ES2383516T3

ES2383516T3 - Internalización fotoquímica para suministrar moléculas en el citosol

Info

Publication number: ES2383516T3
Application number: ES01998646T
Authority: ES
Inventors: Kristian Berg; Lina Prasmickaite; Anders Hoegset; Pal Kristian Selbo
Original assignee: PCI Biotech AS
Current assignee: PCI Biotech AS
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2012-06-21
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: HK1056573A1; BR0115795A; PL213560B1; WO2002044396A1; HUP0402260A2; KR100980153B1; EP1346059B1; JP2004520021A; US7223600B2; JP4578770B2; US20070274953A1; CA2430087A1; CN1553958A; US20050075268A1; PT1346059E; CN100558903C; KR20030074632A; KR20080080685A; CA2430087C; CZ20031791A3

Abstract

Un método in vitro o ex vivo para introducir una molécula en el citosol de una célula, método que comprende poner dicha célula en contacto con un agente fotosensibilizador que se localiza en endosomas, lisosomas, el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi, poner dicha célula en contacto con la molécula que se va a introducir (molécula de transferencia) e irradiar dicha célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en que dicha irradiación se lleva a cabo en un tiempo antes o al mismo tiempo que la puesta en contacto de dicha célula con la molécula de transferencia, en que (i) la molécula de transferencia no penetra fácilmente en las membranas celulares, y/o (ii) uno del agente fotosensibilizador y la molécula de transferencia, o ambos, están fijados a, asociados con, o conjugados con, una o más moléculas vehiculares, moléculas para transporte dirigido o vectores.

Description

Internalizaci6n fotoquimica para suministrar moleculas en el citosol

Metodo�

El presente invento se refiere a un metodo mejorado para introducir moleculas en el citosol de celulas usando un agente fotosensibilizador e irradiaci6n de las celulas con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador.

La mayoria de las moleculas no penetra facilmente en las membranas celulares. Los metodos para introducir moleculas en el citosol de celulas vivas son herramientas utiles para manipular y estudiar procesos biol6gicos. Entre los metodos mas comunmente usados hoy en dia estan la microinyecci6n, la fusi6n mediada por fantasmas de gl6bulos rojos y la fusi6n de liposomas, la lisis osm6tica de pinosomas, la carga por raspado, la electroporaci6n, el fosfato calcico y la transfecci6n mediada por virus. Estas tecnicas son utiles para investigar celulas en cultivo aunque, en muchos casos, pueden ser poco practicas, ineficaces o consumir mucho tiempo, o pueden provocar una muerte celular significativa. Por lo tanto, dichas tecnicas no son 6ptimas para uso en investigaci6n biol6gica ni medica ni en terapias en que se requiere que las celulas permanezcan viables y/o funcionales.

Es bien sabido que las porfirinas y muchos otros compuestos fotosensibilizadores pueden provocar efectos citot6xicos en celulas y tejidos. Estos efectos se basan en el hecho de que, tras la exposici6n a luz, el compuesto fotosensibilizador se puede volver t6xico o puede liberar sustancias t6xicas, tales como oxigeno singlete u otros radicales oxidantes, que son perjudiciales para el material celular o las biomoleculas, incluyendo las membranas de celulas y estructuras celulares, y dicho dano celular o membranal puede matar finalmente a las celulas. Estos efectos han sido utilizados en el tratamiento de diversas anormalidades o trastornos, incluyendo especialmente las enfermedades neoplasicas. El tratamiento es denominado "terapia fotodinamica" (PDT; del ingles, photodynamic therapy) e implica la administraci6n de agentes fotosensibilizadores (fotoquimioterapeuticos) a la zona afectada del cuerpo, seguida de la exposici6n a luz activadora con objeto de activar los agentes fotosensibilizadores y convertirlos en una forma citot6xica, por lo que las celulas afectadas son matadas o su potencial proliferativo resulta disminuido. Se conocen agentes fotosensibilizadores que se localizan preferente o selectivamente en el sitio diana deseado, tal como, por ejemplo, un tumor u otra lesi6n.

Se conoce una diversidad de agentes fotosensibilizadores, incluyendo notablemente los psoralenos, las porfirinas, las clorinas y las ftalocianinas. Dichos farmacos se vuelven t6xicos cuando son expuestos a luz.

Los farmacos fotosensibilizadores pueden ejercer sus efectos mediante una diversidad de mecanismos, directa o indirectamente. De este modo, por ejemplo, ciertos fotosensibilizadores se vuelven directamente t6xicos cuando son activados por luz, mientras que otros actuan para generar especies t6xicas, tales como, por ejemplo, agentes oxidantes tales como oxigeno singlete y otros radicales libres derivados del oxigeno, que son sumamente destructivos para el material celular y para biomoleculas tales como lipidos, proteinas y acidos nucleicos.

Los fotosensibilizadores de porfirina actuan indirectamente por generaci6n de especies oxigenadas t6xicas y son considerados como candidatos particularmente favorables para la PDT. Las porfirinas son precursores de la sintesis de hemo presentes en la naturaleza. En particular, se produce hemo cuando se incorpora hierro (Fe3+) a la protoporfirina IX (PpIX) por la acci6n de la enzima ferroquelatasa. PpIX es un fotosensibilizador muy potente, mientras que el hemo no ejerce efecto fotosensibilizador alguno. Se conoce en la tecnica y se describe en la bibliografia una diversidad de fotosensibilizadores basados en porfirina o relacionados con la porfirina.

El efecto citot6xico de la mayoria de los sensibilizadores usados en la PDT es mediado principalmente a traves de la formaci6n de oxigeno singlete, formado tras la exposici6n de los fotosensibilizadores a la luz. Este intermedio reactivo tiene un tiempo de vida muy corto en las celulas ( 0,04 Is). Por lo tanto, el efecto citot6xico primario de la PDT se ejecuta durante la exposici6n luminica y muy pr6ximo a los sitios de formaci6n de 102. El 102 reacciona con proteinas (histidina, tript6fano, metionina, cisteina, tirosina), DNA (guanina), acidos grasos insaturados y colesterol y los oxida. Una de las ventajas de la PDT es que los tejidos no expuestos a la luz pueden quedar inafectados; es decir, que se puede obtener un efecto de PDT selectivo. Hay una amplia documentaci6n relativa al uso de PDT para destruir poblaciones celulares indeseadas, tales como, por ejemplo, celulas neoplasicas. En la bibliografia de patentes se describen diversos compuestos fotodinamicos, solos o conjugados con agentes para transporte dirigido, tales como, por ejemplo, inmunoglobulinas dirigidas a determinantes de receptores de celulas neoplasicas, lo que hace que el complejo sea mas celularmente especifico. Ciertos compuestos fotoquimicos, tales como derivados de hematoporfirina, tienen ademas la capacidad inherente de localizarse en celulas malignas. Dichos metodos y compuestos se describen en la patente noruega nO 173319 y en las solicitudes de patente noruega numeros 900731, 176645, 176947, 180742, 176786, 301981, 300499 y 891491.

En el Documento W0 93/14142 se describe un sistema para distribuci6n de farmacos que comprende un agente anticanceroso y un agente fotoactivable (es decir, un fotosensibilizador) fijados a vehiculos copolimeros. Tras la administraci6n, este complejo entra en el interior de la celula por pinocitosis o fagocitosis y se localiza dentro de los endosomas y lisosomas. En los lisosomas, se hidroliza el enlace entre el agente antineoplasico y el polimero y el

primero puede difundirse pasivamente en el citosol a traves de la membrana lisos6mica. La utilidad de este metodo esta por ello limitada a pequenos compuestos moleculares que son capaces de difundirse a traves de las membranas lisos6micas. Despues de dejar un periodo de tiempo para la difusi6n, se aplica una fuente luminica de longitud de onda y energia apropiadas para activar el compuesto fotoactivable. El efecto combinado del agente anticanceroso y el agente fotoactivable destruye la celula. Dichos metodos de PDT como los anteriormente descritos se dirigen por tanto a una destrucci6n de estructuras celulares que conduzca a la muerte celular.

Por otro lado, los Documentos W0 96/07432 y W0 00/54802 son relativos a metodos en que se usa el efecto fotodinamico como un mecanismo para introducir moleculas, para las que de otro modo la membrana resulta impermeable, en el citosol de una celula de una manera que no de necesariamente lugar a una destrucci6n celular ni una muerte celular generalizadas. En este metodo, se aplican simultanea o sucesivamente la molecula que se va a internalizar y un compuesto fotosensibilizador a las celulas, tras lo cual el compuesto fotosensibilizador y la molecula son endocitados o, en otros casos, translocados a endosomas, lisosomas u otros compartimentos restringidos por membrana intracelular.

La molecula que se va a translocar a compartimentos intracelulares de las celulas y el compuesto fotosensibilizador son conjunta o sucesivamente aplicados a las celulas y son conjuntamente incorporados por las celulas a los mismos compartimentos intracelulares (es decir, son cotranslocados). La molecula que se va a internalizar en la celula es luego liberada por exposici6n de las celulas a luz de longitud de onda adecuada para activar el compuesto fotosensibilizador, lo que conduce a su vez a la rotura de las membranas de los compartimentos intracelulares y a la subsiguiente liberaci6n de la molecula, que esta localizada en el mismo compartimento que el agente fotosensibilizador, en el citosol. Este metodo fue denominado "internalizaci6n fotoquimica" o PCI (del ingles, photochemical internalisation). De este modo, en estos metodos, la operaci6n final de exponer las celulas a luz da lugar a que la molecula en cuesti6n sea liberada del mismo compartimiento intracelular que el del agente fotosensibilizador y llegue aestar presente en el citosol.

Se creia que, con objeto de que este metodo fuera eficaz, era esencial que tanto el compuesto fotosensibilizador como la molecula que iba a ser liberada en el citosol estuvieran presentes en los mismos compartimentos intracelulares cuando se llevara a cabo la irradiaci6n.

Se ha hallado ahora sorprendentemente que se pueden introducir moleculas en el citosol de celulas mediante metodos de PCI similares pero en los que la exposici6n de las celulas a luz no es necesariamente la operaci6n final y los metodos no dependen de que la molecula y el agente fotosensibilizador esten localizados en los mismos compartimentos intracelulares en el momento de la exposici6n luminica. En tales metodos, el agente fotosensibilizador puede ser puesto en contacto con las celulas y ser activado por irradiaci6n antes de que la molecula que se va a internalizar y, de este modo, distribuir en el citosol sea puesta en contacto con las celulas. De esta manera, a pesar del hecho de que la molecula que se va a internalizar y el agente fotosensibilizador no esten necesariamente localizados en los mismos compartimentos intracelulares en el momento de la exposici6n luminica, la molecula entra en la celula y es distribuida en el citosol. Estos resultados son muy sorprendentes y dichos metodos presentan unas ventajas significativas con respecto a los metodos en que la irradiaci6n luminica es la operaci6n final.

Por lo tanto, en su aspecto mas general, el presente invento proporciona un metodo in vitro o ex vivo para introducir una molecula en el citosol de una celula, metodo que comprende poner dicha celula en contacto con un agente fotosensibilizador y poner dicha celula en contacto con la molecula que se va a introducir (molecula de transferencia) e irradiar dicha celula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en que dicha irradiaci6n se lleva a cabo antes o en el momento de poner dicha celula en contacto con la molecula de transferencia, en que la molecula de transferencia no penetra facilmente en membranas celulares, y/o en que uno del agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia, o ambos, estan fijados a, asociados con, o conjugados con, una o mas moleculas vehiculares, moleculas para transporte dirigido o vectores.

La irradiaci6n se lleva a cabo antes de la incorporaci6n celular de la molecula que se va a internalizar.

Como aqui se utiliza, "internalizaci6n" se refiere a la distribuci6n citos6lica de moleculas. En el caso presente, "internalizaci6n" incluye asi la operaci6n de liberaci6n de moleculas de compartimentos unidos a membranas/intracelulares en el citosol de las celulas.

Como aqui se usa, "incorporaci6n celular" o "translocaci6n" se refiere a una de las operaciones de internalizaci6n en que moleculas externas con respecto a la membrana celular se introducen en la celula de modo que se encuentren interiormente con respecto a la membrana celular que se extiende exteriormente, por ejemplo, mediante endocitosis u otros mecanismos de incorporaci6n apropiados, por ejemplo, en, o asociadas con, unos compartimentos restringidos por membranas intracelulares, tales como, por ejemplo, el reticulo endoplasmico, el aparato de Golgi, lisosomas, endosomas, etc.

De este modo, el presente invento proporciona un metodo in vitro o ex vivo para introducir una molecula en el citosol de una celula, como se describi6 anteriormente, en que dicha celula es puesta en contacto con la molecula de transferencia en el mismo momento o despues de la irradiaci6n.

Como se discute mas adelante, el metodo se puede utilizar in vivo, y, en este aspecto, el presente invento proporciona el uso de una molecula de transferencia y un agente fotosensibilizador, en que el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia son como aqui se definen, para la preparaci6n de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

El invento proporciona ademas el uso de una molecula de transferencia como la aqui definida para la preparaci6n de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicha enfermedad, trastorno o infecci6n se va a tratar al poner en contacto celulas o tejidos de un paciente con dicho medicamento, y, separadamente, se va a poner un agente fotosensibilizador como el aqui definido en contacto con dichas celulas o tejidos de dicho paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

El presente invento proporciona ademas una composici6n relativa a una molecula de transferencia y, separadamente, un agente fotosensibilizador como el aqui definido, como una composici6n combinada para uso separado o secuencial, como se describi6 anteriormente. En un aspecto mas, el invento proporciona una molecula de transferencia como la aqui definida para un uso como el anteriormente descrito.

Preferiblemente, las celulas se ponen en contacto con las moleculas que se van a introducir o internalizar (a las que mas adelante se hace referencia como moleculas de transferencia) en un punto temporal despues de que haya tenido lugar la irradiaci6n, o, en otras palabras, el tratamiento fotoquimico de las celulas, poniendolas en contacto con un agente fotosensibilizador e irradiandolas luego, se efectua antes de que se anadan las moleculas a las celulas. En esta realizaci6n, las moleculas que se van a introducir en el citosol pueden ser puestas en contacto con las celulas que han sido sometidas a tratamiento fotoquimico en cualquier punto temporal despues de que haya tenido lugar el tratamiento con tal de que las moleculas de transferencia aun se puedan incorporar a las celulas. La ventana de tiempo en que las moleculas pueden ser puestas en contacto con las celulas y aun resultar incorporadas puede depender de diversos factores tales como, por ejemplo, el tipo celular, la molecula particular en cuesti6n, el agente fotosensibilizador particular utilizado y la duraci6n del tratamiento luminico. Esta ventana de tiempo puede ser determinada, si es necesario, para un conjunto particular de condiciones. Sin embargo, preferiblemente, la molecula que se va a transferir al citosol es expuesta a las celulas relativamente poco despues del tratamiento fotoquimico, tal como, por ejemplo, en las 24 horas despues del tratamiento fotoquimico y, mas preferiblemente, en las primeras 10 horas despues del tratamiento fotoquimico, por ejemplo, en las primeras 5 horas o, mas preferiblemente, en la primera hora. Por ejemplo, in vitro o ex vivo, la molecula de transferencia se puede administrar durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, de 30 minutos a 24 horas, preferiblemente de 1 a 2 horas, comenzando la administraci6n inmediatamente despues o poco despues de la irradiaci6n; por ejemplo, si el final de la irradiaci6n es considerado el punto de inicio, la molecula de transferencia se puede aplicar en el periodo de los 0 minutos a las 24 horas, por ejemplo, de las 0 a las 4 horas.

Se ha observado que la internalizaci6n en la celula es posible aun cuando la molecula de transferencia sea puesta en contacto con la celula un considerable tiempo despues de la irradiaci6n. De este modo, por ejemplo, la molecula de transferencia se puede aplicar mas de una hora despues de la irradiaci6n, por ejemplo, mas de 2, 4, 8, 10 o incluso 12 horas despues de la irradiaci6n.

Por lo tanto, en una realizaci6n preferida, se pone dicha celula en contacto con dicha molecula de transferencia de 0 a 4 horas despues de la irradiaci6n durante un periodo de 1 a 2 o 3 horas o mas, por ejemplo, de al menos 0,5 a 3 horas. El momento en que se administra la molecula de transferencia variara dependiendo de si los metodos se llevan a cabo in vitro o in vivo. Para los metodos in vitro, en general, las moleculas de transferencia se pueden poner simultaneamente en contacto con todas las celulas diana, por ejemplo, si las celulas estan creciendo en un cultivo in vitro, y, de este modo, es relativamente sencillo poner las moleculas en contacto con las celulas en un punto temporal apropiado. Sin embargo, in vivo, la operaci6n de poner las celulas diana en contacto con las moleculas de transferencia es evidentemente mas complicada y dependera del modo de administraci6n y de la localizaci6n de las celulas diana. Por ejemplo, cuando la molecula de transferencia se puede administrar directamente a las celulas diana, tal como, por ejemplo, por inyecci6n local, la molecula de transferencia entrara entonces en contacto con las celulas diana (o al menos una proporci6n de ellas) de forma relativamente rapida, por ejemplo, en cuesti6n de minutos u horas despues de la administraci6n. Por otra parte, si las moleculas de transferencia se administran por inyecci6n intravenosa a una diana distante, puede que estas moleculas tarden entonces mucho mas en entrar en contacto con las celulas diana. Por ejemplo, pueden tardar en alcanzar las celulas diana de 24 a 96 horas despues de la administraci6n. Este "tiempo de viaje" habra de ser tenido en cuenta a la hora de decidir el momento apropiado para administrar las moleculas de transferencia con respecto a la administraci6n del agente fotosensibilizador y el momento de

la irradiaci6n.

En una realizaci6n alternativa del invento, en lugar de que se ponga la molecula de transferencia en contacto con las celulas despues de que haya tenido lugar la irradiaci6n, se puede poner en contacto con las celulas en el mismo momento de la irradiaci6n.

