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CN101573140B - 通过光化学内化将siRNA引入细胞中的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将siRNA分子引入细胞胞浆中的方法，所述方法包括：i)将所述细胞与siRNA分子、运载体和光敏剂接触，和ii)用有效激活光敏剂的波长的光辐照细胞，其中所述运载体包括阳离子多胺如非脂质体制剂中的脂多胺、聚乙烯亚胺(PEI)、β-环糊精胺聚合物、含氨基的树状聚体和阳离子肽。还提供了可通过所述方法获得的细胞或细胞种群、含有siRNA分子和运载体分子的组合物，上述内容的试剂盒和治疗用途。

Description

通过光化学内化将siRNA引入细胞中的方法
本发明涉及将短干扰RNA(siRNA)引入细胞中、优选引入细胞胞浆中的方法，并涉及该方法用于改变基因活性(例如体外或体内的基因沉默)的用途，所述方法使用光敏剂和运载体分子并用有效激活光敏剂的波长的光辐照细胞。 
RNA干扰的过程发生于许多生物中，在该过程中，双链的非编码RNA以序列特异的、转录后的方式使基因表达沉默。在自然界中，该现象保护生物的基因组抵抗外源的、侵入的核酸，如转座子、转基因和病毒基因。 
引入双链RNA(dsRNA)到细胞中触发该RNA沉默的过程，并且细胞中在序列上对应于被引入的dsRNA的任何mRNA都被降解。RNA沉默途径涉及从dsRNA到短干扰RNA(siRNA)的转化，所述短干扰RNA将核糖核酸酶引导至同源的mRNA靶标。Dicer酶将dsRNA加工为siRNA，所述siRNA一般长20-25个核苷酸。然后siRNA装配成含核糖核酸内切酶的复合物，所述复合物已知为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，其被导向到互补的RNA分子，在那里切割和破坏靶mRNA。小量的dsRNA可以使大量靶mRNA沉默，这归因于RNA沉默的扩增组件(在Hannon and Rossi(2004)，Nature 431，371-378中综述)。 
已知siRNA分子是该途径的关键组件导致对化学合成的siRNA分子的检验，所述siRNA分子长度约20到22个碱基对，对应于靶RNA或DNA序列。这些分子显示在哺乳动物细胞中发挥作用以破坏靶序列的表达(Elbashir S.M.等，(2001)Nature 411，494-498)。20个核苷酸的siRNA通常足够长以诱导基因特异的沉默，但是足够短以避免宿主应答。靶基因产物表达的减少可以是大量的，少数siRNA分子诱导90％的沉默。 
因此，已经开发了siRNA技术作为序列特异性基因沉默的一种一般性技术。基因沉默具有作为研究工具和治疗策略二者的许多体外和体内的应用。使用siRNA技术时看到的高效能和特异性使得该技术尤其吸 引人。 
在所有的情况下，siRNA分子递送进入细胞是一个主要的挑战，因为对于基因沉默的发生而言，siRNA分子必须以足够有用的浓度进入细胞。沉默应答的强度及其持续时间受被递送至细胞的siRNA量影响，已经显示通过提供足够高浓度的siRNA，即便是相对弱的siRNA分子也可使其靶标沉默。然而，这应当与下述事实相平衡：已知向细胞中施用大量siRNA可导致不期望的作用如“脱靶”作用(即蛋白质表达水平的不想要的改变)或固有免疫途径的激活。 
一般地，通过使用针对核酸的标准转染方案(例如通过使用脂质体、阳离子脂质、阴离子脂质和显微注射)将siRNA施加于细胞。siRNA是双链分子，就这一点而言，该分子的递送和细胞摄取比反义RNA要更加困难，所述反义RNA与要被细胞摄入的血清蛋白质结合。为实现该目的，已经使用了多种不同的策略，并且存在市售试剂盒。如上所述，有效的转染是高度期望的，因为基因沉默的效能至少部分取决于细胞中siRNA的浓度，但是以高浓度施用给细胞也可引起不期望的副作用。 
高水平施用还常需要高浓度的转染试剂，这会对细胞具有表型和非表型的不良作用，包括降低的细胞存活力和多种其它副作用。另外，使用高浓度的试剂时，不能达成特异性递送。 
核酸分子如siRNA的定向递送一般也不是足够可靠的。可使用病毒达到该目的，然而对该途径存在安全性的担忧，并且全身性病毒递送是难以达成的。 
siRNA在细胞的胞浆中起作用，并且分子必须到达胞浆才能发挥作用。考虑到上述事项，期望开发出一种改进的将siRNA递送至细胞胞浆的方法。这种改进方法的期望特性包括i)产生时间和位点特异性递送siRNA分子到其作用位点的能力；ii)避免使用高浓度的转染试剂和/或siRNA和/或iii)细胞系中增强的siRNA沉默。尤其是这种方法应该会减少达成某种水平的基因沉默或改善所述基因沉默所需的siRNA：脂质复合物总数。在这种方法中，可改变siRNA：转染试剂比例同时维持一定量的基因沉默或改善所述基因沉默。提高siRNA：脂质比例是有用的，因为这会让使用高浓度转染试剂时观察到的抑制剂作用最小化。
或者，改进方法的总体目标能够表述为期望：在有效和可控的siRNA至胞浆递送的需要与不良副作用(其由高浓度的转染试剂引起)或非特异性作用(例如在特定的细胞类型中)的减少之间达成平衡。如上所述，siRNA：脂质复合物总数的减少和/或siRNA：脂质比例的提高会有助于该目标。 
为了达成这些目标，本发明人将运载体(转染试剂)的使用与光化学内化(photochemical internalization，PCI)的技术相结合。选择的具体运载体将siRNA分子递送至细胞的细胞内区室，例如胞吞小泡如细胞的内涵体(endosome)和/或溶酶体。可摄取siRNA：脂质复合体的其它细胞内区室包括高尔基体和内质网。 
由于PCI技术发生siRNA分子从细胞内小泡的释放。这依赖于细胞暴露于光敏化合物和随后的辐照，可见siRNA分子的释放仅在辐照细胞后发生，就这一点而言，可以以空间或时间的方式控制向胞浆(在那里其作用被介导)中的该释放。只有下述细胞会将siRNA分子释放进细胞的胞浆中使其作用于该细胞中的mRNA，所述细胞即i)其细胞内小泡中含有siRNA，ii)已经暴露于光化学内化剂(internaliser)和iii)暴露于辐照。 
一般地，需要使用高浓度的转染试剂以优化siRNA到胞浆的递送。本发明人出人意料地观察到，通过使用低浓度的转染试剂(和光化学内化剂)，可以使用转染步骤将siRNA引导至细胞内小泡如内涵体，所述siRNA包含在所述内涵体中直至施加辐照触发其释放。因此，该方法允许siRNA在不需要使用高浓度的转染试剂或siRNA的情况下到达其作用位点。另外，可以通过使用PCI技术控制siRNA分子从细胞内小泡如内涵体释放的时间和位置。 
因此，本发明第一方面提供了将siRNA分子引入细胞胞浆中的方法，所述方法包括将所述细胞与siRNA分子、运载体和光敏剂接触，和用有效激活光敏剂的波长的光辐照细胞。一旦被激活，含有所述光敏剂的所述细胞中的细胞内区室将这些区室中包含的siRNA释放进胞浆中。 
PCI是使用光敏剂与激活该光敏剂的辐照步骤相组合而达成共施用 至细胞的分子释放进入细胞胞浆中的一种技术。该技术允许在辐照后被细胞摄入细胞器(如内涵体)中的分子从这些细胞器释放进入胞浆。 
光化学内化(PCI)的基本方法在WO 96/07432和WO 00/54802中描述，其通过参考并入本文。如上文所示，待内化的分子(根据本发明使用的应当是siRNA分子)在该情况下与运载体分子和光敏剂一起与细胞接触。所述光敏剂、运载体分子和待内化的分子被摄入细胞内与细胞膜结合的亚区室中。细胞暴露于适当波长的光时，光敏剂被激活，这直接或间接地产生了破坏细胞内区室膜的活性物质。这样使得被内化的分子被释放进胞浆中。 
这些方法使用光化学作用作为将以其他方式不可透过膜(或透过性弱)的分子以下述方式引入细胞胞浆中的机制，所述方式即如果适当地调整该方法(例如通过降低辐照时间或光敏剂剂量)避免过量的毒性物质产生，则不引起广泛的细胞破坏或细胞死亡。 
该方法对于将siRNA引入细胞中是尤其有利的，因为其允许使用比常规的siRNA转染更低浓度的运载体或转染试剂和/或siRNA，同时达成有效的基因抑制。另外，可控制用于释放siRNA分子的辐照时间和位置，使得siRNA仅在期望实现所需作用的时间和位置释放。这样，细胞对siRNA和运载体的暴露被最小化，不期望的副作用被最小化。这与将siRNA引入细胞中的标准技术不同，在所述标准技术中不可能控制siRNA释放的时间和位置，并且需要高浓度的转染试剂。通过相比于推荐使用的量而降低运载体用量(改变siRNA：运载体比例)或通过降低应用于细胞的siRNA：运载体复合物总量，还有可能使PCI辐照之前从细胞内区室的siRNA渗漏最小化。 
还显示通过使用本文定义的运载体和PCI递送siRNA，可以达成强的基因沉默作用同时还不造成细胞毒性。例如，使用1μg/ml的PEI(Mw25000)与100nM siRNA和至多40秒的光剂量，未观察到细胞毒性作用(见图11B)。在这些条件下，观察到强基因沉默(见图10)。 
RNA是核糖核苷酸的聚合物，各含有与磷酸基和含氮碱基(典型地为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)结合的核糖。如DNA的情况一样，RNA能够形成互补的氢键，且RNA可以是双链的(dsRNA)、单链 的(ssRNA)或带有单链突出的双链。“小干扰RNA”(siRNA)是指约10到约30个核苷酸长度的双链RNA分子，其通过与mRNA分子结合特异地干扰蛋白质表达。优选地，siRNA分子为12-28个核苷酸长，更优选地为15-25个核苷酸长，进一步更优选地为19-23个核苷酸长，最优选地为21-23个核苷酸长。因此，优选的siRNA分子长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。 
一条链的长度被指定为siRNA分子的长度。例如，被描述为21个核糖核苷酸长(21mer)的siRNA可包含两条反向的RNA链，其由19个连续的碱基配对退火在一起。每条链上的两个剩余核糖核苷酸可以形成突出。当siRNA含有两条不同长度的链时，由更长的链确定siRNA的长度。例如，含有21个核苷酸长的第一链和20个核苷酸长的第二链的dsRNA构成21-mer。 
包含突出的siRNA分子是期望的。突出可以处于链的5′或3′端。优选地，其位于RNA链的3′端。突出的长度可以变化，但是优选地为约1到约5个核苷酸，更优选地为约2个核苷酸长。优选地，本发明的siRNA应包含约2到4个核苷酸的3′突出。更优选地，3′突出为2个核糖核苷酸长。进一步更优选地，包含3′突出的这2个核糖核苷酸带有尿嘧啶(U)碱基。 
siRNA被设计为与靶核糖核苷酸序列相互作用，也就是说它们与靶序列互补从而与靶序列结合，即siRNA的一条链与靶序列的一个区域互补。 
还产生了具有经修饰的主链从而提高其半衰期的siRNA分子(例如在Chiu等，(2003)，RNA.9(9)，1034-48和Czauderna等，(2003)，NucleicAcids Research 31，2705-2716中描述)。因此术语“siRNA”还包括这样的经修饰的分子。因此，提及siRNA时还包括显示相同功能(即与靶mRNA序列相互作用)的siRNA的衍生物或变体。优选的变体包括其中使用了经修饰的主链(如上文)或使用了一个或多个非天然存在的碱基的变体。 
可使用该方法向细胞中引入多于一种类型的siRNA分子。也就是 说，可以向细胞中同时引入具有不同序列的siRNA分子。如果要引入多个siRNA分子，可以通过将多于一种siRNA分子与运载体同时结合来达成。或者，每种类型的siRNA分子可分开地与运载体结合。 
存在制备siRNA的若干种方法，例如化学合成、体外转录、siRNA表达载体和PCR表达盒。这样的技术是本领域公知的。参阅例如Pon等，(2005)Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.24(5-7)：777-81、Du等，(2006)，Biochem.Biophys.Res.Commun.345(1)：99-105和Katoh等，(2003)，Nucleic Acids Res Suppl.(3)：249-50。 
类似地，用于设计siRNA分子从而达成预期结果的方法已经被充分记载。首先必须选择siRNA靶位点。这可以通过使用多种技术(参阅例如Jagla等，(2005)，RNA.11(6)：864-72and Takasaki等，(2006)，Comput.Biol.Chem.30(3)：169-78)实施。 
本发明的方法可实现siRNA分子进入胞浆中的转位。然而，应当明白，摄入与细胞接触的每一个分子是无法实现的。然而，可以达成相对于其中不使用PCI或运载体的背景水平而言显著和改进的摄入。 
