CN101501205A

CN101501205A - 用于改良纤维素的酶法水解的酶组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN101501205A
Application number: CNA2007800301971A
Authority: CN
Inventors: J·S·托兰; T·怀特; J·托马斯黑克
Original assignee: Iogen Energy Corp
Current assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2009-08-05
Also published as: BRPI0713506A2; US8318461B2; WO2007147264A8; AU2007262634A1; CA2655645A1; WO2007147264A1; EP2029762A1; EP2029762A4; US20090209009A1

Abstract

本发明提供了一种用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的方法，以及用于该方法中的酶。所述方法包含用纤维素酶、一种或多种β－葡萄糖苷酶以及用于将所述β－葡萄糖苷酶结合至存在于预处理的木质纤维素原料的水性浆液中的纤维固体上的粘合剂水解所述水性浆液。在所述水解过程中，所述纤维素酶和所述β－葡萄糖苷酶都与所述纤维固体结合。所述水解在固体保留型水解反应器中进行，使得未水解的纤维固体和结合的酶在所述反应器中的保留时间长于所述浆液的水相。

Description

用于改良纤维素的酶法水解的酶组合物及其使用方法

技术领域

本发明涉及用于水解纤维素的酶及其使用方法。更具体地，本发明涉及用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。

背景技术

燃料乙醇目前是由诸如玉米淀粉、甘蔗以及甜菜的原料生产的。然而，由于大部分适合生产这些作物的农田已用作人食物的来源，由这些原料生产乙醇的可行性是有限的。再者，由于在转化过程中使用的化石燃料会产生二氧化碳和其他副产物，由这些原料生产乙醇对环境有负面影响。

由含纤维素的原料(如农业废料、草及林业废料)生产乙醇近年来已受到诸多关注。其中的原因是这些原料可大量获得且很廉价，并且将它们用于乙醇的生产提供了除燃烧或填埋木质纤维废料之外的又一途径。而且，纤维素转化的副产品——木质素——可用作燃料，替代化石燃料为该过程提供动力。多项研究已得出这样结论，即当考虑整个生产和消费的循环时，使用由纤维素生产的乙醇产生的温室气体近乎为零。

最有希望用于乙醇生产的木质纤维素原料包括(1)农业废料例如玉米秸、小麦秆、大麦秆、燕麦秆、稻秆、菜籽秆和大豆秸；(2)草例如柳枝稷(switch grass)、芒属(miscanthus)、大米草(cord grass)和草芦(reedcanary grass)；以及(3)林业废料例如白杨木和锯屑。

将木质纤维素原料转化成乙醇的第一个加工步骤涉及使纤维素材料断裂以从所述原料中释放糖单体如葡萄糖，用以在随后的发酵步骤中转化成乙醇。所述两个主要过程为酸水解，它们涉及使用单步骤的酸处理对所述原料的水解，以及酶法水解，后者涉及酸处理及随后的纤维素酶水解。

在所述酸水解过程中，在足以使纤维素水解为葡萄糖且使半纤维素成为木糖和阿拉伯糖的某一温度、酸浓度及时长下，将所述原料经过蒸汽和硫酸处理。所述硫酸可以是浓的(25-80％w/w)或稀的(3-8％w/w)。然后使用酵母将葡萄糖发酵成乙醇，并通过蒸馏回收并纯化所述乙醇。

在所述酶法水解过程中，选择比酸水解过程中更温和的蒸汽温度、硫酸浓度和处理时间，使得随着所述木质纤维素原料转化成泥质而大大地增大所述纤维素的表面积，但很少有纤维素转化为葡萄糖。然后，在随后使用纤维素酶的步骤中将所述预处理的纤维素水解成葡萄糖，所述蒸汽/酸处理在这种情况下被称为预处理。在添加酶之前，将所述酸性原料的pH调节至适宜于所述酶法水解反应的值。具体地，这涉及添加碱至约4至约6的pH，这是纤维素酶的最佳pH范围，但如果使用嗜碱性纤维素酶，所述pH可更高。

在一种类型的预处理中，由所述蒸汽产生的压力通过喷发减压快速地下降，这被称为蒸汽喷发(steam explosion)。Foody(美国专利4,461,648)描述了在蒸汽喷发预处理中使用的装置和条件。在pH 0.4至2.0下添加硫酸的蒸汽喷发已经成为标准的预处理方法有20年了。它产生均一的预处理材料，并且与其他预处理工艺相比需要更少的纤维素酶来水解纤维素。

纤维素酶催化所述原料中的纤维素(β-1，4-D-葡聚糖键)的水解以产生诸如葡萄糖、纤维二糖及其他纤维寡糖产物。概括性术语纤维素酶表示包括外切纤维二糖水解酶(exo-cellobiohydrolase)(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(βG)的多酶混合物，这些酶可以由许多的植物和微生物产生。纤维素酶可协同地起作用，以将纤维素水解成葡萄糖。CBHI和CBHII通常作用于纤维素微纤维中葡萄糖聚合物的末端，释放纤维二糖(Teeri andKoivula，Carbohydr.Europe，1995，12：28-33)，而所述内切葡聚糖酶作用于纤维素上的随机位置。总之，这些酶将纤维素水解成更小的纤维寡糖——主要是纤维二糖。纤维二糖被β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。在现有技术中已经知道，大多数的外切纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)通过糖结合模块(CBM)如纤维素结合域(CBD)与所述原料中的纤维素结合，而包括木霉β-葡萄糖苷酶和曲霉β-葡萄糖苷酶在内的大多数β-葡萄糖苷酶不具有这种结合模块，因此被留在溶液中。纤维素酶可包含将所述催化域与所述糖结合模块连接的连接区。所述连接区被认为有利于所述催化活性域的活性。