Como se mencion6 anteriormente, la regulaci6n temporal precisa de la adici6n de la molecula de transferencia y el agente fotosensibilizador y la regulaci6n temporal de la irradiaci6n para conseguir los efectos anteriormente descritos han de tener en cuenta diversos factores que incluyen las celulas que se van a tratar, los agentes y moleculas en uso y el ambiente de las celulas, particularmente con respecto de si esta en cuesti6n un sistema in vitro o in vivo. Teniendo en cuenta estas consideraciones, se pueden determinar facilmente las regulaciones temporales apropiadas.

Metodos previamente descritos de internalizaci6n fotoquimica en que se anadian la molecula de transferencia y el agente fotosensibilizador a las celulas antes de la irradiaci6n dependian de que las moleculas en cuesti6n estuvieran localizadas en los mismos compartimentos intracelulares antes de la exposici6n luminica para que la lisis de estos compartimentos por la activaci6n luminica del agente fotosensibilizador diera lugar a la liberaci6n tanto de la molecula como del agente fotosensibilizador en el citosol. En la Figura 7 se presenta un dibujo esquematico que muestra esto.

Evidentemente, en los metodos presentes, el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia que se van a introducir en el citosol no estan en los mismos compartimentos intracelulares en el momento de la exposici6n luminica ya que la irradiaci6n se lleva a cabo antes de la incorporaci6n celular de la molecula de transferencia.

El mecanismo de acci6n de los metodos presentes es hasta ahora desconocido y, en realidad, el hecho de que este metodo funcione completamente es sorprendente. Aunque sin pretender un respaldo te6rico, la raz6n para estos sorprendentes hallazgos puede ser que tiene lugar la fusi6n de vesiculas fotoquimicamente danadas con vesiculas endociticas recien formadas, lo que va luego seguido de la liberaci6n de moleculas recien endocitadas en el citosol. En la Figura 7 se muestra un diagrama esquematico que ilustra esto. Alternativamente, el dano fotoquimico a enzimas lisos6micas o vesiculas que contienen enzimas lisos6micas, tales como endosomas tardios, puede reducir la velocidad de degradaci6n intracelular de las moleculas que se van a internalizar. Esto puede ser debido a un transporte reducido a vesiculas que contienen enzimas lisos6micas o a un transporte a vesiculas endociticas que contienen menor actividad hidrolitica. De esta manera, estas moleculas tendran mas tiempo para librarse de la compartimentaci6n endocitica que cuando esta activa la ruta de degradaci6n lisos6mica. 0tra explicaci6n alternativa podria ser que el tratamiento fotoquimico de las celulas condujera a un pequeno dano a la membrana plasmatica de las celulas, lo que conduciria a una penetraci6n aumentada de macromoleculas a traves de la membrana celular. Sin embargo, experimentos llevados a cabo (vease el Ejemplo 7) sugieren que probablemente esta no es la raz6n.

De esta forma, el presente invento se refiere a metodos para transportar o transfectar cualesquier moleculas al citosol de celulas vivas, sea in vitro (es decir, en cultivo) o sea in vivo, despues de lo cual las moleculas estaran disponibles en el citosol.

Dichos metodos pueden ser utilizados no s6lo para transferir moleculas (o partes o fragmentos de las mismas) al interior de una celula sino tambien, en ciertas circunstancias, para presentarlas o expresarlas en la superficie celular. De esta forma, despues del transporte y la liberaci6n de una molecula de transferencia en el citosol celular de acuerdo con los metodos del presente invento, si las celulas en cuesti6n son celulas especializadas, tales como, por ejemplo, celulas presentadoras de antigeno, la molecula o fragmento puede ser transportada a la superficie de la celula, pudiendo ser presentada en la cara externa de la celula, es decir, en la superficie celular. Dichos metodos tienen una utilidad particular en el campo de la vacunaci6n, en el que se pueden introducir componentes de vacunas, es decir, antigenos o inmun6genos, en una celula para su presentaci6n en la superficie de esa celula con objeto de provocar, facilitar o aumentar una respuesta inmune. En el Documento W0 00/54802 se describen detalles adicionales en cuanto a la utilidad de poder expresar moleculas en la superficie celular.

Las moleculas de transferencia que se pueden introducir en el citosol de celulas usando los metodos del presente invento incluyen moleculas que no penetran facilmente en las membranas celulares. Ademas, el presente invento puede aumentar la distribuci6n y actividad citos6licas de las moleculas que s6lo son parcialmente capaces de penetrar en la membrana de las celulas o las membranas de las vesiculas intracelulares. Las moleculas de transferencia pueden ser compuestos organicos, proteinas o fragmentos de proteinas tales como, por ejemplo, peptidos, anticuerpos o antigenos o fragmentos de los mismos. 0tra clase de moleculas de transferencia para uso de acuerdo con el invento son farmacos citot6xicos tales como toxinas proteinicas y compuestos organicos citot6xicos tales como, por ejemplo, la bleomicina. Los acidos nucleicos son aun otra clase de moleculas de transferencia apropiadas.

Los acidos nucleicos se pueden usar en forma de genes que codifican, por ejemplo, proteinas terapeuticas, moleculas de RNA antisentido, ribozimas, aptameros de RNA u oligonucle6tidos que forman helices triples. Alternativamente, se pueden emplear los acidos nucleicos en forma de moleculas no codificadoras tales como, por ejemplo, moleculas antisentido de DNA o RNA sinteticas, ribozimas, aptameros, oligonucle6tidos que forman helices triples, acidos nucleicos peptidicos (PNAs; del ingles, peptide nucleic acids), DNA "senuelo" para factores de transcripci6n y oligo

nucle6tidos quimericos para la reparaci6n de mutaciones especificas en el paciente. Cuando es apropiado, las moleculas de acido nucleico pueden estar en forma de genes completos o fragmentos de acido nucleico opcionalmente incorporados a una molecula o elemento vector, tal como, por ejemplo, un vector plasmidico o una particula virica o bacteri6fago. La ultima forma tiene una aplicabilidad particular cuando la molecula de transferencia se va a utilizar en metodos de terapia genica.

El agente fotosensibilizador que se va a utilizar de acuerdo con el presente invento es convenientemente cualquiera de dichos agentes que se localizan en compartimentos intracelulares, particularmente endosomas o lisosomas. Se conoce en la tecnica y se describe en la bibliografia, incluyendo en el Documento W0 96/07432, una diversidad de dichos agentes fotosensibilizadores. A este respecto, se puede hacer menci6n de ftalocianina de aluminio diy tetrasulfonada (por ejemplo, AlPcS2a), tetrafenilporfinas sulfonadas (TPPSn), azul Nilo, derivados de clorina e6, uroporfirina I, filoeritrina, hematoporfirina y azul de metileno, de los que se ha mostrado que se localizan en endosomas y lisosomas de celulas en cultivo. En la mayoria de los casos, esto se debe a la incorporaci6n endocitica del fotosensibilizador. Por lo tanto, el agente fotosensibilizador es preferiblemente un agente que se incorpora a los compartimentos internos de lisosomas o endosomas. Sin embargo, tambien se pueden utilizar otros agentes fotosensibilizadores que se localizan en otros compartimentos intracelulares, tales como, por ejemplo, el reticulo endoplasmico y el aparato de Golgi. Tambien es concebible que puedan estar actuando mecanismos cuando los efectos del tratamiento fotoquimico son sobre otros componentes de la celula (es decir, componentes distintos de compartimentos restringidos por membrana). De esta manera, por ejemplo, una posibilidad puede ser que el tratamiento fotoquimico destruya moleculas importantes para el transporte intracelular o la fusi6n de vesiculas. Puede que dichas moleculas no esten necesariamente localizadas en compartimentos restringidos por membrana, pero, no obstante, el dano fotoquimico de dichas moleculas puede conducir a la internalizaci6n fotoquimica de las moleculas de transferencia mediante, por ejemplo, un mecanismo por el que los efectos fotoquimicos sobre dichas moleculas conducen a un transporte reducido de la molecula que se va a internalizar (es decir, la molecula de transferencia) hasta vesiculas degradantes tales como lisosomas, por lo que la molecula que se va a internalizar puede escapar al citosol antes de ser degradada. Los ejemplos de dichas moleculas no necesariamente localizadas en compartimentos restringidos por membrana son diversas moleculas del sistema de transporte microtubular, como dineina y componentes de dinactina y, por ejemplo, rab5, rab7, factor sensible a Netilmaleimida (NSF; del ingles, Nethylmaleimide sensitive factor), proteina soluble de fijaci6n a NSF (SNAP; del ingles, soluble NSF attachment protein), etc.

Las clases de agentes fotosensibilizadores adecuados que se pueden mencionar incluyen asi porfirinas, ftalocianinas, purpurinas, clorinas, benzoporfirinas, naftalocianinas, colorantes cati6nicos, tetraciclinas y bases debiles lisosomotr6picas o derivados de las mismas (Berg et al., J. Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403409). 0tros agentes fotosensibilizadores adecuados incluyen texafirinas, feof6rbidos, porficenos, bacterioclorinas, cetoclorinas, derivados de hematoporfirina, y derivados de los mismos, fotosensibilizadores end6genos inducidos por el acido 5aminolevulinico y derivados del mismo, y dimeros u otros productos de conjugaci6n entre fotosensibilizadores.

Preferiblemente, el fotosensibilizador esta en forma libre, es decir, no esta conjugado con ninguna otra macromolecula. Sin embargo, el fotosensibilizador puede estar alternativamente asociado con, fijado a, o conjugado con, un vehiculo u otra molecula como la descrita mas adelante, tal como, por ejemplo, fijado a un anticuerpo para transporte dirigido o copulado con un vehiculo tal como polilisina.

Los agentes fotosensibilizadores preferidos incluyen TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a y otros fotosensibilizadores anfipaticos. En un aspecto preferido, el presente invento proporciona metodos en que los agentes fotosensibilizadores que se pueden usar son compuestos que son el acido 5aminolevulinico o esteres del acido 5aminolevulinico o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.

En dichos esteres, el grupo 5amino puede estar sustituido o no sustituido, siendo el ultimo caso los esteres de ALA.

Mas particularmente, los esteres de ALA para uso de acuerdo con el invento son esteres de acidos 5aminolevulinicos con alcanoles opcionalmente sustituidos, es decir, esteres de alquilo o esteres de alquilo sustituido.

Convenientemente, los esteres de ALA que se pueden usar son compuestos de f6rmula I,

R22NCH2C0CH2CH2C00R1 (I)

(en que R1 puede representar alquilo opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo, alcoxilo, aciloxilo, alcoxicarboniloxilo, amino, arilo, oxo o fluoro y opcionalmente interrumpido por atomos de oxigeno, nitr6geno, azufre o f6sforo; y R2, cada uno de los cuales puede ser igual o diferente, representa un atomo de hidr6geno o un grupo R1) y sales de los mismos.

Los grupos alquilicos R1 sustituidos pueden estar monosustituidos o polisustituidos. De este modo, los grupos R1 adecuados incluyen, por ejemplo, alquilo no sustituido, alcoxialquilo, hidroxialcoxialquilo, polihidroxialquilo, hidroxipolialquilenoxialquilo y similares. Como aqui se usa, el termino "acilo" incluye tanto grupos carboxilato como carbonato; asi, los grupos alquilo sustituidos con aciloxilo incluyen, por ejemplo, alquilcarboniloxialquilo. En dichos grupos, los restos de alquileno tienen preferiblemente el contenido de atomos de carbono definido mas adelante para los grupos alquilo. Los grupos arilo preferidos incluyen fenilo y compuestos heteroaromaticos monociclicos de 57

miembros, especialmente fenilo, y dichos grupos pueden estar en si opcionalmente sustituidos.

Los grupos R1 de alquilo sustituido representativos incluyen los grupos alcoximetilo, alcoxietilo, y alcoxipropilo o los grupos aciloximetilo, aciloxietilo y aciloxipropilo, por ejemplo, pivaloiloximetilo.

Los esteres de ALA preferidos para uso como agentes fotosensibilizadores de acuerdo con el invento incluyen aquellos en que R1 representa un grupo alquilo no sustituido y/o cada R2 representa un atomo de hidr6geno.

Como aqui se usa, el termino "alquilo" incluye cualquier grupo hidrocarbonado alifatico saturado o insaturado, de cadena lineal o ramificada y cadena larga o corta. Los grupos alquilo insaturados pueden ser monoinsaturados o poliinsaturados e incluyen grupos tanto alquenilo como alquinilo. Dichos grupos pueden contener hasta 40 atomos de carbono. Sin embargo, se prefieren los grupos alquilo que contienen hasta 10, por ejemplo 8, mas preferiblemente hasta 6 y especial y preferiblemente hasta 4, atomos de carbono.

Se puede hacer una particular menci6n del ester metilico de ALA, el ester etilico de ALA, el ester propilico de ALA, el ester hexilico de ALA, el ester heptilico de ALA y el ester octilico de ALA, y sales de los mismos, que representan agentes fotosensibilizadores preferidos para uso de acuerdo con el invento.

Necesariamente, el agente fotosensibilizador es puesto en contacto con una celula antes de la irradiaci6n. Sin embargo, a diferencia de la molecula de transferencia, este agente deberia ser administrado suficientemente antes de la irradiaci6n para que en la irradiaci6n dicho agente se hubiera incorporado a un compartimento intracelular. De este modo, dicho agente se aplica convenientemente de 1 a 72 horas antes de la irradiaci6n, por ejemplo, de 4 a 48, por ejemplo, de 4 a 24, horas antes de la irradiaci6n. De nuevo, como se discuti6 anteriormente con respecto a la operaci6n de poner la molecula de transferencia en contacto con las celulas, la regulaci6n temporal de la administraci6n del agente fotosensibilizador para que alcance el contacto con la celula diana en relaci6n con el momento de la irradiaci6n dependera del tiempo que tarde el agente fotosensibilizador en alcanzar las celulas diana y ser incorporado por ellas. Este tiempo puede variar dependiendo de si los metodos se llevan a cabo in vitro o in vivo y de si la administraci6n se dirige al tejido diana o es en un sitio distal. En todos los casos, es importante que el agente fotosensibilizador haya sido incorporado por las celulas diana antes de que tenga lugar la irradiaci6n. Dicho agente puede ser mantenido inmediatamente en contacto con dichas celulas hasta la irradiaci6n, por ejemplo, durante 1 o 4 a 72 horas, preferiblemente 4 a 24 horas, por ejemplo, 12 a 20 horas, o puede ser retirado del contacto inmediatamente antes de la irradiaci6n, por ejemplo, durante mas de 5 minutos, por ejemplo, durante 10 minutos a 8 horas, por ejemplo, de 1 hora a 4 horas, en medio exento de agente.

0pcionalmente, uno o el otro del agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia que se van a introducir en las celulas, o ambos, se pueden fijar a, o asociar con, o conjugar con, una o mas moleculas vehiculares, moleculas para transporte dirigido o vectores que pueden actuar para facilitar o aumentar la incorporaci6n del agente fotosensibilizador o la molecula de transferencia o pueden actuar para dirigir o suministrar estos elementos a un tipo celular, tejido o compartimiento intracelular particular. Los ejemplos de sistemas vehiculares incluyen polilisina u otros policationes, sulfato de dextrano, diferentes lipidos cati6nicos, liposomas, particulas de LDL reconstituidas, liposomas estericamente estabilizados y particulas de adenovirus. En general, estos sistemas vehiculares pueden mejorar la farmacocinetica y aumentar la incorporaci6n celular de la molecula de transferencia y/o el agente fotosensibilizador y pueden ademas dirigir la molecula de transferencia y/o el agente fotosensibilizador a compartimentos intracelulares que son especialmente beneficiosos para obtener una internalizaci6n fotoquimica, pero no tienen generalmente la capacidad para el transporte dirigido de la molecula de transferencia y/o el agente fotosensibilizador a celulas (por ejemplo, celulas cancerosas) o tejidos especificos. Sin embargo, para conseguir dicho transporte dirigido especifico o selectivo, las moleculas vehiculares, la molecula de transferencia y/o el fotosensibilizador se pueden asociar o conjugar con moleculas especificas para transporte dirigido que promoveran la incorporaci6n celular especifica de la molecula de transferencia a celulas o tejidos deseados. Dichas moleculas para transporte dirigido pueden tambien dirigir la molecula de transferencia a compartimentos intracelulares que son especialmente beneficiosos para obtener una internalizaci6n fotoquimica.

Se pueden emplear muchas moleculas para transporte dirigido diferentes, como se describe en, por ejemplo, D. T. Curiel (1999), Ann. New York Acad. Sci. 886, 158171; G. Bilbao et al. (1998) en Gene Therapy of Cancer (redactado por Walden et al., Plenum Press, New York); K. W. Peng y S. J. Rusell (1999), Curr. 0pin. Biotechnol. 10, 454457; y T. J. Wickham (2000), Gene Ther. 7, 110114.

Se puede asociar, unir o conjugar la molecula vehicular y/o la molecula para transporte dirigido con la molecula de transferencia o el agente fotosensibilizador, o con ambos, y se pueden utilizar los mismos o diferentes vehiculos o moleculas para transporte dirigido. Si, por ejemplo, se usan particulas de adenovirus como vehiculos, se pueden incorporar entonces las moleculas de transferencia a las particulas de adenovirus. Por ejemplo, si la molecula de transferencia en cuesti6n es una molecula de DNA que codifica una proteina o una molecula de RNA, se incorpora entonces el DNA al vector virico y, despues de la internalizaci6n fotoquimica, la molecula de DNA estara presente en la localizaci6n intracelular correcta para que pueda tener lugar la expresi6n de la molecula codificada.

