CN101541308B - 甘油磷脂用于关节润滑的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于关节的润滑的脂质体的用途，所述脂质体具有膜，所述膜含有由具有两条相同或不同的C₁₂-C₁₆烃链的甘油磷脂(GPL)和具有一条C₁₂-C₁₈烃链的鞘脂(SPL)组成的组中的至少一种磷脂(PL)，一种或多种膜具有发生有序固相(SO)到无序液相(LD)相变的相变温度，所述相变温度在约20℃至约39℃的温度内。

Description

甘油磷脂用于关节润滑的用途

发明领域

本发明涉及脂质体及它们的治疗用途。 

现有技术列表 

下面是现有技术的列表，所述技术被认为与描述本发明领域的技术状态有关。 

1.Hills，B.A.Phospholipid and propylene glycol based lubricant(基于磷脂和丙二醇的润滑剂).美国专利6133249，1998. 

2.Hills，B.A.Lubricant Composition for Rheumatism(用于风湿症的润滑剂组合物).美国专利5403592，1990. 

3.Hills，B.A.；Monds，M.K.，Enzymatic identification of the load-bearingboundary lubricant in the joint(关节中承载边界润滑剂的酶法鉴定).Br.J.Rheumatol.1998，37，(2)，137-142. 

4.Oloyede，A.，Gudimetla，P.，Crawford，R.，Hills，B.A.，Biomechanicalresponses of normal and delipidized articular cartilage subjected to varyingrates of loading(经受变化的加载速率的正常的关节软骨和脱脂的关节软骨的生物力学响应).Connective Tissue Research 2004，45，(2)，86-93. 

5.Ethell，M.T.；Hodgson，D.R.；Hills，B.A.，The synovial response toexogenous phospholipid(synovial surfactant)injected into the equineradiocarpal joint compared with that to prilocaine，hyaluronan and propyleneglycol(与对丙胺卡因、乙酰透明质酸和丙二醇的滑膜响应相比，对注射进马桡腕关节的外源性磷脂(滑膜表面活性剂)的滑膜响应).New Zealand Veterinary Journal 1999，47，(4)，128-132. 

6.Pickard，J.E.；Fisher，J.；Ingham，E.；Egan，J.，Investigation into theeffects of proteins and lipids on the frictional properties of articular cartilage(蛋白质和脂类对关节软骨的摩擦特性的影响的研究).Biomaterials 1998，19，(19)，1807-1812. 

7.Kawano，T.；Miura，H.；Mawatari，T.；Moro-Oka，T.；Nakanishi，Y.；Higaki，H.；Iwamoto，Y.，Mechanical effects of the intraarticular administrationof high molecular weight hyaluronic acid plus phospholipid on synovial jointlubrication and prevention of articular cartilage degeneration in experimentalosteoarthritis(在实验的骨关节炎中关节内施用高分子量透明质酸加上磷脂对滑膜关节润滑和预防关节软骨退化的力学效应).Arthritis Rheum.2003，48，(7)，1923-1929. 

8.Forsey，R.W.；Fisher，J.；Thompson，J.；Stone，M.H.；Bell，C.；Ingham，E.，The effect of hyaluronic acid and phospholipid based lubricants on frictionwithin a human cartilage damage model(人软骨损伤模型中基于透明质酸和磷脂的润滑剂对摩擦的影响).Biomaterials 2006，27，(26)，4581-4590. 

9.Klein，J.，Molecular mechanisms of synovial joint lubrication(滑膜关节润滑的分子机制).J.Proc.Inst.Mech Eng.，Part J：J.Eng.Tribology 2006，220，(8)，691-710. 

10.Burdick等人，Biological lubricant composition and method ofapplying lubricant composition(生物润滑剂组合物和应用润滑剂组合物的方法).美国专利6,800,298. 

下文偶尔提到的现有技术的完整列表出现在说明书末尾、权利要求书之前。将通过指明出版物在完整参考文献列表的序号来引用它们。 

发明背景 

关节功能障碍影响非常大一部分的群体。充分的生物润滑是适当的关节灵活性的先决条件，其对预防和改进关节的退化性改变是至关重要的¹。 

常见的关节功能障碍是骨关节炎(OA)，其发病率仅在美国就超过两千万²。OA的病因学是多因素的，包括炎症、代谢和力学原因^3-5。相关的危险因素列表中有年龄、性别、肥胖、职业、外伤、动脉粥样硬化血管病和制动(immobilization)^1，3-7。OA可因关节软骨的断裂而出现；或者相反地，软骨下骨硬化(subchondral bone sclerosis)实际上可在软骨退化和缺失之前发生^8，9。一旦关节软骨受伤，损伤就会发展¹⁰。 

现行的治疗致力于减少关节的超载、物理治疗以及疼痛和炎症的减轻，通常通过全身或关节内施用药物¹¹。 

关节软骨形成光滑、坚韧、有弹性和柔韧的表面，帮助骨骼的运动。滑膜空间充满着包含透明质酸(HA)和糖蛋白润滑素(lubricin)的高度黏性的滑液(SF)^12-14。HA是D-葡糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡糖的聚合物，其在OA的炎症条件下高度不稳定并且降解^15，16。润滑素由～44％的蛋白质、～45％的碳水化合物和～11％的磷脂(PL)组成^12-14，所述磷脂中～41％是磷脂酰胆碱(PC)、～27％是磷脂酰乙醇胺(PE)和～32％是鞘磷脂 ^17-19。这些PL被称为“表面活性磷脂”(SAPL)。SAPL的PE和PC包含两条烃链，其中之一是单不饱和油酸(18∶1)。 

其中润滑剂分子层分隔相对表面的边界润滑在关节负载条件下发生¹⁷， ^18，20。已经提出几种不同的物质作为关节软骨中的天然边界润滑剂。在过去，HA被认为是主要的润滑剂²¹，然而，近来的摩擦学研究表明，HA“本身...不负责关节软骨中所发现的几乎没有摩擦的边界生物润滑”，但可能有助于承载(load bearing)和磨损保护(wear protection)²²。许多报道已显示润滑素在滑液的润滑特性中起主要作用^{12，14，19，20，23，24}。Pickard等²⁵以及Schwartz和Hills¹⁹证明定义为润滑素的表面活性磷脂(SAPL)的磷脂有助于关节软骨中的关节润滑。Hills及其合作者证明OA关节具有SAPL缺乏，并且将表面活性磷脂1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)注射到OA患者的关节中产生持续长达14周的灵活性的改进²⁶而没有严重的副作用²⁷。在另一研究中，使用独特的低温关节保存技术，Watanabe等在健康软骨表面观察到脂类球形囊泡(lipidic globular vesicle)，该脂类球形囊泡被假设为在 润滑中起重要作用²⁸。Kawano等²⁹和Forsey等³⁰使用动物模型已显示出，使用高分子量HA(～2000kDa)结合DPPC改进了后者的润滑能力。 

美国专利6,800298公开了用于润滑哺乳动物关节的基于葡聚糖的水凝胶组合物，所述组合物包含脂类，特别是磷脂。 

近来，Klein及其合作者总结了在分子水平上关节润滑的各种问题。他们指出软骨表面的高度水合的刷状带电大分子作为软骨润滑的主要贡献者(contributor)的潜在作用^31-33。 

发明概述 

本发明基于用于关节润滑的脂质体系统的发现，并且基于不同的PL组合物、粒度和层状(lamellarity)对关节摩擦的影响的研究，其使用模拟关节的软骨-之上-软骨(cartilage-on-cartilage)装置。 

因此，根据本发明，提出基于包括磷脂(PL)的脂质体系统的新的润滑剂制剂，用于引入滑膜关节以便改进或恢复关节的灵活性。 

因此，根据其第一方面，提供了脂质体的用途，所述脂质体包括一种或多种膜，所述一种或多种膜含有由具有两条相同或不同的C12-C16烃链的甘油磷脂(glycerophospholipid，GPL)和具有一条C12-C18烃链的鞘脂(SPL)组成的组中的至少一种磷脂(PL)，所述一种或多种膜具有发生有序固相(solid ordered，SO)到无序液相(liquid disordered，LD)相变的相变温度，所述相变温度在约20℃到约39℃的温度内，所述用途是用于具有高于所述相变温度的关节温度的关节的润滑。 

