂基质材料混合，所述基质材料是(例如，在室温下仍为固体但在体温下软化、熔化或溶解的赋形剂)诸如可可脂(coca butter)(可可油)、聚乙二醇、甘油明胶、脂肪酸及其组合。栓剂可通过例如进行以下步骤来制备(不必按照所提供的顺序)：熔化栓剂基质材料以形成熔体；加入偶联物(在熔化栓剂基质材料之前或之后)；将熔体倾入模具中；冷却熔体(例如将含有熔体的模具放置于室温环境中)以由此形成栓剂；并将栓剂从模具中移出。
本发明还提供用于将本文提供的偶联物施用于患有对用该偶联物治疗有响应的疾患的患者的方法。该方法包括一般口服施用治疗有效量的偶联物(优选地提供为药物制剂的一部分)。还包括其他的施用模式，诸如肺部、鼻、口腔、直肠、舌下、透皮和胃肠外。如本文所用，术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、心脏内、鞘内和肌内注射以及输注注射。
在使用胃肠外施用的实例中，可能需要使用比先前描述的低聚物稍大的低聚物，该低聚物具有范围为从约500至30K道尔顿的分子量(例如具有约500、1000、2000、2500、3000、5000、7500、10000、15000、20000、25000、30000或更大的分子量)。
施用方法可用于治疗可通过施用特定的偶联物治疗或预防的任何疾患。本领域普通技术人员了解具体的偶联物可有效治疗何种疾患。所施用的实际剂量将根据以下因素而变化：受治疗者的年龄、体重和一般状况以及所治疗的疾患的严重性、保健专家的判断和所施用的偶联物。治疗有效量为本领域技术人员所知，和/或描述于相关的参考文本和文献中。一般来说，治疗有效量的范围将为从约0.001mg至1000mg，优选地以从0.01mg/天至750mg/天的剂量，且更优选地以从0.10mg/天至500mg/天的剂量。
任何给定的偶联物(再次优选提供为药物制剂的一部分)的单位剂量可以根据临床医师的判断、患者的需要等等来以不同的给药方案施用。具体的给药方案将为本领域普通技术人员所知，或可使用常规方法实验确定。示例性的剂量方案包括但不限于一天五次、一天四次、一天三次、一天两次、一天一次、一周三次、一周两次、一周一次、每月两次、每月一次及其任何组合的施用。一旦已经实现临床终点，就停止组合物的给药。
施用本发明的偶联物的一个优势是相对于母体药物，可实现首过代谢的降低。这一结果对基本上通过穿过消化道代谢的许多口服施用的药物来说是有利的。这样，可通过选择低聚物的分子大小、键合和提供所需清除率特性的共价连接的位置，来调节偶联物的清除率。本领域普通技术人员可根据本文的教导确定低聚物的理想分子大小。本文引用的所有文章、书籍、专利、专利公布和其他出版物通过引用整体并入。与对应的未偶联的小药物分子对比，偶联物的首过代谢的优选的降低包括：至少约10％；至少约20％；至少约30；至少约40；至少约50％；至少约60％；至少约70％；至少约80％和至少约90％。
因此，本发明提供了用于降低活性剂代谢的方法。该方法包括以下步骤：提供单分散或双峰偶联物，每个偶联物包含衍生于小分子药物的部分，小分子药物通过稳定的键合共价连接于水溶性低聚物，其中所述偶联物表现出与没有连接到水溶性低聚物的小分子药物的代谢速率相比，降低的代谢速率；以及将偶联物施用于患者。通常，施用经选自由以下组成的组的一种施用类型来进行：口服施用、透皮施用、口腔施用、透黏膜施用、阴道施用、直肠施用、胃肠外施用和肺部施用。
尽管偶联物降低许多类型的代谢(包括I期和II期代谢)的用途可能被削弱，但当小分子药物由肝酶(例如细胞色素P450同工型的一种或多种)和/或一种或多种肠酶代谢时，偶联物是特别有用的。
本文引用的所有文章、书籍、专利、专利公布和其他出版物通过引用以其整体并入。在本说明书中的教导与通过引用并入的技术之间不一致的情况下，应以本说明书中的教导的含义为准。
实验
应理解，尽管已经描述了本发明连同某些优选的和具体的实施方案，但以上的描述以及随后的实施例意在示例，且并不限制本发明的范围。在本发明的范围内的其他方面、优势和改良对本发明所属领域的技术人员来说将是明显的。
在附加的实施例中涉及的所有化学试剂是商业上可获得的，除非另外指出。PEG-mer的制备描述于例如美国专利申请公布第2005/0136031号中。
所有的1H NMR(核磁共振)数据均由Bruker制造的NMR光谱仪(兆赫≥300)产生。
实施例1
苯海拉明偶联物的制备
用于合成mPEGn-苯海拉明偶联物的一种方法的示意图在如下方案1中提供。
Figure G2008800080850D00321
Figure G2008800080850D00331
方案1
mPEGn-NH2的合成
在圆底烧瓶中，将2克的mPEGn-OH加入到1.7mL三乙烯胺中。随后加入二氯甲烷(5ml)。将溶液放置在冰浴上并允许搅拌30分钟。然后，把甲磺酰氯(1.08mL)加入到反应烧瓶中。使反应在室温下搅拌过夜。加入去离子水(15mL)并将反应混合物搅拌额外的30分钟。使用分液漏斗来分离各层。有机层用0.1N HCl(1×100mL)和水(1×100m L)洗涤，用硫酸钠干燥两个小时，过滤，并在减压下除去溶剂。在烧瓶中，把氯化铵(18g)加入到氢氧化铵(120mL)中。使固体溶解的同时，加入mPEG-甲磺酸盐，并允许在室温下搅拌48小时。然后，把氯化钠(18g)加入到烧瓶中并使其溶解。使用二氯甲烷(3×100mL)萃取产物。把有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下除去溶剂而得到油。
mPEGn-NH-苯海拉明的合成
二苯甲基2-氯乙醚(benzhydryl 2-chloroethyl ether)(2mmol)和mPEGn-NH2(3mmol)溶解在10ml乙腈中，且然后将水(1mL)中的氢氧化钠(2mmol)加入到该溶液中。将混合物在100℃搅拌16个小时。将二氯甲烷(200ml)加入到反应混合物中，并将所得的溶液用水(200mL×3)洗涤。把有机相干燥，并在减压下除去溶剂。通过柱色谱法(SiO2∶DCM/CH3OH，20∶1)或可选地使用利用CAN/H2O的硅胶快速色谱法(40M C-18RP柱，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化粗产物。期望的mPEGn-NH-苯海拉明产物以～70％的收率获得，而mPEGn-N-(苯海拉明)2也以～15％的收率获得。
mPEG3-NH-苯海拉明(3，n＝3)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34-7.25(m，10H)，5.39(s，1H)，3.64-3.61(m，10H)，3.55(m，2H)，3.37(s，3H)，2.93(t，2H)，2.89(t，2H)。LC-MS：374.3(MH+)。
mPEG4-NH-苯海拉明(3，n＝4)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34-7.25(m，10H)，5.39(s，1H)，3.64-3.61(m，14H)，3.55(m，2H)，3.37(s，3H)，2.93(t，2H)，2.89(t，2H)。LC-MS：418.4(MH+)。