La expresi6n de dichas moleculas puede ser controlada al disenar el vector mediante metodos bien conocidos y documentados en la tecnica. Por ejemplo, se pueden usar elementos reguladores tales como, por ejemplo, promoto

res tisularmente especificos o regulables para obtener una expresi6n especifica o regulable para el tejido o la enfermedad. Por ejemplo, se puede usar el promotor de tirosinasa especifica de melanoma, un promotor tisularmente especifico. Promotores regulables tales como los promotores regulados por tetraciclina son bien conocidos. En I. R. Hart, 1996, Semin. Oncol. 23, 154158; D. E. Hallahan et al., 1995, Nature Med. 1, 786791; M. C. Luna et al., 2000, Cancer Res. 60, 16371644; N. Miller y J. Whelan, 1997, Hum. Gene Ther.; T. J. Wickham, 2000, Gene Ther. 7, 110114; D. M. Nettelbeck y J. V. Muller, 2000, Trends Genet. 16, 174181; T. Clackson, 2000, Gene Ther. 7, 120125; S. Freundlieb et al., 1999, J. Gene Med. 1, 412; M. A. Spear, 1998, Anticancer Res. 18, 322331, D. M. Harvey y C. T. Caskey, 1998, Curr. Opin. Chem. Biol. 2 , 512518; B. M. Clary y H. K. Lyerly, 1998, Surg. Oncol. Clin. North Am. 7, 565574; M. C. Luna et al., Cancer Res. 60, 16371644; y las referencias alli citadas, se pueden hallar mas ejemplos de promotores especificos o regulados que se pueden emplear en el presente invento.

Como se mencion6 anteriormente, se pueden usar simultaneamente mas de un vehiculo y/o molecula para transporte dirigido o vector. Por ejemplo, se pueden proporcionar vectores en un vehiculo; por ejemplo, se pueden transportar vectores viricos, tales como adenovirus, en, por ejemplo, un liposoma o una estructura policati6nica.

Los vehiculos y vectores preferidos para uso en el presente invento, particularmente para uso junto con la molecula de transferencia, incluyen adenovirus, policationes tales como polilisina (por ejemplo, poliLlisina o poliDlisina), polietilenimina o dendrimeros (por ejemplo, dendrimeros cati6nicos tales como SuperFect@); lipidos cati6nicos tales como D0TAP y Lipofectin; peptidos y vectores dirigidos tales como, por ejemplo, transferrinapolilisina y vectores adenoviricos dirigidos. En una realizaci6n particularmente preferida del invento, el vehiculo es un adenovirus.

Dichas moleculas para transporte dirigido o vehiculos como los anteriormente descritos pueden ser tambien utilizados para dirigir la molecula de transferencia a compartimentos intracelulares particulares especialmente beneficiosos para el empleo de la PCI, tales como, por ejemplo, lisosomas o endosomas.

El compartimento intracelular restringido por membrana puede ser cualquier compartimento que este presente en una celula. Preferiblemente, el compartimento sera una vesicula de membrana, especialmente un endosoma o un lisosoma. Sin embargo, el compartimento intracelular puede tambien incluir el aparato de Golgi o el reticulo endoplasmico.

La operaci6n de irradiaci6n luminica para activar el agente fotosensibilizador puede tener lugar de acuerdo con tecnicas y procedimientos bien conocidos en este campo tecnico. Por ejemplo, se pueden seleccionar la longitud de onda y la intensidad de la luz de acuerdo con el agente fotosensibilizador usado. Las fuentes luminicas adecuadas son bien conocidas en la tecnica. El tiempo durante el cual se exponen las celulas a la luz en los metodos del presente invento puede variar. Parece que la eficacia de la internalizaci6n de la molecula de transferencia en el citosol aumenta con una exposici6n aumentada a la luz. El periodo de tiempo preferido para la operaci6n de irradiaci6n depende del fotosensibilizador, la cantidad de fotosensibilizador acumulada en las celulas o tejidos diana y la superposici6n entre el espectro de absorci6n del fotosensibilizador y el espectro de emisi6n de la fuente luminica. Generalmente, el periodo de tiempo para la operaci6n de irradiaci6n es del orden de minutos a varias horas, por ejemplo, preferiblemente hasta 60 minutos, por ejemplo, de 0,5 o 1 a 30 minutos, por ejemplo, de 0,5 a 3 minutos o de 1 a 5 minutos o de 1 a 10 minutos, por ejemplo, de 3 a 7 minutos, y preferiblemente de aproximadamente 3 minutos, por ejemplo, de 2,5 a 3,5 minutos. Las dosis luminicas apropiadas pueden ser seleccionadas por una persona experta en la tecnica y dependeran de nuevo del fotosensibilizador y de la cantidad de fotosensibilizador acumulada en las celulas o tejidos diana. Por ejemplo, las dosis luminicas tipicamente utilizadas para el tratamiento fotodinamico de canceres con el fotosensibilizador Photofrin y el precursor de protoporfirina acido 5aminolevulinico estan en el intervalo de 50150 J/cm2 con un intervalo de fluencia inferior a 200 mW/cm2 con objeto de evitar una hipertermia. Las dosis luminicas son normalmente menores cuando se usan fotosensibilizadores con mayores coeficientes de extinci6n en la zona roja del espectro visible. Sin embargo para el tratamiento de tejidos no cancerosos con menos fotosensibilizador acumulado, la cantidad total de luz necesaria puede ser sustancialmente mayor que para el tratamiento de canceres.

Determinar las dosis apropiadas de moleculas diana para uso en los metodos del presente invento es una practica rutinaria para una persona experta en la tecnica. Cuando la molecula de transferencia es una proteina o un peptido, para aplicaciones in vitro las moleculas de transferencia se utilizarian generalmente en dosis inferiores a 5 mg/ml (por ejemplo, 0,15 mg/ml) y para aplicaciones in vivo las moleculas de transferencia se utilizarian generalmente en dosis inferiores a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,15 mg/kg). Cuando la molecula de transferencia es un acido nucleico, para aplicaciones in vitro una dosis ejemplar de las moleculas de transferencia seria aproximadamente 0,150 Ig de acido nucleico por 104 celulas y para aplicaciones in vivo seria aproximadamente 1061 g de acido nucleico por inyecci6n en seres humanos. Cuando la molecula de transferencia esta asociada con un vehiculo de adenovirus, para aplicaciones in vitro una dosis ejemplar seria 11x105 particulas viricas fisicas, por ejemplo, 1x1031x105 particulas por celula, y para aplicaciones in vivo la molecula que se va a introducir en asociaci6n con el vehiculo adenovirico puede estar presente en una concentraci6n de 1x109 a 50%, tal como de 3x106 a 50%, por ejemplo, de 0,003 a 30%, por ejemplo, de 0,2 a 10% (peso/peso) de particulas viricas en la composici6n final para uso in vivo, en que peso/peso se refiere al peso del vehiculo virico ademas del de la molecula que se va a introducir con respecto al peso de la composici6n final. Si se utiliza en inyecciones de 1 ml, esto corresponderia a una dosis de aproximadamente 105 a 1015 particulas viricas fisicas.

Los metodos del invento daran inevitablemente lugar a cierta muerte celular en virtud del tratamiento fotoquimico, es decir, por medio de la acci6n del agente fotosensibilizador. Sin embargo, esta muerte celular no importa y puede ser realmente ventajosa para muchas de las aplicaciones (por ejemplo, el tratamiento de un cancer), y los metodos del invento pueden ser modificados para que la fracci6n o proporci6n de las celulas supervivientes sea regulada seleccionando la dosis luminica en relaci6n con la concentraci6n del agente fotosensibilizador. De nuevo, dichas tecnicas son conocidas en este campo tecnico. Independientemente de la cantidad de muerte celular provocada por el tratamiento fotoquimico puro, es importante que la dosis luminica sea regulada para que algunas de las celulas individuales en que se manifiesta el efecto de la PCI no resulten muertas por el tratamiento fotoquimico puro (aunque puedan ser posteriormente muertas a causa del efecto de la PCI).

En ciertas aplicaciones puede resultar apropiado conservar un numero mayor de celulas viables despues del tratamiento por PCI. Por ejemplo, en la vacunaci6n y algunos metodos de terapia genica, es importante tener celulas viables que permitan, por ejemplo, presentaci6n antigenica o expresi6n proteica. En tales aplicaciones, es apropiado que no resulte muerta una poblaci6n o pluralidad de celulas, sustancialmente todas las celulas, ni una mayoria significativa (por ejemplo, al menos el 50%, mas preferiblemente al menos el 60, 70, 80 o 90% de las celulas). Por supuesto, esto no siempre es deseable, especialmente cuando se utiliza la PCI para introducir moleculas de transferencia citot6xicas y no resulta desventajoso que haya mas muerte celular. Sin embargo, tambien se pueden alcanzar efectos citot6xicos utilizando, por ejemplo, una terapia genica mediante la cual se internaliza un gen terapeutico en celulas tumorales mediante el metodo del invento para que, por ejemplo, estas celulas produzcan sustancias inmunol6gicamente activas que provoquen la muerte inmunol6gica local de las celulas cancerosas restantes o provoquen una respuesta inmune sistemica hacia las celulas tumorales. En dichos casos, despues del tratamiento por PCI se requiere evidentemente una proporci6n de celulas viables.

Las ventajas de los metodos presentes y la secuencia de operaciones de tratamiento, especialmente las realizaciones en que se anade la molecula de transferencia a las celulas despues de la operaci6n de irradiaci6n luminica, en comparaci6n con los metodos previamente descritos son:

a) el dano fotoquimico a la molecula de transferencia resulta disminuido;

b) simplificaci6n del tratamiento de lesiones internas por PCI en combinaci6n con cirugia ya que el tratamiento fotoquimico puede ser llevado a cabo despues de la exposici6n quirurgica de la lesi6n, seguido, por ejemplo, de la inyecci6n intratumoral u otra administraci6n local de la molecula de transferencia;

c) los metodos son mas independientes de la regulaci6n temporal exacta del tratamiento, es decir, de la regulaci6n temporal de la adici6n de la molecula que va a ser incorporada por las celulas con respecto al punto temporal de la irradiaci6n. Esto significa que hay "una ventana de tiempo" mas grande para el tratamiento. Esto es importante ya que la incorporaci6n de una molecula terapeutica puede variar ampliamente en diferentes situaciones clinicas y, ademas, es dificil estimar la incorporaci6n para lesiones individuales en una situaci6n clinica, lo que hace que, por lo tanto, una ventana de tiempo mas grande sea sumamente ventajosa;

d) tiene lugar una rapida translocaci6n de la molecula de transferencia al citosol, por lo que disminuyen sustancialmente las posibilidades de degradaci6n lisos6mica de la molecula de transferencia.

Estas ventajas son ademas de las ventajas asociadas con los metodos de internalizaci6n de moleculas por PCI per se, es decir: 1) no hay restricci6n alguna en cuanto al tamano de la molecula que se va a internalizar y distribuir al citosol con tal de que la molecula pueda ser endocitada por la celula diana; 2) los metodos no dependen de la proliferaci6n celular; 3) los metodos son especificos del sitio ya que s6lo resultan afectadas las zonas expuestas a la luz; 4) no es oncogenico.

Las operaciones de "poner en contacto" las celulas con un agente fotosensibilizador y con la molecula de transferencia pueden ser llevadas a cabo de cualquier modo conveniente o deseado. De esta manera, si la operaci6n de puesta en contacto va a ser llevada a cabo in vitro, las celulas pueden ser convenientemente mantenidas en un medio acuoso tal como, por ejemplo, un medio para cultivo celular apropiado, y, en el punto temporal apropiado, se puede anadir simplemente el agente fotosensibilizador o la molecula de transferencia al medio bajo unas condiciones apropiadas, por ejemplo, en una concentraci6n apropiada y durante un periodo de tiempo apropiado.

El agente fotosensibilizador es puesto en contacto con las celulas en una concentraci6n apropiada y durante un periodo de tiempo apropiado, los cuales pueden ser facilmente determinados por una persona experta usando tecnicas rutinarias y dependeran del agente fotosensibilizador particular usado y el tipo celular. La concentraci6n del agente fotosensibilizador debe ser tal que, una vez incorporado a la celula, por ejemplo, a, o asociado con, uno o mas de sus compartimentos intracelulares, y activado por irradiaci6n, se rompan una o mas estructuras celulares, por ejemplo, se lisen o rompan uno o mas compartimentos intracelulares. Por ejemplo, los agentes fotosensibilizadores usados en los presentes Ejemplos se pueden utilizar en una concentraci6n de, por ejemplo, 10 a 50 Ig/ml. Para uso in vitro, el intervalo puede ser mucho mas amplio, tal como, por ejemplo, 0,05500 Ig/ml. Para tratamientos in vivo a seres humanos, el agente fotosensibilizador puede ser utilizado en el intervalo de 0,0520 mg/kg de peso corporal cuando se administra sistemicamente o de 0,120% en un disolvente para aplicaci6n t6pica. En animales mas pequenos, el intervalo de concentraciones puede ser diferente y puede ser consecuentemente ajustado.

El tiempo de incubaci6n de las celulas con el agente fotosensibilizador (es decir, el tiempo de "contacto") puede variar de unos pocos minutos a varias horas, por ejemplo, incluso hasta 48 horas o mas. El tiempo de incubaci6n deberia ser tal que el agente fotosensibilizador resultara incorporado por las celulas apropiadas.

La incubaci6n de las celulas con el agente fotosensibilizador puede ir opcionalmente seguida de un periodo de incubaci6n con medio exento de fotosensibilizador antes de que las celulas sean expuestas a la luz o se anada la molecula de transferencia.

La molecula de transferencia puede ser cualquier molecula como las anteriormente discutidas y es puesta en contacto con las celulas en una concentraci6n apropiada y durante un periodo de tiempo apropiado. Sorprendentemente, se ha hallado que se puede iniciar el contacto incluso varias horas despues de la irradiaci6n. Se puede determinar una concentraci6n apropiada dependiendo de la eficacia de la incorporaci6n de la molecula en cuesti6n a las celulas en cuesti6n y de la concentraci6n final que se desea alcanzar en las celulas. De este modo, el "tiempo de transfecci6n" o "tiempo de incorporaci6n celular", es decir, el tiempo durante el cual las moleculas estan en contacto con las celulas, puede ser unos pocos minutos o hasta unas pocas horas; por ejemplo, se puede utilizar un tiempo de transfecci6n de 10 minutos hasta 24 horas, por ejemplo, de 30 minutos hasta 10 horas o, por ejemplo, de 30 minutos hasta 2 horas o 6 horas. Un tiempo de transfecci6n aumentado da normalmente lugar a una incorporaci6n aumentada de la molecula en cuesti6n. Sin embargo, parece que los tiempos de incubaci6n mas cortos, por ejemplo, de 30 minutos a 1 hora, dan lugar a una especificidad mejorada de la incorporaci6n de la molecula. Por lo tanto, al seleccionar un tiempo de transfecci6n para cualquier metodo, se debe llegar a un equilibrio apropiado entre obtener una suficiente incorporaci6n de la molecula y mantener una suficiente especificidad de incorporaci6n.

In vivo, un metodo y un tiempo de incubaci6n apropiados mediante los cuales se pongan en contacto las moleculas de transferencia y los agentes fotosensibilizadores con las celulas diana dependeran del modo de administraci6n y del tipo de molecula de transferencia y de agentes fotosensibilizadores. Por ejemplo, si la molecula de transferencia se inyecta en un tumor que va a ser tratado, las celulas pr6ximas al punto de inyecci6n entraran en contacto con, y, por lo tanto, tenderan a incorporar, la molecula de transferencia mas rapidamente que las celulas situadas a una mayor distancia del punto de inyecci6n, siendo probable que estas entren en contacto con la molecula de transferencia en un punto temporal posterior y en menor concentraci6n. Ademas, una molecula de transferencia administrada por inyecci6n intravenosa puede tardar cierto tiempo en llegar a las celulas diana y, por lo tanto, puede durar mas el tiempo posterior a la administraci6n, por ejemplo, varios dias, para que se acumule una cantidad suficiente u 6ptima de la molecula de transferencia en una celula o tejido diana. Por supuesto, se aplican las mismas consideraciones al tiempo de administraci6n requerido para la incorporaci6n del agente fotosensibilizador a las celulas. De este modo, es probable que el tiempo de administraci6n requerido para celulas individuales in vivo varie dependiendo de estos y otros parametros.

No obstante, aunque la situaci6n in vivo es mas complicada que in vitro, el concepto subyacente del presente invento es aun el mismo, es decir, el momento en que las moleculas entran en contacto con las celulas diana debe ser tal que, antes de que tenga lugar la irradiaci6n, una cantidad apropiada del agente fotosensibilizador debe haber sido incorporada por las celulas diana, y: o bien (i) la molecula de transferencia esta siendo incorporada durante la irradiaci6n, o bien (ii) despues de la irradiaci6n, la molecula de transferencia esta en contacto con las celulas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir su incorporaci6n a las celulas.

El termino "celula" se usa aqui para incluir todas las celulas eucari6ticas (incluyendo celulas de insectos y celulas fungicas). Las "celulas" representativas incluyen asi todos los tipos de celulas de animales mamiferos y no mamiferos, celulas vegetales, celulas de insectos, celulas fungicas y protozoos.

Los metodos del presente invento pueden ser utilizados in vitro o in vivo, sea por tratamiento in situ (por ejemplo, utilizando componentes para transporte dirigido) o sea por tratamiento ex vivo seguido de la administraci6n de las celulas tratadas al organismo.

Los metodos del presente invento pueden ser usados, por ejemplo, en el tratamiento del cancer. Diversos fotosensibilizadores se acumulan preferentemente en tejidos neoplasicos, siendo normalmente la selectividad para un tumor con respecto al tejido circundante un factor de 23, pero, en ciertos casos, tales como para tejidos cerebrales, este factor puede ser mayor, es decir, de hasta 30. Alternativamente, se puede dirigir un agente fotosensibilizador particular a un tumor particular mediante los metodos anteriormente descritos. Ademas, moleculas que pueden ser de interes clinico para el tratamiento del cancer pero estan restringidas por falta de incorporaci6n o poca incorporaci6n al citosol pueden ser introducidas en el citosol y dirigidas a celulas especificas por medio del presente invento. Como se ejemplifica mas adelante, la gelonina es un ejemplo de dicha molecula. Se pueden usar otras moleculas, solas o enlazadas con otras moleculas que dirigen la molecula que se va a internalizar a una celula particular (por ejemplo, anticuerpos, transferrina, fotosensibilizadores, y apoB sobre particulas de LDL reconstituidas). Las ventajas de dicho tratamiento de combinaci6n serian: 1) un efecto citot6xico potenciado en capas mas profundas de los tejidos tumorales ya que dosis bajas y subt6xicas de luz son suficientes para la rotura de lisosomas y endosomas; y 2) una especificidad potenciada del tratamiento ya que s6lo se administra la PCI a la zona tumoral.