优选地，本发明的方法允许siRNA分子以足够的水平被摄入，使得它们的作用在这些细胞的表达产物中是明显的。为了在与细胞孵育例如24、48、72或96小时(例如24到48小时)后达到该目标，例如为了达到靶基因表达降低至少10％，例如降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如在靶基因编码的一个或多个蛋白质的表达中)，可以调节要与细胞接触的siRNA的适当浓度。类似地，可以调节运载体类型和/或浓度、光敏剂类型和/或浓度以及辐照时间以达成上文所示的降低。 
这可以通过使用本领域已知的标准技术如Western印迹测定细胞中蛋白质的水平来测量。蛋白质减少的水平取决于蛋白质的半衰期，即已有的蛋白质将根据其半衰期被去除。因此，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的表达降低是相对于无siRNA时相同时间点的表达而言达成的，以便将半衰期考虑在内。 
或者这可以根据siRNA分子对存在于细胞中的mRNA量的影响来 测量，例如可以执行该方法以达成与细胞孵育例如24、48、72或96小时(例如24到48小时)后相对于无siRNA时相同时间点靶序列的mRNA水平而言mRNA水平降低至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。这也可以使用本领域已知的标准技术如杂交或印迹技术和RT-PCR测量。 
因为本发明需要使用比转染siRNA分子的标准方法显著更少的运载体或转染剂(和/或更少的siRNA，取决于是否要减少复合物的总数，或是否要改变siRNA：运载体或转染剂的比例，或二者兼有)，所以也可能在达到蛋白质表达或mRNA水平降低一定量所需的运载体或转染剂的量方面表现出使用本发明方法之转染的改进。例如，本发明的方法优选地使用下述运载体浓度和/或siRNA浓度使得靶蛋白质表达或mRNA水平的某种降低(如上所述例如至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，所述浓度即比不使用PCI时靶蛋白质表达或mRNA水平达到相同的降低水平所需的运载体量低至少10％、20％、30％、40％、50％或60％。 
也可以对存在和不存在PCI时某siRNA和运载体浓度下观察到的蛋白质表达或mRNA水平的降低水平之间进行比较。例如，与不存在PCI技术的辐照步骤时进行该方法所达成的蛋白质表达或mRNA水平相比，本发明的方法优选地使靶蛋白质表达或mRNA水平如上所述降低至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。 
本文使用术语“细胞”包括所有的真核细胞(包括昆虫细胞和真菌细胞)。因此，代表性的“细胞”包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和原生动物。然而，优选细胞为哺乳动物，例如来自猫、犬、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的细胞，但是最优选来自人的细胞。 
本文使用“接触”是指在适合内化进入细胞的条件下(例如优选地于37℃下在适当的营养培养基中，例如从25-39℃)使得细胞和光敏剂和/或siRNA和运载体彼此物理接触。 
光敏剂是一种药剂，其在合适的波长和强度的辐照下被激活，产生 活性物质。该药剂可便利地是定位在细胞内区室中、尤其是内涵体或溶酶体中的药剂。这样的光敏剂的范围是本领域已知的并在包括WO96/07432的文献中描述，该文献通过参考并入本文。在该方面可以提到的是二-和四磺化酞菁铝(例如AlPcS2a)、磺化四苯基卟吩(TPPSn)、尼罗蓝、二氢卟酚e6衍生物、尿卟啉I、叶赤素、血卟啉(hematoporphyrin)和亚甲基蓝，其显示位于培养中细胞的内涵体和溶酶体中。这在大部分情况下归因于光敏剂的胞吞摄入。因此，光敏剂优选地是被摄入细胞内部区室例如溶酶体和/或内涵体中的药剂。用于本发明的其他合适的光敏剂在WO03/020309中描述，该文献也通过参考并入本文，所述其他合适的光敏剂即磺化的间-四苯基二氢卟吩(meso-tetraphenyl chlorin)，优选地为TPCS2a。 
然而，也可以使用定位到其他细胞内区室(例如内质网或高尔基体)的其他光敏剂。还可以想象下述机制可能运行，其中光化学处理的作用位于细胞的其他组分，即除了膜限制的组分(即膜封闭的区室)之外的组分上。因此，例如一种可能性是光化学处理破坏对胞内运输或泡囊融合而言重要的分子。这样的分子可能不一定位于膜限制的区室中，但是这些分子的光化学损伤仍然可以例如通过下述机制导致运载体：siRNA复合物的光化学内化，所述机制即其中对这些分子的光化学作用导致要被内化的分子(即siRNA分子)进入降解性泡囊(如溶酶体)的转运降低，从而该要被内化的分子能够在被降解之前逃离至胞浆。 
不一定位于膜限制区室中的分子实例包括微管转运体系的若干分子，如动力蛋白和动力蛋白激活蛋白的组分；和例如rab5、rab7、N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)、可溶性NSF附着蛋白(SNAP)等等。 
可以提到的合适的光敏剂种类因而包括卟啉类、酞菁类、红紫素类、二氢卟酚类(尤其是下文描述的卟啉类的二氢卟酚衍生物)、苯并卟啉、抗溶酶体(lysomotropic)弱碱、萘酞菁、阳离子染料和四环素或其衍生物(Berg等，(1997)，J.Photochemistry and Photobiology，65，403-409)。其它合适的光敏剂包括得克萨卟啉类(Texaphyrins)、脱镁叶绿甲酯酸(pheophorbide)、porphycenes、菌绿素(bacteriochlorin)、ketochlorins、血卟啉衍生物，及其衍生物，由5-氨基乙酰丙酸及其衍生物诱导的内源光敏剂，光敏剂之间的二聚体或其他缀合物。
优选的光敏剂包括TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a和其他两亲性光敏剂。其他合适的光敏剂包括化合物5-氨基乙酰丙酸或5-氨基乙酰丙酸酯，或其可药用盐。 
“辐照”细胞以激活光敏剂是指如下文所述直接或间接地施用光。因此可以用光源例如直接地(例如体外对单个细胞)或间接地(例如在体内当细胞处于皮肤表面下时，或当细胞是细胞层的形式时，此时并非所有细胞均被直接辐照，即没有其它细胞屏蔽)地辐照细胞。 
在该方法中，要被引入细胞中的siRNA分子与一种或多种运载体分子或转染剂连接或相关联或缀合，所述一种或多种运载体分子或转染剂发挥作用以促进或增加光敏剂或siRNA分子被摄入进细胞。该连接、相关联或缀合可以在将siRNA分子及其运载体与细胞接触之前进行，或在所述接触时通过使这些分子相接触进行。 
术语运载体和转染剂在本文中可交换使用。 
运载体分子可以与siRNA分子或与siRNA分子和光敏剂二者连接、结合或缀合。因此，例如siRNA分子可以通过电荷：电荷相互作用与运载体连接。如上所述，可同时使用多于一种运载体，并且该运载体可以与多于一种siRNA分子，或多于一种类型的siRNA分子连接、结合或缀合。 
优选地，运载体(优选地在非脂质体制剂中)包含下述化合物，所述化合物含有两个或更多个胺基(即为多胺)，是阳离子的并优选地在不同pH值下可质子化(即在合适的反应条件下可以被质子化而带有一个或多个额外的氢原子)。不同的pH值应用于针对单个分子中和/或不同分子中可质子化原子的不同值。 
在本文中使用术语“可质子化的”表示能够接受氢原子的基团，即可质子化的基团是氢原子接受基团。显然基团接受氢的能力不仅取决于基团的性质，而且取决于该基团所暴露于的pH。优选地，所述可质子化的基团含有氮原子且该原子是接受氢原子的原子。 
本文中“阳离子”表示分子的总电荷或净电荷为+1或更高。这优选地在生理pH(即pH 7.2)下测量。分子可具有更高的电荷，例如+2或 ]  更高、+3或更高、+4或更高、+5或更高、+6或更高、+7或更高、+8或更高、+9或更高、+10或更高、+11或更高、+12或更高、+13或更高、+14或更高、+15或更高、+20或更高、+25或更高、+50或更高、+75或更高、+100或更高、+150或更高、+200或更高、+250或更高、+300或更高、+400或更高、+500或更高、+750或更高或+1000或更高。 
根据本发明的方法使用的阳离子多胺在下文中定义并包括： 
(a)非脂质体制剂中的脂多胺(lipopolyamine)， 
(b)聚乙烯亚胺(PEI)，其通过GPC测定Mn值为500-20000， 
(c)下式的β-环糊精胺聚合物 
Figure DEST_PATH_G200780024620701D00011
其中X为1到100并包括此二者的整数，n为从4到10并包括此二者的整数， 
(d)含胺基的树状聚体，和 
(e)阳离子肽。 
优选地，本文所述的多胺含有伯胺或仲胺基团或其混合(例如至少两个伯胺基团)。优选地，多胺区具有至少2、3、4、5或6个氮原子，和在生理pH下至少+1、+2、+3、+4或+5(或至少+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+20、+25、+50、+75、+100、+150、+200、+250、+300、+400、+500、+750或+1000)的电荷，例如一些或所有胺基是带电的。优选地，至少一个(例如至少2、3或4个)含氮基团如NH在生理学pH下是不带电的。多胺(例如脂多胺)最后一个胺质子化的pKa优选地约为5.5，即通过降低pH或添加酸性化合物，最后一个要被质子化的胺在小于或等于5.5的pH下被质子化。 
在一个实施方案中，运载体包括非脂质体制剂中的脂多胺。脂多胺表示包含至少一个亲水多胺区(即其含有两个或多个胺基)和一个亲脂区的两性分子。亲脂区可含有一个或多个亲脂链。 
脂多胺的多胺区优选地具有式(I) 
Figure G2007800246207D00111
其中m为大于或等于2的整数，n为大于或等于1的整数，m可能在两个胺之间包含的不同碳基团之间变化，即每个(CH)m-NH基团可具有不同的m值，且m在所述式中出现时可以是相同或不同的。在各位置上R1是氢或者与脂多胺的脂部分的连接基团，或如下文所述是脂部分自身，并在各碳原子上可以是相同或不同的。如下文所述，R2是氢或者与脂多胺的脂部分的连接基团或是脂部分自身。优选地，m在2和6之间并包括此二者，更优选地为3或4，n在1和5之间并包括此二者，更优选地为3。 
优选地R1和R2中仅其一是连接子、与多胺的脂部分连接的连接子或多胺的脂部分。优选地仅R1基团是连接子、与多胺的脂部分连接的连接子或多胺的脂部分。R2优选地为H。 
当R1或R2是脂部分自身或是与多胺的脂部分连接的连接子时，式(I)为脂多胺。因此，只有当R1或R2不是脂部分或与脂部分连接的连接基团时，式(I)为多胺区。 
进一步更优选地，多胺区由下式表示： 
Figure G2007800246207D00112
其中R2和R1a到R1j如上文定义的R1，优选地R1a是连接子且剩余的R1基团和R2为氢。 
连接基团由在正常条件下稳定的键组成。
优选地R1或R2表示氢原子或通式II的基团： 
Figure G2007800246207D00121
其中R3和R4(其可以是相同的或不同的)各代表饱和的脂肪基CpH2p+2或不饱和的脂肪基CpH2p或CpH2p-2，p为12和22之间并包括此二者的整数，R5表示氢原子或含有1到4个碳原子的烷基，所述烷基任选地被苯基取代。 
或者，R1或R2可各自为通式III的基团： 
Figure G2007800246207D00122
其中X表示亚甲基(-CH2-)或羰基(-CO-)，且R6和R7(其可以相同或不同)各代表饱和的脂肪基Cp′H2p′+2或不饱和的脂肪基Cp′H2p′或Cp′H2p′-2，p′为11和21之间并包括此二者的整数。 
不考虑m和n的值，符号R1和R2中仅其一可表示通式(II)或(III)的基团，当n在2和5之间时，不同的 
Figure G2007800246207D00123
片段中的m值可以是相同或不同的。 
在一个优选的式(I)的实施方案中，n等于3， 
Figure G2007800246207D00124
片段中的m值相同或不同并代表3或4， 或者R1或R2表示：通式(II)的基团，其中R3和R4各表示含有12到22个碳原子的烷基且R5表示氢原子；或者R1或R2表示通式(III)的基团，其中R6-X-和R7-X-各表示含有12到22个碳原子的烷酰基。 
特别优选的是5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(5-carboxyspermylglycinedioctadecylamide，DOGS)和双棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine5-carboxyspermylamide，DPPES)。 