根据本发明的另一方面，提供了脂质体的用途，所述脂质体包括一种或多种膜，所述一种或多种膜含有由具有两条相同或不同的C₁₂-C₁₆烃链的甘油磷脂(GPL)和具有一条C₁₂-C₁₈烃链的鞘脂(SPL)组成的组中的至少一种磷脂(PL)，所述一种或多种膜具有发生有序固相(SO)到无序液相(LD)相变的相变温度，所述相变温度在约20℃到约39℃的温度内，所述用途是用于制备施用到具有高于所述相变温度的关节温度的关节的药物组合物。 

在本发明的脂质体的用途中，所述甘油磷脂(GPL)可包括两条C₁₄或C₁₆酰基链。 

在本发明的脂质体的用途中，所述磷脂(PL)可以是磷脂酰胆碱(PC)。其中所述PC可以是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。其中所述PC可包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)。 

在本发明的脂质体的用途中，所述鞘脂(SPL)可以是鞘磷脂。 

在本发明的脂质体的用途中，所述磷脂(PL)的头基可被络合有每头基至少6分子的水。 

根据又一方面，提供了用于润滑哺乳动物的关节的方法，所述方法包括：将治疗有效量的脂质体施用于具有关节温度的关节腔中，所述脂质体包括一种或多种膜，所述一种或多种膜含有由具有两条相同或不同的C₁₂-C₁₆烃链的甘油磷脂(GPL)和具有一条C₁₂-C₁₈烃链的鞘脂(SPL)组成的组中的至少一种磷脂(PL)，所述一种或多种膜具有发生有序固相(SO)到无序液相(LD)相变的相变温度，所述相变温度在约20℃到约39℃的温度；所述相变温度低于所述关节温度。 

根据本发明的更进一步的方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物用于具有关节温度的关节的关节润滑并包括生理上可接受的载体和脂质体；所述脂质体包括一种或多种膜，所述一种或多种膜含有由具有两条相同或不同的C₁₂-C₁₆烃链的甘油磷脂(GPL)和具有一条C₁₂-C₁₈烃链的鞘脂(SPL)组成的组中的至少一种磷脂(PL)；所述一种或多种膜具有发生有序固相(SO)到无序液相(LD)相变的相变温度，所述相变温度在约20℃到约39℃的温度内并低于所述关节温度。 

在一个实施方案中，所述C₁₂-C₁₆或C₁₂-C₁₈疏水链是饱和的。 

GPL、SPL或它们的组合形成脂质体，优选地形成具有大于约0.3μm，通常大于约0.5μm，并且有时大于约0.8μm的平均直径的脂质体。脂质体的平均直径通常小于约10μm，通常小于约8、7、6或5μm并且有时小于3.5μm。脂质体可以是单膜脂质体或者根据一个实施方案可以是多层囊泡 (multilameller vesicle，MLV)脂质体。根据其他的实施方案，脂质体还可以是大的多囊囊泡(LMVV)或脱水再水化囊泡(DRV)脂质体。 

可通过关节内注射、关节镜施用(arthroscopic administration)、外科手术施用和通常可用来将此类制剂滴注到关节滑膜中或滴注到关节软骨上的任何施用形式来将本发明的脂质体组合物施用到患病关节。能根据本发明治疗的患病关节可与许多疾患相关，例如关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎(以及类风湿性关节炎患者中的骨关节炎)、创伤性关节损伤、运动损伤、关节交锁(如在颞下颌关节(TMJ)中)、在外科手术介入(如关节穿刺术、关节镜手术、关节成形术、膝关节和髋关节置换术)之后的状况。将通过本发明治疗或预防的优选疾患是原发性或继发性骨关节炎 (osteoarthritis)。 

附图简述 

为理解本发明，并且为理解如何在实践中进行本发明，现将仅通都擦测试：5mM HB中的DMPC-MLV(直径0.8-3.5μm)141mM(■)；5mM HB中的DMPC-SUV(直径～100nm)141mM(▲)；或单独HB 5mM(×)；将软骨样品切成圆片，并测试它们的DMPC浓度与软骨深度的函数关系。 

图4A-4F是在存在和不存在润滑介质和摩擦测试时软骨样品的扫描电子显微镜(SEM)的显微照片、在不存在摩擦测试时对照样品的SEM显微照片：图4A是健康软骨的显微照片，其显示在表面上的健康软骨的天然存在的脂类囊泡结构(×3000)；图4B是关节炎软骨的显微照片(×3000)；以及在下述润滑剂存在下经受摩擦测试的健康软骨：盐水(×6000，图4C)；ISF(×800，图4D)；DMPC-SUV(×800，图4E)；和DMPC-MLV(×6000，图4F)。 

一些实施方案的详述 

本发明是基于来自下述的组合的结果：(i)使用人软骨-之上-软骨装置的摩擦系数测量(Merkher，Y.等⁴⁰)、(ii)基于SEM的软骨形态学研究、(iii)软骨磷脂和磷脂酰胆碱(PC)的定量测定和(iv)基于不同PC的脂质体的物理化学特征，所述结果证明分散于低离子强度HB的大的(直径大于0.3μm)多层囊泡(例如DMPC-MLV)和DMPC/DPPC-MLV(0.6/1.0摩尔比)在温度略高于SO-到-LD相变温度(例如约1℃、2℃、3℃、5℃、8℃、11℃和有时达到约15℃)下作为有效的软骨润滑剂和磨损减低剂(wear reducer)的潜力。 

首先，比较主要由各种PC组成的多层脂质体的润滑功效、所述PC具有两条从14到22个碳的烃链，完全饱和或具有可变的不饱和度。C₁₂-C₁₆烃链显示具有优选的长度。 

然后，使用最有效的单组分润滑剂DMPC，研究脂质体粒度、层状的影响和将胆固醇、mPEG-DSPE或额外的PL结合到DMPC脂质体的脂双层(lipidic bilayers)中的影响。这些研究显示当在略高于SO-到-LD相变温度的温度下用作润滑剂时，诸如DMPC-MLV或DMPC/DPPC-MLV(直径0.8-3.5μm)等的MLV最有效。通过DMPC/DPPC-MLV在37℃(该温度略高于其SO到LD相变温度范围，即T_m＝～34℃)的性能与其在24℃(SO相)的性能相比证实这一点。 

本文下面所呈现的结果进一步显示了下述内容： 

-DMPC被鉴定为脂质体生物润滑剂组合物的一种优选组分(当单独使用或与DPPC结合使用时)，DMPC具有饱和的、中等长度的酰基链(14个碳)、具有略低于生理温度的T_m(对于所使用的DMPC-MLV，T_m＝23.2℃，而对于所使用的DMPC/DPPC[0.6/1.0摩尔/摩尔]，T_m＝～34℃)，因此两种PL组合物均提供在37℃处于无序液相(LD)的脂质体，其中它们的极性头基(head group)是高度水合的(每DMPC或DPPC头基～9.7个水分子，相比之下当低于T_m、处于SO相时，每头基＜4.3个水分子)⁵³； 

-本文下面呈现的绝热压缩系数数据证明了有序固相(SO)(低K值) 和LD相(较高K值)的PC之间的差异以及LD相的优势。部分绝热脂双层压缩系数(K)与热致行为(thermotropic behavior)良好相关54，并且被发现反映脂双层中的水合水平、物理状态和腔的体积(自由体积)45。提出与PC头基相互作用的结合水分子影响双分子层中腔的总体积，因此影响了分子间的相互作用以及绝热压缩系数。具体地说，DOPC和DMPC在24℃以及在37℃处于LD相(高于它们的T_m，下面表1)。然而，表2证明DMPC脂质体的润滑能力显著优于DOPC的润滑能力。不受理论所束缚，认为DMPC和DOPC之间的性能差异归于下述事实：在生理条件下，即在36℃和43℃之间的温度下，DMPC只略高于T_m。此外，手的滑膜关节的温度可低至～28℃。在此类条件下，DMPC也略高于T_m。此外，DMPC是具有能够形成稳定的脂质体的最短酰基链的PC，因此构成本文示例的所有其它单组分PC双分子层中力学上“最软的”双分子层44。 