mPEG5-NH-苯海拉明(3，n＝5)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34-7.25(m，10H)，5.39(s，1H)，3.64-3.61(m，18H)，3.55(m，2H)，3.37(s，3H)，2.93(t，2H)，2.89(t，2H)。LC-MS：461.3(MH+)。
mPEG6-NH-苯海拉明(3，n＝6)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34-7.25(m，10H)，5.41(s，1H)，3.68-3.61(m，22H)，3.55(m，2H)，3.38(s，3H)，2.99(t，2H)，2.94(t，2H)。LC-MS：计算值505.3；实测值506.4(MH+)。
mPEG7-NH-苯海拉明(3，n＝7)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.37-7.25(m，10H)，5.41(s，1H)，3.68-3.63(m，26H)，3.57(m，2H)，3.39(s，3H)，2.95(t，2H)，2.91(t，2H)。LC-MS：计算值549.3；实测值550.5(MH+)。
mPEGn-N-(苯海拉明)2(4，n＝6)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.36-7.23(m，20H)，5.35(s，2H)，3.65-3.60(m，16H)，3.53(m，10H)，3.39(s，3H)，2.90(t，4H)，2.81(t，2H)。LC-MS：计算值715.4；实测值716.4(MH+)。
mPEGn-N(CH3)-苯海拉明(5)的合成
将mPEGn-NH-苯海拉明(0.25mmol)、低聚甲醛(0.5mmol)和氯化锌(0.5mmol)溶解在8mL DCM中。加入硼氢化钠(0.5mmol)之前，将混合物在室温下搅拌1小时。将产生的反应混合物在室温下搅拌过夜。将二氯甲烷(150mL)加入反应混合物中，并将所得溶液用水(150mL×4)洗涤。把合并的有机相干燥，并在减压下除去溶剂。通过使用DCM/MeOH的硅胶快速柱色谱法(12M柱，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化粗产物。产物以定量的收率获得。
mPEG3-N-苯海拉明(5，n＝3)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.19(m，10H，2Ph)，5.34(s，1H，Ph2CH)，3.62-3.50(m，12H，6OCH 2)，3.35(s，3H，OCH 3)，2.76(t，J＝5.4-5.7Hz，2H，NCH 2)，2.68(t，J＝5.1-5.4Hz，2H，NCH 2)，2.34(s，3H，NCH 3)；LC-MS：388.3(MH+)。
mPEG4-N-苯海拉明(5，n＝4)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.19(m，10H，2Ph)，5.34(s，1H，Ph2CH)，3.62-3.50(m，16H，8OCH 2)，3.35(s，3H，OCH 3)，2.76(t，J＝5.4-5.7Hz，2H，NCH 2)，2.68(t，J＝5.1-5.4Hz，2H，NCH 2)，2.34(s，3H，NCH 3)；LC-MS：432.4(MH+)。
mPEG5-N-苯海拉明(5，n＝5)：1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.38-7.25(m，10H)，5.39(s，1H)，3.67-3.61(m，20H)，3.40(s，3H)，2.80(t，2H)，2.72(t，2H)，2.38(s，3H)。LC-MS：计算值475.3；实测值476.4(MH+)。
mPEG6-N-苯海拉明(5，n＝6)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.38-7.25(m，10H)，5.38(s，1H)，3.67-3.60(m，24H)，3.39(s，3H)，2.76(t，2H)，2.68(t，2H)，2.35(s，3H)。LC-MS：计算值519.3；实测值520.4(MH+)。
mPEG7-N-苯海拉明(5，n＝7)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.38-7.25(m，10H)，5.38(s，1H)，3.67-3.60(m，28H)，3.39(s，3H)，2.76(t，2H)，2.68(t，2H)，2.35(s，3H)。LC-MS：计算值563.3；实测值564.5(MH+)。
为放大而设计的苯海拉明偶联物的合成。
放大上述PEG-苯海拉明偶联物的试验以支持体内研究被认为是次最佳的，因为反应温度需要提高到120℃，某些步骤后的色谱法导致较低的总收率，而且难以实现和维持无水条件。
在一种用于合成偶联物的可选的方法中，按照如下所示的合成方案(方案2)，使用商业上可得的二苯基甲醇和2-溴乙醇。
Figure G2008800080850D00361
方案2
在此方法中，在浓硫酸存在下，使二苯基甲醇(6)与甲苯中的2-溴乙醇在90℃反应，以得到2-溴乙基二苯甲基醚(2-bromoethylbenzhydryl ether)(7)。在作为碱的碳酸钾和作为相转移催化剂的四丁基溴化铵(“TBAB”)的存在下，2-溴乙基二苯甲基醚(7)通过室温下(“r.t.”)与THF中的甲胺反应，被转化为(2-二苯甲基氧基乙基)甲胺((2-benzhydryloxy ethyl)methylamine)(8)。在作为碱的碳酸钾的存在下，(2-二苯甲基氧基乙基)甲胺(8)与mPEGn-OMs(其中“Ms”是甲磺酸盐)反应，生成最终产物mPEGn-N-苯海拉明(5)。
二苯甲基2-溴乙醚(7)的合成
在室温下，将浓硫酸(1.7mL)加入到搅拌的2-溴乙醇(1.042g，76.34mmol)的甲苯(70mL)溶液中。使溶液升温到60℃。在20分钟内滴加温热的甲苯(65mL)中的二苯基甲醇(9.623g，51.71mmol)。在加入过程中，溶液变得浑浊。将反应混合物在90℃保持6.5小时，冷却到室温，且然后用甲苯(50mL)稀释。将混合物倾入冰水浴中。有机相被分离，并用5％的碳酸氢钠水溶液(100mL)、盐水(2×200mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过使用3-8％EtOAc/己烷的硅胶快速柱色谱法(40M柱，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化所得的残留物，得到77％收率的11.64g产物。注：产物可通过在减压下蒸馏来纯化(b.p.125-165℃/2.5mmHg)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.19(m，10H，2Ph)，5.38(s，1H，Ph2CH)，3.77(t，J＝6.0-6.3Hz，2H，OCH 2)，3.51(t，J＝6.0-6.3Hz，2H，CH 2Br)。