上述脂多胺的合成描述于US 5,476,962中。 
根据本发明使用的脂多胺的其他实例包括2，3-二油酰-氧-N[2-精胺羧基-酰胺]乙基-N，N-二甲基-1-丙胺鎓三氟乙酸盐(2，3-dioleyl-oxy-N[2-:Sperminecarboxyyl-amido]ethyl-N，N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetate，DOS PA)、1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基精胺)(1，3-dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermine)，DOSPER)和RPR-120535(Ahmed et al(2005)Pharmaceutical Research 22(6)，972-980)。图7中显示优选的脂多胺的结构。 
在DOSPA中，连接基团为 
在DOSPER中，连接基团为 
Figure G2007800246207D00132
并且上述结构因此表示其他合适的连接基团的实例。 
亲脂区可以如上文针对R3、R4、R5或R6所述，或任何饱和的或不 饱和的烃链、胆固醇或其他甾族化合物、能够形成片状或六角相的天然脂质或合成脂质。烃链的长度可以是10到30个碳，例如长度为12-28、14-26、16-24、18-22个碳。 
运载体优选地为JetSITM或JetSI-ENDOTM，二者均可得自Polyplustransfection。或者运载体可以是
Figure G2007800246207D00141
其可得自Promega。 
脂质体制剂表示阳离子带电的两亲性化合物(即脂多胺)与中性辅助脂质如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)组合，从而形成脂质体。同样，脂多胺的非脂质体制剂是含有脂多胺的制剂，其中脂多胺不以脂质体的形式存在。也就是说，这样的制剂除了脂多胺以外，不含有任何中性辅助脂质。辅助脂质的实例为中性磷脂、胆固醇、甘油磷酸乙醇胺和二酰基甘油。优选地，脂多胺配方只含有本文所述的脂多胺。 
已知一般将转染剂与辅助脂质如DOPE组合会提高转染效率，因此在本发明的方法中使用时，出人意料地发现通过从配方中省略这些化合物能够达到改进的和更有选择性的抑制程度。 
运载体优选地不是lipofectamine2000、lipofectin、jet PEI，或含有这些可商业获得的转染试剂组合物的运载体。lipofectamine 2000的组成是聚阳离子脂质2，3-双油酰氧基-N[2-(精胺羧基-酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙胺鎓三氟乙酸盐(DOSPA)(Chemical Abstracts Registry名称：N-[2-(2，5-双[(3-氨丙基)氨基]-1-氧戊基-氨基)乙基]-N，N-二甲基-2，3-双(9-十八烯氧)-1-丙胺鎓三氟乙酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的3:1(w/w)脂质体制剂。 
lipofectin的组成是DOTMA(1，2-二油酰氧基丙基-3-三甲基溴化铵)和DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)的1:1混合物。 
运载体还优选地不是siPORT或含有该可商业获得的转染试剂组成的运载体。 
在一个备选的实施方案中，运载体是在生理pH下为阳离子的(并优选地可质子化的)多胺化合物，例如聚乙烯亚胺(PEI)。PEI存在于许多不同的结构变体中，然而对通过GPC(凝胶渗透层析法)测定具有600或更多Mn值(数均分子量)的变体最感兴趣。例如，PEI可具有 500-700、500-750、750-1000、100-1250、1000-1250、1250-1500、1000-20000、1100-15000、1200-12500、1250-10000、1500-7500、1750-5000、2000-4000或2500-3500的Mn值。 
数均分子量是测定聚合物分子量的一种方式。聚合物分子，甚至是相同类型的聚合物分子也显示不同的大小(对于线性聚合物而言为链长度)。因此平均分子量会取决于求均值的方法。数均分子量是个体聚合物的普遍的、中间的分子量均值。其通过测量n个聚合物分子的分子量，对其求和并除以n测定。 
M ‾ n = Σ i N i M i Σ i N i
可以使用线性形式的PEI或非线性的、例如有支链的PEI(其可具有例如本文所述的低分子量Mw)。 
有支链的PEI表示含有叔胺基团以及伯胺和仲胺基团的PEI。叔胺基团相对于伯胺基团和/或仲胺基团而言的数目指示聚合物中分支的量或程度。一般而言，有支链的PEI以0.5-1.5∶1.5-2.5∶0.5-1.5例如1∶2∶1(即仲胺和叔胺基团的比例为2∶1)的比例含有伯胺、仲胺和叔胺基团，但是具有分支结构从而含有相对更多或更少叔胺基团的支链PEI也是存在的，并可用于本发明中。备选比例的实例有1∶1到3∶1(仲胺基团比叔胺基团)，例如1.2∶1到2.8∶1、1.4∶1到2.6∶1、1.6∶1到2.4∶1、1.8∶1到2.2∶1。 
PEI的分子量优选地低于30kDa或25kDa，例如低于15，10，5或2kDa。 
合适的PEI的一个实例可得自Sigma(408719聚乙烯亚胺)(LS测定平均Mw～800Da，GPC测定平均Mn～600，低分子量的，不含水)。其他可商业获得的基于PEI的试剂包括Poly Sciences，Inc PEI(有支链的，Mw 10,000)、US Biological Exgen 500、Polyplus转染jetPEITM、Sigma ESCORTTMV转染试剂和Mirus TransiT- 
Figure DEST_PATH_G200780024620701D00022
如上所述，在一个优选的实施方案中，可使用一种或多种β-环糊精胺聚合物作为运载体分子，即多胺化合物是β-环糊精胺聚合物。合适的 β-环糊精胺聚合物和合成这样的分子的方法描述于Hwang et al，(2001)Bioconjugate Chem，12，280-90中。 
下文展示合适的β-环糊精胺聚合物和显示其从合适的单体合成的原理图： 
Figure G2007800246207D00161
如上文所示，n可以是从4到10并包括此二者、优选5到8并包括此二者或6到7并包括此二者的整数。最优选其为4、6或8。X可以是任何整数。X优选地为1到100、10到50、15到25、1到20，例如2到15、3到12、4到10、5到8或6到7并包括此二者。X最优选地为4或5。 
在另一优选的实施方案中，可以使用一种或多种含有胺基的树状聚体(例如聚酰胺胺(PAMAM)树状聚体)可用作运载体分子，即多胺化合物是含胺基的树状聚体。树状聚体代表一类被称作“致密星形(densestar)”聚合物的大分子结构。 
与经典的聚合物不同，树状聚体具有高度的分子均一性、狭窄的分子量分布、特定的大小和形状特征，和高度功能化的末端表面。因此，树状聚体是人工制造或合成的分子，其由支链单元或单体构建形成单分散、树状或世代结构(generational structure)。合成单分散聚合物需要高水平的合成控制，其通过逐步的反应达成，一次一个单层(或“世代”)地构建树状聚体。每个树状聚体由多功能核心分子组成，该核心分子具有与各功能位点连接的树状楔(dendritic wedge)。核心分子被称作“世代0”。沿着所有分支的各连续重复单元形成下一世代，“世代1”、“世代2”等等，直到终止世代。 
因此，制造过程是从中心引发核心开始的一系列重复步骤。各随后的生长步骤表示具有更大分子直径、两倍反应性表面位点数量的新聚合物“世代”，并大约倍增了前一世代的分子量。例如，PAMAM树状聚体的世代描述于Esfand等，(2001)Drug Discovery Today，6(8)，427-36以及Kukowska-Latallo等，(1996)，PNAS，93(10)，4897-902中。 
合适的树状聚体包括所有含胺基的树状聚体，例如具有三乙醇胺、NH3或乙二胺核心的树状聚体，含胺的单体连接在所述核心上。尤其优选的是PAMAM树状聚体。优选地，树状聚体由多胺单体组成，例如具有通式H2N-(CH2)m-NH-(CO)n-(CH2)o，其中m和o为从1到10的整数，优选地为1或2，且n为0或1。 
PAMAM树状聚体如在图14中显示。各“世代”表示向前一世代的每个末端氨基上各加成两个新的H2N-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-基团；也如该图中所示。 
下表显示按照世代计算的胺表面功能性PAMAM树状聚体的特性。 
Figure G2007800246207D00181
优选地，PAMAM树状聚体分子量为1000-235000或3000-117000，例如6000-60000或14000-30000Da。 
树状聚体也可以针对其世代进行限定，这样，树状聚体(例如PAMAM树状聚体)优选地有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个世代，尤其是有2-6个世代。 
如上所述，在另一备选的实施方案中，可以使用一种或多种阳离子多肽作为运载体分子，即多胺化合物为阳离子多肽。多种阳离子肽是本领域已知的。 
本文中定义的“肽”包括含有任何数量氨基酸(即一个或多个氨基酸)的任何分子。然而优选肽为连续的氨基酸的多聚体。
可以通过任何便利的手段制备肽，例如直接化学合成或通过重组手段由通过在细胞中表达合适序列的核酸分子进行。 
在本文中涉及肽时“阳离子的”表示在生理pH即pH7.2下肽的总电荷或净电荷为+1或更高。若氨基酸在肽中存在时在生理pH下其主要类型带正电荷，则该氨基酸被认为是+1。肽中各个这样的氨基酸贡献了更多的正电荷以计算肽的最终电荷。肽可含有一个或多个带负电的氨基酸残基以及中性残基，只要肽的静电荷(通过将各个氨基酸带来的电荷加在一起计算)为正即可。 
因此，肽的电荷取决于其氨基酸组成。某些氨基酸在正常生理pH下是带电的。带正电的氨基酸为赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)，其按上述标准被认为是+1的。天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)在大部分生理pH下带有一个负电荷，并按照上述标准被认为是-1的。其他天然存在的氨基酸被认为不带电。可以存在任何数量的带正电氨基酸或带负电氨基酸，只要肽的总电荷为+1或更多即可。 
本发明使用的肽中使用的氨基酸不一定要是天然存在的氨基酸。肽中的一个或多个氨基酸可以被非天然存在的(例如衍生化的)氨基酸取代。这样的氨基酸应类似地根据它们对肽电荷的贡献来评价。因此，与使用天然存在的氨基酸一样，如果在生理pH下占优势种类是带正电的，无论该电荷是来自衍生的部分(例如引入的胺基)还是来自也存在于天然氨基酸中的部分，只要总电荷为+1或更多即可。 
肽的电荷为>1，优选地从+1到+1000、从+1到+500、从+1到250或从+1到+100，例如+2到+80，如+3到+60或+4到+50、+5到+30、+6到+20，例如+10或+15。 
优选地，阳离子肽包括L或D赖氨酸、L或D精氨酸、L或D组氨酸和/或鸟氨酸残基。进一步更优选地，肽富含一种或多种这些残基，例如包含10-100％、20-80％、30-70％、40-60％或50％带正电荷的残基。这样的肽的实例包括多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨酸、多聚-组氨酸、组氨酰化的多聚-赖氨酸和多聚-鸟氨酸，或者L或D赖氨酸、L或D精氨酸、L或D组氨酸和/或鸟氨酸残基与其他氨基酸的共聚物，所述其他氨基酸例如下述一种或多种：丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、 谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。 
所述阳离子多肽可以针对其分子量进行限定。在这一点上，它们的重量优选地为至少1000Da、1500Da、2000Da、2500Da、5000Da、7500Da、10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、40000Da、50000Da、60000Da、70000Da、80000Da、90000Da或100000Da。 
或者阳离子多肽可以针对其长度进行限定。优选地阳离子多肽长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500个氨基酸。 