Los metodos del invento pueden ser tambien usados para tratar otros diversos trastornos, como viene dictado por la selecci6n de la molecula que se va a introducir en la celula, tales como artritis reumatoide, arteriosclerosis y otras

enfermedades cardiovasculares, infecciones viricas y otras infecciones, psoriasis, queratosis actinica, cicatrizaci6n de heridas, cicatrizaci6n de fracturas, verrugas y trastornos geneticos heredados tales como fibrosis quistica, sindrome de Gorlin y ataxia telangiectasia.

Los metodos del invento pueden ser tambien utilizados en terapia genica, es decir, la transferencia terapeutica de genes a celulas de un paciente. La terapia genica es prometedora como metodo para tratar muchas enfermedades, tales como cancer, enfermedades cardiovasculares, infecciones viricas, trastornos monogenicos tales como fibrosis quistica y muchos otros estados tales como los anteriormente descritos. Hoy en dia, un problema significativo en la terapia genica es la eficacia y la especificidad elevadas de la transferencia genica que debe tener lugar in vivo. En los metodos actuales se usan muchos vehiculos o vectores diferentes para llevar a cabo la transferencia genica en terapia genica. Se pueden mencionar compuestos policati6nicos, lipidos cati6nicos y sistemas viricos como ejemplos, pero hasta ahora la terapia genica in vivo ha tenido poco exito. Entre los muchos inconvenientes conocidos de los metodos actuales estan la baja estabilidad serica del vector, la especificidad limitada en la distribuci6n de genes, la baja eficacia en la distribuci6n de genes, etc. Los metodos de PCI del presente invento proporcionan un medio para mejorar sustancialmente tanto la eficacia como la especificidad de muchos de los metodos de distribuci6n genica actualmente empleados en terapia genica, al mejorar la fase de liberaci6n endos6mica, la cual puede ser limitante de la eficacia tanto para muchos vectores sinteticos de distribuci6n genica como para diversos sistemas viricos. El tratamiento luminico inherente al metodo de PCI tambien hace posible definir precisamente donde debe tener lugar en el organismo la transferencia genica potenciada, ya que el aumento de eficacia de la transferencia genica s6lo tendra lugar en zonas irradiadas. La transfecci6n puede ser llevada a cabo in vitro, in vivo o ex vivo (administrandose celulas o tejidos al paciente cuando es apropiado). Preferiblemente, los vehiculos y vectores adecuados para la transfecci6n incluyen adenovirus, policationes tales como polilisina (por ejemplo, poliDlisina o poliLlisina), SuperFect@, polietilenimina o dendrimeros; lipidos cati6nicos tales como D0TAP y Lipofectin y lipidos cati6nicos formulados con un "lipido auxiliar" tal como D0PE; peptidos, y vectores dirigidos tales como, por ejemplo, transferrinapolilisina y vectores adenoviricos dirigidos. En una realizaci6n preferida del invento, el vehiculo usado para el gen terapeutico es un adenovirus.

0tro aspecto preferido del presente invento es utilizar sistemas vehiculares no viricos tales como, por ejemplo, polimeros cati6nicos, incluyendo lipidos cati6nicos y peptidos. Los polimeros tipicos incluyen, por ejemplo, poliamina, poliaminoacidos que incluyen poliaminoacidos basicos, polimeros de azucar cati6nicos sinteticos y naturales, polimeros de metacrilato, dendrimeros, polialquileniminas y otros polimeros conocidos en la tecnica por ser utiles en la distribuci6n de farmacos, especialmente polimeros utiles en distribuci6n genica. Los compuestos tipicos, utiles de acuerdo con el presente invento, incluyen polilisina, poliarginina, poli(acido Lglutamico), polivinilpiridina, quitosan, polietilenimina, poli[metacrilato de (2dimetilamino)etilo], histonas, protamina, poli(Lornitina), avideno, espermina, espermidina y cualquier derivado de los mismos. En un aspecto preferido del presente invento, los polimeros aqui descritos pueden ser combinados con otros polimeros o combinados con otros sistemas para distribuci6n genica. Por ejemplo, R. I. Mahato et al. en Advances in Genetics (redactado por J. C. Hall et al.) (1999) 41, 95156, describen un sistema no virico para distribuci6n genica, util de acuerdo con el presente invento. M. C. Garnett en Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1999) 16, 147207, K. A. Howard et al. en Biochimica et Biophysica Acta (2000) 1475, 245255, H. K. Nguyen et al. en Gene Therapy (2000) 7, 126138, A. Bragonzi et al. en J. Controlled Release (2000) 65, 187202, S. C. DeSmedt et al. en Pharmaceutical Research (2000) 17, 113126, y R. I. Mahoto en J. Drug Targeting (1999) 7, 249268, describen adicionalmente polimeros cati6nicos.

0tro aspecto del presente invento implica el uso de liposomas u otras construcciones de base lipidica como sistemas vehiculares no viricos. Los liposomas pueden ser liposomas sensibles al pH o liposomas no sensibles al pH. Los liposomas sensibles al pH consisten en al menos un componente sensible al pH en la membrana del liposoma. Los compuestos tipicos incluyen acidos grasos tales como acido oleico, palmitoilhomocisteina, colesterol, sal de hemisuccinato y morfolina, y dioleilsuccinilglicerol. Ademas de los componentes sensibles al pH, los liposomas pueden consistir en dioleoilfosfatidiletanolamina (D0PE) y/o otros fosfolipidos similares.

Los liposomas u otro sistema de base lipidica para distribuci6n contienen preferiblemente al menos un lipido cati6nico.

El sistema de base lipidica para distribuci6n puede estar presente en diversos tipos de formulaci6n acuosa. Para estas formulaciones, en la bibliografia se utilizan diversos terminos y expresiones: liposomas multilaminares, liposomas unilaminares, liposomas sensibles al pH, nanoemulsiones, nanoparticulas, proteoliposomas, virosomas, quimerasomas, coquelatos, Lipofectin@ y Lipoplex. Las referencias al uso de lipidos cati6nicos en transferencia genica incluyen P. L. Felgner et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84, 74137417, D. D. Lasic et al. en Adv. Drug Del. Rev. (1996), 20, 221266, L. G. Barron et al. en Gene Therapy (1999), 6, 11791183, S. Kawakami et al. en Pharmaceutical Research (2000), 17, 306313, N. S. Templeton et al. en Molecular Biotechnology (1999), 11, 175180, Y. Zou et al. en Cancer Gene Therapy (2000), 7, 683696, D. D. Stuart et al. en Biochemistry et Biophysica Acta (2000), 1463, 219229, R. I. Mahato et al. en Drug Deliv. (1997), 4, 151, y R. J. Lee et al. en Crit. Rev. Drug Carrier Syst. (1997), 14, 173.

En, por ejemplo, los Documentos US 6.120.751, US 6.056.938, US 6.093.816, US 6.039.936, US 6.034.137, US 6. 034.135, US 6.020.526, US 5.980.935, US 5.958.935, US 5.935.936, US 5.877.220, US 5.830.430, US 5.777.153, US 5.705.693, US 5.459.127, US 5.334.761, US 5.264.618 y las referencias en ellos citadas se describen lipidos

utiles de acuerdo con el presente invento.

Los ejemplos tipicos de lipidos cati6nicos incluyen cloruro de N[1(2,3dioleiloxi)propil]N,N,Ntrimetilamonio (D0TMA), bromuro de 1,2dimiristiloxipropil3dimetilhidroxietilamonio (DMRIE), 1,2bis(oleoiloxi)3(trimetilamino)propano (D0TAP), 3�(N',N'dimetilaminoetano)carbamoilcolesterol (DCCol), trifluoroacetato de 2,3dioleiloxiN(2esperminacarboxilamido)etilN,Ndimetil1propanaminio (D0SPA), 3�(N4esperminacarbamoil)colesterol, 3�(N4espermidinacarbamoil)colesterol y dioctadecilamidoglicilespermina (D0GS).

Como se describi6 anteriormente, en una de las realizaciones preferidas del invento el vehiculo es lipidos cati6nicos. Se ha comunicado previamente que el tratamiento fotoquimico ejerce un efecto inhibidor sobre la transfecci6n mediada por lipidos cati6nicos cuando se proporciona luz despues de la molecula de transferencia [Prasmickaite et al. (2000), J. Gene Med. 6, en prensa]. Sin embargo, ahora se ha mostrado muy sorprendentemente que cuando se proporciona luz antes de la molecula de transferencia, la PCI puede ejercer un efecto estimulante sobre la transfecci6n por lipidos cati6nicos (vease el Ejemplo 9).

Ademas, otro aspecto del invento proporciona una composici6n que contiene una molecula de transferencia como la aqui definida y, separadamente, un agente fotosensibilizador como el aqui definido, como una composici6n combinada para uso separado o secuencial en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica. 0pcionalmente, la molecula de transferencia y/o el agente fotosensibilizador de las composiciones se pueden asociar con moleculas vehiculares tales como las anteriormente descritas. Preferiblemente, las composiciones se usan para terapia del cancer o terapia genica. Para terapia genica, una molecula vehicular preferida es un adenovirus. 0tros vehiculos preferidos son lipidos cati6nicos.

Por lo tanto, en otro aspecto, el presente invento proporciona el uso de una molecula de transferencia y un agente fotosensibilizador, en que el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia son como aqui se definen para la preparaci6n de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

Como aqui se define, "tratamiento" se refiere a reducir, aliviar o eliminar uno o mas sintomas de la enfermedad, trastorno o infecci6n que se esta tratando, con respecto a los sintomas previos al tratamiento. "Prevenci6n" se refiere a retrasar o prevenir el inicio de los sintomas de la enfermedad, trastorno o infecci6n.

Como se mencion6 previamente, dichos metodos tambien tienen aplicaci6n en metodos de vacunaci6n. En consecuencia, un aspecto mas del invento proporciona un metodo in vitro para expresar o presentar una molecula antigenica (la molecula de transferencia) o parte de ella en la superficie de una celula, preferiblemente una celula presentadora de antigeno, en que dicho metodo comprende las operaciones anteriormente definidas. El correspondiente segundo uso medico es un aspecto mas de este invento.

Como aqui se usa, "expresar" o "presentar" se refiere a la presencia de la molecula o parte de ella en la superficie de dicha celula para que al menos una porci6n de esa molecula quede expuesta y accesible al ambiente que rodea a esa celula. La expresi6n en la "superficie" puede ser llevada a cabo de modo que la molecula que se va a expresar este en contacto con la membrana celular y/o con componentes que pueden estar presentes, o que se puede hacer que esten presentes, en esa membrana.

Preferiblemente, dicha presentaci6n antigenica puede dar ventajosamente lugar a la estimulaci6n de una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta inmune que confiera protecci6n frente a la subsiguiente estimulaci6n por un elemento que comprenda o contenga dicha molecula antigenica o parte de ella, y, consecuentemente, el invento encuentra una utilidad particular como un uso para vacunaci6n. Por lo tanto, el presente invento proporciona preferiblemente un uso para vacunaci6n que comprende el uso anteriormente descrito.

En este aspecto del invento, a la molecula de transferencia como aqui se define se hace referencia como "molecula antigenica". La molecula antigenica puede ser cualquier molecula, siendo esa molecula o una parte de ella capaz de estimular una respuesta inmune cuando se presenta al sistema inmune de un modo apropiado. Por lo tanto, la molecula antigenica sera ventajosamente un antigeno de vacuna o componente de vacuna, tal como un elemento que contiene un polipeptido.

Muchos de dichos antigenos o componentes antigenicos de vacuna son conocidos en la tecnica e incluyen toda clase de antigenos bacterianos o viricos o, en realidad, antigenos o componentes antigenicos de cualquier especie

pat6gena, incluyendo protozoos y organismos superiores. Ademas, aunque tradicionalmente los componentes antigenicos de vacunas han comprendido organismos completos (vivos, muertos o atenuados), es decir, vacunas de celulas completas, las vacunas de subunidades, es decir, las vacunas basadas en componentes antigenicos particulares de organismos, por ejemplo, proteinas o peptidos, o incluso hidratos de carbono, han sido ampliamente investigadas y presentadas en la bibliografia. Cualquiera de dichos componentes de vacuna basados en "subunidades" puede ser usado como la molecula antigenica del presente invento. Sin embargo, el invento encuentra una utilidad particular en el campo de las vacunas peptidicas. De este modo, una molecula antigenica preferida de acuerdo con el invento es un peptido (que se define aqui para incluir peptidos mas cortos y mas largos, es decir, peptidos, oligopeptidos y polipeptidos, y tambien moleculas proteinicas o fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, peptidos de 5500, por ejemplo, de 10 a 250, tal como de 15 a 75, o de 8 a 25, aminoacidos). Las partes de moleculas antigenicas que se presentan o expresan comprenden preferiblemente partes que son generadas mediante la maquinaria de la celula para procesamiento de antigenos. Sin embargo, las partes pueden ser generadas mediante otro medio, pudiendose conseguir por medio de un apropiado diseno antigenico (por ejemplo, banda sensibles al pH) o a traves de otro medio de procesamiento celular. Convenientemente, dichas partes tienen un tamano suficiente para generar una respuesta inmune, tal como, por ejemplo, un tamano superior a 5, por ejemplo, superior a 10 o 20, aminoacidos en el caso de peptidos.

Se ha propuesto un vasto numero de candidatos a vacuna peptidica en la bibliografia, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades e infecciones viricas tales como gripe o infecci6n por HIV/sida, parvovirus canino, virus de la leucemia bovina, hepatitis, etc. [veanse, por ejemplo, Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy Immunol. 1997, 15 (1), 418; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69 (4), 81120; Casal et al., J. Virol., 1995, 69 (11), 72747; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95 (4), 170914; Naruse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91 (20), 958892; Kabeya et al., Vaccine 1996, 14 (12), 111822; Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83 (23), 91748. Similarmente, se pueden usar peptidos bacterianos, como en efecto se pueden usar antigenos peptidicos procedentes de otros organismos o especies.

Ademas de antigenos procedentes de organismos pat6genos, se han propuesto tambien peptidos para uso como vacunas contra el cancer u otras enfermedades tales como la esclerosis multiple. Por ejemplo, peptidos de oncogenes mutantes siguen siendo muy prometedores como vacunas para el cancer al actuar como antigenos en la estimulaci6n de linfocitos T citot6xicos (Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical 0ncology 1995, 121, 443451; Curtis, Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316327). Tambien se ha evaluado una vacuna peptidica sintetica para el tratamiento del melanoma metastasico (Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4 (3), 3217). Wilson et al., J. Neuroimmunol. 1997, 76 (12), 1528, han descrito una vacuna peptidica de receptor de celulas T para el tratamiento de la esclerosis multiple. Cualquiera de dichos componentes peptidicos de vacuna puede ser utilizado como molecula antigenica del invento, como en efecto puede serlo cualquiera de los peptidos descritos o propuestos como vacunas peptidicas en la bibliografia. De esta manera, el peptido puede ser sintetico o aislado o, en otro caso, procedente de un organismo.

La celula que es sometida a los metodos, usos, etc. de este aspecto del invento puede ser cualquier celula que sea capaz de expresar, o presentar en su superficie, una molecula que es administrada o transportada a su citosol.

Puesto que la utilidad primaria de este aspecto del invento radica en presentaci6n antigenica o vacunaci6n, la celula es convenientemente una celula efectora inmune, es decir, una celula implicada en la respuesta inmune. Sin embargo, otras celulas tambien pueden presentar un antigeno al sistema inmune y caen tambien dentro del alcance de este aspecto del invento. De este modo, ventajosamente, las celulas de acuerdo con este aspecto son celulas presentadoras de antigeno. La celula presentadora de antigeno puede estar implicada en cualquier aspecto o "rama" de la respuesta inmune, incluyendo tanto la inmunidad humoral como la inmunidad mediada por celulas, tal como, por ejemplo, la estimulaci6n de la producci6n de anticuerpos o la estimulaci6n de celulas citot6xicas o asesinas, las cuales pueden reconocer y destruir (o, en cualquier caso, eliminar) celulas que expresan antigenos "extranos" en su superficie. La expresi6n "estimular una respuesta inmune" incluye asi todos los tipos de respuestas inmunes y los mecanismos para estimularlas.

La estimulaci6n de las celulas citot6xicas o las celulas productoras de anticuerpos requiere que las celulas presentadoras de antigeno presenten antigenos de una manera particular a la celula que se va a estimular, por ejemplo, la presentaci6n del MHC de Clase I (por ejemplo, la activaci6n de celulas T citot6xicas CD8+ requiere la presentaci6n de antigenos por el MHC1).

Las celulas presentadoras de antigeno son conocidas en la tecnica y descritas en la bibliografia e incluyen, por ejemplo, linfocitos (tanto celulas T como B), celulas dendriticas, macr6fagos, etc. 0tras incluyen, por ejemplo, celulas cancerosas, tales como, por ejemplo, celulasdemelanoma.

Para la presentaci6n antigenica por una celula presentadora de antigeno a una celula T citot6xica (CTL; del ingles, citotoxic T lymphocyte), es necesario que la molecula antigenica entre en el citosol de la celula presentadora de antigeno (Germain, Cell, 1994, 76, 287299). El presente invento proporciona un medio eficaz de distribuci6n de la molecula antigenica en el citosol.

Una vez liberada en el citosol celular mediante el proceso de internalizaci6n fotoquimica, la molecula antigenica

puede ser procesada por la maquinaria procesadora de antigenos de la celula y ser presentada en la superficie celular de un modo apropiado por, por ejemplo, el MHC de Clase I. Este procesamiento puede implicar una degradaci6n del antigeno, por ejemplo, la degradaci6n de un antigeno proteico o polipeptidico en peptidos, peptidos que se complejan luego con moleculas del MHC para su presentaci6n. De esta manera, la molecula antigenica expresada o presentada en la superficie de la celula de acuerdo con el presente invento puede ser una parte o fragmento de la molecula antigenica que se incorpora a la celula.