(2-二苯甲基氧基乙基)甲胺(8)的合成
将二苯甲基2-溴乙醚7(3.35g，11.50mmol)、碳酸钾(10.13g，72.57mmol)、四丁基溴化铵(652mg，2.0mmol)在甲胺(2.0M THF溶液，63mL，126mmol)中的混合物于室温下搅拌27.5小时。加水以终止反应，浓缩以除去有机溶剂和多余的甲胺。余下的水溶液用二氯甲烷(4×30mL)萃取。合并的有机溶液用盐水(2×40mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过使用3-8％MeOH/DCM的硅胶快速柱色谱法(40M柱，20CV，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化所得的残留物，以得到69％收率的产物(1.93g)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.19(m，10H，2Ph)，5.36(s，1H，Ph2CH)，3.61(t，J＝5.1Hz，2H，OCH 2)，2.84(t，J＝5.1Hz，2H，NCH 2)，2.43(s，3H，NCH 3)；LC-MS：242.1(MH+)。
mPEG3-N-苯海拉明(5，n＝3)的合成
在碳酸钾(441mg，3.16mmol)的存在下，将(2-二苯甲基氧基乙基)甲胺8(280mg，1.16mmol)和mPEG3-OMs(252mg，1.04mmol，其中“Ms”是甲磺酸盐)在乙腈(20mL)中的混合物于室温下搅拌60分钟，且然后加热到回流23个小时。混合物被冷却到室温，过滤，并用DCM洗涤固体。所收集的有机溶液在减压下浓缩，并通过使用0-10％MeOH/DCM的硅胶快速柱色谱法(25M柱，20CV，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化残留物，以得到74％收率的产物(300mg)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.19(m，10H，2Ph)，5.34(s，1H，Ph2CH)，3.62-3.50(m，12H，6OCH 2)，3.35(s，3H，OCH 3)，2.76(t，J＝5.4-5.7Hz，2H，NCH 2)，2.68(t，J＝5.1-5.4Hz，2H，NCH 2)，2.34(s，3H，NCH 3)；LC-MS：388.3(MH+)。
mPEG6-N-苯海拉明(5，n＝6)
在碳酸钾(399mg，2.86mmol)的存在下，将(2-二苯甲基氧基乙基)甲胺8(228mg，0.95mmol)和mPEG6-OMs(410mg，1.10mmol)在乙腈(15mL)中的混合物于室温下搅拌90分钟，且然后加热到回流22.5个小时。加入额外量的mPEG6-OMs(100mg，0.27mmol)。将混合物加热到回流达另外的23个小时。混合物被冷却到室温，过滤，并用乙腈和DCM洗涤固体。所收集的有机溶液在减压下浓缩，并通过使用3-10％MeOH/DCM的硅胶快速柱色谱法(25M柱，20CV，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化残留物，以得到63％收率的产物(308mg)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.18(m，10H，2Ph)，5.34(s，1H，Ph2CH)，3.70-3.50(m，24H，12OCH 2)，3.35(s，3H，OCH 3)，2.76(t，J＝5.7-6.0Hz，2H，NCH 2)，2.68(t，J＝5.7-6.0Hz，2H，NCH 2)，2.34(s，3H，NCH 3)；LC-MS：520.4(MH+)。
使用另一种合成方法，其示意图在下面被提供为“方案3”。
Figure G2008800080850D00381
方案3
在此方法中，mPEGn-N-Me(9)的制备通过使用氯化铵作为催化剂，使活化的mPEGn-OMs与甲胺反应而完成。mPEGn-N-Me随后与商业上可得的二苯甲基2-氯乙醚(1)反应，以在仅仅2个步骤内得到所期望的mPEGn-N-苯海拉明偶联物，且收率与方案1中所概述的合成途径中获得的那些收率相当。
mPEGn-OMs(9)的合成
在圆底烧瓶中，将mPEGn-OH(4.00g)加入到三乙胺(3.39mL)中。随后加入二氯甲烷(10ml)，并将溶液放置在冰浴上并允许搅拌30分钟。然后，把甲磺酰氯(2.16mL)加入到反应烧瓶中。允许反应搅拌过夜，且然后将去离子水(15mL)加入到反应混合物中。将溶液搅拌额外的30分钟。然后加入二氯甲烷(40mL)。使用分液漏斗来分离各层，并且加入0.1N HCl(100mL)。收集有机层并用去离子水(3×100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并在减压下除去溶剂以得到所需的油状的mPEGn-OMs。
mPEGn-N-CH3(9)的合成
在圆底烧瓶中，将氯化铵(30g)溶解在氢氧化铵(200mL)中。然后，加入上面制备的mPEGn-OMs(3.8g)，并允许反应混合物搅拌48小时。将产物用二氯甲烷(3×100mL)萃取。把合并的有机萃取物用Na2SO4干燥，过滤，并在减压下除去溶剂。得到期望的油状产物，且并不将该产物放在真空中，因观察到其在2小时后分解。产物通过1H NMR确认。
mPEGn-N-苯海拉明(5)的制备
将二苯甲基2-氯乙醚(1)溶解在乙腈(10mL)中，并加入到mPEGn-N-CH3(9，370g)中。然后在搅拌下加入氢氧化钠/水溶液(160mg)。将反应混合物在120℃搅拌过夜，且然后将二氯甲烷(400mL)加入溶液中。有机层用(3×300mL)和NaCl/H2O(1×300mL)洗涤，用Na2SO4干燥2小时，过滤，并在减压下除去溶剂。通过使用MeOH/DCM的硅胶快速柱色谱法(25M柱，Biotage，Inc.，Charlottesville，VA)纯化所得产物，以得到期望的产物。
mPEG3-N-苯海拉明(5，n＝3)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ7.35-7.19(m，10H，2Ph)，5.34(s，1H，Ph2CH)，3.62-3.50(m，12H，6OCH 2)，3.35(s，3H，OCH 3)，2.76(t，J＝5.4-5.7Hz，2H，NCH 2)，2.68(t，J＝5.1-5.4Hz，2H，NCH 2)，2.34(s，3H，NCH 3)；LC-MS：388.3(MH+)。