具有CBD的纤维素酶已经通过基因工程产生。例如，美国专利5,763,254(W

ldike et al.)公开了衍生自腐质霉(Humicola)、镰刀菌(Fusarihm)和毁丝霉(Myceliopthora)并包含糖结合域的基因工程的纤维素降解酶。该研究的目标是用所述催化活性域、所述交联区和所述CBD的新组合产生降解纤维素或半纤维素的酶，或者从那些缺乏CBD的酶产生具有CBD的降解纤维素或半纤维素的酶。然而，这些新型酶降解木质纤维素原料的能力没有被证实。

酶法水解方法的一个重要的问题是需要大量的纤维素酶，这增加该方法的成本。纤维素酶的费用占水解费用的超过50％。多种因素会增加对所述酶的需求，而特别重要的一个因素是存在降低纤维素酶以及/或者在后续的糖发酵中微生物的反应速率的化合物。例如，在该过程中释放的葡萄糖会抑制纤维素酶，尤其是β-葡萄糖苷酶(Alfani et al.，J.Membr.Sci.，1990，52：339-350)。在纤维素水解过程中产生的纤维二糖是特别强的纤维素酶抑制剂(Tolan et al.见Biorefineries-Industrial Processes and Products，第1卷，Kamm et al.编辑，第9章，第203页)。其他可溶性抑制剂是在预处理过程中产生的，包括糖酵解产物，如糖醛和羟基-甲基糖醛；呋喃衍生物；有机酸，例如乙酸；以及衍生自木素的可溶性酚类化合物。这些化合物还会抑制酵母，这会减少乙醇的生成并因此使所述方法更加昂贵。虽然可以通过在更稀的浓度下进行所述水解以降低所述抑制剂的效应，但是这需要使用较大的水解反应器，这会增大所述过程的成本。

同时进行糖化作用和发酵(SSF)是一种将木质纤维生物质转化成乙醇而的方法，这使葡萄糖对纤维素酶的抑制最小化(见例如Ghosh et al.，EnzymeMicrob.Technol.，1982，4：425-430)。在SSF体系中，酶法水解与酵母发酵葡萄糖成乙醇同时进行。在SSF中，酵母通过将葡萄糖发酵成乙醇而从所述体系中除去葡萄糖，这会减少对纤维素酶的抑制。然而，该方法的一个缺点是纤维素酶会被乙醇抑制。另外，一般在35-38℃的温度下进行SSF，该温度低于纤维素酶的50℃最佳温度并高于酵母的28℃最佳温度。该中间温度导致纤维素酶和酵母的性能都低于标准水平。因此，所述不充分水解需要很长的反应时间以及很大的反应器，二者都是昂贵的。

现有技术中已经提出了另一种方法以减少葡萄糖、纤维二糖和其他可溶性抑制剂的抑制，该方法通过在膜反应器中进行反应而在整个水解过程中不断移出水解产物。膜反应器包含这样的超滤膜，即该超滤膜保留颗粒和高分子量组分(例如酶)，而使低分子量分子(例如糖)作为渗透物通过所述膜。

应用膜反应器的过程的一个实例记载于Ohlson and

(Biotech.Bioeng.，1984，26：647-653)中；在该过程中，在装配有具有10,000分子量截留的膜的反应器中进行预处理的黄花柳(sallow)(一个柳树种)的酶法水解。纤维素酶具有50,000的分子量，因此会被所述膜保留在所述水解反应器中，而糖被除去并且被来自具有间歇添加的新鲜底物的进料容器的缓冲溶液替换。由于移出了抑制剂，除了会提高所述可溶性糖的产量外，也增加了所述水解的速率。然而，这种反应器的缺点是商业化的水解体系需要的膜非常巨大并十分昂贵。所述膜还易于被所述反应混合物中存在的悬浮固体物阻塞。

多个小组已经研究了在酶法水解过程中的收集和回收纤维素酶以减少在所述转化过程中需要的酶量。在某些情况下，这还涉及不断地从所述反应混合物中移出水解产物，从而移出抑制性化合物。

例如，Ishihara et al.(Biotech.Bioeng.，1991，37：948-954)公开了在反应器中水解蒸过的硬木和硬木牛皮纸纸浆过程中回收纤维素酶。该过程涉及从所述反应器中移出纤维素酶反应混合物，随后通过抽吸过滤从所述混合物中移出含木素的不溶性剩余物。通过超滤从水解产物(例如葡萄糖和纤维二糖)中分离出所述滤出液中的纤维素酶，然后将其返加至水解反应器中。正如这些研究人员所陈述的，这个体系的缺点是，额外的固体移出步骤由于会增加原料消耗而在工业应用中是不实用的。另外，大部分的纤维素酶保持与所述纤维素的结合，难以回收。

Larry et al.(Appl.Microbiol.Biotechnol.，1986，25：256-261)描述了一种再利用纤维素酶的方法，涉及在含纤维素(Solka Floc)的柱式反应器中进行水解。通过用稳定的缓冲液流过滤所述柱连续地移出水解的糖。根据这些研究人员，移出糖产物将减少产物抑制并会提高水解效率。然而，由于非结合的β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶被从柱中洗脱，得到的水解并不充分。