Los antigenos pueden ser incorporados por las celulas presentadoras de antigeno mediante endocitosis y ser degradados hasta peptidos en las vesiculas endociticas. Estos peptidos pueden unirse a moleculas del MHC de Clase II en los endosomas y ser transportados a la superficie celular, donde el complejo de peptidoMHC de Clase II puede ser reconocido por celulas cooperadoras T CD4+ y provocar una respuesta inmune. Alternativamente, proteinas del citosol pueden ser degradadas en partes de las mismas, por ejemplo, mediante proteosomas, y ser transportadas al reticulo endoplasmico por medio de un transportador asociado con la presentaci6n de antigenos (TAP), donde los peptidos pueden unirse a moleculas del MHC de Clase I y ser transportados a la superficie celular, como se ilustra en la Figura 1 (Yewdell y Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52: 1123). Si el peptido es un antigeno de origen extrano, el complejo de peptidoMHC de Clase I sera reconocido por celulas T citot6xicas (CTLs) CD8+. Las CTLs se uniran al complejo de peptidoMHC (HLA) de Clase I y, por ello, se activaran, comenzaran a proliferar y formaran un clon de CTLs. La celula diana y otras celulas diana con el mismo complejo de peptidoMHC de Clase I en su superficie pueden ser matadas por el clon de CTLs. Se puede establecer una inmunidad frente al antigeno extrano si se puede introducir una cantidad suficiente del antigeno en el citosol (Yewdell y Bennink, 1992, supra; Rock, 1996, Immunology Today 17: 131137). Esta es la base para el desarrollo de, inter alia, vacunas contra el cancer. Uno de los mayores problemas practicos es introducir cantidades suficientes de antigenos (o partes del antigeno) en el citosol. Esto puede ser resuelto de acuerdo con el presente invento mediante una PCI.

Las composiciones tambien pueden comprender una celula que contenga una molecula de transferencia que se haya internalizado en el citosol de dicha celula mediante un metodo del invento, para uso en terapia, particularmente terapia contra el cancer, terapia genica y vacunaci6n.

De este modo, se describe una celula o una poblaci6n de celulas que contiene una molecula de transferencia que se ha internalizado en el citosol de dicha celula, celula que es obtenible mediante un metodo del presente invento.

Se describe el uso de dicha celula o poblaci6n de celulas para la preparaci6n de una composici6n o un medicamento para uso en terapia, preferiblemente terapia contra el cancer, terapia genica o vacunaci6n.

Se describe un metodo de tratamiento de un paciente, que comprende administrar celulas o composiciones del presente invento a dicho paciente, es decir, un metodo que comprende las operaciones de introducir una molecula en una celula del modo anteriormente descrito y administrar dicha celula asi preparada a dicho paciente. Dichos metodos pueden ser utilizados para tratar el cancer, en terapia genica o para vacunaci6n.

In vivo, se puede usar cualquier modo de administraci6n comun o corriente en la tecnica, tal como, por ejemplo, inyecci6n, infusi6n, administraci6n t6pica, tanto a superficies corporales internas como externas, etc. Para uso in vivo, se puede usar el invento en relaci6n con cualquier tejido que contenga celulas en las que se localicen el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia, incluyendo localizaciones en fluidos corporales, asi como tejidos s6lidos. Se pueden tratar todos los tejidos con tal de que el fotosensibilizador sea incorporado por las celulas diana y se pueda suministrar apropiadamente la luz.

De este modo, las composiciones y medicamentos del invento se pueden formular de cualquier modo conveniente de acuerdo con tecnicas y procedimientos conocidos en el campo farmaceutico usando, por ejemplo, uno o mas vehiculos o excipientes farmaceuticamente aceptables. Como aqui se hace referencia, "farmaceuticamente aceptable" se refiere a ingredientes que son compatibles con otros ingredientes de la composici6n o medicamento asi como fisiol6gicamente aceptables para el receptor. La naturaleza de la composici6n o medicamento y de los vehiculos

o materiales excipientes, las dosificaciones, etc. se pueden seleccionar de forma rutinaria de acuerdo con la elecci6n y la via deseada de administraci6n, la finalidad del tratamiento, etc. Asimismo, las dosificaciones pueden ser determinadas de forma rutinaria y pueden depender de la naturaleza de la molecula, la finalidad del tratamiento, la edad del paciente, el modo de administraci6n, etc. En relaci6n con el agente fotosensibilizador, tambien se deberia tener en cuenta la potencia/capacidad para romper membranas tras la irradiaci6n.

El invento sera ahora descrito con mayor detalle en los Ejemplos no restrictivos siguientes con referencia a los dibujos siguientes, en que:

La Figura 1 muestra la transfecci6n, provocada por luz, de celulas THX con un complejo de pEGFPN1/polilisina, en que las celulas son puestas en contacto con el complejo de pEGFPN1/polilisina antes o despues de que las celulas hayan sido expuestas a luz, como se indica en la Figura.

La Figura 2 muestra la transfecci6n, provocada por luz, de celulas HCT116 con un complejo de pEGFPN1/polilisina, en que las celulas son puestas en contacto con el complejo de pEGFPN1/polilisina antes o despues de que las celulas hayan sido expuestas a luz, como se indica en la Figura.

La Figura 3 muestra el tratamiento, provocado por luz, de celulas THX con gelonina y, de este modo, una reducci6n de la sintesis de proteinas, en que las celulas son puestas en contacto con la molecula de gelonina antes o despues de que las celulas hayan sido expuestas a luz, como se indica en la Figura.

La Figura 4 muestra el efecto, sobre la eficacia de la transfecci6n de celulas THX provocada por luz, de la puesta en contacto de las celulas con el complejo de pEGFPN1/polilisina inmediatamente despues de la exposici6n a la luz y en puntos temporales posteriores despues de la exposici6n a la luz.

La Figura 5 muestra el efecto sobre la eficacia de la transfecci6n de celulas THX provocada por luz cuando las celulas son puestas en contacto con el complejo de pEGFPN1/polilisina, en diversos puntos temporales antes y despues de la exposici6n a la luz.

La Figura 6 muestra el efecto sobre la transfecci6n de celulas THX provocada por luz cuando las celulas son puestas en contacto con el complejo de pEGFPN1/polilisina durante diversos periodos de tiempo despues de la exposici6n a la luz.

La Figura 7 muestra una representaci6n esquematica de un modelo potencial mediante el cual puede funcionar el presente invento.

A. El fotosensibilizador S es endocitado (I) y va a parar a vesiculas intracelulares (II). Estas vesiculas se rompen tras la exposici6n a la luz (III).

B. Despues del tratamiento fotoquimico, como se describe en A, las celulas son tratadas con una molecula M que es endocitada y va a parar a vesiculas intracelulares. Estas vesiculas se fusionaran con vesiculas fotoquimicamente danadas, y la molecula M se liberara en el citosol.

La Figura 8 muestra el efecto del tratamiento de las celulas a 0 °C con el complejo de pEGFPN1/polilisina, sobre la transfecci6n.

La Figura 9 muestra la transfecci6n, provocada por luz, del complejo de pEGFPN1/polilisina cuando se utiliza 3THPP, que no se localiza esencialmente en vesiculas endociticas, como un agente fotosensibilizador.

La Figura 10 muestra el efecto de una combinaci6n de fotosensibilizador y pretratamiento luminico sobre la transfecci6n de celulas con lipidos cati6nicos.

La Figura 11 muestra el efecto del tratamiento fotoquimico sobre la transducci6n adenovirica de celulas THX.

La Figura 12 muestra el efecto del tratamiento fotoquimico sobre la localizaci6n intracelular de FITCdextrano. Se incubaron celulas THX con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, seguidas de una incubaci6n durante 4 horas en medio exento de AlPcS2a. Las celulas fueron luego expuestas a luz durante 4 minutos (B, D) o mantenidas en la oscuridad (A, C) antes de una incubaci6n de 3 horas con 5 mg/ml de FITCdextrano. Micrografias de fluorescencia (A, B) y contraste de fase (C, D).

La Figura 13 muestra el efecto del tratamiento fotoquimico sobre la toxicidad de gelonina en celulas THX y HCT 116. Para la estrategia "luz antes", las celulas fueron primero incubadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas y luego durante otras 4 horas en medio exento de AlPcS2a antes de la exposici6n a la luz, como se indica en la figura. Despues de la irradiaci6n, se anadi6 1 Ig/ml de gelonina y se incubaron las celulas durante 18 horas. Para la estrategia "luz despues", las celulas fueron conjuntamente incubadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a y 1 Ig/ml de gelonina durante 18 horas antes de la exposici6n a la luz, como se indica en la figura. Las celulas testigo fueron tratadas s6lo con 1 Ig/ml de gelonina durante 18 horas y fueron expuestas a la luz; o s6lo con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, cazadas 4 horas en medio exento de AlPcS2a y expuestas a la luz. Se midi6 la incorporaci6n de [3H]leucina a las proteinas el dia siguiente despues del tratamiento luminico y se expres6 como sintesis proteica relativa. Los puntos de datos representan la media ± el error estandar (S.E.; del ingles, standard error) de triplicados.

La Figura 14 muestra el efecto del tratamiento fotoquimico sobre la expresi6n de galactosidasa en celulas THX infectadas con AdHCMVlacZ. Para la estrategia "luz antes", celulas pretratadas con AlPcS2a fueron incubadas durante otras 4 horas en medio exento de AlPcS2a antes de una exposici6n luminica durante 3 minutos. Despues de la irradiaci6n, las celulas fueron infectadas con AdHCMVlacZ [con una multiplicidad de infecci6n (M0I; del ingles, multiplicity of infection) de 1] durante 30 minutos a 37 °C. Luego se anadieron 2 ml de medio y se incubaron las celulas durante dos dias antes del analisis de la expresi6n de galactosidasa. Para la estrategia "luz despues", celulas tratadas con AlPcS2a fueron incubadas en medio exento de AlPcS2a durante 3 horas antes de una infecci6n de 30 minutos con AdHCMVlacZ. Despues de la adici6n de 2 ml de medio de cultivo, las celulas fueron incubadas durante otros 30 minutos antes de una irradiaci6n durante 3 minutos y, dos dias mas tarde, fueron analizadas en cuanto a la expresi6n de galactosidasa.

La Figura 15 muestra el efecto del tiempo de incubaci6n sobre la eficacia de la transfecci6n, provocada por luz, con pEGFP/polilisina en celulas THX y HCT 116. Celulas pretratadas con AlPcS2a fueron lavadas e incubadas en medio exento de AlPcS2a durante 4 horas antes de una exposici6n luminica durante 3 minutos (celulas THX) o 7 minutos

(celulas HCT). Despues de la irradiaci6n, se anadi6 el complejo de pEGFPN1/polilisina (5 Ig/ml de plasmido) y se incubaron las celulas durante los diferentes periodos de tiempo indicados en la figura. Despues de separar el complejo, se anadi6 medio fresco exento de complejo y se incubaron las celulas durante dos dias antes del analisis de la expresi6n de EGFP.

La Figura 16 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas THX mediada por poliLlisina usando TPPS2a como fotosensibilizador, en comparaci6n con la estrategia "luz despues", usando diversos tiempos de irradiaci6n. PLLL: irradiaci6n despues del complejo de pEGFPN1/PLL. LPLL: irradiaci6n antes del complejo de pEGFPN1/PLL. Barras no sombreadas - sin luz; barras sombreadas - irradiaci6n de 70 segundos; barras negras -irradiaci6n de 100 segundos.

La Figura 17 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas THX mediada por poliLlisina usando TPPS4 como fotosensibilizador, en comparaci6n con la estrategia "luz despues", usando diversos tiempos de irradiaci6n. PLLL: irradiaci6n despues del complejo de pEGFPN1/PLL. LPLL: irradiaci6n antes del complejo de pEGFPN1/PLL. Barras no sombreadas - sin luz; barras horizontalmente sombreadas - irradiaci6n de 50 segundos; barras verticalmente sombreadas -irradiaci6n de 70 segundos; barras negras - irradiaci6n de 100 segundos.

La Figura 18 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliLlisina usando TPPS2a como fotosensibilizador, en comparaci6n con la estrategia "luz despues", usando diversos tiempos de irradiaci6n. PLLL: irradiaci6n despues del complejo de pEGFPN1/PLL. LPLL: irradiaci6n antes del complejo de pEGFPN1/PLL. Barras no sombreadas - sin luz; barras sombreadas - irradiaci6n de 70 segundos; barras negras -irradiaci6n de 100 segundos.

La Figura 19 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliLlisina usando TPPS4 como fotosensibilizador. PLLL: irradiaci6n despues del complejo de pEGFPN1/PLL. LPLL: irradiaci6n antes del complejo de pEGFPN1/PLL. Barras no sombreadas - sin luz; barras horizontalmente sombreadas - irradiaci6n de 1,5 minutos; barras verticalmente sombreadas - irradiaci6n de 2 minutos; barras negras -irradiaci6n de 3 minutos.

La Figura 20 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n mediada por D0TAP usando TPPS4 como fotosensibilizador, en comparaci6n con la estrategia "luz despues", usando diversos tiempos de irradiaci6n. D0TAPL: irradiaci6n despues del complejo de pEGFPN1/D0TAP. LD0TAP: irradiaci6n antes del complejo de pEGFPN1/D0TAP. Barras no sombreadas - sin luz; barras sombreadas - irradiaci6n de 70 segundos; barras negras -irradiaci6n de 100 segundos.

La Figura 21 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n mediada por SuperFect@ usando TPPS2a como fotosensibilizador, en que se usan diversos tiempos de irradiaci6n y transfecci6n y se varia la cantidad de DNA para transfecci6n. _ - transfecci6n durante 1 hora con 0,75 Ig de DNA; . -transfecci6n durante 4 horas con 0,75 Ig de DNA; o -transfecci6n durante 1 hora con 1,5 Ig de DNA.

La Figura 22 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transducci6n genica de celulas HCT 116, mediada por adenovirus, usando AlPcS2a como fotosensibilizador, en que el virus se anade en diversos momentos. Se analiz6 por citometria de flujo, como se describe en el Ejemplo, el porcentaje de celulas transducidas cuando se anadi6 el virus en diferentes puntos temporales. En la figura se indican los puntos temporales de adici6n de los complejos viricos. Los puntos temporales a la izquierda del eje Y representan el virus anadido antes de la irradiaci6n, y los puntos temporales a la derecha representan la adici6n del virus despues de la irradiaci6n. _ - irradiaci6n de 1 minuto; D -sin irradiaci6n.

La Figura 23 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliDlisina usando AlPcS2a como fotosensibilizador, con tiempos de irradiaci6n variables.

La Figura 24 muestra el efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la muerte celular por el agente citostatico bleomicina usando TPPS2a como fotosensibilizador, con cantidades variables de bleomicina, tiempos de irradiaci6n y tiempos de transfecci6n. 0 -5 TPPS, 1 h = bleomicina 5 IM, sin TPPS2a, 1 h de incubaci6n; • -5 TPPS+, 1 h = bleomicina 5 IM, con TPPS2a, 1 h de incubaci6n; f - 25 TPPS, 1 h = bleomicina 25 IM, sin TPPS2a, 1 h de incubaci6n; . - 25 TPPS+, 1 h = bleomicina 25 IM, con TPPS2a, 1 h de incubaci6n; D -100 TPPS, 1 h = bleomicina 100 IM, sin TPPS2a, 1 h de incubaci6n; _ - 100 TPPS+, 1 h = bleomicina 100 IM, con TPPS2a, 1 h de incubaci6n; o 100 TPPS, 4 h = bleomicina 100 IM, sin TPPS2a, 4 h de incubaci6n; . - 100 TPPS+, 4 h = bleomicina 100 IM, con TPPS2a, 4 h de incubaci6n.

La Figura 25 muestra el efecto de la PCI con gelonina para el tratamiento de tumores en un modelo de rat6n in vivo. Los grupos de tratamiento fueron los siguientes: (f) s6lo gelonina; (_) un tratamiento con placebo por inyecci6n de disoluci6n salina tamponada con fosfato (PBS; del ingles, phosphate buffered saline), combinado con irradiaci6n; (0) s6lo el tratamiento fotoquimico (es decir, AlPcS2a + luz) pero sin gelonina; (.) tratamiento completo de PCI con gelonina (es decir, AlPcS2a + gelonina + luz).

EJEMPLOS

Materiales�M�Metodo�

Lineas celulares

Se estableci6 la linea celular THX de melanoma humano a partir de tejido tumoral obtenido de un paciente tratado para melanoma maligno metastasico en el Norwegian Radium Hospital (Aamdal et al., 1986, Int. J. Cancer 37, 579) y se cultiv6 en medio RPMI 1640 (GibcoBRL) complementado con FCS al 10% (GibcoBRL) y glutamina 2 mM (GibcoBRL). Se obtuvo la linea celular HCT 116 de carcinoma de colon humano del American Type Culture Collection (ATCC nO CCL247) y se cultiv6 en medio RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal (FCS; del ingles, foetal calf serum) al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, y glutamina 2 mM (todos de Gibco BRL, Paisley, Reino Unido).

Irradiaci6n

Se utilizaron dos diferentes fuentes de luz para el tratamiento de las celulas, consistentes ambas en una hilera de 4 tubos fluorescentes. Las celulas tratadas con TPPS4, TPPS2a y 3THPP (Porphyrin Products, Logan, Utah, EE.UU.) fueron expuestas a luz azul (modelo 3026; Appl. Photophysics, Londres, Reino Unido) con una intensidad luminica que alcanzaba a las celulas de 1,5 mW/cm2, mientras que las celulas tratadas con AlPcS2a (Porphyrin Products, Logan, Utah, EE.UU.) fueron expuestas a luz roja (Philips TL 20W/09) filtrada a traves de un filtro Cinemoid 35 con una intensidad luminica que alcanzaba a las celulas de 1,35 mW/cm2.