mPEG5-N-苯海拉明(5，n＝5)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.38-7.25(m，10H)，5.39(s，1H)，3.67-3.61(m，20H)，3.40(s，3H)，2.80(t，2H)，2.72(t，2H)，2.38(s，3H)。LC-MS：计算值475.3；实测值476.4(MH+)。
mPEG6-N-苯海拉明(5，n＝6)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.38-7.25(m，10H)，5.38(s，1H)，3.67-3.60(m，24H)，3.39(s，3H)，2.76(t，2H)，2.68(t，2H)，2.35(s，3H)。LC-MS：计算值519.3；实测值520.4(MH+)。
mPEG7-N-苯海拉明(5，n＝7)：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.38-7.25(m，10H)，5.38(s，1H)，3.67-3.60(m，28H)，3.39(s，3H)，2.76(t，2H)，2.68(t，2H)，2.35(s，3H)。LC-MS：计算值563.3；实测值564.5(MH+)。
实施例2
羟嗪偶联物的制备
制备mPEGn-Br(n＝1、3、5、6、7、8)的示意图
Figure G2008800080850D00401
使用mPEG5-Br制备羟嗪偶联物的合成步骤：
mPEG(n＝5)-甲磺酸盐：搅拌下将三乙胺(5.7mL，40mmol)加入mPEG(n＝5)-OH(5.0g，20mmol)的二氯甲烷(20mL)中。在N2下在冰浴中冷却溶液，并在30分钟内滴加2.5mL甲磺酰氯(32mmol)。然后将溶液在室温下搅拌过夜。把40mL水加入反应混合物中，并将溶液用CH2Cl2(3×150mL)萃取，用0.1N HCl(3×80mL)和水(2×80mL)洗涤有机相。在用Na2SO4干燥，并在减压下除去溶剂后，以定量的收率获得期望的浅棕色液体状的mPEG(n＝5)-甲磺酸盐。1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ4.41(m，2H)，3.80(m，2H)，3.71(m，14H)，3.58(m，2H)，3.41(s，3H)，3.11(s，3H)。
mPEG(n＝5)-Br：将mPEG(n＝5)-甲磺酸盐(6.51g，19.8mmol)和Bu4NBr(12.80g，39.7mmol)溶解在CH3CN(50mL)中，并在N2下将所得溶液于50℃搅拌15小时。在冷却到室温后，在减压下除去CH3CN而得到红色液体，将该红色液体溶解于150mL水中，并用EtOAc(2×200mL)萃取。将有机相合并，用水洗涤，并用Na2SO4干燥。在除去溶剂后，得到红色液体(4.83g，77.4％)。1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ3.82(t，2H)，3.67(m，14H)，3.51(m，2H)，3.40(s，3H)。
上述程序之后，制备值不同于5的mPEGn-Br。
mPEGn-羟嗪偶联物(n＝1、3、5、6、7、8)的一般合成示意图
Figure G2008800080850D00411
将羟嗪二盐酸盐(1.0mmol)溶解在6mL DMF中。在搅拌下将NaH(5.0mmol)加入溶液中。20分钟后，将mPEGn-Br(3.0mmol)加入溶液中，然后将该溶液在室温下搅拌过夜。加入二氯甲烷(150mL)，并通过过滤收集沉淀的固体。用水(100mL×2)洗涤有机滤液，且然后干燥。通过柱色谱法(SiO2∶DCM/甲醇，20∶1)纯化粗产物。得到高收率和高纯度的淡黄色油状产物(收率：～90％，纯度：＞99％)。
mPEG1-羟嗪：1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ7.40(m：4H)，7.28(m，5H)，4.23(s，1H)，3.65(m，8H)，3.57(m，2H)，3.40(s，3H)，2.64(t，2H)，2.61(b，4H)，2.57(b，4H)。
mPEG3-羟嗪：1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ7.38(m，4H)，7.28(m，5H)，4.20(s，1H)，3.64(m，18H)，3.42(s，3H)，2.64(t，2H)，2.61(b，4H)，2.57(b，4H)。LC-MS：计算值520.3，实测值521.3(M+H+)。
mPEG5-羟嗪：1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ7.36(m，4H)，7.24(m，5H)，4.21(s，1H)，3.63(m，26H)，3.39(s，3H)，2.61(t，2H)，2.55(b，4H)，2.43(b，4H)。LC-MS：计算值608.3，实测值609.3(M+H+)。
mPEG6-羟嗪：1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ7.36(m，4H)，7.24(m，5H)，4.19(s，1H)，3.63(m，30H)，3.39(s，3H)，2.61(t，2H)，2.55(b，4H)，2.43(b，4H)。
mPEG7-羟嗪：1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ7.38(m，4H)，7.28(m，5H)，4.20(s，1H)，3.64(m，34H)，3.42(s，3H)，2.64(t，2H)，2.61(b，4H)，2.57(b，4H)。LC-MS：计算值696.4，实测值697.4(M+H+)。
mPEG8-羟嗪：1H NMR(300Hz，CDCl3)：δ7.36(m，4H)，7.24(m，5H)，4.21(s，1H)，3.63(m，38H)，3.39(s，3H)，2.61(t，2H)，2.55(b，4H)，2.43(b，4H)。
实施例3
西替利嗪偶联物的制备
在紧接着下面提供制备mPEGn-NH2的示意图。
Figure G2008800080850D00421
在紧接着下面提供制备西替利嗪偶联物的示意图。
Figure G2008800080850D00422
制备mPEGn-西替利嗪的合成步骤
将西替利嗪二盐酸盐(1.0mmol)溶解在8mL DMF中。将DCC(1.1mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(1.1mmol)加入溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，且然后加入mPEGn-NH2(5mmol)。反应持续了另外的5个小时。通过过滤除去沉淀的固体，并在减压下除去溶剂。通过柱色谱法纯化所得残留物，得到～80％的收率和＞99％的纯度(HPLC)的期望的产物。