Knutsen and Davis(Appl.Biochem.Biotech.，2002，98-100：1161-1172)报道了一种结合斜沉降和超滤的方法，用于在水解木质纤维生物质的过程中回收纤维素酶。该过程的目标是移出较大的木质纤维颗粒，因此在后继的超滤步骤中膜滤器不会被阻塞。该过程首先涉及用纤维素酶处理木质纤维颗粒，然后将所形成的混合物进料至倾斜沉降器中。大的木质纤维颗粒——包括结合于所述颗粒上的酶——被保留在所述倾斜沉降器中，而较小的颗粒以及可溶性酶会随沉降器上溢液被带出。然后将所述上溢液进料至横流(crossflow)超滤单元以回收非结合的纤维素酶，而使糖通过。在超滤后，将所回收的纤维素酶添加至水解反应器中。保留在所述倾斜沉降器中的木质纤维颗粒和结合的酶与所述沉降器的下溢液一起被回加至所述反应器中。该体系的一个缺点是，在商业水解反应器规模上操作(它有可能大约70英尺高并且每小时加工数千加仑的浆液)这种体系将是无法实现的。该体系的第二个缺点是，在所述反应器中葡萄糖和纤维二糖的浓度在整个过程中保持不变，使得高水平的抑制仍然会发生。该过程的又一个缺点是，它需要一个昂贵的超滤步骤以回收非结合的纤维素酶。

Mores et al.(Appl.Biochem.Biotech.，2001，91-93：297-309)报道了一种类似于Knutsen and Davis(见上文)描述的结合倾斜沉降和超滤的方法。然而，Mores et al.的方法涉及一个额外的澄清步骤，该步骤涉及在超滤前将所述沉降器上溢液经过微孔过滤以减少所述超滤膜的阻塞。Mores et al.的方法也有与在Knutsen and Davis(见上文)中所描述的那些相同的局限。

美国专利3,972,775(Wilke et al.)公开了一种用于回收纤维素酶的方法，其中在所述水解完成后将水解产物分成含糖的水性相和含未水解残余固体物(spent solid)的固相。用水冲洗所述残余固体物以回收其上面吸附的酶，并将含所得的脱附的酶的冲洗水注入所述水解反应中。剩下的残余固体物可用作该体系的燃料来源。然而，Wilke et al.的所述方法面临着水解后另外水冲洗的成本，这是由于大量的固体材料及所述固体的细粒性质使得所述成本很大。另外，由于分离水解产物是在所述水解反应完成之后进行的，该方法没有移出所述水解反应过程中存在的纤维素酶抑制剂。

Ramos et al.(Enzyme Microb.Technol.，1993，15：19-25)公开了这样一个方法，即在该过程中使用纤维素酶水解蒸汽喷发的桉树木片，并且移出可溶性糖并回收酶。该方法包括在选定的孵育时间停止反应，并收集垂熔(sintered)玻璃滤器上未水解的、含酶的残留物。所述含酶的残留物经水解缓冲液冲洗以移出可溶性的糖。然后将所述冲洗的残留物再悬浮于含有新鲜β-葡萄糖苷酶的新鲜水解缓冲液中，并在45℃下孵育用于随后的水解。该方法的问题是，在再悬浮后重复添加新鲜的β-葡萄糖苷酶会显著地增加该方法的费用。

Lee et al.(Biotech.Bioeng.，1994，45：328-336)在一个包括超过5个连续水解循环的步骤中检测了纤维素酶的回收。该过程包括添加纤维素酶和β-葡萄糖苷酶(Novoz

188)至过氧化合物处理的桦木中，并且在水解12小时后通过过滤回收残留的底物。然后将新鲜的底物添加至所述回收的残留底物中以得到2％的总底物浓度，并且将所形成的混合物再悬浮于包含β-葡萄糖苷酶的缓冲液中，使得水解继续进行。然后重复3次纤维素酶回收及随后的水解。他们还公开了一个这样的步骤，即在所有纤维素被水解之前及之后，回收存在于所述完全反应混合物中的纤维素酶。与Ramos et al.类似，该过程的一个局限是必须在每个回收步骤将β-葡萄糖苷酶加入至反应物中。

美国专利5,962,289(Kilburn et al.)公开了一种3步的酶法水解。该方法的第一步包括将内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶都添加至将被水解成纤维二糖的木质纤维素材料中。第二步包括将这种材料添加至第二Avicel

柱中以吸附内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。然后，在第三步中将包含纤维二糖的洗脱液施加于包含经CBD固定的β-葡萄糖苷酶的第二Avicel

柱中。所述固定的β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。该方法的一个局限是葡萄糖的产生在3个不同的过程步骤中完成，这是非常复杂和昂贵的。第二个局限是，以商业水解过程常用的高流速将部分水解的木质纤维素材料浆液送递通过Avicel

的柱是十分困难的。另外，在所述纤维素水解过程中存在较高的纤维二糖抑制效应。

目前，在现有技术中要想实现有效的纤维素的酶法水解尚存在许多困难。一个关键的障碍是要克服葡萄糖以及尤其是纤维二糖对纤维素酶的抑制效应。开发这种体系对于将纤维素转化成葡萄糖的方法来说仍然是迫切需求的。

发明内容

本发明涉及用于水解纤维素的酶以及使用该酶的方法。更具体而言，本发明涉及用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。

本发明的一个目标是提供一种用于处理木质纤维素原料的改良方法。

根据本发明，提供了一种用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的酶组合物，所述酶组合物包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料上的粘合剂，其中所述水解通过以下步骤实现：