-主要由具有较好混合性和几乎完美的混合特性以及结合的SO-到-LD相变温度～34℃的DMPC/DPPC(0.6∶1.0摩尔/摩尔)混合物组成的MLV的润滑能力。与在37℃差的(inferior)润滑功效的单独的DPPC-MLV(41.4℃的T_m)(静摩擦系数和动摩擦系数分别为0.029和0.022)相比，DMPC/DPPC-MLV在37℃显示高的润滑功效(静摩擦系数和动摩擦系数分别为0.017和0.0083)，但在24℃没有显示高的润滑功效(静摩擦系数和动摩擦系数分别为0.042和0.021)； 

-DMPC-MLV的“柔软性”和水合水平以及这些特征的改变对软骨润滑的影响。制剂的第一次更改(modification)包括将～33摩尔％的胆固醇引入到脂质体膜中。如下面显示，这导致从LD相到有序液相(LO)的物理转变34。已知这种改变“干燥”脂双层56，并且这种改变还反映在绝热压缩系数的降低和因此双分子层柔软性的降低上。因此，用DMPC/胆固醇-MLV润滑软骨显著地劣于用DMPC-MLV润滑软骨(表3或图1)。在另一个更改中，将5摩尔％的脂质聚合物(lipopolymer)mPEG-DSPE引入到DMPC-MLV的脂双层中。从脂质体表面延伸4-10nm(取决于聚合物链的状态，为蘑菇状或刷状构型³⁹)的PEG部分是高度柔性的和高度水合的(每环氧乙烷基团3个到4个水分子)⁴⁵。然而，将mPEG-DSPE添加到DMPC脂质体并没有改进润滑(图1)，这看起来与水合作用在润滑中的作用相矛盾。这可通过下述事实来解释：PEG部分尽管极性高，但其是非离子型的，并且因此其水合作用不同于离子型PC头基的水合作用⁴⁵。必须注意，这些接枝的PEG部分在体内仍旧可能是有益的，因为它们能保护脂质体不与间质液的大分子相互作用³⁴，类似于HA的软骨保护行为²²； 

-通过不同介质(盐水、ISF和低离子强度HB)获得的摩擦系数证明HB优于盐水和优于ISF(表2和图1)。此外，用HB润滑的软骨样品的总PL浓度几乎是用ISF润滑的软骨的总PL浓度的两倍，并且显著高于用盐水润滑的软骨的总PL浓度(图2)。说明HB可更好地保持天然存在的软骨SAPL，因此改善了润滑。HB超过盐水的优势(图1)还可通过其低离子强度来解释，所述低离子强度导致脂双层中较不紧密的PL堆积，因此能够在摩擦事件之后迅速恢复双分子层^34，57。这进一步支持了作为有效润滑的主要贡献者的双分子层柔软性的重要性。由上所述，变得明显的是，HB对于脂质体作为润滑剂是有效和支持的介质； 

-发现大的多层DMPC-MLV优于小单层脂质体(＜100nm)。不受理论所限，因为不是建立本发明所需的，认为这种优势源自于前者保持在软骨表面附近的方式，如PC沿软骨深度的分布所证明的(图3)，这是由于MLV的大的粒度(直径0.8-3.5μm)。Maroudas等报道软骨中的胶原纤维之间存在100-nm的间隙⁵⁰。Stockwell和Barnett⁵¹以及Barnett和Palfrey⁵²指出这些纤维作为阻碍大颗粒穿入软骨的屏障，报道了小的蛋白银颗粒比大颗粒穿入软骨更深。本文呈现的结果显示，较小的DMPC-SUV深深地穿入软骨，而DMPC-MLV保持在表面附近(图3)。这与由用HB中的DMPC-SUV润滑的软骨和单独用HB润滑的软骨所获得的摩擦水平的相似性一致(图1)，因为DMPC-SUV深深地穿入软骨，对润滑的影响主要是介质(即HB)。 

-SEM形态学研究，其中在DMPC-MLV的粒度范围的天然存在的球形结构似乎在进行摩擦测试前存在于健康的未被润滑的软骨的表面上(图4A)，而在用盐水或ISF润滑的健康的软骨的摩擦测试之后消失(分别为图4C和图4D)。用DMPC-MLV润滑的软骨样品在进行摩擦测试之后似乎在它们的表面上具有球形脂类结构(图4F)。

根据这些结果，已设想，选自甘油磷脂(GPL)和鞘脂(SPL)的磷脂(PL)是天然存在的脂类球形结构的潜在替代物(substituent)，其能减少摩擦并保护软骨以防磨损。 

进一步，已设想，当存在于软骨表面附近时，包括GPL、SPL或它们的组合(作为形成脂质体的磷脂)的脂质体起到用于补充包覆软骨表面的保护性脂双层的储库(reservoir)的作用，因此帮助保存天然存在的PL，如与用其他润滑剂和介质润滑的软骨相比，用DMPC-MLV润滑的软骨中更高的总PL水平所示(图2)。 

根据本发明的一些实施方案，GPL带有磷酸胆碱头基(磷脂酰胆碱，基于PC的脂类)或磷酸甘油头基(磷脂酰甘油，基于PG的脂类)，并且SPL是神经酰胺(带有磷酸胆碱头基的N-酰基鞘氨醇，也称为N-酰基-鞘氨基(sphingosyl)-磷酸胆碱(基于SM的脂类)。 

如精通基于脂类的技术的技术人员所理解，PC和SM是具有阳离子胆碱和阴离子磷酸二酯部分(构成磷酸胆碱头基)的两性离子磷脂，其在宽pH范围内保持完全离子化，并且不带净电荷(ζ电位＝0mV)³⁴。PG在宽pH范围内带负电荷，如其负ζ电位明显指明。PC和PG的疏水部分包括2条烃(如酰基和烷基)链。SM也具有2条疏水烃链，其中1条是鞘氨醇碱(sphingoid base)链本身，且另1条是N-酰基链。其中烃链大于12个碳原子的PC、SM和PG都是类似圆柱体的形状，因为它们的堆积参数(packingparameter)是在0.74-1.0的范围内。它们形成脂双层，所述脂双层在高于SO到LD相变时变得高度水合并囊泡化以形成脂囊泡(脂质体)^34，35。PC和PG脂质体双分子层可处于有序固相(SO)(先前称为凝胶相或固相)或处于无序液相(LD)(先前称为液晶相或液相)³⁴。SO相到LD相之间的转变包括吸热的、被称为主相变的一级相变。T_m是在SO到LD相变期间发生热容量变化的最大变化时的温度。PC的T_m和SO到LD相变的温度范围取决于(除了别的因素以外)PC烃链组成。在LD相(而不是在SO相)中，带电的磷酸胆碱和磷酸甘油头基是高度水合的。 

应进一步注意，PG和SM具有与对应的PC(同样长度的取代烃链)的T_m相似的T_m。例如，DMPG的T_m与DMPC的T_m相同，即23℃，并且DPPG或N-棕榈酰SM的T_m与DPPC的T_m相同，即41℃。因此，尽管下述实施例使用基于PC的脂类，但根据本发明的PL还可以是基于PG或基于SM的脂类。 

根据本发明，可使用两种或多种PL的混合物(如两种不同的PC、PC和PG、两种不同的PG、两种SM、PC和SM或PG和SM等)，只要在原位时(在健康的或功能障碍关节的关节区)，所形成的混合物处于LD状态且脂类头基是高度水合的。 