mPEG1-西替利嗪：δ7.42(m，1H)，7.40(m，4H)，7.28(m，5H)，4.25(s，1H)，3.99(s，2H)，3.65(t，2H)，3.48(m，4H)，3.34(s，3H)，2.63(t，2H)，2.58(b，4H)，2.46(b，4H)；分析型HPLC：tR＝7.15分钟。
mPEG3-西替利嗪：δ7.45(m，1H)，7.35(m，4H)，7.25(m，5H)，4.22(s，1H)，3.96(s，2H)，3.59(m，10H)，3.53(m，2H)，3.46(m，2H)，3.37(s，3H)，2.60(t，2H)，2.58(b，4H)，2.43(b，4H)；分析型HPLC：tR＝7.22分钟。
mPEG5-西替利嗪：δ7.42(m，1H)，7.36(m，4H)，7.24(m，5H)，4.23(s，1H)，3.96(s，2H)，3.60(m，20H)，3.46(m，2H)，3.38(s，3H)，2.60(t，2H)，2.55(b，4H)，2.43(b，4H)；分析型HPLC：tR＝7.28分钟。
mPEG7-西替利嗪：δ7.45(m，1H)，7.35(m，4H)，7.25(m，5H)，4.22(s，1H)，3.96(s，2H)，3.59(m，28H)，3.46(m，2H)，3.37(s，3H)，2.60(t，2H)，2.58(b，4H)，2.43(b，4H)。
实施例4
血脑屏障(“BBB”)测定
BBB模型
原位脑灌注技术利用完整的大鼠脑，并允许测定药物在正常生理状态下穿过BBB的穿透。该模型还允许研究转运机制，如被动扩散对载体介导的转运。使用单一时间点的方法进行灌注。将含有待测化合物的灌注流体(灌注液)经由左侧颈外动脉通过输液泵以恒定速率(20mL/分钟)注入大鼠。灌注流率被设置为在正常生理压力(80-120mmHg)下完全将液体流带到大脑。灌注的持续时间为30秒。紧接着灌注之后，用不含药物的灌注液灌注脑脉管系统额外30秒以除去残留药物。关闭泵，且然后立即将大脑从头骨中取出。首先称量每只大鼠的左脑样品，且然后使用Polytron均化器将其均化。将四(4)mL 20％的甲醇加入每个大鼠脑组织以均化。在均化之后，测量并记录匀浆的总体积。
用有机溶剂稀释被测量的量的匀浆并离心。上清液被取出，在氮气流中被蒸发，并重新构建以及通过LC/MS/MS分析。脑匀浆中药物浓度的定量通过由将药物加入空白的(即不含药物)脑匀浆生成的校正曲线来完成。脑匀浆中药物浓度的分析进行一式三份。
每种灌注溶液都含有阿替洛尔(靶浓度(target concentration)，50μM)、安替比林(靶浓度，5μM)和靶浓度为20μM的被测化合物(来自上面的列表)。
表I
组胺(H1)结合活性
  药物   分子量   溶解性(μM)   IC50
  羟嗪   374.91   作为盐酸盐可溶   48.8nM
  PEG1-羟嗪   433.0   可溶   70.3nM
  PEG3-羟嗪   521.0   可溶   105.0nM
  PEG5-羟嗪   609.0   可溶   76.7nM
  PEG7-羟嗪   未检测
  西替利嗪   388.89   作为盐酸盐可溶   77.1nM
  PEG1-西替利嗪   446.0   可溶   61.0nM
  PEG3-西替利嗪   534.0   可溶   86.4nM
  PEG5-西替利嗪   622.0   可溶   128.0nM
  PEG7-西替利嗪   未检测
  苯海拉明   -   -   4.32 10-8M
  mPEG5-N-苯海拉明   -   -   60.0 10-8M
  mPEG6-N-苯海拉明   -   -   59.1 10-8M
  mPEG7-N-苯海拉明   -   -   173 10-8M
  mPEG6-NH-苯海拉明   -   -   412 10-8M
  mPEG7-NH-苯海拉明   -   -   761 10-8M
  mPEG6-N-(苯海拉明)2   -   -   650 10-8M
表II
脑摄入率(brain uptake rate)
  药物   以pmol/gm脑/秒的归一化的脑摄入率(平均值±SD)   N(大鼠)
  阿替洛尔(低标准)   0.7±0.9   4
  安替比林(高标准)   17.4±5.7   4
  羟嗪   355.89±59.02   3
  PEG5-羟嗪   131.60±15.84   3
  PEG7-羟嗪   12.01±2.97   3
  西替立嗪   1.37±0.37   3
  PEG5-西替立嗪   4.32±0.26   3
  PEG7-西替立嗪   1.13±0.05   3
实施例5
生物利用度测定
将几种羟嗪偶联物口服施用于大鼠，然后定期测试血浆以确定存在于血浆中的偶联物(或对照)的量。用Zorbax XDB C-8柱，2.1×50mm，1.8μm颗粒尺寸，150μL/分钟，进行LC-MS/MS。使用的缓冲液是：“A”为0.1％的甲酸、20％的乙腈；“B”为0.1％的甲酸、70％的乙腈；梯度洗脱是在2.5分钟内从0％到100％B进行。检测由设定在对应于羟嗪、西替利嗪、PEG3-羟嗪、PEG5-羟嗪、PEG7-羟嗪的389-201m/z、521-201m/z、609-201m/z和697-201m/z的MRM-质谱仪完成。结果呈现在图1中。
实施例6
游离药物测定(羟嗪)
将几种羟嗪偶联物口服施用于大鼠，然后定期测试血浆以确定存在于血浆中的游离羟嗪(或对照)的量。按照实施例5中所述进行LC-MS/MS。结果呈现在图2中。
实施例7
游离药物测定(西替立嗪)
将几种西替立嗪偶联物口服施用于大鼠，然后定期测试血浆以确定存在于血浆中的游离西替立嗪(或对照)的量。按照实施例5中所述进行LC-MS/MS。结果呈现在图3中。
实施例8
代谢测定-体外
在NADPH再生缓冲液的存在下，将几种羟嗪偶联物和大鼠肝酶在体外混合。加入偶联物(或对照或附加物(interest))并在37℃温育。阶段I代谢是有保证的，因为PAPS和UDPGA(磺化和葡萄苷酸化阶段II反应所需的物质)并没有加入到反应体系中。结果呈现在图4中。
实施例9
代谢测定-体内
Sprague-Dawley雌性大鼠(共16只大鼠，每只180克)被口服施用(1)羟嗪、(2)PEG3-羟嗪、(3)PEG5-羟嗪和(4)PEG7-羟嗪以使羟嗪剂量为5mg/kg，且在第1小时、第2小时和第4小时采血样。将样品离心，且收集血清并使其在-80℃冷冻，直到准备分析。结果呈现在图5中。
实施例10
对H1组胺受体的受体结合