(i)提供所述预处理的木质纤维素原料的水性浆液，所述水性浆液包含纤维固体和水相；

(ii)在一个固体保留型水解反应器中用包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及所述粘合剂的酶组合物水解所述水性浆液以产生所述含葡萄糖的水解产物，其中所述纤维素酶以及所述一种或多种β-葡萄糖苷酶结合于所述纤维固体上；以及

(iii)从所述固体保留型水解反应器中取出未水解的纤维固体和包含所述水解产物的水相，

其中所述未水解的纤维固体在所述固体保留型水解反应器中的保留时间比所述水相长约6小时至约148小时。

所述粘合剂可以是可操作连接至所述一种或多种β-葡萄糖苷酶上的碳水化合物结合模块。优选地，所述碳水化合物结合模块是一种纤维素结合域。

本发明还涉及如上述的酶组合物，其中所述纤维素酶由曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或它们的组合产生。优选地，所述纤维素酶由木霉属产生。

本发明还涉及如上述的酶组合物，其中所述纤维素酶包括选自纤维素酶CBHI和CBHII及它们的组合的纤维二糖水解酶(CBH)，以及选自纤维素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它们的组合的内切葡聚糖酶(EG)。

本发明还涉及如上述的酶组合物，其中存在于所述酶组合物中的总纤维素酶的约75％至约100％(w/w)与步骤(ii)中的纤维固体结合。

本发明还涉及如上述的酶组合物，其中存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶的约75％至约100％(w/w)或者约90％至约100％(w/w)包含纤维素结合域。所述纤维素结合域可以是家族I纤维素结合域。再者，所述纤维素结合域可以是细菌的或真菌的纤维素结合域。任选地，所述β-葡萄糖苷酶包含一个接头，该接头将所述纤维素结合域可操作地连接于所述β-葡萄糖苷酶。

本发明还涉及如上述的酶组合物，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的结合物产生。优选地，所述β-葡萄糖苷酶由木霉属或曲霉属产生。所述β-葡萄糖苷酶可以是天然存在的或者是基因修饰的融合蛋白。

本发明还涉及如上述的酶组合物，还包含从含葡萄糖的水解产物中分离未水解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的水性溶液。可以将所述分离的纤维固体再悬浮于一种水性溶液中，并继续所述水解。

根据本发明，还提供了酶组合物用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的用途，所述酶组合物包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料上的粘合剂，其中所述酶组合物的用途包含：

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中所述固体保留型水解反应器被作为分批反应器或连续反应器操作。本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中所述固体保留型水解反应器是这样的水解体系的一部分，即该水解体系包含两个或多个水解反应器，并且这些水解反应器被以连续、并行或它们的结合的方式操作。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中所述固体保留型水解反应器是一个沉降反应器，并且其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，至少部分的所述纤维固体在所述沉降反应器中沉降。所述沉降反应器可以是一个塔，所述水性浆液向上流经所述塔。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中所述纤维素酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。优选地，所述纤维素酶由木霉属产生。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中所述纤维素酶包括选自纤维素酶CBHI和CBHII及它们的组合的纤维二糖水解酶(CBH)，以及选自纤维素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它们的组合的内切葡聚糖酶(EG)。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中存在于所述酶组合物中的总纤维素酶的约75％至约100％(w/w)与步骤(ii)中的纤维固体结合。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶的约75％至约100％(w/w)，优选约90％至约100％(w/w)包含纤维素结合域。所述纤维素结合域可以是家族I纤维素结合域。再者，所述纤维素结合域可以是细菌的或真菌的纤维素结合域。任选地，所述β-葡萄糖苷酶包含一个接头。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。优选地，所述β-葡萄糖苷酶由木霉属或曲霉属产生。所述β-葡萄糖苷酶可以是天然存在的或者是基因修饰的融合蛋白。所述β-葡萄糖苷酶可以是所述宿主固有的，或者是其他属或种固有并插入至所述宿主以表达的。

本发明还涉及如上述的酶组合物的用途，还包含从含葡萄糖的水解产物中分离未水解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的水性溶液。然后可以将所述分离的纤维固体再悬浮于一种水性溶液中，并继续所述水解。

根据本发明，还提供了一种用于纤维素的酶法水解以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的方法，所述方法包含：

(ii)在一个固体保留型水解反应器中用纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述纤维固体上的粘合剂水解所述水性浆液以产生所述含葡萄糖的水解产物，其中所述纤维素酶以及所述一种或多种β-葡萄糖苷酶结合于所述纤维固体上；以及

所述粘合剂可以是可操作连接至所述一种或多种β-葡萄糖苷酶上的碳水化合物结合模块。优选地，所述碳水化合物结合模块是纤维素结合域。

本发明还涉及如上述的方法，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶包含一种与所述预处理原料中纤维素结合的纤维素结合域。

本发明还涉及如上述的方法，其中在所述提供步骤(步骤(i))中，所述水性浆液具有约3％至约30％(w/w)悬浮的或非溶解性的固体含量。在所述水解步骤(步骤(ii))之前可以将所述水性浆液浓缩。优选地，在水中配制所述水性浆液。

本发明还涉及如上述的方法，其中从所述含葡萄糖的水解产物分离所述未溶解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的第一水性溶液。可将所述分离固体再悬浮于一种水性溶液中，并且在第二水解中继续水解，产生含葡萄糖的第二水性溶液和未水解的固体。可将含葡萄糖的所述第一和第二水性溶液合并，产生合并的糖流体。可将所述糖流体发酵，产生含乙醇的发酵液。