Microscopia de fluorescencia

Las celulas fueron analizadas mediante microscopia de fluorescencia del modo descrito por K. Berg et al., Biochem. Biophys. Acta 1370: 317324, 1998. Para el analisis de las moleculas marcadas con fluoresceina, el microscopio fue provisto de un filtro de excitaci6n de 450490 nm, un divisor dicroico de haz de 510 nm y un filtro de emisi6n de paso de banda de 510540 nm.

Preparaci6n de complejos de plasmidopLys y tratamiento de las celulas

Se prepararon complejos de plasmidopLys [relaci6n de cargas de 1,7, como describen Berg et al. (1999), Cancer Res. 59: 118083] mezclando lentamente 5 Ig de plasmido (pEGFPN1; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, EE.UU.) en 75 Il de HBS con 5,3 Ig de pLys (peso molecular de 20.700; Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) en 75 Il de HBS. Las disoluciones fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiental, diluidas con medio de cultivo y anadidas a las celulas.

Las celulas THX fueron incubadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas a 37 °C, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 3 horas antes de la incubaci6n con los complejos de plasmidopLys durante 1 hora seguida de exposici6n a luz. Alternativamente, despues de la incubaci6n con AlPcS2a, las celulas fueron lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 4 horas antes de la exposici6n a luz seguida de una incubaci6n de 1 hora con los complejos de plasmidopLys. Antes de que se llevara a cabo el analisis de la expresi6n de GFP por citometria de flujo, las celulas fueron incubadas a 37 °C durante 2 dias.

Las celulas HCT116 fueron incubadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas e incubadas durante 4 horas en ausencia de AlPcS2a antes de la exposici6n luminica. Las celulas fueron tratadas con complejo de pEGFPN1/polilisina durante 4 horas inmediatamente antes o despues de la exposici6n a la luz. Despues de 2 dias de incubaci6n a 37 °C, se estudi6 la expresi6n de GFP por citometria de flujo.

Analisis por citometria de flujo

Las celulas fueron tratadas con tripsina, centrifugadas, resuspendidas en 400 Il de medio de cultivo y separadas por filtraci6n a traves de un filtro de nailon de 50 Im de malla. Las celulas fueron luego analizadas mediante un cit6metro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). Se recogieron 10.000 subconjuntos de resultados para cada muestra. Se midi6 la fluorescencia de fluoresceina [por ejemplo, proteina fluorescente verde (GFP; del ingles, green fluorescent protein)] a traves de un filtro de 510530 nm despues de la excitaci6n con un laser de arg6n (200 mW) ajustado 488 nm. Se midi6 la AlPcS2a a traves de un filtro de paso largo de 670 nm despues de la excitaci6n con un laser di6dico (50 mW) ajustado a 635 nm. Los dobletes celulares y las celulas muertas fueron discriminados de las celulas viables individuales por acotamiento. Los datos fueron analizados con el software CELLQuest (Becton Dickinson).

Ejemplo1

Transfecci6n provocada por luz en funci6n de la dosis luminica

Celulas THX fueron tratadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 3 horas, lo que fue seguido de una incubaci6n de 1 hora con 5 Ig de complejo de pEGFPN1/polilisina antes de una exposici6n luminica durante 1, 2, 3 o 4 minutos. Alternativamente, despues de la incuba

ci6n con AlPcS2a, las celulas fueron lavadas e incubadas durante 4 horas en medio exento de sensibilizador antes de un tratamiento luminico durante 1, 2, 3 o 4 minutos, seguidos de 1 hora con complejo de pEGFPN1/polilisina, como se indica en la Figura 1. Se analiz6 la expresi6n de GFP por citometria de flujo 48 horas despues de la exposici6n luminica. La relaci6n de cargas para el complejo de pEGFPN1/polilisina fue 1,7.

Los resultados se muestran en la Figura 1, y se puede ver que la transfecci6n de GFP es tan eficaz cuando el complejo de plasmidopLys (es decir, pEGFPN1/pLys) se anade a las celulas despues de la exposici6n luminica como cuando se anade antes. Tambien se puede ver que con ambos tratamientos el porcentaje de celulas transfectadas depende del periodo de tiempo durante el cual las celulas estan expuestas a la luz, alcanzando el porcentaje un maximo nivel a aproximadamente 2 minutos y nivelandose luego.

Ejemplo2

Expresi6n de GFP en celulas HCT116

Se incubaron celulas HCT116 con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, seguidas de 4 horas en ausencia de AlPcS2aantes de la exposici6n a la luz. Las celulas fueron tratadas con complejo de pEGFPN1/polilisina durante 4 horas inmediatamente antes o despues de la exposici6n a la luz, como se indica en la Figura 2. La expresi6n de GFP se midi6 por citometria de flujo 2 dias despues de la exposici6n luminica.

Los resultados se muestran en la Figura 2, y se puede ver que, de un modo similar a la transfecci6n de las celulas THX en el Ejemplo 1, la transfecci6n de GFP es tan eficaz cuando el complejo de plasmidopLys (es decir, pEGFPN1/pLys) se anade a las celulas despues de la exposici6n luminica como cuando se anade antes. De nuevo, el porcentaje de celulas transfectadas varia dependiendo del periodo de tiempo durante el cual las celulas estan expuestas a la luz.

Ejemplo3

Efectos sinergicos de la adici6n de gelonina antes y despues del tratamiento fotoquimico

La gelonina es una toxina vegetal que inhibe eficazmente la sintesis proteica cuando esta presente en el citosol de celulas. Se incubaron celulas THX con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, seguidas de 4 horas en medio exento de sensibilizador antes de la exposici6n a la luz. Las celulas fueron conjuntamente tratadas con AlPcS2a y 1 Ig/ml de gelonina, o se anadi6 gelonina (1 Ig/ml) al medio inmediatamente despues de una exposici6n luminica durante 18 horas, despues de lo cual fue separada del medio, como se indica en la Figura 3. Se midi6 la sintesis proteica 24 horas despues de la exposici6n luminica.

Los resultados se muestran en la Figura 3, y se puede ver que, aunque el propio tratamiento fotoquimico en ausencia de gelonina conduce a cierta reducci6n de la sintesis proteica, la presencia de gelonina antes o despues del tratamiento fotoquimico provoca una inhibici6n significativamente mayor de la sintesis proteica. Estos datos muestran que la gelonina se internaliza en las celulas si se pone la gelonina en contacto con las celulas antes o despues del tratamiento fotoquimico.

Ejemplo�

Efecto del tiempo de caza sobre la transfecci6n provocada por luz

Celulas THX fueron tratadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 4 horas antes de un tratamiento luminico de 3 minutos. Las celulas fueron incubadas en medio de cultivo durante los tiempos indicados en la Figura 4 antes de un tratamiento con complejo de pEGFPN1/polilisina (relaci6n de cargas de 1,7) durante 1 hora. Se analiz6 la expresi6n de GFP por citometria de flujo 48 horas despues de la exposici6n luminica.

Los resultados se muestran en la Figura 4, y se puede ver que, para los mejores resultados, la molecula que se va a internalizar debe ser expuesta a las celulas relativamente poco despues del tratamiento fotoquimico ya que la transfecci6n con pEGFPN1 decae con una semivida de aproximadamente 5 horas despues de la exposici6n luminica.

Ejemplo�

Eficacia de la transfecci6n en funci6n de un pulso de transfecci6n, con respecto a la irradiaci6n

Celulas THX fueron tratadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador. Las celulas recibieron un pulso (0,5 o 1 hora; en la Figura 5, la anchura de la barra refleja el comienzo y el fin del tratamiento) de tratamiento con el complejo de pEGFPN1/polilisina antes (valores de abscisas negativos)

o despues (valores de abscisas positivos) de una exposici6n luminica de 3 minutos. Se analiz6 la expresi6n de GFP por citometria de flujo 48 horas despues de la exposici6n luminica. Los datos de diversos experimentos han sido normalizados tomando como 100% la eficacia de transfecci6n cuando esta se lleva a cabo justo antes o justo despues de la exposici6n luminica.

Los resultados se muestran en la Figura 5, y se puede ver que, para la mejor eficacia de transfecci6n, las celulas deben ser expuestas a las moleculas que se van a internalizar poco antes o despues de la exposici6n a la luz.

Ejemplo6

Transfecci6n provocada por luz -dependencia del tiempo de incubaci6n con el complejo de pEGFPN1/polilisina

Celulas THX fueron tratadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 4 horas antes de la exposici6n a la luz, lo que fue seguido de una incubaci6n con complejo de pEGFPN1/polilisina (relaci6n de cargas de 1,7) durante hasta 6 horas, como se ilustra en la Figura 6A. Se analiz6 la expresi6n de GFP por citometria de flujo 48 horas despues de la exposici6n luminica. El numero de celulas que expresan GFP despues de dichos tratamientos se presenta en la Figura 6B, y la especificidad de los diferentes tratamientos se presenta en la Figura 6C.

Los resultados se muestran en la Figura 6, y se puede ver que, aunque el numero de celulas transfectadas aumenta al aumentar el tiempo de incubaci6n con el complejo de pEGFPN1/polilisina (Figura 6B), la mayor especificidad de transfecci6n tiene lugar despues de los tiempos de incubaci6n mas cortos (Figura 6C).

Ejemplo7

Tratamiento con complejo de pEGFPN1/polilisina a 0 °C

Este experimento fue disenado para probar si el tratamiento fotoquimico conducia a un dano menor a las membranas celulares, lo que significaria que el plasmido puesto en contacto con las celulas despues del tratamiento luminico podria filtrarse a traves de la membrana plasmatica.

Celulas THX fueron tratadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 4 horas antes de la exposici6n luminica, lo que fue inmediatamente seguido de una incubaci6n de 45 minutos a 0 °C con complejo de pEGFPN1/polilisina (relaci6n de cargas de 1,7). Las celulas fueron luego A) tratadas con tripsina y sembradas antes de ser transferidas a 37 °C, o B) transferidas a 37 °C sin tratamiento con tripsina. Las celulas fueron expuestas a luz, como se indica en la Figura 8. Se analiz6 la expresi6n de GFP por citometria de flujo 48 horas despues de la exposici6n luminica.

Despues de la incubaci6n de las celulas durante 45 minutos a 0 °C con complejo de pEGFPN1/polilisina, el complejo se pegara a la superficie celular pero no sera endocitado. Las celulas THX fueron luego incubadas en medio exento de plasmido a 37 °C (Figura 8B) o fueron tratadas con tripsina (Figura 8A) para separar el plasmido de la superficie y sembradas en nuevas placas a 37 °C. Estos experimentos indican que el complejo de plasmido/polilisina no se filtra a traves de la membrana plasmatica despues del tratamiento fotoquimico.

Ejemplo8

Combinaci6n de 3THPP y luz con un tratamiento con complejo de pEGFPN1/polilisina

Celulas THX fueron tratadas con 0,25 Ig/ml de 3THPP durante 18 horas, lavadas e incubadas en medio exento de sensibilizador durante 4 horas antes de la exposici6n luminica, lo que fue inmediatamente seguido de una incubaci6n de 1 hora con complejo de pEGFPN1/polilisina (relaci6n de cargas de 1,7). Las celulas fueron expuestas a luz, como se indica en la Figura 9, y fueron analizadas en cuanto a la expresi6n de GFP por citometria de flujo 48 horas despues de la exposici6n luminica.

El 3THPP es un fotosensibilizador cuya localizaci6n principal no es en endosomas ni lisosomas. Los resultados mostrados en la Figura 9 indican que el tratamiento de las celulas con 3THPP antes de la irradiaci6n s6lo provoca un aumento menor de la expresi6n de GFP en comparaci6n con los resultados mostrados en ejemplos previos en que se usa el agente fotosensibilizador AlPcS2a. Esto indica que puede resultar ventajoso un agente fotosensibilizador que se localice en endosomas y lisosomas.

Ejemplo�

La combinaci6n de fotosensibilizador y tratamiento luminico permite la transfecci6n de celulas usando lipidos cati6nicos

Se sembraron celulas HCT 116 en una placa de 12 pocillos, con una densidad de 75.000 celulas/pocillo, un dia antes del experimento. Las celulas fueron incubadas con el fotosensibilizador AlPcS2a (20 Ig/ml) durante 18 horas, seguidas de una caza de 7 horas en medio exento de fotosensibilizador, y fueron expuestas a luz roja durante 7 minutos. Las celulas fueron luego incubadas con un complejo de D0TAP (El D0TAP fue obtenido de Boehringer) con el plasmido pEGFPN1 (D0TAP/plasmido de 5:1, 1 Ig/ml de pEGFPN1) durante 3 horas, lavadas con el medio de cultivo e incubadas a 37° durante 21 horas antes de que se midiera la expresi6n de EGFP por citometria de flujo del modo descrito en Materiales y Metodos. Las celulas testigo no fueron expuestas a la luz; por lo demas, el tratamiento fue identico.

Los resultados se muestran en la Figura 10, y se puede ver que el tratamiento por PCI aumenta aproximadamente 4 veces la eficacia de transfecci6n con el complejo de D0TAP/plasmido.

Ejemplo�10

Efecto de la PCI sobre la transducci6n adenoviral de celulas THX

Material

Se obtuvo fluoresceinadiDgalactopiran6sido (FDG) de Molecular Probes (F1179). Se prepar6 una disoluci6n madre 20 mM disolviendo el polvo en una mezcla 1:1 de DMS0/etanol. La mezcla se anadi6 gradualmente a un volumen apropiado de agua enfriada con hielo para preparar una disoluci6n en H20/DMS0/etanol 8:1:1.

Se form6 el virus recombinante AdCA17lacZ y se propag6 en la linea celular humana 293, una linea celular de rin6n embrionario transformada con Ad E1, mantenida en medio MEM F11 complementado con FCS al 10%, 100 U/ml de penicilina (GibcoBRL), 0,1 mg/ml de estreptomicina (GibcoBRL) y glutamina 2 mM.

Construcci6n del virus recombinante

Se obtuvo por recombinaci6n hom6loga el adenovirus recombinante AdCA17lacZ que codifica el gen lacZ de E. coli bajo el control del promotor de CMV humano, usando el sistema pJM17 en celulas 293 (Addison et al., 1997, J. Gen. Virol. 78, 16531661). Los vectores recombinantes fueron purificados por formaci6n de placas de lisis, desarrollados hasta un titulo elevado en celulas 293 y purificados por formaci6n de bandas en cloruro de cesio, de la manera previamente descrita (Hitt et al., 1995, Methods in Mol. Genetics, 7, 1530).

Sensibilizaci6n de celulas

Las celulas THX (4 x 105 celulas) fueron sembradas en placas de 6 cm y dejadas desarrollar durante la noche. En una confluencia de aproximadamente 60%, se cambi6 el medio de cultivo por 2 ml de medio de cultivo complementado con 20 Ig/ml de AlPcS2, y se pusieron de nuevo las placas en la incubadora durante 1618 horas. Luego se separ6 por aspiraci6n el medio que contenia el sensibilizador y se incubaron las celulas en un medio de cultivo ordinario al menos 4 horas antes del tratamiento luminico y la infecci6n virica.

Infecci6n de las celulas

Se us6 tripsinaEDTA para separar las celulas de tres placas y se calcul6 el numero medio de celulas en las placas mediante recuento en una camara Burcher. Se prepararon diluciones de adenovirus en PBS con CaCl2 0,68 mM y MgCl2 0,5 mM de acuerdo con el numero de celulas a infectar. Normalmente, las celulas fueron infectadas con una multiplicidad de infecci6n (M0I) de 1 y 10.

Antes de que se anadiera el virus, las celulas fueron expuestas a luz roja (Philips TL 20W/09, filtrada a traves de un filtro Cinemoid 35 con una intensidad luminica que alcanzaba a las celulas de 1,35 mW/cm2) durante 3 minutos. Posteriormente, se separ6 el medio por aspiraci6n y se anadieron 200 Il de suspensi6n virica (o PBS con CaCl2 0,68 mM y MgCl2 0,5 mM en los casos de los testigos no tratados con el virus) a cada placa. Despues de una incubaci6n durante 30 minutos a 37 °C, se anadieron 5 ml de medio de cultivo ordinario y se dej6 que las celulas se desarrollaran durante 48 horas.

Ensayo de galactosidasa

Las celulas fueron separadas mediante tripsinaEDTA y fueron resuspendidas en 5 ml de medio de cultivo. Despues de una centrifugaci6n durante 5 minutos a 1000 rpm, se separ6 el medio por aspiraci6n, se resuspendieron los sedimentos celulares en 50 Il de medio de cultivo y se pusieron los tubos en un bano de agua a 37 °C durante 5 minutos. Posteriormente, se anadieron 50 Il de una disoluci6n 2 mM de FDG precalentada a 37 °C y se pusieron de nuevo los tubos en el bano de agua durante 1 minuto. Finalmente, se anadieron 900 Il de medio de cultivo y se incubaron los tubos sobre hielo durante 3060 minutos antes de que se analizaran las muestras por citometria de flujo del modo anteriormente descrito.

Se trataron celulas THX con AlPcS2a (indicado como PS en la Figura 11) y adenovirus (indicado como "virus" en la Figura 11) y se expusieron a 3 o 4 minutos de luz del modo descrito en Materiales y Metodos, y se midi6 su actividad

galactosidasa (� gal) por citometria de flujo. Se cuantific6 la actividad gal total integrando las celulas positivas para �gal y su actividad �gal. Tanto el numero de celulas positivas para gal como la actividad gal media resultaron aumentados mediante el tratamiento por PCI.

Los resultados muestran que tiene lugar una minima infecci6n de celulas THX cuando se incuban las celulas con virus solo o con virus y agente fotosensibilizador pero que el tratamiento fotoquimico, es decir, la adici6n de luz al agente fotosensibilizador, potencia significativamente la transducci6n de celulas (como se muestra por el aumento de actividad gal).