按照与Novascreen目录#100-0456号(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)相关的程序，使用人类重组H1组胺受体进行受体结合研究。通过由使用10μM曲普利啶确定的非特异性结合替换高亲和力配体[3H]吡拉明(Kd 1.0nM)，利用了竞争性抑制研究。本研究使用每个数据点一式两份样品(n＝2)来进行。各种PEG-苯海拉明偶联物的结合亲和力(Ki)在下面的表III提供。用各种PEG-苯海拉明偶联物重复该测定，并在表III中用星号标记在该重复测定中测试的化合物。在两次测定中测试的那些化合物所得的相对结合亲和力是在同一个范围内。其他结果在图6至图8中提供。
表III
各种PEG-苯海拉明偶联物的结合亲和力
Figure G2008800080850D00461
实施例11
对H1、H2、M1、M2和M3受体的受体结合
为了确定PEG-苯海拉明对其它受体的结合亲和力，分别按照与Novascreen目录第100-0456、100-0086、100-0038、100-0039和100-0040号(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)相关的程序，对H1组胺受体、H2组胺受体、M1毒蕈碱型受体、M2毒蕈碱型受体和M3毒蕈碱型受体使用PEG-6-DPH[mPEG(6)-N-苯海拉明]进行了结合研究。每种受体进行一次实验(N＝1)，且每个数据点一式三份样品(n＝3)。这些实验的细节在下面的表IV示出。
表IV
在PEG-6-DPH上筛选模式受体结合研究的实验细节
受体 物种 放射性标记的配体  浓度(放射性配体)   非特异性的决定子 阳性对照
H1   人类(重组) [3H]吡拉明 1nM   曲普利啶10μM 曲普利啶
H2   豚鼠(纹状体膜) [125I]aminopotentidine 0.1nM   硫替丁3μM 硫替丁
M1   人类(重组) [3H]N-甲基氯东莨菪碱 0.5nM   (-)甲溴东莨菪碱1μM (-)甲溴东莨菪碱
M2   人类(重组) [3H]N-甲基氯东莨菪碱 0.5nM   (-)甲溴东莨菪碱1μM (-)甲溴东莨菪碱
M3   人类(重组) [3H]N-甲基氯东莨菪碱 0.2nM   (-)甲溴东莨菪碱1μM   (-)甲溴东莨菪碱
这些实验的结果总结在下面的表V中：
表V
由筛选实验确定的PEG-6-DPH和DPH对组胺和毒蕈碱型受体的结合亲和力(Ki)
Figure G2008800080850D00481
＊数值由不完整的曲线外推，并因此非常近似。
结果表明，PEG-6-DPH保留超过H2的高H1选择性，因为没有观察到对H2受体的特异性结合。对于毒蕈碱型受体，观察到在M2亚型的特异性结合，M2亚型在亲和力(低μM)上与苯海拉明的亲和力相近。从实验的角度看，认为对H1和M2受体结合的数值是可信的。基于使用太低而不能形成完整结合曲线的配体浓度的实验设计而计算出的关于H2、M1和M3受体的数值是近似值。
实施例12
代谢
PEG-苯海拉明偶联物在人类肝细胞中的代谢稳定性，通过检测在与人类肝细胞共同温育后残留的未代谢的母体化合物的量来确定。这个实验设计说明了并非所有的偶联物将同等地渗透穿过细胞膜的可能性。代谢酶的胞内定位要求药物首先进入细胞。使用整个肝细胞而不是微粒体的代谢稳定性实验包括此参数，并为理解这些化合物的总的代谢稳定性提供最相关的系统。
表VI中所列的半衰期显示，PEG偶联物并不减慢苯海拉明在肝细胞中的代谢速率。根据母体分子(n＝1)最初的损失率，在化合物之间仅注意到相对细微的差别，且mPEG(5)-N-苯海拉明表现出比苯海拉明本身适度地更快的代谢分解。
表VI
苯海拉明和PEG-苯海拉明偶联物的代谢
  半衰期(t1/2)(肝细胞)
  苯海拉明   139.3分钟
  mPEG(5)-N-苯海拉明   44.2分钟
  mPEG(6)-N-苯海拉明   122.9分钟
  mPEG(7)-N-苯海拉明   88.4分钟
已注意到，苯海拉明相对于PEG(6)-N-苯海拉明的肝细胞代谢的物种差异是明显的。在人类和狗模型中，PEG(6)-N-苯海拉明的肝脏内在清除率快于母体苯海拉明的肝脏内在清除率。然而，在大鼠肝细胞培养中，PEG(6)-N-苯海拉明显示出比苯海拉明慢的代谢分解。
实施例13
蛋白结合
在公布的体外研究中，已经显示苯海拉明通过与心脏的hERG通道相互作用产生电生理效应。因此，评估了PEG(6)-N-苯海拉明和PEG(7)-N-苯海拉明偶联物与稳定表达在HEK细胞中的克隆的hERG通道相互作用的能力。使用电生理技术测量了hERG电流的抑制，并且由浓度响应曲线计算PEG-苯海拉明偶联物的IC50值。
苯海拉明和PEG(6)-N-苯海拉明是hERG通道的等效抑制剂，且IC50值分别为3.18μM和3.79μM。PEG(7)-N-苯海拉明的IC50比这个低4倍(12.99μM)。这些数据表明，PEG-苯海拉明偶联物保留了母体苯海拉明分子的hERG通道的抑制特性。
实施例14
体外安全药理学
本研究的目的是确定不断提高的偶联物浓度对自发跳动的大鼠心脏的电生理特性(PQ、QRS、RR、QT、QTc)和机械特性(dLVP/dtmax和dLVP/dtmin)的潜在作用。所有生理参数(PQ、QRS、RR、QT、dLVP/dtmax、dLVP/dtmin)的测定都通过手动使用EMKA ECG自动软件(计算QTc[Fridericia2])由体现窦性节律的心跳间隔来进行。对所有浓度计算所有施用试验样品的动物的平均值。绘制所有动物以及阴性对照动物的平均值(±SEM)的所有参数对浓度曲线图。绘制阳性对照的所有参数对浓度曲线图。利用基线调整，绘制所有参数的值减去媒介物的值的曲线图。
该实验方案以奎尼定的药理学特性所预期的方式响应于阳性对照。类似于奎尼定，PEG(5)-N-苯海拉明表现出比苯海拉明更大的负变传导效应(negative dromotropism)(延长PQ和QRS)。PEG(5)-N-苯海拉明在10-5M比另外两种偶联物产生更大的心跳减速。PEG(5)-N-苯海拉明显得比苯海拉明或奎尼定稍多地延缓心室复极化(QT和QTc)。相比于奎尼定或苯海拉明，PEG(5)-N-苯海拉明在10-5M产生了显著的正性变力作用(inotropism)和松弛效应(lusitropism)。PEG(5)-N-苯海拉明显得对冠状动脉平滑肌具有血管舒张作用，而苯海拉明或奎尼定没有表现出这种作用。进一步比较使用具有与人类更相似的离子通道(例如豚鼠)的实验方案的电生理作用是重要的。
进行豚鼠研究的目的是确定不断提高的偶联物浓度的潜在作用。所有生理参数(PQ、QRS、RR、QT、dLVP/dtmax、dLVP/dtmin)的测定都通过手动使用EMKA ECG自动软件(计算QTc[Fridericia2])由体现窦性节律的心跳间隔来进行。对所有浓度计算所有施用试验样品的动物的平均值。绘制所有动物以及阴性对照动物的平均值的所有参数对浓度曲线图。绘制阳性对照的所有参数对浓度曲线图。利用基线调整，绘制所有参数的值减去媒介物的值的曲线图。此外，实施了不断提高的化合物浓度(10-8、10-7、10-6、10-5和10-4M)和媒介物(Krebs)对豚鼠心脏的电生理参数和机械参数的作用。