考虑到上述内容，本发明人已开发了用于关节润滑的脂质体系统，所述脂质体系统是化学上稳定的、抗氧化性损伤的并且不含HA。 

因此，根据本发明的一方面，提供了脂质体用于关节润滑的用途，所述脂质体包括选自甘油磷脂(GPL)或鞘脂(SPL)中的至少一种PL。 

根据本发明的另一方面，提供了脂质体用于制备用于关节润滑的药物组合物的用途，所述脂质体包括选自甘油磷脂(GPL)或鞘脂(SPL)中的至少一种PL。 

根据这两方面的脂质体的特征为它们包括一种或多种膜，所述一种或多种膜含有由具有两条相同或不同的C₁₂-C₁₆烃链的甘油磷脂(GPL)和具有一条C₁₂-C₁₈烃链的鞘脂(SPL)组成的组中的至少一种磷脂(PL)。发生有序固相(SO)到无序液相(LD)相变的相变温度在约20℃到约39℃的温度范围内。脂质体用来润滑具有略高于相变温度的关节温度的关节。因此，脂质体在关节内处于LD相。关节温度通常只略高于相变温度(如在约1℃到约15℃的范围内，如上详述)的事实似乎对有效的润滑具有重要性。 

在一个实施方案中，所述C₁₂-C₁₆或C₁₂-C₁₈疏水链是饱和的。 

应注意，上述条件是累积(cumulative)的，即包含在脂质体内的PL(单个PL或PL与另外的PL的组合)的选择应使得脂质体将具有在约20℃到约39℃之间的SO-LD相变温度。 

根据本发明的另外的实施方案，使用所述GPL或SPL的脂质体系统 进一步包括下述中的一种或多种： 

GPL或SPL具有烷基、链烯基或酰基C₁₂到C₁₆烃链。就GPL来说，两条链可以相同或不同。 

一个特定的实施方案涉及具有含有至少一条C₁₄酰基链的GPL或SPL的脂质体的用途。 

另一个特定实施方案涉及具有C₁₄和C₁₆酰基链的GPL的用途。 

另一个特定实施方案涉及具有含有C₁₆酰基链的SPL的脂质体的用途。 

另一个特定实施方案涉及上述脂质体中的任一种的组合的用途。 

一些GPL或SPL具有离子头基，并且根据本发明的实施方案，该头基在宽范围pH内是高度离子化的。宽范围可被界定为pH在3和14之间。 

GPL以及SPL是高度水合的，即每脂类头基水分子的数目是至少约6个；7个或有时至少8个水分子，所述水分子与GPL或SPL的离子化头基络合。 

GPL或SPL能形成MLV(以及上文提到的其它类型的脂质体)，优选地形成具有大于0.3μm的平均直径的MLV。根据一个实施方案，MLV被界定为平均直径在0.3μm和5μm之间的范围内。根据另一个实施方案，MLV被界定为平均直径在0.8μm和3.5μm之间的范围内。 

因为发现胆固醇降低由GPL、SPL或它们的组合形成的MLV的润滑特性(如本文所定义)，根据本发明可使用的MLV或其它类型的脂质体在它们的双分子层中不应该包括膜活性固醇(membrane active sterol)，例如胆固醇。膜活性固醇被界定为影响膜内的短程和长程脂序(lipid order)、使体积减到最小并降低膜渗透性。具体地说，固醇应具有1)扁平的稠环系统、2)在3位的羟基或其它小的极性基团、3)“像胆固醇样”的尾部和4)每分子小的面积(当在表面压力12mN/m下在空气/水界面聚集(assemble)时， 

)。 

应注意，本发明的组合物优选地不包含丙二醇。 

应进一步注意，本发明的组合物优选地不包含葡聚糖。 

上述实施方案中的一个或多个包括的GPL的特定组包括带有磷酸胆碱头基的GPL(基于PC或SM的脂类)。根据本发明的一个优选的PC是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)。 

根据本发明可使用的基于PC的脂类的非限制性实例包括1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC，Tm 41.4℃)；1，2-双十五烷酰(dipentadecanoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C15，T_m 33.0℃)。根据本发明可使用的SPL包括带有磷酸胆碱头基的鞘磷脂(SM)，且非限制性实例包括N-棕榈酰SM Tm 41.0℃和1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-PC。各种基于PC的脂类的Tm值可参见“Thermotropic Phase Transitions of Pure Lipids inModel Membranes and Their Modifications by Membrane Proteins”(模型膜中纯脂类的热致相变和它们的膜蛋白的改性)，John R.Silvius，Lipid-ProteinInteractions(脂类-蛋白质相互作用)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1982，并且还可参见Lipid Thermotropic Phase Transition Data Base-LIPIDAT(脂类热致相变数据库-LIPIDAT)和参见Marsh(1990)³⁶。 

应注意，根据本发明，MLV脂质体(或根据本发明使用的其它脂质体)具有不高于原位(即关节内)温度15℃、范围在约20℃到约39℃内的SO到LD相变的终止温度(offset temperature)(上限)。根据本发明，MLV脂质体由GPL、SPL或它们的组合形成，并且因此上述SO到LD相变温度涉及由GPL、SPL及其组合形成的MLV脂质体，因此提供了其中PL或它们的混合物处于LD相的脂质体。 

根据本发明一个特定的实施方案涉及DMPC-MLV或DMPC/DPPC-MLV用于制备天然存在的软骨PL的替换物(即作为软骨润滑剂和磨损减低剂)的用途。这些MLV也具有较大的实践优势。它们可简单地并且以低成本被制备。DMPC和DPPC都抗氧化性损伤，并且长期稳定。此外，这些PC已经被批准用于人类使用。根据一个实施方案，当使用DMPC和DPPC的混合物时，DMPC和DPPC之间的摩尔比取决于待被治疗的关节的温度，并且被设计成使得混合物的T_m提供处于LD相的MLV。合适的比率的一个实例是约0.6/1.0，该比率在35℃到39℃之间的关节温度下提供处于LD相的MLV。 

根据本发明另一方面，提供了用于润滑哺乳动物的关节的方法，所述方法包括将有效产生润滑效果的量的脂质体施用至包含滑液的所述关节的腔内。 

在一个实施方案中，所述C₁₂-C₁₆或C₁₂-C₁₈疏水链是不饱和的。 

应注意，患有减少的关节润滑或患有关节磨损(如骨关节炎)的患者的关节温度随疾病的进行而变化[Hollander，J.L.；Moore，R.，Studies inosteoarthritis using Intra-Articular Temperature Response to Injection ofHydrocortisone(利用关节内温度对注射氢化可的松的响应来研究骨关节炎).Ann.Rheum.Dis.1956，15，(4)，320-326]。实际上，这种温度变化被用作评估骨关节炎的炎症的临床工具[Thomas，D.；Ansell，B.M.；Smith，D.S.；Isaacs，R.J.，Knee Joint Temperature Measurement using a DifferentialThermistor Thermometer(使用差示热敏电阻温度计测量膝关节温度).Rheumatology 1980，19，(1)，8-13]。在骨关节炎患者的手关节中，显示温度从～28℃到～33℃变化[Varju，G.；Pieper，C.F.；Renner，J.B.；Kraus，V.B.，Assessment of hand osteoarthritis：correlation between thermographic andradiographic methods(手骨关节炎的评估：热像法和射线照相法之间的相关性).Rheumatology 2004，43，915-919]，而健康的颞下颌关节(TMJ)的温度从～35℃到～37℃变化[Akerman，S.；Kopp，S.，Intra-articular and skinsurface temperature of human temporomandibular joint(人颞下颌关节的关节内温度和皮肤表面温度).Scand.J.Dent.Res.1987，95，(6)，493-498]。 

因此，根据本发明，GPL或其与另外的PL的混合物在待用其润滑的关节区原位处于LD相是必要的，并且实际上是先决条件。 

本发明的方法可用来治疗、减轻、延缓、预防、控制或治愈起因于与关节功能障碍相关的任何关节病症或症状。为了本公开的目的，术语“关节病症”应总是表示引起关节的退化、疼痛、灵活性降低、炎症或生理破坏和功能障碍的关节区的任何痛苦(先天性的、自身免疫的或其它方面的)、损伤或疾病。所述病症可能与减少的关节分泌和润滑相关以及来自膝关节和髋关节置换术的并发症。 