本发明还涉及如上述的方法，其中所述未水解的固体经微孔过滤、离心、真空过滤或加压过滤分离。优选地，所述未水解的固体经微孔过滤从所述葡萄糖中分离。

本发明还涉及如上述的方法，其中所述固体保留型水解反应器是这样的水解体系的一部分，即所述水解体系包含两个或多个水解反应器，并且这些水解反应器被以连续、并行或它们的结合的方式操作。所述水解体系可以包含选自搅拌罐、非混合罐、搅拌塔和非混合塔的水解反应器。所述搅拌塔或所述非混合塔可以是下流式塔或上流式塔。所述方法可以是一个连续过程——连续地补入水性浆液并连续地取出水解的固体和水相，或者是一个分批过程。

本发明还涉及如上述的方法，其中所述再悬浮的浆液具有约10％至15％(w/w)的固体含量。用于再悬浮所述分离固体的水性溶液可以是生产用水。

所述预处理的木质纤维素原料可来自小麦秆、燕麦秆、大麦秆、玉米秸、大豆秸、菜籽秆、稻秆、甘蔗、甘蔗渣、柳枝稷、草芦、大米草或芒属。

本发明还涉及如上述的酶组合物、所述酶组合物的用途或方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，以每克纤维素约1.0至约40.0IU的剂量添加纤维素酶。所述纤维素酶可以由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的结合物产生。优选地，约75％至约100％(w/w)的存在的总纤维素酶与步骤(ii)中的纤维固体结合。

本发明还涉及如上述的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，以每克纤维素约35至约200IU的剂量添加所述一种或多种β-葡萄糖苷酶。所述β-葡萄糖苷酶可以由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。优选地，所述β-葡萄糖苷酶由曲霉属或木霉属产生。所述β-葡萄糖苷酶可以是所述宿主固有的，或者是其他属或种固有并插入至所述宿主以表达的。

本发明还涉及如上述的过程，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述水性浆液的pH是约4.5至约5.5，或者约4.5至5.0。所述水性浆液的温度可以是约45℃至约55℃。可以用水制备所述水性浆液。若再悬浮所述未水解的固体，用于再悬浮的所述水性溶液可以是生产用水。

本发明还涉及如上述的方法，其中所述水解步骤(步骤(ii))进行约12至约200小时的总水相保留时间。所述再悬浮浆液的继续水解步骤可以进行约12至约200小时。

根据本发明，还提供了酶组合物的一种这样的用途，即用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物，所述酶组合物包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料上的粘合剂，其中所述酶法水解在固体保留型水解反应器中进行。

本发明通过考虑在将木质纤维素原料转化成葡萄糖过程进行的步骤中遇到的困难，克服了现有技术中的多个缺点。如本文所述，纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述木质纤维素原料上的粘合剂被用于对预处理的木质纤维素原料的水性浆液进行酶法水解。在本发明的一个实施方案中，所述酶法水解在固体保留型水解反应器中进行，使得所述水性浆液中的纤维固体比所述浆液的水相在所述水解反应器中保留更长时间，以增加所述纤维素酶与纤维素之间的反应时间。通过沉降、过滤、离心或者从所述纤维固体部分分离或完全分离所述水相的其他方法，将所述纤维固体保留在所述水解反应器中。在常规水解中，所述β-葡萄糖苷酶不与所述纤维素结合，因此随所述水相被从所述水解反应器中移出。β-葡萄糖苷酶的移出会导致纤维二糖的积聚，它会抑制纤维素酶并显著地降低纤维素的水解速率。相反，在实施本发明中，所述β-葡萄糖苷酶保持与所述纤维固体中纤维素的结合，不会随所述水相被从所述水解反应器中移出。由于β-葡萄糖苷酶被保留在所述水解反应器中，纤维二糖被转化为葡萄糖而不在所述反应器中积聚。纤维素酶和纤维素之间更长的接触时间以及纤维二糖向葡萄糖的转化的结合，可形成一个效率提高且纤维素酶需求降低的水解体系。

本发明的该发明内容没有必要描述本发明的所有特征。

附图说明

通过下文的描述并参照附图，本发明的这些特征以及其他特征将变得更为显而易见，附图中：

图1A为示出了根据本发明的实施方案处理木质纤维素原料的步骤的方法流程图。图1B为示出了使用上流式水解反应器处理木质纤维素原料的步骤的方法流程图。

图2A和2B示出了在再悬浮和非再悬浮的情况下，利用含有具有CBD的β-葡萄糖苷酶的木霉属纤维素酶水解5％的预处理的小麦秆纤维素。在24小时的时候，再悬浮的水解物经过滤并被再悬浮，而非再悬浮的水解物保持原状。在图2A中所述纤维素酶的剂量是16mg/g，在图2B中所述纤维素酶的剂量是24mg/g。

图3示出了通过含有缺乏CBD的β-葡萄糖苷酶的木霉属纤维素酶水解5％的预处理的小麦秆纤维素。在24小时的时候，所述水解物经过滤并被再悬浮。

图4A和4B为在存在(+)或不存在(-)预处理的小麦秆的情况下孵育后，纯化的不具有CBD的β-葡萄糖苷酶(βG)和具有CBD的β-葡萄糖苷酶(βG-CBD)的SDS-PAGE凝胶。在图4A中所述孵育在4℃下进行，在图4B中所述孵育在50℃下进行。在孵育30分钟后，离心所述反应混合物，上清液级分经SDS-PAGE分离并通过考马斯蓝染色进行显色。