大鼠和豚鼠标本(preparation)的反应相似。由已知其药理学的化合物(奎尼定)的响应支持试验标本对变时性(chronotropy)、变传导性(dromotropy)、变力性(inotropy)和舒张(lusitropy)变化的响应的有效性。一般来说，对于所有被试验样品，若心率减慢，则QRS和PQ持续时间只对于10-5M浓度的PEG(5)-N-苯海拉明的情况增加，且QT而非QTc稍微延长；但对于显著延长QT的奎尼定，心肌收缩性和舒张在仅对于10-8M浓度都增加之后都以剂量反应的方式减小。除了PEG(5)-N-苯海拉明能使冠状动脉灌注急剧增加以外，冠状动脉灌注或者略有下降，或者根本不下降。对于所有试验样品，10-4M浓度为致命性的。所有变化都可归因于试验样品对调节钙动力学(对于变时性、变力性、舒张和变传导性)和钾动力学(对于变时性和心室复极化)的特定离子通道的作用。
实施例15
周边疗效
风团(wheal)和红肿(flare)实验
风团和红肿(红斑)实验在大鼠内进行以便测量PEG-苯海拉明的体内活性。皮内注射组胺在皮肤内产生“风团和红肿”反应，这是由于组胺诱导的大量细胞脱粒，这通过用有效的抗组胺剂治疗来阻止。
使用剂量为0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg和0.3mg/kg(每种条件，n＝4)的苯海拉明；剂量为0.03mg/kg、0.1mg/kg和0.3mg/kg(每种条件，n＝4)的mPEG(6)-N-苯海拉明；以及盐水对照(n＝8)。所有值都代表“苯海拉明当量(diphenhydramine equivalent)”浓度，即摩尔当量。
第一个动物被施用1mg/kg的mPEG(6)-N-苯海拉明，并遭受痉挛而死亡。然后把对于所有动物测试的最高剂量减少到0.3mg/kg。剂量方案的细节在下面的表VII提供。
表VII
试验样品的制备
最终剂量(mg/kg) 使用的浓度(mg/mL) 注射体积(μL)(375g大鼠)   每5mL加入的体积 溶液中的浓度
  0.03   0.09   125   0.5   1mg/mL
  0.1   0.3   125   0.5   3mg/mL
  0.3   0.9   125   1.50   3mg/mL
  1   3   125   不予改变   ----
实验细节
组胺由在PBS中的1mg/mL(3.26mM)的组胺二磷酸盐制备，并在将试验样品IV注射到尾静脉2.5分钟之后，通过皮下注射施用。在注射后第5、10、20、30和60分钟，用卡尺测量风团大小，并计算面积(宽度×长度，mm2)。红肿反应用眼睛测量，并根据1(最不显著)-5(最严重)的评分体系进行分等级。
结果：红肿反应
进行红肿反应的目测评分以确定mPEG(6)-N-苯海拉明是否减少组胺的作用。尽管盐水治疗在第10分钟时产生平均最大的红肿，在10-30分钟之间渐渐消失，并在60分钟内彻底消失，但是苯海拉明和mPEG(6)-N-苯海拉明在最高浓度下没有产生可检测的红肿。(注意，在第五分钟时间点上观察到关于mPEG(6)-N-苯海拉明的一些极微的反应，或“噪声”)。随着药物浓度下降，保护作用开始减弱。因此，在mPEG(6)-N-苯海拉明为0.03mg/kg时，红肿反应开始恢复，然而在相同浓度下，苯海拉明仍然有效地抑制该反应。但是，在苯海拉明为0.01mg/kg时，苯海拉明的保护作用开始下降，因为记录到了红肿反应。
这些数据表明，苯海拉明和mPEG(6)-N-苯海拉明两者都抑制风团反应，而且mPEG(6)-N-苯海拉明比苯海拉明稍弱，因为在苯海拉明仍然有效的浓度(0.03mg/kg)下，mPEG(6)-N-苯海拉明失去抗组胺作用。
结果：风团反应
在所有被测的浓度下，生成在约30分钟内达到大小的稳定水平的风团。苯海拉明使得该风团大小明显地剂量依赖性地减小。与对照注射相比，较高剂量的mPEG(6)-N-苯海拉明(0.1mg/kg、0.3mg/kg)减小风团大小，虽然这个效应程度小于相同浓度的苯海拉明的效应程度。mPEG(6)-N-苯海拉明(0.03mg/kg)没有产生可检测的风团大小变化。
当使用“风团反应百分比减少”分析从20分钟时间点开始的剂量反应的影响时，该影响表明，苯海拉明在0.1-0.3mg/kg剂量范围内对风团大小产生了约40％的改变。在这个同样的剂量范围内，mPEG(6)-N-苯海拉明对风团大小产生了约25％的改变，而且曲线形状表明这并不是最大值。
进一步研究
进行进一步研究，其目的是比较当通过静脉注入施用时，苯海拉明、PEG(5)-N-苯海拉明和PEG(7)-N-苯海拉明的抗组胺剂作用。简言之，大鼠通过颈静脉导管接受持续注入60分钟。改变注入速率以在注入的最后20分钟(61到80分钟)期间保持稳定状态。注入周期开始60分钟后，给大鼠进行四(4)次组胺(盐水中200mg/mL；剂量50μL，10μg/大鼠)的皮间(ID)注射。此外，给每只大鼠通过颈静脉导管注射锥虫蓝(盐水中0.4％，0.5mL体积)。组胺注射二十分钟后，使用卡尺(FowlerSylvac Ultra-Cal Mark III)测量风团和红肿(蓝色区域的直径)。将组胺注射处的蓝色区域的直径测量两次，彼此相差90度。按照0、1和2级来评估风团反应的隆起程度。通过心脏穿刺收集的血液样本用于苯海拉明的定量。血样被安置在含有K2EDTA的真空采血管中。大鼠被放血，脑用冰冷的盐水冲洗、用箔片包裹并冷冻。分析脑和血浆样品以确定药物含量。
在所有被测的组胺浓度下，对于苯海拉明，都观察到风团大小剂量依赖性地减小。在10μg和30μg的组胺之间，未检测到风团面积的显著变化。因此，苯海拉明为大鼠的风团和红肿提供了良好的剂量反应，EC50是～400ng/mL的靶血浆浓度(即～1.6mM)(基于第1天和第3天的数据)。PEG(5)-N-苯海拉明显示了疗效，但在相同的浓度也产生毒性。根据在苯海拉明等量的靶血浆浓度下的疗效，PEG(5)-N-苯海拉明比苯海拉明弱≥10倍。PEG(7)-N-苯海拉明在所试验的浓度范围内没有显示任何疗效。
实施例16
口服生物利用度
口服生物利用度是在大鼠内通过比较在IV施用和口服施用如下四种化合物之后的药代动力学曲线(血浆浓度对时间)而测定：DPH(苯海拉明)、PEG-5-DPH[mPEG(5)-N-苯海拉明]、PEG-6-DPH[mPEG(6)-N-苯海拉明]和PEG-7-DPH[mPEG(7)-N-苯海拉明]。对于IV给药，使用1mg/kg的DPH-等价物。对于口服给药，使用5mg/kg的DPH-等价物。
给药溶液的配制
施用摩尔当量剂量的所有四种化合物，使得最终IV剂量(1mg/kg)为1.03μM(0.3mg/mL DPH)，而且最终口服剂量(5mg/kg)是5.14μM(1.5mg/mL DPH)。由于PEG-DPH偶联物在含水缓冲液中有限的溶解度，样品在2％的乙醇中制备。最后剂量范围为：对于静脉内施用为0.30-0.58mg，且对于口服施用为1.50-2.90mg。表VIII和IX中列出了化合物的给药参数。
表VIII
被测化合物的给药参数
化合物 分子量 摩尔比   浓度(mg/mL)   经调整的浓度(mg/mL)
  苯海拉明   291.8   1.00   3.00