根据本发明，关节可以是膝关节、髋关节、踝关节、肩关节、肘关节、跗骨关节、腕关节、指间关节和椎间关节中的任何一个。

特定的关节病症包括但不限于起因于关节炎的关节分泌和/或润滑的缺乏，包括下述疾患：类风湿性关节炎中的关节侵蚀、骨关节炎、类风湿性关节炎患者中的骨关节炎、创伤性关节损伤(包括运动损伤)、关节交锁(例如在颞下颌关节(TMJ)中)、在关节穿刺术、关节镜手术、开放关节手术(open joint surgery)、哺乳动物(优选为人)的关节(如膝关节和髋关节)置换术之后的状况。本发明的方法治疗或预防的优选病症是骨关节炎。 

本发明的方法可用作预防措施，以预防将来的损伤或退化。例如，可将基于PL的MLV脂质体在运动员的整个职业生涯期间间歇地关节内施用于运动员，来将应力相关的损伤或软骨退化的危险降至最低。 

本发明的方法可不与抗炎症剂、镇痛剂、肌肉松弛剂、抗抑郁剂或促进关节润滑的药剂一起使用，或用作这些药剂的辅助物，这些药剂通常用来治疗与关节僵硬相关的病症如关节炎。结合的治疗方法在降低与药剂如非类固醇抗炎药(NSAID)相关的副作用上是有益的，所述药剂通常用来预防、控制或治疗与减少的关节润滑相关的病症，如骨关节炎。除了增强安全性外，结合的治疗方法可能在提高疗效上也是有利的。 

将脂质体施用于患者的关节腔内可通过选自由关节内注射、关节镜施用(arthroscopic administration)或外科手术施用组成的组中的方法。 

根据本发明的又一方面，本发明还提供用于关节润滑的药物组合物，所述药物组合物包括生理上可接受的载体和脂质体，所述脂质体包括选自如本文定义的GPL或SPL中的至少一种PL。 

根据一个实施方案，生理上可接受的载体是透明质酸(HA)或组氨酸缓冲液(HB)。所述组合物还可以包括聚合物，如Klein，2006³¹所述的那些聚合物。 

根据本发明的组合物优选地是以适于通过选自关节内注射、关节镜施用或外科手术施用中的途径施用的形式存在。 

组合物中脂质体的量将随脂质体的PL组成、疾病、疾病的严重性和治疗方案，以及随待治疗的哺乳动物的年龄、体重等而变化。为了本文目的的量通过本领域可能已知的这些考虑事项来确定。所述量必须有效实现所治疗关节的润滑的改进，即减少形成关节的软骨之间的摩擦，所述改进可通过临床测试以及通过经历所述治疗的受治疗者的健康的改进(如患病关节的疼痛的减少、灵活性的改进)来显示。有效量通常在适当设计的临床试验(剂量范围研究)中确定，并且精通本领域的技术人员将知道如何恰当地进行此类试验，以便确定有效量。 

贯穿本说明书的描述和权利要求，单数形式“一个(a)”“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另外清楚指明。因此，例如，引用“一种PL”是引用一种或多种PL，并且“一种脂质体”指一种或多种脂质体。贯穿本说明书的描述和权利要求，单词的复数形式也包括单数引用，除非上下文另外清楚指明。 

另外，贯穿本说明书的描述和权利要求，单词“包括(comprise)”和“含有”以及所述单词的变体(例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”)指“包括但不限于”，并且不期望(且并不)排除其它部分、添加物、组分、整数(integer)或步骤。 

现在将通过非限制性实施例来描述本发明。 

非限制性实施例的描述 

材料和方法 

脂类：本研究中使用的脂类及其来源描述于表1；所有脂类都是＞98％纯。表1还呈现了磷脂双分子层的有序固相(SO)到无序液相(LD)相变温度T_m ^34-36，以及在37℃下的双分子层的状态。 

水：水使用WaterPro PS HPLC/超滤器混合系统(WaterPro PSHPLC/Ultrafilter Hybrid system)(Labconco，Kansas City，MO)来纯化，提供具有低水平的总碳和无机离子的无热原水(18.2MΩ)。 

试剂：所使用的所有其它试剂是分析级或更高。 

脂质体：通过把所需脂类溶解于叔丁醇中，然后冻干形成干“饼”来制备多层脂质体(MLV)。该干“饼”在高于T_m至少5℃的温度下在pH6.7的低离子强度(5mM)组氨酸缓冲液(HB)中水合³⁴。当需要时，通过逐步挤压穿过聚碳酸酯膜(GE-Osmonics，Minnetonka，MN)来减小MLV的粒度以形成小单层囊泡(＜100nm，SUV)，使用在高于T_m至少5℃下加热的10-mL挤压系统(Northern Lipids，Vancouver，Canada)，以400-nm孔径的膜开始并以50-nm孔径的膜结束³⁷。 

软骨润滑剂的初步筛选用不同PC组成一DMPC、DPPC、HSPC、DBPC、DOPC和POPC(缩写参见表1)的MLV来进行。在此筛选中，发现DMPC脂质体充当了最好的减摩剂(表2)。因此，进一步研究基于DMPC的脂质体，比较主要由不同粒度和层状的单独DMPC、或DMPC/DPPC混合物(0.6∶1.0摩尔比)、或DMPC结合胆固醇(2∶1摩尔比)、或DMPC结合脂质聚合物mPEG-DSPE(95∶5摩尔比)组成的脂质体。所使用的mPEG-DSPE由连接到二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的伯氨基的2000道尔顿的聚乙二醇组成。 

脂质体的表征：表征脂质体的下述： 

(i)磷脂(PL)浓度，使用改良的Bartlett检验^37，38； 

(ii)粒度分布，对1μm以下的脂质体，使用ALV-NIBS高性能粒度仪(Langen，Germany)在173°的散射角下通过动态光散射来表征；以及对大于400nm的脂质体，使用Beckman Coulter LS粒度分析仪13-320(Fullerton，CA)通过光衍射来表征，所述分析仪配备有偏振强度差散射(polarization intensity differential scattering，PIDS)以提供从40nm到2000μm的动态检测范围； 

(iii)微分比绝热压缩系数(partial specific adiabatic compressibility)，通过从脂质体分散体的密度(使用DMA 5000密度计，Anton Paar，Graz，Austria)和5MHz超声波通过其的速度(使用UCC-12超声速度计，NDTInstruments，Jerusalem，Israel)的计算来表征，如Garbuzenko等所述³⁹；以及 

(iv)结构，使用扫描电子显微镜(SEM)来表征。 

软骨：来自健康或OA人(年龄65到86岁)的关节软骨从股骨头骨折手术或全髋关节置换术获得。从股骨头的承载区去除完整的软骨栓(plugofcartilage)(直径4mm和8mm，～1.5cm厚)，并且随后在骨侧使用1320Leica冷冻切片机修剪，产生2mm厚的扁平软骨圆片，将所述圆片保存在-20℃。 

摩擦和磨损测试：在24℃和37℃下，覆盖宽范围粒度和浓度、分散于HB中的脂质体被筛选为减少两个人软骨圆片之间的摩擦和磨损的潜在润滑剂。使用浸没在HB中的脂质体分散体中、或作为对照，浸没在单独的HB中、或浸没在生理盐水(0.9％w/v；pH5.0；Teva Medical，Israel)中、或浸没在从OA患者获得的发炎的滑液(ISF)中的两个软骨圆片，用软骨-之上-软骨装置进行摩擦测量(Merkher，Y.；Sivan，S.；Etsion，I.；Maroudas，A.；Halperin，G.；Yosef，A.，A rational human joint friction test usinga human cartilage-on-cartilage arrangement(使用人软骨-上-软骨装置的合理的人关节摩擦测试).Tribol.Lett.2006，22，29-36，其内容通过引用整体并入本文)。使这些圆片在宽范围负载(1N到30N)内经受相对滑动，所述负载等于关节中的生理压力(0.08MPa到2.4MPa)。使用各种滑动速度(0.5mm/s到2mm/s)和保压时间(5s到300s)与各种负载一起来模拟各种生理运动。 