具体实施方式

以下是对优选的实施方案的描述。

本发明涉及用于改良纤维素水解的酶。更具体地，本发明涉及用于改良木质纤维原料的酶转化的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，以及使用这些酶的方法。

以下对实施方案的说明仅是示例性的，而并不限制有效实施本发明的必要技术特征的组合。

本发明提供了用于加工木质纤维素原料的酶组合物和方法，它改良所述方法的效率。所述方法包含用纤维素酶和经粘合剂结合至预处理的原料上的一种或多种β-葡萄糖苷酶进行所述预处理的原料浆液的水解，在所述水解反应器中将含木素、纤维素及其他不溶性化合物的未水解纤维固体保留比含葡萄糖、葡萄糖寡聚体和纤维二糖的水相更长的时间。通过在固体保留型水解反应器中进行水解保留所述纤维固体，所述固体保留型水解反应器包括，但不限于，沉降反应器。通过在所述水解反应器中保留所述纤维固体，增加了所述酶和纤维素之间的接触时间，从而提高了纤维素转化的程度。

在所述水解后，从所述水解反应器中取出所述未水解的纤维固体和包含水解产物的水相。然后从所述水解产物分离未水解的纤维固体，产生分离的纤维固体和含葡萄糖的水性溶液。该步骤是任选的，但由于其有助于对所述糖的发酵和所述未水解固体的进一步处理，经常需要该步骤。得益于其与所述分离纤维固体结合的能力，所述纤维素酶和所述结合的β-葡萄糖苷酶随所述固体留下。在本发明的一个实施方案中，然后可继续进行所述分离纤维固体的水解。通过从所述水解产物分离出所述未水解的纤维固体，葡萄糖、纤维二糖和其他可溶性抑制被移出，或者它们的浓度被降低，使得所述水解在无这些化合物抑制或者在这些化合物抑制降低的条件下继续进行。

所述方法可以是一个连续过程，连续地补入预处理的原料浆液并取出水解产物。或者，所述方法可以是一个分批过程。

用预处理的原料浆液进行该过程，以提高所述纤维素酶对所述原料中的纤维素的消化性。所述纤维素酶至少将所述原料中部分的纤维素转化为葡萄糖、纤维二糖、葡萄糖寡聚体或它们的组合。

用于实施本发明的原料是木质纤维素材料。术语“木质纤维素原料”意指任何类型的植物生物质例如，但并不限于，种植作物的植物生物质例如但不限于草，例如但不限于C4草，例如，柳枝稷、大米草、黑麦草、芒属、草芦或它们的组合；或糖加工残渣例如，甘蔗渣或甜菜废粕；农业废料例如，大豆秸、玉米秸、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、小麦秆、菜籽秆、稻秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维或它们的组合；或者林业废料例如，回收的木浆纤维、锯屑、硬木例如白杨木和锯屑、软木或它们的结合物。再者，所述木质纤维素原料可以包括其他木质纤维素废料例如，但并不限于，新闻用纸、纸板等。木质纤维素原料可包括一种纤维，或者木质纤维素原料可包括源自不同木质纤维素原料的纤维混合物。另外，所述木质纤维素原料可以包括湿的木质纤维素原料、半干的木质纤维素原料、全干的木质纤维素原料或它们的组合。

木质纤维素原料包含的纤维素的量超过约20％，更优选超过约30％，更优选超过约40％(w/w)，还更优选超过约50％(w/w)。例如，所述木质纤维素材料可以包含约20％至约50％(w/w)的纤维素，或更多或介于其之间的任何量，例如但并不限于20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50％(w/w)的纤维素。所述木质纤维素原料还可包含含量超过约10％的木素，更优选的含量超过约15％(w/w)。所述木质纤维素原料还可以包含总量小于约20％的蔗糖、果糖和淀粉，优选小于约10％(w/w)。以上公开的重量百分率为相对于所述木质纤维素原料质量，因为它存在于预处理之前。

优选的木质纤维素原料的实例包括(1)农业废料例如玉米秸、小麦秆、大麦秆、燕麦秆、稻秆、菜籽秆、菜籽秆和大豆秸；以及(2)草例如柳枝稷、芒属、大米草和草芦。

使用经过预处理的木质纤维素材料实施本发明。预处理法的目的在于给予充足的机械作用和化学作用组合，以破坏纤维结构并增加纤维素酶可接触的原料表面积。机械作用一般包括，但并不限于，使用压力、研磨、碾磨、搅拌、粉碎、压缩/膨胀，或其他形式的机械作用。化学作用可包括，但不限于，使用热(通常为蒸汽)、酸、碱及溶剂。几种化学的及机械的预处理方法在本技术领域中是熟知的。

在预处理之前，可将所述木质纤维素原料沥滤。例如，这可以依照WO02/070753(Griffin et al.，该文献通过引证的方式纳入本文)的所公开的方法进行。然而，即使进行了沥滤，在随后的预处理过程中仍会产生大量的抑制性化合物。

进行预处理以增加所述木质纤维素原料浆液对纤维素酶水解的敏感性。例如，可以进行预处理以将存在于所述木质纤维素原料中的半纤维素或其部分水解成单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或它们的组合。优选地，进行预处理，使得所述半纤维素几乎完全水解且少量纤维素转化成葡萄糖。纤维素在随后使用纤维素酶的步骤中被水解成葡萄糖。在预处理过程中，一般将浓度为约0.02％(w/v)至约2％(w/v)或介于其之间的任何量的稀释酸用于预处理所述木质纤维素原料。优选地，所述预处理在约180℃至约250℃的温度下进行约6秒至约120秒的时间，pH为约0.8至约2.0。可以在单个阶段或者在多个阶段进行预处理。优选地，至少一个阶段在上文设定的温度范围、时长和pH范围内进行。