一种高度优选的阳离子肽为多聚精氨酸，尤其是Mw至少为15000kDa的多聚精氨酸。 
尽管不希望受任何理论束缚，但推测运载体与siRNA分子的连接是基于带正电的运载体与带负电的siRNA分子之间的相互作用导致siRNA-运载体复合物的形成。siRNA-运载体复合物与细胞表面的阴离子蛋白聚糖相互作用并通过胞吞作用被摄入。 
运载体与siRNA分子或者siRNA和光敏剂二者的相关联、结合或缀合一般通过将两种组分在适当的条件和浓度下简单地混合并允许成分相互作用来达成。因此在一个优选的实施方案中，该方法包括将所述siRNA与所述运载体接触的额外步骤。本领域技术人员可以通过进行常规试验容易地确定该接触步骤进行的条件和运载体与siRNA分子各自的适当浓度。合适的条件的例子在实施例中陈述。例如，可以通过例如涡旋混合将siRNA分子和运载体分子混合在一起并允许其例如在室温下静置。然后在与细胞接触之前可以将siRNA分子和运载体分子放置约10-20、10-30或20-40分钟。 
优选地，使用10nM-200nM，例如15-150nM、20-100nM、20-100nM、30-90nM、40-80nM或50-70nM siRNA例如在标准6孔平板的孔中进行转染，尽管可以测试不同的浓度。测量在该方法中要使用的siRNA的最优浓度是常规技术。 
使用标准的细胞培养技术制备要施用siRNA和运载体的细胞。如 果细胞是贴壁细胞，则它们优选地有50-70％或25-50％汇合度。 
可以基于标准方案以多种比例混合运载体和siRNA分子。例如，如实施例1到6中所述，可以将在水性溶液中制成的8.4μl 2mM运载体在2ml培养基中与2.8μg siRNA混合，应用于6孔平板中。类似地，在水性溶液中制成的4.2μl 2mM运载体可以在1ml培养基中与1.4μgsiRNA混合，应用于6孔平板。运载体不一定总是2mM，合适的范围包括0.5-5mM、1-3mM、1.5-2.5mM(例如在水性溶液中制成的)。对于每ng siRNA而言，含光敏剂的溶液中总计可以使用相当于约6(例如1-10、2-8)纳摩尔用量的运载体。 
对于PEI而言，优选的浓度为1μg/ml和10μg/ml(例如0.5-20或1-15μg/ml)与100nM siRNA，例如对于应用于6孔平板而言，在1ml培养基中。如实施例9中所示，这已经显示对于具有1200-25000道尔顿(例如1300-2000道尔顿)分子量的PEI而言尤其有效。可以改变使用的PEI的浓度以达到使用实施例9中所述条件所达到的电荷比例和/或N/P比例。 
对于β-环糊精胺聚合物而言，合适的浓度为100μg/ml(例如10-1000、20-800、30-600、40-400、50-200μg/ml)与50nM siRNA，例如对于应用于6孔平板而言在1ml培养基中。这基于的是实施例11中所述聚合物的使用。n和X的值会影响分子的电荷，在这一点上，不同的浓度可能是适当的。可以改变使用的β-环糊精胺聚合物的浓度以达到使用实施例11中所述条件所达到的电荷比例和/或N/P比例。 
对于含胺基的树状聚体而言，合适的浓度为100μg/ml(例如10-1000、20-800、30-600、40-400、50-200μg/ml)与100nM siRNA，例如对于应用于6孔平板而言在1ml培养基中。可以改变使用的含胺基的树状聚体的浓度以达到使用实施例12中所述条件达到的电荷比例和/或N/P比例。 
对于阳离子肽而言，合适的浓度为0.35μg/ml或0.7μg/ml(例如0.1-20、0.2-15、0.3-10μg/ml)与100nM siRNA，例如对于应用于6孔平板而言在1ml培养基中。如实施例13中所述，这些浓度成功地与分子量15000-70000和>70000的多聚精氨酸运载体一起使用。肽的分子量 和氨基酸组成会影响分子的电荷，这样不同的浓度可能是适当的。可以改变使用的阳离子肽的浓度以达到使用实施例13中所述条件达到的电荷比例和/或N/P比例。 
两种组分的比例可以电荷的比例表示，并且这也需要被考虑在内。优选地，运载体和siRNA之间的电荷比例至少为1+/-(即每个负电荷有1个正电荷)、5+/-、10+/、20+/-、30+/-、40+/-、50+/-、60+/-、70+/-、80+/-、90+/-、100+/-、200+/-、300+/-、400+/-或500+/-。 
电荷比例取决于各组分(即siRNA和运载体)的电荷和存在的各组分的用量。 
或者，两种组分的比例可以表述为N/P比例，即氮残基与寡核苷酸磷酸酯的比例。因为并非运载体的每个氮原子总是阳离子，所以N/P比例与电荷比例并不相同。N/P比例取决于各化合物的化学组成和存在的各化合物的用量。N/P比例的合适值包括1-500，例如2-450、3-400、4-350、5-300、6-250、7-200、8-150、9-100、10-80、15-60、20-50、30-40、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5。 
优选地，运载体是这样的：在选择使用的浓度下，没有PCI辐照步骤时没有来自细胞内区室的释放，并且在PCI辐照步骤后观察到来自细胞内区室的释放。合适的siRNA和运载体的浓度和比例在上文提到。 
运载体一般就转染的目的配制在水性溶液中(例如水中)。然后可以将储存溶液(例如乙醇中20mM)稀释(例如在水中)至适当的使用浓度。US5,476,962描述了脂多胺的配制。 
如上所述，siRNA运载体也可以被用作光敏剂的运载体。或者，光敏剂也可以在无运载体时使用，或与未在本发明中用于siRNA的备选运载体一起使用。这样的备选运载体在本文中指光敏剂运载体，并包括多聚阳离子如多聚赖氨酸(多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸)、聚乙烯亚胺或树状聚体(例如阳离子树状聚体如SuperFect7)；阳离子脂质如DOTAP或Lipofectin和肽。 
为了将siRNA分子和/或光敏剂靶向到特定的细胞(例如癌细胞)或组织，可以将siRNA分子和/或光敏剂和/或运载体与特定的靶向分子 连接或缀合，所述靶向分子会促进siRNA分子进入期望的细胞或组织中的特定细胞摄入。 
可以使用许多不同的靶向分子，例如如Curiel(1999)，Ann.NewYork Acad.Sci.886，158-171；Bilbao等，(1998)，Gene Therapy of Cancer(Walden等.，eds.，Plenum Press，New York)；Peng and Russell(1999)，Curr.Opin.Biotechnol.10，454-457；Wickham(2000)，Gene Ther.7,110-114中所述。 
靶向分子可以与siRNA分子、运载体或光敏剂或这些部分中的两种(例如siRNA和运载体，或siRNA和光敏剂，或运载体和光敏剂)或所有三种连接、结合或缀合，并可以使用相同或不同的靶向分子。如上所述，可同时使用多于一种靶向分子。 
本发明的方法可以如下文所述实施。在本发明的方法中，siRNA分子与其运载体和光敏剂化合物(任选地与相同的运载体或与光敏剂运载体)一起被同时或先后施用给细胞，藉此光敏化合物、运载体和siRNA分子被胞吞或以其他方式转位进入内涵体、溶酶体或其他细胞内膜限制的区室中。 
siRNA、运载体和光敏剂化合物可以一起或先后施用给细胞。一般将siRNA分子与如上所述的运载体混合从而形成复合物，该复合物随后与光敏化合物一起同时被施用给细胞。或者，siRNA：运载体复合物和光敏化合物可以被先后施用。siRNA：运载体复合物和光敏化合物可以被细胞摄入到相同或不同的细胞内区室中(例如它们可以被共转位)。 
然后如下释放siRNA：将细胞暴露于合适波长的光以激活光敏化合物，所述光敏化合物随后导致细胞内区室膜的破裂以及随后siRNA向胞浆中的释放，所述siRNA可位于与光敏剂相同的区室中。因此，在这些方法中，将细胞暴露于光的最终步骤导致siRNA从与光敏剂相同的细胞内区室释放，并变成存在于胞浆中。 
WO 02/44396(其通过参考并入本文)描述了一种方法，其中可以改变步骤的顺序，使得例如在要被内化的分子(和运载体)与细胞接触之前将光敏剂与细胞接触并通过辐照激活。该修改的方法利用了下述 事实：在辐照时要被内化的分子不必须存在于和光敏剂相同的细胞亚区室中。 
因此在一个优选的实施方案中，所述光敏剂、所述运载体和所述siRNA分子(例如作为运载体：siRNA复合物)被一起施用给细胞，或所述光敏剂相对于所述运载体和所述siRNA分子而言被分开施用。因此，它们可以被细胞摄入到相同的细胞内区室中，然后可以进行所述辐照。光敏剂、运载体和siRNA分子可以是分开的，或它们可以被配制为树状聚体分子(见例如Nishiyama N等，(2005)Nat Mater.4(12)：934-41)。 
在一个备选的实施方案中，可以通过将所述细胞与光敏剂接触，将所述细胞与要被引入的运载体和siRNA分子接触并用具有有效激活光敏剂波长的光辐照所述细胞，其中所述辐照在所述siRNA分子和所述运载体被细胞摄入到含有所述光敏剂的细胞内区室之前进行，优选地在所述分子和所述运载体被细胞摄入到任何细胞内区室之前进行。 
可以在分子和运载体分子被细胞摄入到细胞内区室之后进行所述辐照，无论所述siRNA分子和光敏剂在光暴露时是否位于相同的细胞内区室中。然而在一个优选的实施方案中，在要被内化的分子被细胞吸收之前进行辐照。 
本文使用的“内化”是指分子的胞浆递送。因此在本案中“内化”包括分子从细胞内/膜结合区室释放进入细胞胞浆中的步骤。 
本文使用的“细胞摄入”或“转位”是指内化的步骤之一，其中细胞膜外的分子被摄入细胞，从而它们存在于外部细胞膜以内，例如通过胞吞作用或其他合适的摄入机制，例如进入细胞内膜限制的区室或与之结合，所述区室例如内质网、高尔基体、溶酶体、内涵体等。 
将细胞与光敏剂接触以及与siRNA分子和运载体接触的步骤可以以任何便利的或期望的方式进行。因此，如果接触步骤在体外进行，则细胞可便利地维持在水性培养基(例如适宜的细胞培养基)中，并在适宜的时间点在适宜的条件下(例如在适宜的浓度和适宜的时间长度下)简单地向培养基中添加光敏剂和/或siRNA分子和运载体。例如，细胞 可以在存在无血清培养基时与siRNA分子和运载体接触。 
光敏剂在适宜的浓度和适宜的时间长度下与细胞接触，所述浓度和时间长度可以由技术人员使用常规技术确定，并取决于例如使用的具体光敏剂和靶细胞类型和位置这样的因素。光敏剂的浓度必须使得：一旦被细胞摄入(例如进入一个或多个其细胞内区室或与之结合)并通过辐照被激活，则一个或多个细胞结构被破坏，例如一个或多个细胞内区室裂解或破裂。例如，如本文所述的光敏剂可以在例如10到50μg/ml的浓度下使用。对于体外用途而言，该范围可以广泛得多，例如0.05-500μg/ml。对于体内人治疗而言，当全身性施用时光敏剂可以在0.05-20mg/kg体重的范围内使用，当局部应用时光敏剂可以在溶剂中0.1-20％的范围内使用。在更小的动物中，浓度范围可以是不同的并可相应地调节。 
细胞与光敏剂(即“接触”时间)的孵育时间可在数分钟到若干小时之间变化，例如甚至多达48小时或更久，例如12到20或24个小时。孵育时间应该使得光敏剂被适宜的细胞摄入，例如进入所述细胞的细胞内区室中。 
在细胞暴露于光或添加siRNA分子和运载体之前，可以任选地在细胞与光敏剂的孵育后用无光敏剂培养基进行一段孵育，例如10分钟到8个小时，特别是1到4个小时。 
siRNA分子和运载体(例如作为预先形成的siRNA：运载体复合物)在适宜的浓度和适宜的时间长度下与细胞接触。 
测定用于本发明方法的siRNA分子的适宜剂量是本领域技术人员的常规实践。对于体外应用而言，示范性的siRNA分子剂量应当约为1-100nM siRNA，对于在人中体内应用而言，应为每次注射约10-6-1g。例如，siRNA分子可以以下述水平施用：少于500nM，例如少于300nM，特别是优选地少于100nM或50nM，例如从1到100nM，或5到50nM，其中指出的浓度反映与细胞接触的水平。 
如上所述，已经发现可以在添加了光敏剂和辐照发生后甚至若干个小时后开始接触。
可以根据所述siRNA分子被摄入所述细胞中的效率和期望在细胞中达到的终浓度来确定适宜的浓度。因此，“转染时间”或“细胞摄入时间”(即分子与细胞接触的时间)可以是几分钟或多至几小时，例如可以使用从10分钟到多至24小时的转染时间，例如从30分钟到多达10小时或例如30分钟到多至2小时或6小时的转染时间。也可以使用更长的孵育时间，例如24到96小时或更长，例如5-10天。 
增加的转染时间常导致所述分子摄入的增加。然而，较短的孵育时间(例如30分钟到1小时)还可导致分子摄入的特异性改善。因此，在选择用于任何方法的转染时间时，必须在获得分子的足够摄入同时维持PCI处理的足够特异性之间达到适宜的平衡。 