Ejemplo�11

Efecto del tratamiento fotoquimico sobre la localizaci6n intracelular de una molecula marcadora de endocitosis

Se sembraron celulas THX en placas Falcon 3001 (2,5 x 104 celulas por placa) y, al dia siguiente, las celulas fueron tratadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a durante 18 horas, lavadas para retirar el AlPcS2a e incubadas en medio exento de AlPcS2a durante 4 horas. Las celulas fueron luego expuestas a luz durante 4 minutos antes de una incubaci6n de 3 horas con 5 mg/ml del marcador endocitico FITCdextrano. Las celulas no irradiadas fueron tratadas de un modo similar salvo en cuanto a la irradiaci6n. Se observ6 la localizaci6n intracelular del FITCdextrano en celulas no fijadas, con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan (0berkochen, Alemania) usando un objetivo con un aumento de 63x, un filtro de excitaci6n de paso de banda de 450490 nm y un filtro de emisi6n de paso de banda de 510540 nm. Se grabaron micrografias de fluorescencia por medio de una camara con dispositivo de carga acoplada (CCD; del ingles, chargedcoupled device) (Photometrics Inc., Tucson, Arizona, EE.UU.) enfriado.

Los resultados (Figura 12) muestran que la PCI con luz proporcionada antes que el marcador endocitico fluorescente FITCdextrano desplaza la localizaci6n de este marcador de las vesiculas endociticas (las manchas vistas en la parte A para celulas no irradiadas) al citosol (la fluorescencia difusa vista en la parte B para celulas irradiadas). De este modo, cuando se proporciona el tratamiento luminico antes que la macromolecula que se va a internalizar, la macromolecula se transloca muy rapidamente al citosol, disminuyendo sustancialmente las posibilidades de degradaci6n lisos6mica de la macromolecula.

Ejemplo�12

Efectos de los tratamientos fotoquimicos sobre la toxicidad de la gelonina en celulas THX y HCT 116

La gelonina es una toxina vegetal que inhibe eficazmente la sintesis proteica cuando esta presente en el citosol celular pero que no es capaz de alcanzar el citosol por si misma, y, por lo tanto, es bastante at6xica para las celulas intactas. Para el tratamiento con gelonina, se sembraron 25 x 103 celulas por pocillo en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca). Al dia siguiente, se anadieron 20 Ig/ml de AlPcS2a y se incubaron las celulas durante 18 horas a 37 °C. Todos los procedimientos despues de la adici6n de AlPcS2a se llevaron a cabo bajo luz atenuada. Para la estrategia "luz antes", se separ6 el AlPcS2a de las celulas por lavado y se incubaron las celulas en medio exento de AlPcS2a durante 4 horas. Las celulas fueron luego expuestas a la luz (como se indica en las figuras) antes del tratamiento con 1 Ig/ml de gelonina durante 18 horas. Para la estrategia "luz despues", las celulas fueron conjuntamente incubadas con 20 Ig/ml de AlPcS2a y 1 Ig/ml de gelonina durante 18 horas y fueron lavadas antes de la exposici6n a la luz, como se indica en la figura. Las celulas no irradiadas fueron tratadas de un modo similar salvo en cuanto a la irradiaci6n. Las celulas tratadas fueron lavadas una vez con medio de cultivo y, despues de la adici6n de medio fresco, fueron incubadas a 37 °C antes del analisis ulterior. 24 horas despues de la exposici6n luminica, se examin6 la inhibici6n de la sintesis proteica por incorporaci6n de [3H]leucina a proteina. La irradiaci6n se llev6 a cabo desde una bancada con cuatro tubos de luz (Philips TL 20W/09) y un filtro de paso largo con un corte a 550600 nm. La intensidad de luz que llegaba a las celulas era 13,5 W/m2.

El ejemplo muestra que, tanto en celulas THX (Figura 13A) como en celulas HCT 116 (Figura 13B), la estrategia "luz antes" funciona mejor que el metodo "luz despues". Por lo tanto, para celulas THX con la mayor dosis luminica, la inhibici6n de la sintesis proteica era aproximadamente tres veces mas potente con "luz antes" que con "luz despues". Tambien se puede ver que, en ambas lineas celulares, la gelonina no ejercia por si efecto t6xico alguno sin el tratamiento por PCI, lo que muestra la potencia y la especificidad que se pueden alcanzar en la inducci6n de los efectos de toxinas mediante el tratamiento fotoquimico.

Figura�13

Estimulaci6n fotoquimica de transducci6n genica mediada por adenovirus

Se sembraron 5 x 104 celulas THX por pocillo en placas de 6 pocillos. Al dia siguiente, se anadieron 20 Ig/ml de AlPcS2a y se incubaron las celulas durante 18 horas a 37 °C. Todos los procedimientos despues de la adici6n de AlPcS2a se llevaron a cabo bajo luz atenuada. Para la estrategia "luz antes", se separ6 el AlPcS2a de las celulas por lavado y se incubaron las celulas en medio exento de AlPcS2a durante 4 horas. Las celulas fueron luego expuestas a la luz durante 3 minutos antes del tratamiento con el vector adenovirico AdHCMVlacZ (al que tambien se hace referencia como AdCA17lacZ en el Ejemplo 10) con una multiplicidad de infecci6n (M0I) de 1 durante 30 minutos. Este vector contiene un gen informador de �galactosidasa cuya expresi6n puede ser analizada mediante citometria de flujo (vease mas adelante).

Para la estrategia "luz despues", las celulas tratadas con AlPcS2a y lavadas fueron primero tratadas con el adenovirus en la misma concentraci6n y durante el mismo tiempo que los anteriormente indicados, lavadas y, despues de la adici6n de medio de cultivo fresco, expuestas a la luz. Las celulas no irradiadas fueron tratadas de un modo similar salvo en cuanto a la irradiaci6n.

Las celulas tratadas fueron lavadas una vez con medio de cultivo y, despues de la adici6n de medio fresco, fueron incubadas a 37 °C antes del analisis ulterior. Se analiz6 la expresi6n de galactosidasa por citometria de flujo dos

dias despues de la exposici6n luminica. Los metodos detallados para la construcci6n del virus (al que se hace referencia como AdHCMVlacZ o AdCA17lacZ), el tratamiento de las celulas, la irradiaci6n y el analisis de la expresi6n de galactosidasa se describen en el Ejemplo 10.

Los resultados (Figura 14) muestran que el tratamiento fotoquimico usando el procedimiento "luz antes" (mostrado por las barras de la parte derecha de la Figura 14) aumenta aproximadamente 6 veces el porcentaje de celulas que expresan galactosidasa; de 2,5% a 15% bajo estas condiciones experimentales. Tambien se puede ver que el efecto con el procedimiento "luz antes" era casi igual al que se obtuvo con el metodo "luz despues" (mostrado mediante las barras de la parte izquierda de la Figura 14).

Ejemplo�1�

Efecto del tiempo de incubaci6n sobre la eficacia de la transfecci6n provocada por luz

Se sembraron 5 x 104 celulas THX o 7,5 x 104 celulas HCT 116 por pocillo en placas de 6 pocillos y 12 pocillos, respectivamente. Al dia siguiente, se anadieron 20 Ig/ml de AlPcS2a y se incubaron las celulas durante 18 horas a 37 °C. Todos los procedimientos despues de la adici6n de AlPcS2a se llevaron a cabo bajo luz atenuada. Se separ6 el AlPcS2a de las celulas por lavado y se incubaron las celulas en medio exento de AlPcS2a durante 4 horas. Las celulas fueron luego expuestas a la luz (3 minutos para las celulas THX o 7 minutos para las celulas HCT 116) antes del tratamiento con complejo de pEGFPN1/polilisina (5 Ig/ml de pEGFPN1) durante los tiempos indicados en la Figura

15. Las celulas no irradiadas fueron tratadas de un modo similar salvo en cuanto a la irradiaci6n. Las celulas tratadas fueron lavadas una vez con medio de cultivo y, despues de la adici6n de medio fresco, fueron incubadas a 37 °C durante 2 dias antes del analisis de la expresi6n de EGP mediante citometria de flujo (vease Materiales y Metodos). La irradiaci6n se llev6 a cabo desde una bancada con cuatro tubos de luz (Philips TL 20W/09) y un filtro de paso largo con un corte a 550600 nm. La intensidad de luz que llegaba a las celulas era 13,5 W/m2. Se prepar6 el complejo de pEGFPN1/polilisina (relaci6n de cargas de 1,7) mezclando lentamente disoluciones de plasmido y polilisina preparadas separadamente: se diluyeron 5 Ig de plasmido pEGFPN1 en 75 Il de agua y se diluyeron 5,3 Ig de polilisina en 75 Il de agua. Las disoluciones fueron mezcladas, incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiental, diluidas con medio de cultivo hasta 1 ml y anadidas a las celulas.

Los resultados (Figura 15) muestran que, tanto en celulas THX como en celulas HCT 116, se puede provocar acusadamente una transfecci6n por complejos de DNA/polilisina mediante el tratamiento fotoquimico "luz antes". Se puede ver que la estimulaci6n de la transfecci6n es ya eficaz despues de tiempos de incubaci6n cortos con DNA, al menos hasta 30 minutos de tiempo de incubaci6n. La transfecci6n provocada por luz aumenta con el tiempo de incubaci6n; sin embargo, parece que se nivela despues de aproximadamente 2 horas de incubaci6n con DNA.

Ejemplo�1�

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas THX mediada por polilisina usando TPPS2a como fotosensibilizador

La tetrafenilporfinadisulfonato TPPS2a, lote nO 04197, fue producida por Porphyrin Products (Utah, EE.UU.). Se disolvi6 la TPPS2a en DMS0.

El plasmido pEGFPN1 fue obtenido de Clontech Laboratories Inc. (California, EE.UU.; nO 60851 del catalogo). La partida utilizada (lote nO EGFPN11002) fue producida por ELIM Biopharmaceuticals, Inc. (California, EE.UU.) y fue suministrada en una concentraci6n de 5 mg/ml en agua esteril. Se prepar6 una disoluci6n madre de 0,5 mg/ml en tamp6n de TE (TrisHCl 1 mM, EDTA 1 mM) esteril, pH de 7,4, y se guard6 a 20 °C.

Se cultivaron las celulas de melanoma humano THX en medio RPMI 1640 complementado con FCS (suero de ternera fetal) al 10%, penicilina/estreptomicina y Lglutamina. Bajo luz atenuada, se retir6 el medio y se anadi6 medio que contenia 2 Ig/ml de TPPS2a. Se incubaron las celulas (protegidas de la luz) a 37° durante 18 horas. Se lavaron las celulas tres veces con medio y, para las muestras PLLL ("luz despues"), se anadi6 1 ml de medio que contenia un complejo de pEGFPN1/poliLlisina. El complejo contenia 5 Ig de pEGFPN1 y tenia una relaci6n de cargas de poliLlisina (PLL) a DNA de 1,7. Despues de 4 horas de incubaci6n adicional a 37 °C en la oscuridad, se retir6 el medio y se lavaron una vez las celulas con medio. Se anadi6 1 ml de medio y se expusieron las celulas a luz azul como se indica en la Figura 16 y se describe en Materiales y Metodos. Para las muestras LPLL ("luz antes"), la primera incubaci6n de 4 horas fue en medio sin complejo de pEGFPN1/PLL, anadiendose el complejo inmediatamente despues de la irradiaci6n y siendo separado despues de otra incubaci6n de 4 horas. Las celulas fueron incubadas durante 2 dias (aun protegidas de la luz) antes del analisis de la expresi6n de EGFP por citometria de flujo. Para este analisis, las celulas fueron tratadas con tripsina (tripsina - EDTA, Sigma, Missouri, EE.UU.), resuspendidas en 400 Il de medio RPMI y separadas por filtraci6n a traves de un filtro de nailon de 50 Im de malla antes del analisis en un cit6metro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, California, EE.UU.). Se midi6 la EGFP a traves de un filtro de 510540 nm despues de una excitaci6n a 488 nm. Se utiliz6 yoduro de propidio (1 Ig/ml) para discriminar las celulas muertas de las celulas viables, y se llev6 a cabo un procesamiento de pulsos para discriminar los dobletes celulares de las celulas individuales. Se recogieron 10.000 subconjuntos de resultados para cada muestra y se analizaron los datos con el software CELLQuest (Becton Dickinson, California, EE.UU.).

Resultados

Como se puede ver en la Figura 16, para la transfecci6n de celulas THX mediada por poliLlisina, el planteamiento de "luz antes" de la adici6n de la molecula de transferencia funciona tan bien como el planteamiento de "luz despues" cuando se utiliza el fotosensibilizador TPPS2a.

Ejemplo�16

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas THX mediada por poliLlisina usando TPPS4 como fotosensibilizador

Las celulas THX fueron cultivadas y tratadas del modo descrito en el Ejemplo 15 salvo por que se utiliz6 el fotosensibilizador TPPS4 (75 Ig/ml) en lugar de TPPS2a.

Resultados

A partir de la Figura 17 es evidente que, para la transfecci6n de celulas THX mediada por poliLlisina, el planteamiento de "luz antes" funciona ligeramente mejor que el planteamiento de "luz despues" cuando se utiliza el fotosensibilizador TPPS4, pero con ambos metodos se consigue la transfecci6n.

Ejemplo�17

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliLlisina, usando TPPS2a como fotosensibilizador

Las celulas HCT 116 fueron cultivadas y tratadas del modo descrito en el Ejemplo 15.

Resultados

A partir de la Figura 18 se puede ver que, para la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliLlisina, el planteamiento de "luz antes" funciona tan bien como el planteamiento de "luz despues" cuando se utiliza el fotosensibilizador TPPS2a.

Ejemplo�18

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliLlisina, usando TPPS4 como fotosensibilizador

Las celulas THX fueron cultivadas y tratadas del modo descrito en el Ejemplo 15 salvo por que se us6 el fotosensibilizador TPPS4 (75 Ig/ml) en vez de TPPS2a.

Resultados

La Figura 19 muestra que, para la transfecci6n de celulas THX mediada por poliLlisina, el planteamiento de "luz antes" funciona tan bien como el planteamiento de "luz despues" cuando se utiliza el fotosensibilizador TPPS4.

Ejemplo�1�

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n mediada por D0TAP usando TPPS4 como fotosensibilizador

Se cultivaron celulas HCT 116 en medio RPMI 1640 complementado con FCS (suero de ternera fetal) al 10%, penicilina/estreptomicina y Lglutamina. Bajo luz atenuada, se retir6 el medio y se anadi6 medio que contenia 75 Ig/ml de TPPS4. Se incubaron las celulas (protegidas de la luz) a 37° durante 18 horas. Se lavaron las celulas tres veces con medio y, para las muestras D0TAPL ("luz despues"), se anadi6 1 ml de medio que contenia un complejo de 1 Ig pEGFPN1 y 5 Ig de D0TAP. Despues de 4 horas de incubaci6n adicional a 37 °C en la oscuridad, se retir6 el medio y se lavaron una vez las celulas con medio. Se anadi6 1 ml de medio y se expusieron las celulas a luz azul como se indica en la Figura 20 y se describe en Materiales y Metodos. Para las muestras LD0TAP ("luz antes"), la primera incubaci6n de 4 horas fue en medio sin complejo de pEGFPN1/D0TAP, anadiendose el complejo inmediatamente despues de la irradiaci6n y siendo separado despues de otra incubaci6n de 4 horas. Las celulas fueron incubadas durante 1 dia (aun protegidas de la luz) antes del analisis de la expresi6n de EGFP por citometria de flujo como se describe en el Ejemplo 15.

Resultados

A partir de la Figura 20, se puede observar que, para la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por el lipido cati6nico D0TAP, el planteamiento de "luz antes" funciona sustancialmente mejor que el planteamiento de "luz despues" cuando se usa el fotosensibilizador TPPS4. Parece que el planteamiento de "luz antes" es especialmente ventajoso para la transfecci6n mediada por lipidos cati6nicos.

Ejemplo�20

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n mediada por SuperFect@ usando TPPS2a como fotosensibilizador

Se obtuvo SuperFect@ de QIAGEN AG.

Preparaci6n de complejos de plasmido/Superrect@

Se prepararon complejos de plasmido/SuperFect@ del modo siguiente: (i) se diluy6 pEGFPN1 con medio RPMI 1640 (sin suero, proteinas ni antibi6ticos). (ii) Se anadi6 SuperFect@ (2 Il por Ig de DNA) a la disoluci6n plasmidica y se mezclaron los contenidos mediante agitaci6n con formaci6n de remolinos durante 10 segundos. (iii) Se incub6 la disoluci6n durante 1020 minutos a temperatura ambiental para permitir la formaci6n del complejo. (iv) Se anadieron 400 Il de medio para cultivo celular (con suero y antibi6ticos) a los tubos que contenian los complejos de transfecci6n, se mezclaron los contenidos haciendo subir y bajar el liquido dos veces por una pipeta y se transfiri6 inmediatamente el volumen total a las celulas.

Tratamiento de las celulas

Se sembraron celulas HCT 116 (75.000 celulas/pocillo, 1 ml/pocillo) en placas de 12 pocillos (Costar Corning, New York, EE.UU.) y se dej6 que se fijaran durante seis horas. Se anadi6 1 ml de medio con 0,7 Ig/ml de TPPS2a y se incubaron las celulas durante 18 horas (C02 al 5% en volumen/volumen, 37 °C). Las celulas fueron lavadas tres veces con medio y fueron incubadas durante 4 horas (37 °C, C02 al 5% en volumen/volumen) en medio que contenia suero. Las celulas fueron irradiadas por exposici6n a una hilera de cuatro tubos fluorescentes (0sram 18W/67), con la maxima fluencia cerca de 420 nm. Se anadieron los complejos de plasmido/SuperFect@ inmediatamente despues de la exposici6n luminica y se incubaron las celulas con los complejos durante 1 o 4 horas. Las celulas fueron luego lavadas 4 veces en medio RPMI y, despues de la adici6n de 1 ml de medio, fueron adicionalmente incubadas durante dos dias. Luego se analiz6 la expresi6n de EGFP por citometria de flujo del modo descrito en el Ejemplo 15.