  mPEG(5)-N-苯海拉明   475.6   1.63   4.89   2.44
  mPEG(6)-N-苯海拉明   519.7   1.78   5.34   2.67
  mPEG(7)-N-苯海拉明   563.7   1.93   5.80   2.70＊
＊注意：2.70mg/mL被用错了(它应该是2.90mg/mL)
表IX
被测化合物的给药参数
化合物   使用的体积-IV(mL)   IV剂量(mg)(1mg/kg)   IV剂量(mole)   使用的体积-PO(mL)   口服剂量(mg)(5mg/kg)   口服剂量(mole)
  苯海拉明   0.1   0.30   1.03E-06   0.5   1.50   5.14E-06
  mPEG(5)-N-苯海拉明   0.2 0.49   1.03E-06   1.0 2.44   5.14E-06
  mPEG(6)-N-苯海拉明   0.2 0.53   1.03E-06   1.0 2.67   5.14E-06
  mPEG(7)-N-苯海拉明   0.2 0.54   9.58E-07   1.0 2.70   4.79E-06
实验细节
动物通过对股静脉弹丸注射(IV)或者口服强饲(PO)被给药三次，然后在适当的时间点将所有动物从颈动脉采集全血以制备血浆样品。血浆中实验样品的定量由LC-MS/MS进行。
IV施用和口服施用后的血浆浓度-时间曲线显示在图14和15中。相应的药代动力学参数显示下面的表X和XI中。
结果：IV施用
IV施用后大鼠内PEG-N-DPH偶联物的药代动力学参数提供在表X中。IV施用后大鼠内DPH和PEG-N-DPH偶联物的血浆浓度-时间曲线提供在图9中。
表X
IV施用后大鼠内PEG-N-DPH偶联物的药代动力学参数
IV施用后大鼠内药代动力学曲线最显著的特点是PEG-DPH偶联物与母体DPH相比的减少的清除率(CL)和更低的体积分布(Vss)。PEG-DPH偶联物与母体苯海拉明化合物相比，清除率减少了2倍，而分布体积数值降低了4倍，这使得更高的浓度残留在血浆中更长的时间。
结果：口服施用
口服施用后大鼠内PEG-N-DPH偶联物的药代动力学参数提供在表XI中。口服施用后大鼠内DPH和PEG-N-DPH偶联物的血浆浓度-时间曲线提供在图10中。
表XI
口服施用后大鼠内PEG-N-DPH偶联物的药代动力学参数
Figure G2008800080850D00561
大鼠的口服生物利用度对所有四个化合物来说都是非常低的，这表明在啮齿动物中口服给药不实用(虽然观察到与DPH相比PEG-N-DPH偶联物口服生物利用度有所增加)。对于苯海拉明的人类口服生物利用度约为72％，这表明，啮齿动物只能为这些偶联物在人类中的药代动力学行为提供有限模型，而且也许不能可靠地预测。
实施例17
血脑屏障(“BBB”)穿透
在偶联至PEG之后对DPH(苯海拉明)的大脑分布的影响通过比较以下四种化合物的脑∶血浆浓度比率确定：DPH(苯海拉明)、PEG-5-DPH[mPEG(5)-N-苯海拉明]、PEG-6-DPH[mPEG(6)-N-苯海拉明]和PEG-7-DPH[mPEG(7)-N-苯海拉明]。在静脉注射至大鼠尾静脉后，测试四种化合物。在2％的乙醇中(如先前所讨论)以列于下面的表XII的浓度制备PEG-DPH溶液。
表XII
大鼠脑∶血浆实验的给药溶液
化合物   使用的体积-IV(mL)   IV剂量(mg)   IV剂量(mole)   浓度(mg/mL)   经调整的浓度
  苯海拉明   0.3   0.90   3.08E-06   3
  mPEG(5)-N-苯海拉明   0.3   0.73   1.54E-06   4.89   2.44
  mPEG(6)-N-苯海拉明   0.3   0.80   1.54E-06   5.34   2.67
  mPEG(7)-N-苯海拉明   0.3   0.81   1.44E-06   5.80   2.70＊
＊应为2.90
由于苯海拉明摩尔剂量是PEG-DPH偶联物摩尔剂量的两倍，因此没有按照等摩尔量施用这些化合物。以下的计算中已经考虑到这一事实。
在测试给药后确保单个大鼠可以存活后，大鼠(每个条件4只)由尾静脉注射给药，并在1小时后处死。通过心脏穿刺收集血液，并收集脑组织。准备好血浆并将脑组织均匀化，以便使得可以通过LC-MS/MS确定药物的定量。测定每种化合物的浓度，并由此计算脑∶血浆比率。
结果
结果表明，PEG-DPH衍生物的脑∶血浆比率相比苯海拉明明显地减少。苯海拉明显示出21∶1的脑∶血浆比率，这与其他人所报道的有很好的一致性。这表明，在所选定的一小时时间点处死动物时，苯海拉明自尾静脉注射后已经在所有组织中达到了平衡分布。
与苯海拉明相比，所有3种PEG-DPH偶联物都显示出0.2∶1的脑∶血浆比率，即脑中的浓度比血浆中的浓度低5倍。
因此，相对于苯海拉明，PEG-DPH偶联物有比之低105倍的脑穿透率，这意味着有显著程度的CNS排斥。在脑和血浆中苯海拉明和PEG-DPH偶联物的定量提供在表XIII中。
表XIII
尾静脉注射后大鼠内脑和血浆中DPH和PEG-DPH的定量
化合物   脑浓度(ng/g)  倍数改变(相对于DPH)＊   血浆浓度(ng/mL) 脑∶血浆比率
  苯海拉明   5460.7±1137.9  1   258.0±59.1   21比1
  PEG-5-DPH   97.9±32.9  28X   415.3±78.7   0.2比1
  PEG-6-DPH   45.1±4.4  60.5X   237.0±41.1   0.2比1
  PEG-7-DPH   106.5±27.1  26X   544.8±57.9   0.2比1
＊注意：DPH的摩尔剂量是PEG-DPH偶联物的两倍。因此调整相对变化以反映这一点。
药代动力学实验表明，PEG偶联物对苯海拉明的生物分布产生重大改变。最值得注意的是，观察到了其被脑显著排斥，具有比母体分子低100倍的脑穿透。此外，PEG偶联物显示了低3-4倍的体积分布，这表明它们经历较少的组织分布，并且相对较为集中在血浆室内。

Claims (6)

1.一种具有如下结构的化合物：
Figure FSB00000858848000011
其中：
n是3至10的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中n是选自3、4、5、6和7的整数。
3.一种药物组合物，其包括根据权利要求1所述的化合物以及可选地药学上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3的药物组合物，该药物组合物以适合于口服给药的形式存在。
5.权利要求1所述的化合物在制备用于抗组胺的药物中的用途。
6.权利要求1所述的化合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于结合组胺受体。
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