siRNA分子、运载体和光敏剂与靶细胞接触的体内适宜方法和孵育时间将依赖于下述因素，如施用模式和siRNA分子、运载体和光敏剂的类型。例如，如果siRNA分子和运载体被注射进待治疗的肿瘤、组织或器官中，则接近注射点的细胞会接触siRNA分子并因此趋向于比位于远离注射点的细胞更迅速地摄入siRNA分子，所述位于远离注射点的细胞可能在更晚的时间点和更低的浓度下与siRNA分子接触。 
另外，通过静脉注射施用siRNA分子到靶细胞可花费一些时间，因此，为了使足量或最优量的siRNA分子在靶细胞或组织中累积施用后可能耗时更久，例如若干天。同样的考虑当然也适用光敏剂摄入细胞中所需的施用时间。体内个体细胞所需的施用时间因此可能取决于这些参数和其他参数而变化。 
然而，尽管体内状况比体外状况更加复杂，但是本发明的根本原理仍然是相同的，即分子与靶细胞接触的时间必须使得在辐照发生前适量的光敏剂已经被靶细胞摄入，以及以下任一：(i)在辐照前或期间，siRNA分子已经被摄入，或者在与靶细胞充分接触后会被摄入，进入相同或不同的细胞内区室中，或(ii)辐照后，siRNA分子与细胞接触一段时间，这段时间足够使得其被摄入进细胞。只要siRNA分子被摄入受光敏剂激活影响的区室(例如该药剂存在的区室)中，则siRNA分子可以在辐照之前或之后被摄入。 
激活光敏剂的光辐照步骤可以根据本领域公知的技术和步骤发 生。例如，可以根据使用的光敏剂选择光的波长和强度。合适的光源是本领域公知的。 
本发明的方法中细胞暴露于光的时间可以变化。siRNA分子内化进入胞浆中的内化效率随着提高的光暴露而提高至最大值，超过该最大值后细胞损伤和因此造成的细胞死亡增加。 
辐照步骤的优选时间长度取决于下述因素，如靶标、光敏剂、靶细胞或组织中累积的光敏剂的量，和光敏剂的吸收光谱和光源的发射光谱之间的重叠。一般地，辐照步骤的时间长度处于分钟到数小时的数量级中，例如优选地至多60分钟例如从0.5或1到30分钟，例如从0.5到3分钟或从1到5分钟或从1到10分钟例如从3到7分钟，和优选地约3分钟例如2.5到3.5分钟。也可以使用更短的辐照时间，例如1到60秒，例如10-50、20-40或25-35秒。 
适宜的光剂量可以由本领域技术人员选择，并也取决于光敏剂和靶细胞或组织中累积的光敏剂的量。例如，一般用于用光敏剂Photofrin和原卟啉前体5-氨基乙酰丙酸光动力治疗癌症的光剂量在50-150J/cm2的范围内，能流范围少于200mW/cm2以避免过热。当使用可见光谱红光区域中具有更高消光系数的光敏剂时，光剂量通常更低。然而，为了用累积的更少的光敏剂治疗非癌组织，需要的光总量可能明显高于用于治疗癌症的量。另外，如果要维持细胞存活力，则要避免产生过量水平的毒性物质，并且可以相应地调节相关的参数。 
本发明的方法由于光化学处理(即通过光敏剂的激活产生毒性物质)而不可避免地引起一些细胞杀伤。取决于所计划的用途，该细胞死亡可能不是重要的，并且事实上可能对一些应用(例如癌症治疗)是有利的。然而优选地避免细胞死亡，并且如本文中别处所述，可进行该方法使得在不存在细胞毒性时引发强表达抑制(即强siRNA作用)。在不存在普遍细胞毒性或对细胞存活力的影响时达到强表达抑制是非常有利的。本发明的方法可以被修饰，使得通过选择与光敏剂浓度相关的光剂量来调节存活细胞的分数或比例。这样的技术也是本领域已知的。 
在期望有活力的细胞的应用中，基本上所有的细胞或显著的大部分(例如至少50％，更优选地至少60％、70％、80％或90％的细胞) 细胞没有被杀死。PCI处理后的细胞存活力可以通过本领域已知的标准技术如MTS测试来测定(见实施例)。 
与光敏剂激活诱导的细胞死亡量无关，对于在细胞中有作用的siRNA而言，调节光剂量使得一些个体细胞(其中PCI作用已被证实)不被单独的光化学处理杀死是重要的(尽管它们可随后被引入细胞中的分子杀死，如果这些分子具有细胞毒性的话)。 
可以通过使用例如基因疗法达成细胞毒性作用，其中通过本发明的方法siRNA分子被内化进入肿瘤细胞中，例如用于下调基因。 
可以体外或体内使用本发明的方法，例如用于原位治疗或用于离体治疗然后将经治疗的细胞施用给机体，用于多种目的，包括抑制特定基因产物的表达(例如在基因疗法中)和产生筛选实验。 
因此，本发明提供了通过用本文前文所述的方法将siRNA分子引入细胞中抑制靶基因表达的方法，所述细胞含有所述靶基因，其中所述siRNA分子特异性抑制所述靶基因的表达。 
“特异性抑制”是指序列依赖性的靶基因抑制。下述基因的表达会受siRNA分子影响，所述基因即含有与所使用的siRNA分子在核酸水平上足够相同的序列。如上所述，已经开发了标准技术，其允许技术人员设计有适宜序列的siRNA分子以引起序列特异性的表达抑制。 
“靶基因”是指下述基因，其表达要被下调且其将是研究或操作的靶标。 
可以使用这些方法改变细胞的表达谱，例如用于研究细胞途径，或测定具体基因表达的影响，或用于治疗目的。 
本发明的方法还可用于治疗任何疾病，所述疾病受益于一个或多个基因的下调、修复或突变。例如，可以通过施用适宜的siRNA分子(Lage(2005)Future Oncol 1(1)：103-13)下调在癌症中过表达的基因。可以被治疗的备选疾病包括神经变性疾病如亨廷顿舞蹈病和阿尔茨海默病，和病毒感染如肝炎(例如乙型肝炎和丙型肝炎)和HIV。 
因此，本发明的又一方面提供了组合物，其包含siRNA分子、(优 选地与所述siRNA分子作为复合物的)运载体分子和任选地也独立地包含本文所述的光敏剂。本发明又一方面提供了用于治疗中的所述组合物。 
或者，本发明提供了一种试剂盒，其包含siRNA分子、运载体分子和任选地也包含如本文所述的光敏剂。优选地，所述试剂盒(或产品)用于在医学治疗中同时、分开或先后使用。 
或者如所述的，本发明提供了本文所述的siRNA分子和运载体在制备药物中的用途，所述药物通过改变所述患者中一个或多个靶基因的表达来治疗或预防疾病、病症或感染。任选地，所述药物可仅含有所述siRNA分子或运载体之一，并可被用于下述方法中，其中不存在于所述药物中的所述siRNA分子或运载体是用于在治疗或预防所述疾病、病症或感染时施用给所述患者的。任选地，所述药物可含有光敏剂。优选地，所述药物用于基因疗法，即用于治疗疾病或病症，所述疾病或病症特征是异常的基因表达或会受益于一个或多个基因的阻抑。所述改变包括所述表达的下调。 
根据上文公开的不同的实施方案，所述光敏剂和所述siRNA分子和运载体同时或先后地与患者的细胞或组织接触，且所述细胞用有效激活光敏剂的波长的光辐照，并且在细胞将所述siRNA分子和运载体摄入到含有所述光敏剂的细胞内区室中之前、期间或之后进行辐照，优选地在细胞将所述转移分子摄入到任何细胞内区室之前进行辐照。 
因此在一个备选的方面，本发明提供了在患者中治疗或预防疾病、病症或感染的方法，包括根据本文前文所述的方法将siRNA分子和运载体引入一个或多个体外、体内或离体的细胞中，并且在必要时(即转染在体外或离体进行时)将所述细胞施用给所述患者。 
本文定义的“治疗”是指相对于治疗前的症状而言，减少、减轻或消除被治疗的疾病、病症或感染的一个或多个症状。“预防”是指延迟或防止疾病、病症或感染的症状的发生。 
本发明的组合物也可包含含有siRNA分子的细胞，所述siRNA分子已通过本发明的方法被内化进所述细胞的胞浆内。本发明还扩展至 用于疗法中特别是癌症或基因疗法中的这样的组合物。 
因此，本发明再一方面提供了含有siRNA分子的细胞或细胞群，所述siRNA分子已被内化进所述细胞的胞浆内，所述细胞可以通过本发明的方法获得。 
本发明再一方面提供了这样的细胞或细胞群用于制备组合物或药物的用途，所述组合物或药物用于如本文上文所述的疗法中，优选地用于癌症或基因疗法中。 
本发明还提供了治疗患者的方法，所述方法包括对所述患者施用本发明的细胞或组合物，即包括下述步骤的方法：向本文前文所述的细胞中引入siRNA分子并将如此制备的所述细胞施用给所述患者。优选地，所述方法被用于治疗癌症或用在基因疗法中。 
在体内，可以使用本领域常见或标准的任何施用模式，例如注射、输注、局部施用(至内部和外部体表二者)等。对体内用途而言，本发明可用于任何含有光敏剂和siRNA分子所定位的细胞的组织，包括体液位置以及实体组织。所有的组织都可被治疗，只要光敏剂被靶细胞摄入并且光能够被适当地递送即可。 
因此，可以根据制药领域已知的技术和步骤以任何便利的方式配制本发明的组合物，例如使用一种或多种可药用的载体或赋形剂。“可药用的”在本文中是指能够与组合物的其他成分相容以及可被受体生理学接受的成分。可以根据选择和期望的施用途径、治疗目的等以常规方式选择组合物和载体或赋形剂材料的性质、剂量等。剂量同样可以用常规方式确定，并可取决于分子性质、治疗目的、患者年龄、施用方式等。还应该考虑与光敏剂相关的在辐照后破坏膜的潜能/能力。 
上述方法或者可用于产生用于高通量筛选方法的筛选工具，尤其是用于分析沉默具体基因的作用。可如上所述产生指向一个或多个特定基因的siRNA并用于本发明的方法中。因此，siRNA可用于降低细胞群中基因的表达。然后得到的细胞群可用作筛选工具，用于通过标准技术鉴定基因沉默的下游效应。 
先前用正常的和经化学修饰的反义寡核苷酸降低基因表达的尝试 受到下述问题的限制：反义寡核苷酸的核酸酶降解、发生非特异性作用和/或靶标亲和力不足。通过使用本发明的方法施用siRNA，可克服这些问题。 
因此，本发明另一方面提供了修饰细胞(例如细胞群)的基因表达模式以制备用作筛选工具(例如用于高通量筛选)的细胞(或细胞群)的方法，所述方法包括将能够抑制或降低基因表达的siRNA分子、运载体和光敏剂与细胞(例如细胞群)接触，并用有效激活光敏剂的波长的光辐照细胞(或细胞群)。本发明还扩展至这样的细胞和筛选这样细胞的方法，其中例如在微阵列中检验这样的细胞的特性，例如这样的细胞的mRNA表达水平。“经修饰的基因表达模式”表示由于细胞核中存在所述siRNA分子，其指向的基因的转录或翻译受到影响。 
由于基因表达的这种变化，其他基因的表达可能被影响。因此，通过影响所研究的基因的表达，可能测定其他基因表达模式的改变。鉴定这些基因和鉴定所研究基因的表达对它们的影响使得研究人员得出关于基因功能(例如其下游功能)的结论。被所研究的基因正常表达的改变影响的基因可以被上调或下调，但是表达模式中的总体变化指示了该基因在正常细胞功能中的作用和其失调的后果。 
使用本领域公知的标准技术，可能研究下调或消除感兴趣的基因表达的作用。这可例如通过寻找细胞(或细胞群)中的功能性改变来完成，所述功能性改变例如细胞贴壁、蛋白质分泌的改变或形态学改变。或者可以通过再次使用本领域公知的标准技术分析mRNA模式和/或蛋白质表达来直接研究基因表达谱。 
通过抑制或降低基因的表达，应当理解与未进行该方法的细胞(即野生型或正常细胞)相比时，感兴趣的基因的表达被降低。基因表达水平的改变可以通过本领域已知的标准技术测定。 
可存在表达的完全抑制，从而没有可检测的基因表达(即没有mRNA或蛋白质是可检测的)，或可存在表达的部分抑制(即降低)，由此基因表达的量比野生型或正常细胞更低。这可通过将具有特定序列的siRNA的作用与具有乱序序列(即相同的核苷酸组成，但是不同的序列顺序)的siRNA的作用比较来评价和控制。优选地要对该技术有用的 话，表达降低到少于或等于对照水平的80％，例如<50％、优选地<20％、10％或5％的对照水平。使用的细胞应优选地为其个体细胞遗传上同一的细胞群。细胞可以是如上所述的任何细胞。 
根据本发明的方法产生的细胞或细胞群可用于制造文库，其形成了本发明的又一方面。 
接着将在以下的非限制性实施例中根据下图更详细地描述本发明，所述图中： 
图1显示使用siRNA9的基因沉默实验的结果，该实验使用OHS细胞系与多种转染试剂，使用(黑色柱)和不使用(白色柱)PCI处理。图表展示S100A4蛋白质水平，从左至右为；1)siPORT脂质、2)FuGene6、3)Lipofectamine 2000、4)Lipofectin、5)jetSI和6)jetSI-ENDO。结果表示为未处理的对照细胞的百分比。柱是来自三个独立实验的平均值。误差条显示均值的标准误(SEM)。 
图2显示基因沉默实验的结果，其中使用jetSI-ENDO用siRNA转染(使用和不使用PCI处理)不同类型的细胞。(A)中的结果展示了用siRNA处理的四个细胞系中的S100A4蛋白质水平。灰色柱显示使用PCI的乱序对照siRNA，黑色柱显示不使用PCI的效应子siRNA，白色柱显示使用PCI的效应子siRNA。细胞系从左到右为HCT-116，SW620，OHS和RMS。柱是来自三个独立实验的平均。误差条显示均值的标准误(SEM)。(B)中的结果显示不同细胞系的Western印迹，所述细胞系从顶部到底部为HCT-116，SW620，OHS和RMS。上图显示α-微管蛋白上样对照，下图为S100A4水平。在每个下图中，泳道1-3显示不使用PCI处理的蛋白质水平：未处理的对照(C)、乱序对照(siRNA11)和效应子(siRNA9)。泳道4-6显示使用PCI处理的蛋白质水平：未处理的对照(C)、乱序对照(siRNA11)和效应子(siRNA9)。 