Resultados

Se puede ver (Figura 21) que la PCI mejora sustancialmente la transfecci6n de SuperFect@ bajo todas las condiciones examinadas. Por ejemplo, para 0,75 Ig de DNA y un tiempo de transfecci6n de 1 hora, se vio una mejora de 9 6rdenes de magnitud, mientras que, para 0,75 Ig de DNA y un tiempo de transfecci6n de 4 horas, se observ6 una potenciaci6n de 10 6rdenes de magnitud.

Ejemplo�21

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transducci6n genica, mediada por adenovirus, de celulas HCT 116 usando TPPS2a como fotosensibilizador

Se cultivaron celulas HCT 116 en medio RPMI 1640 complementado con FCS (suero de ternera fetal) al 10%, penicilina/estreptomicina y Lglutamina. Bajo luz atenuada, se retir6 el medio y se anadi6 medio que contenia 1 Ig/ml de TPPS2a a cada pocillo. Se incubaron las celulas (protegidas de la luz) a 37° durante 18 horas. Se lavaron las celulas tres veces con medio. Luego se infectaron las celulas con el adenovirus AdHCMVLacZ en diferentes puntos temporales antes o despues de la irradiaci6n (que siempre fue 4 horas despues de la separaci6n del fotosensibilizador). Las celulas fueron adicionalmente incubadas durante 2 dias (aun protegidas de la luz) antes del analisis de la actividad �galactosidasa por citometria de flujo como se describe en el Ejemplo 10 (Materiales y Metodos).

Resultados

La Figura 22 muestra el efecto de la regulaci6n temporal del tratamiento luminico con respecto a la distribuci6n del virus, sobre el efecto de la PCI sobre la transducci6n genica mediada por adenovirus. Se puede ver que, para el planteamiento de "luz antes" (la parte derecha del eje Y), la irradiaci6n para PCI es eficaz durante al menos 13 horas, por lo que el virus puede ser administrado hasta al menos 13 horas despues de la irradiaci6n manteniendose aun los efectos positivos de la PCI sobre la transducci6n. Esto es muy importante desde un punto de vista clinico porque permite al clinico una gran flexibilidad a la hora de disenar el tratamiento y coordinarlo con otros tratamientos que el paciente pudiera recibir, por ejemplo, con procedimientos quirurgicos.

Ejemplo�22

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la transfecci6n de celulas HCT 116 mediada por poliDlisina usando AlPcS2a como fotosensibilizador

Se cultivaron, trataron y analizaron celulas HCT 116 del modo descrito en el Ejemplo 15 salvo por que se us6 poliDlisina en lugar de poliLlisina en la preparaci6n del complejo con pEGFPN1.

Resultados

A partir de la Figura 23, se puede observar que la PCI con el protocolo "luz antes" tambien funciona bien cuando se usa el policati6n poliDlisina como agente de transfecci6n.

Ejemplo�23

Efecto de la estrategia de PCI "luz primero" sobre la muerte celular por el agente citostatico bleomicina usando TPPS2a como fotosensibilizador

En este estudio se us6 la linea celular V79 de fibroblastos de pulm6n de hamster chino.

El MTT [bromuro de 3(4,5dimetiltiazol2il)2,5difeniltetrazolio] era de Sigma (Missouri, EE.UU.; nO M 2128 del catalogo) y se disolvi6 en PBS hasta una concentraci6n de 5 mg/ml. La disoluci6n fue esterilizada por filtraci6n y fue almacenada a 4 °C.

La bleomicina (Asta Medica), 15 000 IE/KY, se obtuvo de la farmacia del Norwegian Radium Hospital. 1 IE corresponde a 1 mg de bleomicina. El polvo de bleomicina se disolvi6 en una disoluci6n esteril de NaCl al 0,9% hasta una concentraci6n final de 2 mM.

Cultivo celular

Las celulas V79 fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco) complementado con suero de ternera fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 Ig/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM (todos de Gibco BRL, Paisley, Escocia) a 37 °C y C02 al 5% en un ambiente humedo.

Tratamiento de las celulas

Se sembraron las celulas (75.000 celulas/pocillo, 1 ml/pocillo) en placas de 12 pocillos (Costar Corning, New York, EE.UU.) y se dej6 que se fijaran durante 6 horas. A algunos de los pocillos se anadi6 1 ml de medio con 0,7 Ig/ml de TPPS2a (vease la Tabla 1), y se incubaron las celulas durante 18 horas (C02 al 5% en volumen/volumen, 37 °C). Se lavaron las celulas tres veces con medio. Luego se incubaron las celulas en medio que contenia suero durante 4 horas. Se retir6 el medio, se anadi6 nuevo medio y se irradiaron las celulas por exposici6n a la luz de una caja que contenia una hilera de cuatro tubos fluorescentes (0sram 18W/67), con la maxima fluencia cerca de 420 nm.

Se anadieron inmediatamente diferentes dosis de bleomicina. Despues de una incubaci6n de 1 o 4 horas con bleomicina, se lavaron las celulas una vez con medio RPMI, se anadi6 1 ml de medio y, despues de 3 dias de incubaci6n, se midi6 la supervivencia celular mediante el ensayo de MTT. Este metodo se basa en la reducci6n de una sal de tetrazolio (MTT) soluble en agua hasta un producto de formazan morado e insoluble por las deshidrogenasas mitocondriales presentes en celulas vivas metab6licamente activas. Se anade 1 ml de medio que contiene 0,25 Ig de MTT a las celulas, lo que va seguido de una incubaci6n de 4 horas (37 °C, C02 al 5% en volumen/volumen). Los cristales de formazan resultantes son disueltos por adici6n de 200 Il de isopropanol (Sigma, Missouri, EE.UU.) por pocillo. La disoluci6n es transferida a una placa de 96 pocillos, la cual es leida por un dispositivo Multiskan EX lector de microplacas (Labsystems, Finlandia) con un filtro de paso de banda de 570 nm. La supervivencia celular es calculada como porcentaje de las celulas testigo que no reciben tratamiento luminico.

Resultados

La Figura 24 muestra que la PCI con el planteamiento de "luz antes" puede tambien aumentar el efecto biol6gico de un un agente quimioterapeutico clinicamente aprobado de bajo peso molecular (bleomicina). De este modo, se puede ver que, para una dosis de bleomicina de 100 IM, se puede observar un aumento sustancial, provocado por la luz, de la citotoxicidad de la bleomicina (_ y . en la Figura 24). La falta de efecto con la dosis mas baja de bleomicina (• en la Figura 24) muestra que esta citotoxicidad aumentada no es un resultado del tratamiento fotoquimico per se, ya que esta serie de muestras recibi6 el mismo tratamiento fotoquimico que la serie de la bleomicina 100 IM sin observables efectos sobre la supervivencia celular provocados por la luz.

Ejemplo�2�

PCI con gelonina para el tratamiento de tumores en un modelo de rat6n in vivo

Animales

Se criaron hembras de rat6n Balb/c desnudo (nu/nu) en el Animal Department del Institute for Cancer Research. Se mantuvieron los ratones bajo condiciones especificas exentas de pat6genos. Se les administr6 agua y alimento ad libitum. Todos los procedimientos que atanian a los ratones fueron llevados a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el comite de cuidados a animales del Norwegian Radium Hospital, bajo control por las directrices del National Ethical Committee sobre el bienestar de los animales. Los ratones tenian un peso medio de 2025 g (58 semanas de edad) al comienzo de los experimentos, y se usaron al menos 5 ratones por grupo experimental. El

adenocarcinoma humano WiDr usado en el presente estudio fue propagado por trasplantes sucesivos a los ratones Balb/c (nu/nu). Se desmenuzaron los tumores hasta homogeneidad mediante un escalpelo y se inyectaron subcutaneamente 20 Il de la disoluci6n en la cadera derecha de cada rat6n. Se midi6 el tamano tumoral dos o tres veces por semana midiendo dos diametros perpendiculares. Se calcul6 el volumen tumoral utilizando la f6rmula siguiente:

V = (W2 x L)/2

en la que W es la anchura y L la longitud, diametros de los tumores medidos.

Tratamiento

Los ratones fueron aleatoriamente repartidos en los diferentes grupos mostrados en la Tabla 1 y la Figura 25. Se diluy6 una disoluci6n madre de AlPcS2a hasta 1,25 mg/ml en PBS y se inyect6 intraperitonealmente hasta una concentraci6n final de 10 mg/kg cuando los tumores hubieron alcanzado un volumen de aproximadamente 100 mm3. 48 horas despues de la inyecci6n de AlPcS2a, los tumores fueron expuestos a luz roja durante 16 minutos (vease mas adelante). Inmediatamente despues de la exposici6n luminica, se inyect6 intratumoralmente gelonina (una cantidad total de 50 Ig en una disoluci6n de 2 mg/ml; es decir, 25 Il). Despues de la inyecci6n de AlPcS2a, los ratones fueron mantenidos en la oscuridad durante 1 semana.

Tratamiento luminico

Se irradiaron los tumores con una lampara hal6gena de 150 W (Xenophot HLX64640) filtrada con un filtro de paso largo de 580 nm y un filtro de paso corto de 700 nm, que emitia 150 mW/cm2. Se cubrieron los animales con papel de aluminio salvo por encima de la zona del tumor, donde se habia hecho en el papel un agujero con un diametro 2 mm mayor que el diametro del tumor. Se expusieron los tumores a 145 J/cm2 de luz. Se midieron los volumenes tumorales dos o tres veces por semana del modo anteriormente descrito. Se mataron los ratones cuando los tumores alcanzaron un diametro de aproximadamente 20 mm. Se anot6 la fracci6n de ratones exentos de tumor 30 dias despues de la irradiaci6n (Tabla 1) y se registr6 el volumen tumoral medio en cada grupo de tratamiento (Figura 25).

Resultados

Tabla 1. Se trataron los ratones del modo anteriormente descrito y se registr6 la incidencia de tumores 30 dias despues de la irradiaci6n.

N°�DE GRUPO: TRATAMIENTO FRACCION DE RATONES EXEN-TOS DE TUMOR 30 DiAS DES-PUES DE LA IRRADIACION % DE RATONES EXENTOS DE TUMOR 30 DiAS DES-PUES DE LA IRRADIACION

1: No tratados 1/8 13

2: PBS + luz 0/7 0

3: Gelonina 0/8 0

4: Gelonina + "luz antes" 0/5 0

5: AlPcS2a 0/10 0

6: AlPcS2a + gelonina 0/7 0

7: AlPcS2a + luz 2/11 18

8: AlPcS2a + gelonina + "luz antes" 4/5 80

A partir de la Tabla 1, se puede ver que la PCI con gelonina usando el planteamiento de "luz antes" (grupo 8) cur6 al 80% (4 de 5) de los ratones de sus tumores. Por contraste, la gelonina sola no mostr6 efecto alguno, ni con (grupo 4) ni sin (grupo 3) el tratamiento luminico adicional (sin AlPcS2a). Tampoco la gelonina en combinaci6n con AlPcS2a sin tratamiento luminico (grupo 6) mostr6 efecto alguno. Se vio un bajo indice de curaci6n en los animales no tratados (grupo 1), probablemente debido a un tumor que desaparecia espontaneamente. Tambien se pudo observar un bajo indice de curaci6n en los animales que recibieron AlPcS2a y tratamiento luminico (grupo 7), debido a un efecto de la terapia fotodinamica (PDT) que era independiente de la presencia de gelonina. Sin embargo, este efecto de la PDT (18% de curaci6n) era significativamente menor que el que se hall6 con el tratamiento de PCI con gelonina (80%, grupo 8). Puesto que la gelonina no ejercia por si efecto alguno, el elevado indice de curaci6n en el grupo de la PCI no puede ser explicado por un efecto aditivo de PDT y gelonina sino que debe serlo por un efecto sinergico cuando el tratamiento por PCI extrae el potencial t6xico de la gelonina.

La Figura 25 muestra el efecto del tratamiento por PCI sobre el volumen tumoral medio en algunos de los grupos de tratamiento. Se puede ver que, en el grupo que s6lo recibi6 gelonina (f), los tumores crecieron tan rapido como en los animales a los que se administr6 un tratamiento con placebo, por inyecci6n de disoluci6n salina tamponada con fosfato (PBS), combinado con irradiaci6n (_). En los animales que s6lo recibieron el tratamiento fotoquimico pero no gelonina (0), el crecimiento tumoral result6 retrasado pero los tumores comenzaron a crecer de nuevo aproximadamente 15 dias despues de la irradiaci6n. Por contraste, en los animales que recibieron el tratamiento completo de PCI y gelonina (.), no se pudo observar aumento alguno en el volumen tumoral medio ni siquiera 33 dias despues de la irradiaci6n.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un metodo in vitro o ex vivo para introducir una molecula en el citosol de una celula, metodo que comprende poner dicha celula en contacto con un agente fotosensibilizador que se localiza en endosomas, lisosomas, el reticulo endoplasmico o el aparato de Golgi, poner dicha celula en contacto con la molecula que se va a introducir (molecula de transferencia) e irradiar dicha celula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en que dicha irradiaci6n se lleva a cabo en un tiempo antes o al mismo tiempo que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que (i) la molecula de transferencia no penetra facilmente en las membranas celulares, y/o (ii) uno del agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia, o ambos, estan fijados a, asociados con, o conjugados con, una o mas moleculas vehiculares, moleculas para transporte dirigido o vectores.
2.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 1, en que la celula es puesta en contacto con la molecula de transferencia en un punto temporal despues de que haya tenido lugar la irradiaci6n.
3.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 2, en que la celula es puesta en contacto con dicha molecula de transferencia de 0 a 4 horas despues de que haya tenido lugar la irradiaci6n.
4.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 1, en que la celula es puesta en contacto con la molecula de transferencia en el mismo momento que la irradiaci6n.
5.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que la molecula de transferencia es puesta en contacto con dicha celula durante un periodo de 30 minutos a 6 horas.
6.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha molecula de transferencia es una proteina, peptido, anticuerpo o antigeno o fragmento del mismo.
7.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en que dicha molecula de transferencia, o una parte o fragmento de la misma, se presenta o expresa en la superficie celular.
8.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 8, en que dicha celula es una celula presentadora de antigeno.
9.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha molecula de transferencia es un farmaco citot6xico.
10.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha molecula de transferencia es una molecula de acido nucleico.
11.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 10, en que dicha molecula de acido nucleico esta incorporada a una molecula vector.
12.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en que el agente fotosensibilizador es seleccionado del grupo que consiste en TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a y otros fotosensibilizadores anfipaticos.
13.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en que dichos agentes fotosensibilizadores son compuestos que son el acido 5aminolevulinico o esteres del acido 5aminolevulinico o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
14.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, en que dicho agente fotosensibilizador es puesto en contacto con dichas celulas durante un periodo de 4 a 24 horas antes de la irradiaci6n.
15.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 14, en que dicho agente fotosensibilizador es puesto en contacto con dichas celulas durante un periodo de 4 a 24 horas inmediatamente antes de la irradiaci6n.
16.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15, en que dicho agente fotosensibilizador es retirado despues del contacto con dicha celula durante un periodo de 1 a 4 horas antes de la irradiaci6n.
17.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16, en que el vehiculo, la molecula para transporte dirigido o el vector al que, o con el que, se fija, asocia o conjuga la molecula de transferencia es un adenovirus, un policati6n, un lipido cati6nico o un peptido o un vector dirigido.
18.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 17, en que dicha molecula de transferencia se fija a, o se asocia o conjuga con, un vector, y dicho vector se fija a, o se asocia o conjuga con, una molecula vehicular, una molecula para transporte dirigido o un vector.
19.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 18, en que dicho vector es un adenovirus.
20.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 17, en que dicho policati6n es poliLlisina, poliDlisina o SuperFect@.
21.

Un metodo como el reivindicado en la Reivindicaci6n 17 o 18, en que dicho lipido cati6nico es D0TAP.
22.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 19, en que dicha molecula vehicular es un liposoma o una construcci6n de base lipidica, que contiene preferiblemente al menos un lipido cati6nico.
23.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 o 10 a 22, en que al menos el 50% de dichas celulas en que se introduce dicha molecula no resultan muertas.
24.

Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 23, en que la operaci6n de irradiaci6n es de 1 a 10 minutos.
25.

Uso de una molecula de transferencia y un agente fotosensibilizador, en que el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia son como se definen en cualquier reivindicaci6n precedente, para la preparaci6n de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.
26.

Uso de una molecula de transferencia como se define en cualquier reivindicaci6n precedente, para la preparaci6n de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicha enfermedad, trastorno o infecci6n se va a tratar poniendo celulas o tejidos de un paciente en contacto con dicho medicamento, y, separadamente, un agente fotosensibilizador como el definido en cualquier reivindicaci6n precedente se va a poner en contacto con dichas celulas o tejidos de dicho paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.
27.

Una composici6n que contiene una molecula de transferencia y, separadamente, un agente fotosensibilizador, en que el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia son como se definen en cualquier reivindicaci6n precedente, como una composici6n combinada para uso separado o secuencial en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar

o prevenir un cancer, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.
28. Una molecula de transferencia como la definida en cualquier reivindicaci6n precedente, para uso en el tratamiento o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o infecci6n, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicha enfermedad, trastorno o infecci6n se va a tratar poniendo celulas o tejidos de un paciente en contacto con dicha molecula de transferencia, y, separadamente, un agente fotosensibilizador como el definido en cualquier reivindicaci6n precedente se va a poner en contacto con dichas celulas

o tejidos de dicho paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiaci6n se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.
29.

Un uso, composici6n o molecula de transferencia como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 25 a 28, en que dicho metodo de incorporaci6n celular se va a llevar a cabo del modo descrito en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, 14, 15, 16, 23 o 24.
30.

Un uso, composici6n o molecula de transferencia como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 25 a 29 para vacunaci6n, en que dicha molecula de transferencia es una molecula antigenica y dicha molecula de transferencia, o una parte o fragmento de la misma, se va a presentar o expresar en la superficie celular.

Figura1

Figura2

Figura3

Figura�

Figura�

Figura7

Figura8

Figura�11