对原料进行预处理的方法之一是蒸汽喷发(steam explosion)，使用美国专利4,461,648和4,237,226(这些专利通过引用的方式纳入本文)所述的工艺条件进行。另一种预处理所述原料浆液的方法涉及连续的预处理，意思是通过一个反应器连续地泵入所述木质纤维素原料。连续的酸预处理是本领域技术人员熟知的，见例如美国专利5,536,325(Brink)；共同未决的美国申请60/687,224(Foody and Tolan)；美国专利4,237,226(Grethlein；其通过引用的方式纳入本文)。根据需要使用本领域中已知的其他方法制备预处理的原料，例如但不限于，美国专利4,556,430(Converse et al.；该专利通过引用的方式纳入本文)中公开的那些方法。

所述预处理的木质纤维素原料可任选地在酶法水解之前用水冲洗。所述冲洗和沥滤步骤可除去一些纤维素酶和酵母的抑制剂如溶解的糖及糖降解产物、溶解的木质素及含酚化合物，以及系统中的其他有机化合物。然而，虽然预处理之后进行冲洗在本发明的范围之内，但是它的缺点是昂贵并难以除去所有的存在的不溶性杂质。

将所述木质纤维素材料用一种水性溶液调成浆液，以形成水性原料浆液或“水性浆液”。例如，但非意在限制，所述水性溶液可以是生产用水、淡水、蒸汽冷凝液或处理回收流体。水性浆液中预处理的木质纤维素原料的浓度取决于颗粒大小、水滞留(water retention)、泵能力和所述原料的其他性质。所述浓度一般是约3％至约30％(w/w)，或约10％至约20％(w/w)的纤维固体(也被称作悬浮固体或不溶固体)，或介于其之间的任何浓度值。所述水性浆液优选具有能使其被泵送的固体浓度。本领域中熟知的，悬浮固体或不溶解固体的浓度可通过用玻璃微纤维滤纸过滤浆液样品、将滤饼用水冲洗并在105℃下使其干燥过夜的方法进行测定。所述纤维固体优选含有至少约20％至约70％(按重量计)的纤维素，或介于其之间的任何量。例如所述悬浮固体可以含有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％(按重量计)的纤维素。

所述水性浆液的pH通常调整到所用纤维素酶的最优pH范围内。一般而言，将所述水性浆液的pH调整到约3.0至约7.0的范围内，或介于其之间的任何pH。所述pH一般为约4.5至约5.5，或介于其之间的任何pH。然而需要理解，如果所用的纤维素酶为嗜碱的或嗜酸的，则浆液的pH可分别高于或低于约4.5至约5.5。所述浆液的pH可用本领域已知的任何适宜的酸或碱调整。例如，如果所述浆液为碱性(例如，如果进行了碱的预处理)可使用硫酸。如果所述浆液为酸性，可使用选自氨水、氢氧化铵、石灰、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钠或它们混合物的碱调整pH。优选地，所述碱选自氨水、氢氧化铵和氢氧化钠。

将所述水性原料浆液的温度调整到对于所述纤维素酶的活性而言的最优范围内。一般而言，大多数纤维素酶的适宜温度为约45℃至约55℃，或介于其之间的任何温度。但对于嗜热的纤维素酶而言，所述浆液的温度可更高。

在调整所述水性浆液的温度和pH之前、之中或之后将纤维素酶和β-葡萄糖苷酶与粘合剂一起添加至所述水性浆液中。优选在调整所述预处理的木质纤维素原料浆液的温度和pH之后，将纤维素酶和β-葡萄糖苷酶添加至所述浆体中。然后进行所述预处理的木质纤维素材料的水解。

纤维素酶对纤维固体中的纤维素具有水解活性，并含有至少一个催化域。纤维素酶通常具有另外的结构域，包括但不限于，碳水化合物结合模块或其他功能性域。

术语“纤维素酶”或“纤维素酶”意指水解纤维素的酶混合物。所述混合物可以包含葡萄二糖水解酶(glucobiohydrolase)(GBH)、纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)。虽然GBH酶可以构成所述酶混合物的组分，但是它们在纤维素的酶法水解中的使用不如CBH酶和EG酶普遍。在一个非限制性实例中，所述混合物包含CBH酶和EG酶。所述GBH酶主要从其末端水解纤维素多聚体链来释放葡萄糖，而所述CBH酶主要从其末端水解纤维素多聚体链来释放纤维二糖，所述EG酶主要在链中间水解纤维素多聚体。所述GBH酶可以是具有类型EC#3.2.1.73的活性的酶，所述CBH酶可以具有类型EC#3.2.1.91的酶活性，且所述EG酶可以具有类型EC#3.2.1.4或EC#3.2.1.151的活性。

所述纤维素酶可以由多种植物和微生物产生。本发明的方法可使用任意类型的纤维素酶来实施而不必考虑其来源。研究最为广泛的、典型的、商业化生产的纤维素是由曲霉属、腐质霉属及木霉属的真菌，以及芽孢杆菌属及喜热裂孢菌属的细菌获得。由丝状真菌长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)产生的纤维素酶包括至少两种称为CBHI和CBHII的纤维二糖水解酶和至少4种EG酶。纤维素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI还已经从特异腐质霉(Humicola insolens)中被分离(见Schulein et al.，Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reeseiCellulases and Other Hydrolases，Espoo 1993，P.Suominen and T.Reinikainen，Eds.Foundation for Biotechnical and IndustrialFermentation Research，Helsinki 8：109-116，其通过引用的方式纳入本文)。