为评估磨损，确定摩擦测试对软骨中总PL浓度的影响和对软骨表面的结构的影响。 

PL的提取和定量：使用Bligh和Dyer提取方法^41，42，在润滑测试之前和之后，从软骨样品中提取总PL。为此，将软骨样品于37℃在氯仿-甲醇溶液(1∶1v/v)中孵育1小时。加入水使最终氯仿-水-甲醇之比为1∶1∶1，将溶液涡旋混合1分钟，且然后使用台式离心机离心以形成两相。收集包含PL的富氯仿的下相(lower phase)，真空(Concentrator 5301，Eppendorf)下干燥，并将残余物(包含脂类)重新溶解于小体积的氯仿-甲醇溶液(2∶1v/v)，且然后上样(load)到低磷硅胶TLC玻璃板(Uniplate-Silica Gel G，Analtech，Newark，DE)上。TLC使用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4 v/v/v)溶剂系统⁴¹。鞘磷脂、PC和PE的商品化的标记物也被上样到板上，用于斑点鉴 定(spot identification)。用UV可检测的樱草灵(primulin)(Sigma)溶液(1mL 0.1％w/v樱草灵水溶液，加到100mL丙酮-水，4∶1v/v中)喷洒干燥的TLC板后检测脂类斑点。从TLC板上刮下每个PL斑点，并且通过改良的Bartlett方法定量其PL含量^37，38。 

PL浓度还被定量为软骨深度的函数。为此，软骨样品从软骨表面向内、平行于软骨面用切片机切成20μm或50μm厚的片。如上面所述提取PL后，通过改良的Bartlett方法定量每个片的PL浓度^37，38。 

软骨结构：通过SEM分析软骨结构。样品通过在液氮中快速冷却被保存并且被保持在真空下(～15mbar)48小时以去除多余的水。然后，将样品装到短管(stub)上，并且在Polaron E5100溅射涂膜机(Watford，England)内用金溅射涂膜。使用FEI Quanta 200扫描电子显微镜系统(Polaron)、使用30kV的加速电压来分析样品。 

结果 

所测试的表面活性磷脂(SAPL)是磷脂酰胆碱(PC)，它也天然存在于软骨和滑液中。 

筛选用于软骨润滑和磨损减少的脂质体包括比较主要由各种单组分PC组成的MLV所获得的静摩擦系数和动摩擦系数(如在材料和方法和表1中所述)。示例性的PC在它们的酰基链方面不同，这确定了脂质体的基本特征，特别是T_m和物理状态。 

筛选不同PC组成的脂质体：筛选主要由不同PC(DMPC、DPPC、HSPC、DBPC、DOPC和POPC)组成的MLV(直径0.8μm到3.5μm)显示，在24℃和37℃两种情况下，DMPC都是表现最好(best-performing)的软骨润滑剂(表2)。关于脂质体分散体介质，发现HB的润滑效率比盐水的润滑效率或ISF的润滑效率更好(表2和图1)。此外，分散于HB的脂质体是比分散于盐水的脂质体更好的润滑剂(数据未显示)。 

用几种基于DMPC的脂质体润滑的软骨中的摩擦和磨损：研究脂质体粒度和层状的影响，将多层DMPC脂质体(DMPC-MLV)的润滑功效与＜100-nm的单层DMPC脂质体(DMPC-SUV)的润滑功效相比。此外， 研究添加脂类的DMPC-MLV作为软骨润滑剂的功效，所述脂类尽管是常见的脂质体组分，但其是形成非脂质体的，例如胆固醇或mPEG-DSPE。添加～33摩尔％的具有堆积参数～1.2³⁹的胆固醇以形成DMPC/胆固醇-MLV，因此引起脂双层从有序固相(SO，如果PL低于T_m)或无序液相(LD，如果PL高于T_m)转变到被称为有序液相(LO)的新物理相^43，44。因此，可比较在3种不同双分子层相LD、SO和LO的脂质体对润滑的影响。添加到DMPC-MLV的另一个组分是具有相对低的堆积参数～0.5³⁹的脂质聚合物mPEG-DSPE，这引入了包围脂质体的高度水合的延伸的空间障碍^39，45。添加5摩尔％的mPEG-DSPE以形成DMPC/mPEG-DSPE-MLV。 

HB中的DMPC-MLV的静摩擦系数和动摩擦系数(分别为0.020和0.011)低于由HB中的DMPC/胆固醇-MLV获得的静摩擦系数和动摩擦系数(分别为0.040和0.036)或由HB中的DMPC/mPEG-DSPE-MLV获得的静摩擦系数和动摩擦系数(分别为0.022和0.023)，如图1所示，并且与存在于健康的滑膜关节的低摩擦系数⁴⁶相似。此外，用DMPC-MLV润滑的软骨的静摩擦系数和动摩擦系数低于用DMPC-SUV润滑的软骨的静摩擦系数和动摩擦系数(分别为0.045和0.036)，用DMPC-SUV润滑的软骨的静摩擦系数和动摩擦系数仅略低于单独用HB润滑的软骨的静摩擦系数和动摩擦系数(分别为0.053和0.037)，图1。 

通过学生t检验的统计学评价表明了DMPC-MLV对本试验所测试的其它脂质体制剂以及对介质的优势(p＜0.008)。 

脂双层的压缩系数：微分比绝热压缩系数K是对脂双层的物理相(SO、LD或LO)及其水合状态两者的度量，本文假设这对脂质体作为摩擦和磨损减低剂的功效具有重要贡献⁴⁵。在37℃测定的DMPC、DPPC和氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的K值分别是50.7×10^-6mL/(g-atm)、31.2×10^-6mL/(g-atm)和33.3×10^-6mL/(g-atm)。发现在24℃，DMPC、DPPC和HSPC具有略低的K值的相似分布(profile)，分别为46.4×10^-6mL/(g-atm)、28.0×10^-6mL/(g-atm)和30.3×10^-6mL/(g-atm)。这些K值反映了DPPC和HSPC的相变温度T_m(41.4℃、52.5℃)高于DMPC的相变温度(23.2℃)。在DMPC/胆固醇脂质体(2∶1摩尔比)中，在24℃和37℃，K分别被减小到42.2×10^-6mL/(g-atm)和45.5×10^-6mL/(g-atm)。在24℃和37℃，将5摩尔％mPEG-DSPE引入到HSPC脂质体(T_m 53℃)³⁹将压缩系数分别提高到32.8×10^-6mL/(g-atm)和35.5×10^-6mL/(g-atm)。而在HSPC/胆固醇脂质体(2∶1摩尔比)中，在24℃和37℃，K被减小到30.0×10^-6mL/(g-atm)和33.6×10^-6mL/(g-atm)。 

不受理论所限，上述结果说明，MLV双分子层的物理相对软骨生物润滑是重要的，并且润滑的最佳条件是处于LD相，不远高于SO-到-LD相变温度(T_m)。为进一步检验此假设，本发明人测试了主要由0.6/1.0(摩尔/摩尔)DMPC/DPPC组成的MLV。选择该组成以便能形成具有～34℃T_m的脂质体⁴⁷(由于这两种PC几乎理想的混合而成为可能)。在24℃和37℃研究这些MLV。结果明显支持上述假设，因为它们显示(图1)DMPC/DPPC-MLV在37℃是最有效的润滑剂(静摩擦系数和动摩擦系数分别为0.017和0.0083)，但在24℃则不是最有效的润滑剂(静摩擦系数和动摩擦系数分别为0.042和0.021)。此外，DMPC/DPPC-MLV优于单独的DPPC-MLV(T_m＝41.3)，单独的DPPC-MLV在37℃是差的(静摩擦系数和动摩擦系数分别为0.029和0.022)。 

润滑的软骨样品中的PL水平：测量了在不同润滑剂和介质存在下，经受摩擦测试之前和之后的健康软骨样品(厚度～1200μm)的总PL(包括天然存在的SAPL和来自脂质体的PL)水平。可以观察到(图2)，在所有被测试样品中，用DMPC-MLV润滑的软骨中的总PL浓度最高。从健康的受治疗者获得的软骨和用HB润滑的软骨的PL浓度高于用盐水或ISF润滑的相似软骨的PL浓度，后者(ISF)具有与从OA患者获得的软骨相似的PL水平。 