图3显示OHS细胞中基因沉默实验的结果：a)辐照后96小时的剂量依赖型沉默(1-5nM siRNA)，b)使用siRNA9的时间依赖型沉默(24、48和96小时)。结果表示为未处理的对照细胞的百分比。柱是来自三个独立实验的平均。误差条显示均值的标准误(SEM)。
图4显示用jetSI转染的siRNA的基因沉默(辐照后96小时，使用和不使用PCI处理)的结果。结果显示如下所示用100nM siRNA处理OHS细胞系后的S100A4蛋白质水平(A)和RNA水平(B)。黑色柱表示不使用PCI的样品，白色柱表示使用PCI的样品。不使用PCI处理的未处理对照用作所有样品的对照(未显示)。样品：1和4)乱序对照(siRNA11)，2和5)效应子(siRNA9)，3)未处理的对照。柱表示来自三个独立实验的平均。误差条显示均值的标准误(SEM)。 
图5显示用jetSI-ENDO转染(200nM)(使用和不使用PCI处理)后OHS中荧光标记的siRNA的分布。a)不使用PCI处理的siRNA递送，从左到右：相差、荧光和相应合并，b)使用PCI处理的siRNA递送：从左到右：相差、荧光和相应合并，c)不使用PCI处理的荧光照片，从左到右展示：陷入内涵体的荧光(左侧框)和来自内涵体的荧光渗漏(右侧框)，左侧框内图像的放大，和右侧框内图像的放大。 
图6显示在用100nM siRNA和jetSI处理OHS后，使用与标准方案相比50％推荐水平的jetSI的基因沉默结果。柱表示：1)不使用PCI的乱序对照siRNA，2)不使用PCI的效应子siRNA，3)使用PCI的未处理的对照，4)使用PCI的乱序对照siRNA，5)使用PCI的效应子对照siRNA。柱代表来自三个独立实验的平均。 
图7显示优选的脂多胺的结构(也见Ahmed等，上文以及Behr等(1989)PNAS，86，6982-6)。 
图8显示使用PEI作为运载体的基因沉默结果。Western印迹在上图中显示上样对照(α-微管蛋白)，下图中显示S100A4蛋白质水平。泳道1＝未处理的对照(无PEI)，2＝1μl PEI+效应子siRNA，3＝10μl PEI+效应子siRNA，4＝未处理对照(无PEI)，5＝1μl PEI+效应子siRNA，6＝10μl PEI+效应子siRNA。泳道1-3不使用PCI，泳道4-6使用PCI。 
图9显示使用25kDa PEI作为运载体的基因沉默结果。使用的样品在图中指出。图A.通过扫描Western印迹定量的S100A4蛋白质水平(使用S100A4siRNA，使用或不使用PCI，三个独立实验的平均，其中误差条代表SEM)。B.Western印迹的一个实例。
图10显示PCI对siRNA活性的作用，在不同浓度下使用不同的PEI运载体。S100A4蛋白质水平通过扫描Western印迹定量。黑色柱代表不使用PCI的转染，而白色柱代表使用PCI的转染。结果是三个独立实验的平均。 
图11显示实验结果，所述实验测定PEI单独的毒性和与PCI和siRNA组合的毒性。标明了PCI实验中使用的PEI量和光剂量。A.不使用PCI的PEI毒性。标明了测试的不同(有支链的)PEI运载体的MW(5个独立实验的平均)。B.不同光剂量下PCI、PEI(1μg)和siRNA组合的毒性。显示了测试的样品和使用的光剂量。对照-＝未处理的对照(使用PEI但不使用PCI)，乱序的-＝乱序的siRNA对照(使用PEI但不使用PCI)，siRNA-＝S100A4 siRNA(使用PEI但不使用PCI)。对照+、乱序+和siRNA+与对照-、乱序-和siRNA-相同，但是使用PCI(5个独立实验的平均)。 
图12显示PCI-诱导的siRNA分子递送，其使用β-环糊精胺作为运载体。泳道1和4＝无siRNA的对照，泳道2和5＝对照乱序siRNA，泳道3和6＝S100A4 siRNA。显示了微管蛋白对照条带和S100A4条带。 
图13显示了PCI-诱导的siRNA分子递送，其使用具有乙二胺核心的聚酰胺胺(PAMAM)树状聚体(G2-7)。(A)Western印迹，其中上部的条带代表上样对照(α-微管蛋白)，下部的条带代表S100A4水平。不同泳道中的样品为：1.使用PCI的PAMAM G6。2.使用PCI的PAMAM G7。3.使用PCI的对照。4.不使用PCI的PAMAM G6。5.不使用PCI的PAMAM G7。6.不使用PCI的对照。(B).通过扫描Western印迹定量的S100A4蛋白质水平。黑色柱代表不使用PCI的转染，而白色柱代表使用PCI的转染。结果是3个独立实验的平均。图中指出所使用的不同形式PAMAM。 
图14显示G0、G1和G2PAMAM树状聚体的结构式。 
图15显示PCI对多聚精氨酸介导的siRNA递送的作用。通过Western印迹分析S100A4蛋白质的水平。上部泳道表示上样对照(α-微管蛋白)，下部泳道代表S100A4水平。凝胶上的样品如下：C+＝使用PCI的对照，S+＝使用PCI的对照乱序siRNA，R+＝使用PCI的 S100A4siRNA，C＝不使用PCI的对照，S＝不使用PCI的对照乱序siRNA，R＝不使用PCI的S100A4 siRNA。1＝0.35μg的多聚精氨酸MW15,000-70,000，2＝0.7μg的多聚精氨酸MW15,000-70,000，3＝0.35μg的多聚精氨酸MW>70.000，4＝0.7μg的多聚精氨酸MW>70,000。 
实施例 
材料和方法 
细胞系和培养条件 
HCT-116(结肠直肠腺癌)和SW620(结肠直肠腺癌)得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)。OHS(骨肉瘤)和RMS细胞系在挪威Radium医院建立。使用无抗体的但补充有10％胎牛血清(FCS；PAA Laboratories，Linz，Austria)和2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Verviers，Belgium)的RPMI-1640培养基(Bio Whittaker，Verviers，Belgium or GibcoBRL，Paisley，UK)培养所有的细胞系。细胞在含5％ CO2的湿润气氛中于37℃下生长和孵育。在实验前检验所有的细胞系并发现对支原体感染是阴性的。 
光源和光敏剂 
使用Lumisource
Figure G2007800246207D0035183756QIETU
(PCI Biotech AS，Oslo，Norway)作为光源。Lumisource
Figure 2007800246207100002G2007800246207D0035183756QIETU
是一排四个荧光管，其被设计成为处理区域提供均一辐照，主要发射峰在420nm处的蓝光。光敏剂二磺化四苯基卟啉(TPPS2a)购自Porphyrin Products(Logan，UT，USA)。TPPS2a首先溶于0.1MNaOH中，然后在pH 7.5的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中稀释至5mg/ml的浓度和0.002M NaOH的终浓度。对光敏剂进行光防护并储存于-20℃下直至使用。 
不使用PCI的siRNA转染。 
通过使用来自Life Technologies Inc.(Gaithersburg，MD，USA)的LipofectinTM Reagent、来自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的LipofectamineTM2000、来自Roche Diagnostics(Mannheim，Germany) 的FuGene6、来自Ambion(Austin，TX，USA)的siPORTTM脂质转染剂、来自Polyplus transfection(Illkirch，France)的jetSITM和jetSITM-ENDO评价用于siRNA递送的不同转染试剂。所有的转染试剂根据制造商的说明进行操作。所有的细胞系如“细胞系和培养条件”中所述培养，并在24、48或96小时的转染前于6孔平板中培养24小时至50-70％汇合。除了使用转染试剂的乱序siRNA外，对细胞单独应用转染试剂作为未处理的对照。 
针对标准6孔平板的用于jetSI/jetSI-ENDO的方案如下： 
●第1步：对各孔而言，将4.2(8.4)μl的jetSI/jetSI-ENDO溶液稀释进100μl培养基中。剧烈涡旋混合(注意：不要吸打混合)并等候10分钟(注意：不要超过30分钟)。 
●第2步：对各孔而言，将1.4μg(100nM)的siRNA双链体稀释进100μl培养基中。轻柔涡旋混合。 
●向100μl siRNA溶液中添加100μl jetSI培养基溶液并立刻混合溶液(注意：不要以相反顺序混合溶液) 
●立即将溶液涡旋混合10秒。 
●在室温下孵育30分钟以允许复合物形成(注意：不要超过1小时)。 
●在复合物形成期间，从平板中去除生长培养基并添加0.8ml新鲜的含血清培养基(和光敏剂，如果使用的话)，在37℃预热。 
●向各孔中添加200μl jetSI/siRNA溶液并通过轻柔回荡(swirling)平板使混合物混匀。 
●在所需的细胞培养条件下将平板孵育18小时，然后用新鲜的培养基将平板洗涤三次，并用2-4ml培养基再孵育。 
使用PCI的siRNA转染。 
如“不使用PCI的siRNA转染”中培养和转染细胞，少数修改例外。转染后向培养基中添加光敏剂TPPS2a(0.5μg/ml)。孵育18个小时后，用新鲜的培养基将细胞洗涤3次，并在光处理前孵育4小时。4小 时后，将细胞在蓝光(7mW/cm2)下暴露不同的持续时间(60-90秒)(取决于细胞系)，并在收获前再孵育24、48和96小时。为了测量PCI作用，在相同平板的不同孔中施加效应子siRNA、乱序siRNA和仅仅转染试剂，添加或不添加光敏剂，并给予相同的处理。在这些实验中用铝箔对细胞进行光防护。 
S100A4的实时逆转录PCR。 
用GenElute哺乳动物总RNA小量制备试剂盒(Sigma-Aldrich，Steinheim，GER)分离总细胞RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad，Hercules，CA)进行逆转录。两个试剂盒均根据制造商手册使用。所有的PCR均平行进行，通过使用SYBR Green I获得实时检测结果。对于各PCR而言，添加10μl cDNA、30μl iQ SYBRGreen Supermix(BioRad)、300nM各引物和无核酸酶的水至60μl终体积。然后向PCR平板施加各25μl的样品。该方法确保平行是真实的平行，并且对所有的重复而言存在足够的PCR混合物。引物设计使用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems，Foster City，CA)的软件PrimerExpress完成。使用的引物组(正向引物5′-AAGTTCAAGCTCAACAAGTCAGAAC-3′和反向引物5′-CATCTGTCCTTTTCCCCAAGA-3′)扩增了S100A4序列的外显子2和3中的一个79-bp区段。 
使用以下的扩增方案在iCycler(Bio-Rad)上进行实时反应：95℃的3分钟初始变性，50个循环的95℃变性10秒和60℃退火/延伸35秒，95℃保持20秒随后55℃保持1分钟，最后是80步的融解曲线分析，每步10秒提高0.5℃直到95℃的最终温度。通过两个看家基因TBP(正向引物5′-GCCCGAAACGCCGAATAT-3′和反向引物5′-CGTGGCTCTCTTATCCTCATGA-3′)和RPLPO(正向引物5′-CGCTGCTGAACATGCTCAAC-3′和反向引物5′-TCGAACACCTGCTGGATGAC-3′)的扩增验证RNA样品的品质。使用Gene Expression Macro，1.1版(Biorad)进行定量计算。该程序基于ΔΔCT方法进行计算，该方法允许比较对相同样品集合使用不同引物组获得的循环阈值。 
显微镜研究。
如所述用siRNA/jetSI-ENDO复合物孵育细胞(使用和不使用PCI的siRNA转染)，48小时后使用和不使用PCI处理，并用装配了FITC滤光片(450-490nm BP激发滤光片，510nm FT分光镜和515-565nmLP发射滤光片)和罗丹明滤光片(546/12nm BP激发滤光片，580nmFT分光镜，和590nm LP发射滤光片)的Zeiss倒置显微镜Axiovert 200分析。图像通过使用Carl Zeiss AxioCam HR，5.05.10版和AxioVision3.1.2.1软件形成。图形使用Adobe Photoshop 7.0(Adobe，San Jose，CA)和Zeiss LSM Image Browser(第3版)制备。 
Western免疫印迹。 
在含有150mM NaCl和0.1％NP-40的50mM Tris-HCl(pH 7.5)中制备蛋白质裂解物，该NP-40中含有2g/ml胃蛋白酶抑制剂、抑肽酶(Sigma Chemical Company，St Louis，MO)和亮肽酶素(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)。根据制造商手册通过12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自各样品的总蛋白质裂解物(30μg)，并转移至Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA)上。作为上样和转移对照，用0.1％氨基黑将膜染色。随后将膜在20mM Tris-HCl(pH 7.5)中孵育，该Tris-HCl含有0.5M NaCl和0.25％Tween 20(TBST)以及10％的奶粉(封闭溶液)，之后与兔多克隆抗S100A4抗体(1∶300稀释，DAKO，Glostrup，Denmark)和鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体(1∶250稀释，Amersham Life Science，Buckinghamshire，England)在含5％奶粉的TBST中孵育。洗涤后，使用与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(1∶5000稀释，DAKO，Glostrup，Denmark)和强化的化学发光系统(AmershamPharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)使免疫反应性蛋白质显影。S100A4蛋白质水平作为对照样品的百分比报告，并使用α-微管蛋白作为上样对照。 
实施例1 OHS细胞系中的基因沉默 
使用多种转染体系，用设计为靶向S100A4蛋白质表达的siRNA转染OHS细胞。在各情况下根据制造商的说明使用标准转染方案。使用光敏剂时，光敏剂为TPPS2a(1ml转染体积中0.5μg，例外是jetSI，其使用2ml转染体积)。各情况下的辐照时间为60秒。 
将20μM siRNA储存溶液与各种不同的转染试剂混合，并在6-孔平板中转染至1ml的终体积(除了jetSI和jetSI-ENDO，其终体积为2ml)。 
siPORT Lipid＝1000μl中测试了2和4μl，与1.4μg siRNA组合 
FuGene 6＝1000μl中测试了4.2μl和8.4μl，与1.4μg siRNA组合 
Lipofectamine 2000＝1000μl中测试了4.2和7μl，与1.4μg siRNA组合 
Lipofectin＝1000μl中测试了4.2和7μl，与1.4μg siRNA组合 
jetSI＝2000μl中8.4μl，与2.8μg siRNA组合 
jetSI-ENDO＝2000μl中4.2μl，与1.4μg siRNA组合 
siRNA分子是针对S100A4 mRNA序列(GenBank登录号NM_002961)的。根据Elbashir等，((2001)，Genes Dev.15，188-200)设计了具有序列5′-UGAGCAAGUUCAAUAAAGA-3′3′-ACUCGUUCAAGUUAUUUCU-5′的特异性siRNA。除了针对选定的靶基因设计的siRNA外，通过制造乱序siRNA(5`-CGCAUAAGUGAAAUAGAAU-3`，3`-GCGUAUUCACUUUAUCUUA-5`)设计了对照siRNA，并进行BLAST检索消除假杂交。双链体的GC含量被控制在30-70％的范围内，且为了siRNA双链体有最佳稳定性所有的siRNA分子被合成为其3′端具有dTdT突出。siRNA分子定购自Eurogentec(Seraing，Belgium)。 
将干燥的siRNA寡核苷酸在DEPC-处理的水中重悬至100μM并储存于-20℃。通过分开地将各RNA寡核苷酸等分和稀释至50μM的浓度进行退火。然后将30μl各RNA寡核苷酸溶液和15μl5X退火缓冲液组合至DEPC-处理的水中50mM Tris，pH 7.5，100mM NaCl的终浓度。然后将溶液在95℃水浴中孵育3分钟，随后在工作台上逐渐冷却45分钟。通过4％NuSieve琼脂糖凝胶电泳证实退火成功(数据未显示)。
从图1中可以看出，可以通过使用转染试剂jetSI和jetSI-ENDO达成PCI依赖性的基因沉默。当不存在PCI的情况下(即辐照，但是不存在光敏剂)使用这两种转染剂时，以使用Western印迹的蛋白质水平测量为基础，基因表达在对照的75％左右，然而当另外使用PCI时，基因表达被降低至对照的15％左右。 
相反，SIPORT脂质或Fugene 6作为转染剂的使用未达成基因表达的任何显著降低，而无论是否还使用了PCIlipofectamine 2000和lipofectin的使用实现了基因表达的抑制。 
实施例2 不同细胞系中的基因沉默 
使用标准jetSI-ENDO方案，在存在和不存在光敏剂(0.5μg/mlTPPS2a)时，用被设计为沉默S100A4表达的50nM siRNA(jetSI-ENDO＝4.2μl，与1.4μg siRNA组合)(见实施例1)转染四种不同的细胞系：HCT 116，SW620，OHS和RMS细胞。对细胞进行辐照，并通过在辐照(辐照条件如下：OHS＝60秒，SW620＝80秒，HCT116＝90秒，RMS＝70秒)后96小时进行Western印迹测定S100A4蛋白质水平。 
结果的实例在图2B中展示，结果在图2A中图示。在各细胞类型中，经转染的细胞暴露于PCI处理引起了高水平的基因沉默，而用S100A4 siRNA转染但是未进行PCI处理的这些细胞则显示明显较少的基因沉默。该作用显示是特异的，因为乱序的siRNA对基因表达没有作用，无论是否存在PCI。在测试的不同细胞系之间，基因沉默效应没有显著差异。 
实施例3 siRNA浓度和时间的作用 
使用4.2μl jetSI-ENDO，以1到5nM的浓度，将被设计为沉默S100A4蛋白质表达的siRNA分子转染进OHS细胞中，并如上所述进行PCI处理。 
使用Western印迹测量细胞裂解物中的蛋白质水平，并在图3A中表示为未处理对照细胞中蛋白质水平的百分比。 
基因沉默效应随着细胞暴露于其中的siRNA分子的浓度提高而提 高，尽管用4nM和5nM siRNA观察到的沉默效应之间几乎不存在差异。 
乱序siRNA分子也在所有的实验中使用，并显示出不影响基因表达。因此，基因抑制效应是特异性的。 
图2B通过改变辐照细胞和收获用于分析的细胞裂解物之间的时间段显示时间对基因沉默的影响。可以看出在辐照后和收获前细胞被放置得越久，观察到越多的基因表达抑制。 
实施例4 siRNA PCI处理后OHS细胞中的基因沉默 
如上所述用100nM siRNA或乱序siRNA转染OHS细胞，并在辐照后96小时通过Western印迹和RT-PCR测定PCI处理对蛋白质和mRNA水平的影响，并与未处理的对照的蛋白质和mRNA水平比较。 
图4中所示的结果表明，对于蛋白质和mRNA水平二者而言，当用jetSI ENDO转染该基因特异性siRNA并对细胞进行PCI处理时，观察到S100A4基因的大量的基因沉默(图3A和B的泳道5)。无PCI处理时观察到蛋白质和RNA水平的小量降低(图3A和B的泳道2)，但是这被PCI处理显著增强。 
实施例5 带标记siRNA的胞浆递送 
使用jetSI ENDO((1000μl转染体积中jetSI-ENDO＝8.4μl与2.8μgsiRNA组合＝200nM siRNA溶液)用200nM FITC标记的siRNA转染OHS细胞，使用和不使用光敏剂。然后对经转染的细胞进行辐照。 
使用相差显微镜和荧光显微镜观察细胞。通过比较图像看到在不存在PCI处理时，siRNA保持点状分布，这代表分布于细胞内小泡中(图5a和c)。还观察到一些渗漏(图5c中的右侧框)。相反，在PCI处理后，看到标记的siRNA分布在整个细胞质和细胞核中(见图5b)。 
这证实了PCI处理对于siRNA递送至所需的细胞区室中是必需的，并且该递送依赖于PCI处理。 
实施例6 使用siRNA-PCI的基因沉默需要使用比标准转染更少的运载体
使用jetSI用100nM siRNA转染OHS细胞。与上述实验相反，使用更低浓度的jetSI，即标准方案中推荐的50％。6-孔平板的标准方案是：2000μl培养基中2.8μg siRNA+8.4μl jetSI，得到各孔中100nMsiRNA。 
相反，对于6-孔平板而言，将1.4μg siRNA与1000μl培养基中4.2μl jetSI混合，导致各孔中100nM siRNA。复合物的总量因此被降低50％。 
转染后，对细胞进行PCI处理(该实验的光剂量为30秒，使用0.5μg/ml TPPS2a)或不进行处理，并使用RT-PCR测量基因沉默。效应子siRNA能够将S100A4基因的表达降低到少于未处理对照的20％，而不使用PCI和使用乱序siRNA(使用或不使用PCI处理)时几乎观察不到降低。 
这证实了运载体与PCI的组合使用不仅提供了选择性释放siRNA分子的优点，而且当与PCI组合时可以使用更低浓度的转染剂可达到高水平的基因沉默。通过将图6泳道5与图1泳道5比较可以看出，当使用PCI时，即便是仅使用在实施例1中使用的转染剂的50％，基因抑制的程度也更大。 
实施例7 使用PEI作为运载体的转染 
针对S100A4 mRNA序列(Gene Bank登录号NM002961)选择siRNA靶标。使用siRNA 481-499作为效应子(序列见实施例1)。 
针对PCI-诱导的递送评价聚乙烯亚胺(EPI)。转染前在6-孔平板中将细胞系培养(补充有10％FBS，10ml L-谷氨酸，10ml Hepes的RPMI-1640)至50-80％汇合。使用100nM siRNA作为标准浓度。 
使用的PEI来自Sigma，在无菌水中稀释并制备含1000μl PEI和9000μl无菌水的储存溶液。使用1μl和10μl储存溶液和1.4μg siRNA转染细胞(每孔100nM)。 
使用来自Sigma的PEI(408719聚乙烯亚胺(LS测量的平均Mw～800，GPC测量的平均Mn～600，有支链的，低分子量，无水))。
为了转染配制两种溶液，溶液A：将siRNA稀释在100μl无血清(OPTI-MEM I)培养基中。溶液B：将PEI稀释在100μl无血清培养基中。轻轻混合溶液A和B并在室温下孵育30分钟。然后将混合的溶液添加到细胞(1ml的100nM siRNA)。 
如上针对jetSI所述进行PCI处理。PEI实验的光剂量为40秒。在辐照后96小时通过Western印迹测量蛋白质水平。 
从图8能够看出在泳道5和6所示的样品(即进行了使用PEI的转染和PCI处理的样品)中S100A4蛋白质表达降低。 
实施例8 使用25kDa PEI运载体时PCI对siRNA活性的作用 
siRNA转染。如“细胞系和培养条件”中所述培养所有的细胞系，并在转染前以25-50％的汇合铺于6孔平板中。轻轻混合使siRNA和运载体复合物化并在添加至细胞之前孵育30分钟。用siRNA、运载体和添加或不添加光敏剂(TPPS2a＝0.5μg/ml)转染细胞并孵育18小时，然后用新鲜培养基洗涤3次并在光处理前再孵育4小时。4小时后，将细胞在蓝光(7mW/cm2)下暴露不同的持续时间(0-60秒)(取决于实验)，并在收获前再孵育96小时。为了测量PCI对基因沉默的作用，在相同平板的不同孔中应用特异性siRNA、乱序siRNA和仅仅转染试剂，添加或不添加光敏剂，并给予完全相同的处理。在这些实验中用铝箔对细胞进行光防护。 
在蛋白质水平上测量siRNA介导的S100A4基因沉默，使用和不使用PCI处理，使用有支链的25kDa聚乙烯亚胺(PEI)(1μg/ml)和100nM浓度的靶向S100A4基因的siRNA。随后进行上述方案，使用30秒的光剂量，使用复合物在含血清培养基中转染。图9A显示使用PCI时，S100A4 siRNA一般将S100A4水平降低至未处理对照(用PEI处理但是不使用siRNA)中水平的5-15％。相反，不使用PCI的S100A4 siRNA仅能够将S100A4水平降低至对照的100-80％。未处理的对照水平与使用乱序siRNA代替S100A4特异性siRNA的水平相当(数据未显示)。在图9B中，实验通过Western印迹表示。上部条带代表上样对照(α-微管蛋白)，下部条带代表S100A4水平，如图上所指出的。从印迹中可以看出，与未用PCI处理的接受S100A4 siRNA的细胞的情况(其中未 能检测到显著的基因沉默)相比，当使用PCI时S100A4被siRNA显著沉默。 