脂质体粒度和层状对它们穿入软骨的影响：对用都分散于HB的DMPC-MLV和DMPC-SUV润滑的样品和对用单独的HB润滑的样品(对照)的摩擦测试之后，测量软骨深度(0-800μm，以20-50-μm增量)与PC浓度的函数关系。这些样品中，用DMPC-MLV润滑的软骨在软骨表面附近具有最高的PC浓度(图3)。在～100μm的深度时，PC浓度达到最大值，低于该深度，PC浓度下降。另一方面，在用DMPC-SUV润滑的软 

骨中，最高的PC浓度出现在软骨内的深处(～600μm)，而在表面，PC浓度与对照(用HB润滑的软骨)的PC浓度相似。 

软骨形态学：使用SEM来研究软骨表面形态学和磨损²⁸。在图4中，我们呈现经受不同治疗的软骨样品的SEM图像。两个对照样品(图4A和图4B)不经受摩擦测试，而所有其它软骨样品(图4C-4F)是从健康人获得，并且在不同润滑剂存在下经受相同的摩擦测试。图4A显示健康的软骨，其中天然存在的球形脂类结构分散在其多孔表面上，如Ohno及其合作者先前在大鼠软骨的表面上所示^28，48。另一方面，与用盐水(图4C)或ISF(图4D)润滑的摩擦测试的健康软骨一样，骨关节炎软骨表面缺少这些结构(图4B)，表明这些润滑剂对磨损的差的保护。在用DMPC-SUV润滑的软骨表面(图4E)上，摩擦测试后可观察到非常少的脂类结构。对于DMPC-MLV(图4F)，摩擦测试后显示类似健康的软骨上的那些脂类结构的大的脂类结构。 

参考文献 

1.Alexander，C.J.Idiopathic osteoarthritis：time to change paradigms？(特发性骨关节炎：到了改变范式的时候？)Skeletal Radiol.33，321-324(2004). 

2.Corti，M.C.& Rigon，C.Epidemiology of osteoarthritis：prevalence，risk factors and functional impact(骨关节炎流行病学：流行性、危险因素和功能影响).Aging Clin.Exp.Res.15，359-363(2003). 

3.Bullough，P.G.&Vigorita，V.J.Orthopaedic Pathology，Edn.3rd(整形外科病理学，第3版).(Mosby-Wolfe，Baltimore；1997). 

4.Koopman，W.J.& Moreland，L.W.Arthritis and Allied Conditions：ATextbook of Rheumatology，Vol.1-2，Edn.15th(关节炎及关联病症：风湿病学教科书，第15版，1-2卷).(Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia；2005). 

5.Sokoloff，L.The biology of degenerative joint disease(退化性关节疾病的生物学).Acta RhumatolBelg.1，155-156(1977). 

6.Conaghan，P.G.，Vanharanta，H.& Dieppe，P.A.Is progressive osteoarthritisan atheromatous vascular disease？(进行性骨关节炎是动脉粥样硬化血管病吗？)Anm.Rheum.Dis.64，1539-1541(2005). 

7.Neame，R.& Doherty，M.Osteoarthritis update(骨关节炎进展).Clin.Med.5，207-210(2005). 

8.Imhof，H.等，Subchondral bone and cartilage disease：a rediscoveredfunctional unit(软骨下骨和软骨疾病：重新发现的功能单位).Invest.Radiol.35，581-588(2000). 

9.Lajeunesse，D.& Reboul，P.Subchondral bone in osteoarthritis：a biologiclink with articular cartilage leading to abnormal remodeling(骨关节炎中的软骨下骨：与导致异常重塑的关节软骨的生物联系).Curr.Opin.Rheumatol.15，628-633(2003). 

10.Radin，E.L.Who gets osteoarthritis and why？(什么人患骨关节炎以及为什么患骨关节炎？)J.Rheumatol.Suppl.70，10-15(2004). 

11.Grainger，R.& Cicuttini，F.M.Medical management of osteoarthritis of theknee and hip joints(膝关节和髋关节的骨关节炎的医学控制).Med.J.Aust.180，232-236(2004). 

12.Swann，D.A.，Hendren，R.B.，Radin，E.L.，Sotman，S.L.& Duda，E.A.Thelubricating activity of synovial fluid glycoproteins(滑液糖蛋白的润滑活性).Arthritis Rheum.24，22-30(1981). 

13.Swann，D.A.& Mintz，G.The isolation and properties of a secondglycoprotein(LGP-II)from the articular lubricating fraction from bovinesynovial fluid(2型糖蛋白(LGP-II)从来自牛滑液的关节润滑部分的分离及其特性).Biochem.J.179，465-471(1979). 

14.Swann，D.A.，Slayter，H.S.& Silver，F.H.The molecular structure oflubricating glycoprotein-I，the boundary lubricant for articular cartilage(关节软骨的边界润滑剂-润滑糖蛋白-I的分子结构).J.Biol.Chem.256，5921-5925(1981). 

15.Nitzan，D.W.，Kreiner，B.& Zeltser，R.TMJ lubrication system：its effecton the joint function，dysfunction，and treatment approach(TMJ润滑系统：其对关节功能、功能障碍和治疗方法的影响).Compend.Contin.Educ.Dent.25，437-444(2004). 

16.Yui，N.，Okano，T.& Sakurai，Y.Inflammation responsive degradation ofcrosslinked hyaluronic acid gels(交联透明质酸凝胶的炎性响应降解).J.Control.Release 22，105-116(1992). 

17.Hills，B.A.& Butler，B.D.Surfactants identified in synovial fluid and theirability to act as boundary lubricants(滑液中鉴定的表面活性剂及它们作为边界润滑剂的能力).Anm.Rheum.Dis.43，641-648(1984). 

18.Sarma，A.V.，Powell，G.L.& LaBerge，M.Phospholipid composition ofarticular cartilage boundary lubricant(关节软骨边界润滑剂的磷脂组合物).J.Orthop.Res.19，671-676(2001). 

19.Schwarz，I.M.& Hills，B.A.Surface-active phospholipid as the lubricatingcomponent of lubricin(作为润滑素润滑组分的表面活性磷脂).Br.J.Rheumatol.37，21-26(1998). 

20.Hills，B.A.& Monds，M.K.Enzymatic identification of the load-bearingboundary lubricant in the joint(关节中承载边界润滑剂的酶法鉴定).Br.J.Rheumatol.37，137-142(1998). 

21.Ogston，A.G.& Stanier，J.E.Physiological function of hyaluronic acid insynovial fluid；viscous，elastic，and lubricant properties(滑液中透明质酸的生理功能；黏性、弹性和润滑特性).J.Physiol.(Cambridge)119，244-252(1953). 

22.Benz，M.，Chen，N.& Israelachvili，J.Lubrication and wear properties ofgrafted polyelectrolytes，hyaluronan and hylan，measured in the surfaceforces apparatus(表面力仪中测量的接枝的聚电解质、乙酰透明质酸和海兰的润滑和磨损特性).J.Biomed.Mater.Res.A.71，6-15(2004). 

23.Rhee，D.K.等，The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth(分泌的糖蛋白润滑素保护软骨表面并抑制滑膜细胞过度生长).J.Clin.Invest.115，622-631(2005). 

24.Swann，D.A.，Bloch，K.J.，Swindell，D.& Shore，E.The lubricating activityof human synovial fluids(人滑液的润滑活性).Arthritis Rheum.27，552-556(1984). 

25.Pickard，J.E.，Fisher，J.，Ingham，E.& Egan，J.Investigation into the effectsof proteins and lipids on the frictional properties of articular cartilage(蛋白质和脂类对关节软骨的摩擦特性的影响的研究).Biomaterials 19，1807-1812(1998). 

26.Vecchio，P.，Thomas，R.& Hills，B.A.Surfactant treatment for osteoarthritis.(表面活性剂治疗骨关节炎).Rheumatology(Oxford)38，1020-1021(1999). 

27.Gudimelta，O.A.，Crawford，R.& Hills，B.A.Consilidation responses ofdelipidized cartilage(脱脂软骨的凝固应答).Clin.Biomech.19，534-542(2004). 

28.Watanabe，M.等，Ultrastructural study of upper surface layer in rat articularcartilage by”in vivo cryotechnique″combined with various treatments(通过“体内低温技术”结合各种治疗对大鼠关节软骨上表面层的超微结构研究).Med.Elect.Microsc.33，16-24(2000). 