实施例9 使用不同浓度的PEI运载体时，PCI对siRNA活性的作用 
使用不同浓度(0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml和100μg/ml，每孔使用1ml培养基)的多种有支链PEI制剂时，PCI对S100A4 siRNA活性的作用。测试的PEI种类(均为有支链的)如下： 
PEI  MW(Da) 
1    800 
2    1200 
3    1300 
4    1800 
5    2000 
6    25000 
随后进行材料和方法中所述的方案，使用30秒的光剂量，使用复合物在含血清的培养基中转染。以100nM的浓度使用siRNA。从图10中能够看出，PCI的使用能够显著地增强使用不同PEI运载体时S100A4siRNA的基因沉默效应。该效应在使用更低量的PEI(1μg/ml和10μg/ml)时特别突出，其中不使用PCI的作用非常小，10μg/ml的PEI4(MW1800)除外。在这两个PEI浓度下，PCI显著增强了测试的所有PEI种类的基因沉默效应，PEI1(MW800)除外。 
不使用PCI时，基因沉默的程度随着PEI浓度增加而提高，使用PCI时该作用没有如此显著，例外是使用0.1μg/ml PEI时不能观察到基因沉默(使用或不使用PCI)。一种可能的解释是PEI的该用量不足够高到与所有siRNA产生复合物，产生不被细胞摄入的带负电的复合物。不使用PCI时，似乎存在基因沉默随着PEI运载体的分子量提高而提高的趋势；使用PCI时，该作用没有如此突出，PEI1(MW800)再次例外。不使用PCI处理时更高MW和更高用量的PEI的作用可能归 因于报道的PEI内涵体裂解(endosomolytic)特性，其仅在高浓度的PEI下作用 
这显示PCI可替代该作用，使得可能使用低用量和低MW的聚乙烯亚胺，这是非常有利于避免PEI运载体的毒性和其他问题的一种特性。 
实施例10 毒性研究 
首先评价了单独的(不使用PCI处理的)不同PEI制剂(MW800-25.000)的毒性。在该实验中，将OHS细胞铺在96-孔板中并允许其在含血清的培养基中贴壁过夜。然后弃去培养基，并用培养基和多种PEI制剂在不同的浓度下孵育20小时。然后弃去含PEI的培养基，向每孔(1:6稀释，100μl/孔)中添加MTS溶液(来自Promega，Madison，WI，USA)，并将平板再孵育4小时。测量490nm下的吸光度。 
从图11A中可以看到，毒性随着PEI制剂分子量提高(例如25000PEI vs.800PEI)和PEI用量提高而提高。重要的是，1μg/ml(未显示)和10μg/ml的PEI制剂未显示显著的毒性。对这些样品而言，可以使用PCI达到siRNA的显著生物学作用，而不使用PCI时所述作用非常小(见实施例9)。 
也评价了使用siRNA/PCI处理的PEI毒性。将OHS细胞铺在6-孔板中并允许其在含血清的培养基中贴壁过夜。然后弃去培养基，并用仅仅PEI、乱序siRNA和特异的siRNA转染6孔板中的细胞，添加或不添加光敏剂。然后将细胞孵育过夜，随后洗涤并如“siRNA转染”中所述用蓝光(PCI)处理。再孵育44小时后，向每孔中添加166.6μl MTS溶液并将平板再孵育4小时。测量490nm处的吸光度。图11B显示用1μg/ml的PEI(MW 25 000)、100nM siRNA和不同光剂量的PCI组合处理的毒性。从图中可以看出，在所有PEI基因沉默实验中，在所使用的光剂量(30秒)下PCI处理均不诱导显著的毒性，该剂量为PCI诱导强基因沉默效应的光剂量(见图10)。即便是在40秒的更高的光剂量下，也未能观察到PCI处理的细胞毒性，显示PCI能够诱导siRNA递送的充分增强而不带来细胞毒性效应。
实施例11 使用β-环糊精胺作为运载体的PCI-诱导的siRNA分子递送 
研究了PCI对β-环糊精胺诱导的siRNA递送的作用。在这些实验中使用60秒的光剂量，随后进行材料和方法中所述的方案。在无菌水中稀释如上所述n＝6和X＝4的β-环糊精胺，并在无血清的培养基中产生复合物和进行转染。从Western印迹(图12)中能够看出，与50nM(0.7μg)siRNA形成复合物的100μg/ml(每孔使用1ml)的β-环糊精胺对于PCI诱导的siRNA递送是有效的(泳道3)，而在这些条件下，不使用PCI的递送是无效的(泳道6)。该研究中使用的β-环糊精胺分子由下述β-环糊精分子组成并在Hwang S.J.等.(2001，Bioconjugate Chem.12，280-290)中描述，所述分子即通过负责与siRNA结合的胺桥(aminebridge)缀合的β-环糊精分子。 
实施例12.使用具有乙二胺核心的聚酰胺胺(PAMAM)树状聚体(G2-7)的PCI-诱导的siRNA分子递送 
针对PCI-诱导的siRNA递送评价多聚酰胺胺(PAMAM)树状聚体。在无菌水中稀释PAMAM并在含血清的培养基中进行转染。100μg/ml(每孔使用1ml)的不同类PAMAM树状聚体(G2-7)与100nM(1.4μg)siRNA形成复合物，并根据上文所述的步骤进行转染。在这些实验中使用30秒的光剂量。如从Western印迹(图13A)中可以看到的，在仅仅siRNA/PAMAM对基因沉默无效(泳道4和5)的条件下，PCI可有力地增强siRNA的活性(泳道1和2)。如从图13B中可以看到，对于若干种其他类的PAMAM树状聚体而言该效应也是明显的，表明PCI能够普遍地增强基于多胺的树状聚体对siRNA的递送。 
该研究中使用的含有不同量表面胺基的不同类PAMAM如下：G2＝分子式：[NH2(CH2)2NH2]:(G＝2)；树状PAMAM(NH2)16G3＝分子式：[NH2(CH2)2NH2]:(G＝3)；树状PAMAM(NH2)32G4＝分子式：[NH2(CH2)2NH2]:(G＝4)；树状PAMAM(NH2)64G5＝分子式：[NH2(CH2)2NH2]:(G＝5)；树状PAMAM(NH2)128G6＝分子式：[NH2(CH2)2NH2]:(G＝6)；树状PAMAM(NH2)256 G7＝分子式：[NH2(CH2)2NH2]:(G＝7)；dendri PAMAM(NH2)512
  
世代(G) MW 测量直径(nm) 表面胺基
2 3，256 29 16
3 6，909 36 32
4 14，215 45 64
5 28，826 54 128
6 58，048 67 256
7 116，493 81 512
实施例13.使用多聚-L-精氨酸盐酸盐作为运载体的PCI-诱导的siRNA递送 
在无菌水中稀释多聚精氨酸并在无血清的培养基中进行转染。测试了两种多聚精氨酸运载体(分子量15000-70000和>70000)。0.35或0.7μg/ml的多聚精氨酸(每孔使用1ml)与100nM(1.4μg)siRNA形成复合物，随后是上文所述的方案，在给予30秒的光剂量后通过Western印迹评价S1004A表达。如从图15中可以看出，PCI-处理的和未处理的样品之间存在显著的基因沉默效应差异。因此，尽管所有的PCI-处理的样品(图15中的R+-样品)显示显著的基因沉默，但是在未用PCI处理的相应样品(图15中的R-样品)中不能观察到沉默效应。因此，在测试的两种不同的多聚精氨酸运载体和使用的两种浓度下PCI均有效诱导基因沉默，显示PCI能够显著地增强基于阳离子肽的运载体对siRNA的递送。

Claims (29)

1.将siRNA分子引入细胞胞浆中的体外方法，所述方法包括：
i)将所述细胞与siRNA分子、运载体和光敏剂接触，其中所述光敏剂选自卟啉、酞菁、二氢卟酚或其可药用盐，和
ii)用能有效激活光敏剂的波长的光辐照细胞，其中所述运载体包括选自以下的阳离子多胺：
(a)非脂质体制剂中的脂多胺，其中所述脂多胺选自5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺、JetSITM和JetSI-ENDOTM，
(b)有支链的聚乙烯亚胺，其分子量为1.2至25kDa，
(c)下式的β-环糊精胺聚合物，
Figure FSB0000121754620000011
其中X为选自4或5的整数，n为选自5、6、7或8的整数，
(d)2-6世代的PAMAM树状聚体分子，和
(e)阳离子肽，其选自多聚精氨酸，或者L或D精氨酸的共聚物。
2.权利要求1的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有通过GPC测定的500-20000的Mn值。
3.权利要求2的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有通过GPC测定的500-1500的Mn值。
4.权利要求1的方法，其中所述运载体为聚乙烯亚胺，其中所述聚乙烯亚胺的分子量等于25kDa。
5.权利要求1的方法，其中所述运载体为聚乙烯亚胺，其中所述聚乙烯亚胺的分子量少于25kDa。
6.权利要求1或2的方法，其中所述siRNA分子为12-28个核苷酸长。
7.权利要求1或2的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
8.权利要求1或2的方法，其中所述光敏剂选自TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a，或其可药用盐。
9.权利要求1或2的方法，其还包括将所述siRNA与所述运载体接触的额外步骤。
10.权利要求1或2的方法，其中在与细胞接触之前，siRNA分子和运载体分子彼此接触20-40分钟。
11.权利要求1或2的方法，其中使用10nM-200nM siRNA用于转染。
12.权利要求1或2的方法，其中额外地存在选自聚阳离子、聚乙烯亚胺、树状聚体、阳离子脂质和肽的光敏剂运载体。
13.权利要求1或2的方法，其中siRNA与运载体混合形成复合物，然后将所述复合物与光敏剂同时或先后施用给细胞。
14.权利要求1或2的方法，其中所述方法如下进行：将所述细胞与光敏剂接触，将所述细胞与待引入的运载体和siRNA分子接触并用有效激活所述光敏剂的波长的光辐照细胞，其中所述辐照在所述siRNA分子和所述运载体被细胞摄入到含有所述光敏剂的细胞内区室中之前进行。
15.权利要求14的方法，其中所述辐照在所述siRNA分子和所述运载体被细胞摄入到任何细胞内区室之前进行。
16.通过将siRNA分子引入含靶基因的细胞中抑制所述靶基因表达的体外方法，所述引入通过权利要求1到15中任一项定义的方法进行，其中所述siRNA分子特异性抑制所述靶基因的表达。
17.含有siRNA分子的细胞或细胞群，所述siRNA分子已被内化进所述细胞的胞浆中，所述细胞通过权利要求1到16中任一项的方法获得。
18.组合物，其含有如权利要求1到5中任一项定义的siRNA分子和运载体分子，并还分开地含有权利要求1定义的光敏剂。
19.权利要求18的组合物，其中含有光敏剂。
20.权利要求18或19的组合物，其中所述光敏剂选自TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a，或其可药用盐。
21.组合物，其含有根据权利要求17的细胞或细胞群。
22.用于治疗的权利要求18-21中任一项的组合物。
23.试剂盒，其包含siRNA分子、权利要求1到5中任一项定义的运载体分子和权利要求1定义的光敏剂。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述光敏剂选自TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a，或其可药用盐。
25.siRNA分子、权利要求1到5中任一项定义的运载体和权利要求1定义的光敏剂在制备下述药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、神经变性疾病或病毒感染。
26.权利要求25的用途，其中所述光敏剂选自TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a，或其可药用盐。
27.权利要求17中定义的细胞或细胞群在制备下述药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、神经变性疾病或病毒感染。
28.产品，其包含siRNA分子和如权利要求1-5中任一项定义的运载体分子以及权利要求1定义的光敏剂，所述产品用于在医学治疗中同时、分开或先后使用。
29.权利要求28的产品，其中所述光敏剂选自TPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a，或其可药用盐。
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