29.Kawano，T.等，Mechanical effects of the intraarticular administration ofhigh molecular weight hyaluronic acid plus phospholipid on synovial jointlubrication and prevention of articular cartilage degeneration inexperimental osteoarthritis(在实验的骨关节炎中关节内施用高分子量透明质酸加磷脂对滑膜关节润滑和预防关节软骨退化的力学效应).Arthritis Rheum.48，1923-1929(2003). 

30.Forsey，R.W.等，The effect of hyaluronic acid and phospholipid basedlubricants on friction within a human cartilage damage model(人软骨损伤模型中基于透明质酸和磷脂的润滑剂对摩擦的影响).Biomaterials 27， 4581-4590(2006). 

31.Klein，J.Molecular mechanisms of synovial joint lubrication(滑膜关节润滑的分子机制).J.Proc.Inst.Mech Eng.，Part J：J.Eng.Tribology 220，691-710(2006). 

32.Briscoe，W.H.等，Boundary lubrication under water(水下的边界润滑).Nature 444，191-194(2006). 

33.Raviv，U.等，Lubrication by charged polymers(带电聚合物的润滑).Nature 425，163-165(2003). 

34.Barenholz，Y.& Cevc，G.Structure and properties of membranes inPhysical Chemistry of Biological Surfaces(膜的生物表面的物理化学结构和特性).(Marcel Dekker，New York；2000). 

35.Israelachvili，J.，Intermolecular and surface Forces，2^nd edition，(分子间力和表面力，第2版).Academic Pres，Lomdon(1992). 

36.Marsh，D.CRC Handbook of Lipid Bilayers(CRC脂双层手册).(CRCPress，Boca Raton，FL；1990). 

37.Barenholz，Y.& Amselem，S.Quality control assays in the developmentand clinical use of liposome-based formulations in Liposome Technology，Edn.2nd(脂质体技术中基于脂质体的制剂的开发和临床使用中的质量控制测定，第2版).(CRC，Boca Raton，FL；1993). 

38.Shmeeda，H.，Even-Chen，S.& Barenholz，Y.Enzymatic assays for qualitycontrol and pharmacokinetics of liposome formulations：Comparison withnonenzymatic conventional methodologies(用于脂质体制剂的质量控制和药物动力学的酶法测定：与非酶的传统方法学的比较).MethodsEnzymol.367，272-292(2003). 

39.Garbuzenko，O.，Barenholz，Y.& Priev，A.Effect of grafted PEG onliposome size and on compressibility and packing of lipid bilayer(接枝的PEG对脂质体粒度以及对脂双层压缩系数和堆积的影响).Chem.Phys.Lipids 135，117-129(2005). 

40.Merkher，Y.等，A rational human joint friction test using a humancartilage-on-cartilage arrangement(使用人软骨-之上-软骨装置的合理的人关节摩擦测试).Tribol.Lett.22，29-36(2006). 

41.Barenholz，Y.Relevancy of drug loading to liposomal formulationtherapeutic efficacy(载药量与脂质体制剂疗效的相关性).J.LiposomeRes.13，1(1993). 

42.Bligh，E.G.& Dyer，W.J.A rapid method of total lipid extraction andpurification(总脂类提取和纯化的快速方法).Can.J.Biochem.Physiol.37，911-917(1959). 

43.Biltonen，R.L.& Lichtenberg，D.The use of differential scanningcalorimetry as a tool to characterize liposome preparations(使用差示扫描量热法作为工具来表征脂质体制剂).Chem.Phys.Lipids 64，129-142(1993). 

44.Mouritsen，O.G.Life As a Matter of Fat.The Emerging Science ofLipidomics(生命-作为脂肪的问题。新兴的脂类组学科学).(Springer-Verlag，Berlin；2005). 

45.Tirosh，O.，Barenholz，Y.，Katzhendler，J.& Priev，A.Hydration ofpolyethylene glycol-grafted liposomes(聚乙二醇接枝的脂质体的水合作用).Biophys.J.74，1371-1379(1998). 

46.Hills，B.A.Boundary lubrication in vivo(体内边界润滑).J.Eng.Med.214，83-94(2000). 

47.Mabrey，S.& Sturtevant，J.M.Investigation of phase transitions of lipidsand lipid mixtures by high sensitivity differential scanning calorimetry(通过高灵敏差示扫描量热法研究脂类和脂类混合物的相变).PNAS 73，3862-3866(1976). 

48.Yoshida，M.，Zea-Aragon，Z.，Ohtsuki，K.，Ohnishi，M.& Ohno，S.Ultrastructural study of upper surface layer in rat mandibular condylarcartilage by quick-freezing method(通过快速冷冻方法对大鼠下颌髁突 软骨上表面层的超微结构研究).Histol.Histopathol.19，1033-1041(2004). 

49.Klein，J.Mechanism of friction across molecularly confined films of simpleliquids(越过简单液体的分子限定膜的摩擦的机制).Tribology Series 36，59-64(1999). 

50.Maroudas，A.Distribution and diffusion of solutes in articular cartilage(关节软骨中溶质的分布和扩散).Biophys.J.10，365-379(1970). 

51.Stockwell，R.A.& Barnett，C.H.Changes in permeability of articularcartilage with age(关节软骨渗透性随年龄的改变).Nature 201，835-836(1964). 

52.Bamett，C.H.& Palfrey，A.J.Absorption into the rabbit articular cartilage(进入兔关节软骨中的吸收).J.Anat.99，365-375(1965). 

53.Faure，C，Bonakdar，L.& Dufourc，E.J.Determination of DMPC hydrationin the L(alpha)and L(beta′)phases by 2H solid state NMR of D2O(通过D2O的2H固态NMR测定DMPC在L(α)和L(β′)相的水合作用).FEBS Lett.405，263-266(1997). 

54.Schrader，W.等，Compressibility of lipid mixtures studied by calorimetryand ultrasonic velocity measurements(通过量热法和超声速测量法研究脂类混合物的压缩系数).J.Phys.Chem.B106，6581-6586(2002). 

55.Schwarz，U.S.，Komura，S.& Safran，S.A.Deformation and tribology ofmulti-walled houow nanoparticles(多壁空心纳米颗粒的变形和摩擦学).Europhys.Lett.50，762-768(2000). 

56.Parasassi，T.，Di Stefano，M.，Loiero，M.，Ravagnan，G.& Gratton，E.Cholesterol modifies water concentration and dynamics in phospholipidbilayers：a fluorescence study using Laurdan probe(胆固醇改良磷脂双分子层中的水浓度和动力学：使用Laurdan探针的荧光研究).Biophys J.66，763-768(1994). 

57.Oncins，G.，Garcia-Manyes，S.& Sanz，F.Study of frictional properties of a phospholipid bilayer in a liquid environment with lateral force microscopyas a function of NaCl concentration(用侧向力显微术研究液相环境中的磷脂双分子层的摩擦特性与NaCl浓度的函数关系).Langmuir 21，7373-7349(2005). 

Claims (9)

1.脂质体的用途，所述脂质体包括一种或多种膜，所述一种或多种膜含有至少一种磷脂，其中所述磷脂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，或二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱的混合物，且其中所述脂质体是多层囊泡，所述一种或多种膜具有发生有序固相到无序液相相变的相变温度，所述相变温度在20℃到39℃的温度内，所述用途是用于制备施用到具有高于所述相变温度的关节温度的关节的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述脂质体具有在0.3μm到5μm之间的平均直径。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述磷脂的头基被络合有每头基至少6分子的水。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述脂质体被配制用于关节内注射、关节镜施用或用于外科手术施用。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物是用于治疗关节病症或起因于所述关节病症的症状的。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述关节病症选自关节炎、创伤性关节损伤、关节交锁、运动损伤、在关节穿刺术、关节镜手术、开放关节手术和关节置换术之后的状况。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述关节炎为骨关节炎。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述骨关节炎为类风湿性关节炎患者中的骨关节炎。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述包括至少一种磷脂的脂质体膜的所述有序固相或无序液相是通过测定所述至少一种磷脂的微分比绝热压缩系数随温度的变化而确定的。

Images