所述CBHI酶被定义为主要通过两步置换反应(retaining mechanism)水解纤维素多聚体链的CBH，这是本领域技术人员已知的。所述CBHI酶是进行性的(processive)。所述CBHI酶可以是糖水解酶(glycohydrolase)家族7、10或家族48的成员。在一个优选的实施方案中，所述CBHI酶是家族7的成员。在另一个较优选的实施方案中，所述CBHI酶是来自木霉属的家族7 CBHI。

所述CBH II酶被定义为主要通过一步置换反应(inverting mechanism)水解纤维素多聚体链的酶，这是本领域技术人员已知的。所述CBHII酶可以是进行性的。所述CBH II酶可以是家族6、9或74的成员。在一个优选的实施方案中，所述CBH II酶是家族6的成员。在另一个较优选的实施方案中，所述CBH II酶是来自木霉属的家族6 CBH II。

可用于实施本发明的EG酶的实例在以下表1中列出：

表1：EG酶的实例

EG	葡萄糖水解酶家族
EG	葡萄糖水解酶家族	EGI	7
EGII	5	EGI	7
EGII	5	EGIII	12
EGIV	61	EGIII	12
EGIV	61	EGV	45
EGVI	74	EGV	45

优选地，所述EG酶是真菌酶，例如由木霉属表达的酶。所述EG酶优选具有CBD(纤维素结合域)，但是某一特定部分的EG酶可以被包括在缺乏CBD的纤维素酶的混合物中。

选择所述纤维素酶的剂量以将所述预处理原料的纤维素转化成葡萄糖。例如，适宜的纤维素酶的剂量可为每克纤维素约1.0至约40.0滤纸单位(Filter Paper Unit)(FPU或IU)，或介于其之间的任何量。FPU是本领域普通技术人员熟悉的标准单位，根据Ghose(Pure and Appl.Chem.，1987，59：257-268)定义及测量。

在实施本发明中使用的纤维素酶与所述预处理原料的组分结合。然而应了解，所述酶组合物可以含有一些没有与所述预处理的木质纤维素原料结合的纤维素酶，例如那些不具有纤维素结合域的纤维素酶。与纤维素(固体)结合的纤维素酶百分率可以是存在于所述酶组合物中的总纤维素酶的约75％至100％(w/w)；例如，与纤维素结合的纤维素酶百分率可以是存在于所述酶组合物中的总纤维素酶的约75、78、80、83、85、87、90、93、95、97或100％(w/w)。

将纤维二糖转化成葡萄糖是通过β-葡萄糖苷酶完成的。所述术语“β-葡萄糖苷酶”是指任何将葡萄糖双体、纤维二糖水解成葡萄糖的酶。所述β-葡萄糖苷酶的活性由酶学委员会(Enzyme Commission)按照其活性定义为EC#3.2.1.21。在本发明中使用的β-葡萄糖苷酶是水溶性的。多种微生物可产生β-葡萄糖苷酶，并且这些酶的性质有差异，所述性质包括结构(分子量、三维取向、氨基酸组成和活性位点)和催化活性(纤维二糖水解的速率和动力学以及作用于其他底物的能力)。所述β-葡萄糖苷酶可以有多种来源；然而，在所有情况下，这些β-葡萄糖苷酶都能将纤维二糖水解成葡萄糖。所述β-葡萄糖苷酶可以是家族1或家族3糖苷水解酶，而其他家族成员也可以用于实施本发明。在本发明中使用的优选β-葡萄糖苷酶是来自里氏木霉的Bgl1蛋白。其他的形式可以包括来自木霉属的其他Bgl蛋白或来自其他生物的β-葡萄糖苷酶。

所述β-葡萄糖苷酶与所述预处理原料的结合受到将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料的粘合剂的影响。所述术语“粘合剂”是指任何用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述纤维固体的化学化合物。所述粘合剂对所述预处理原料的亲和力足够强以使所述β-葡萄糖苷酶粘附于所述水性原料浆液中的纤维固体上，从而使之可以在所述水解反应器中保留比所述浆液水相更长的时间。

所述粘合剂可以是以化学修饰的形式粘附于所述β-葡萄糖苷酶上的化学物。该修饰包括在所述酶上粘附与所述纤维固体有足够亲和力的化学物。适宜的化合物的实例包括去污剂、表面活性剂、聚乙二醇、蛋白及蛋白片段。去污剂和表面活性剂的实例包括，但不限于，胆汁酸(胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和甘氨脱氧胆酸都是实例)、烷基糖苷(n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、吡喃葡萄糖苷和癸基-β-D-麦芽糖苷都是实例)和两性去污剂(zwittergent)。聚乙二醇的实例包括，但不限于，聚乙二醇和聚氧乙烯。

所述粘合剂还可以是蛋白或蛋白片段。蛋白或蛋白片段的实例包括上述被用作结合域的那些。可作为粘合剂的蛋白的其他实例还包括，但不限于，疏水蛋白、链球菌溶血素、膨胀因子(swollenin)或膨胀素(expansin)。可作为粘合剂的蛋白片段的实例包括，但不限于，聚色氨酸、聚酪氨酸和两性螺旋。

优选地，所述粘合剂是一个结合域，例如可操作连接至β-葡萄糖苷酶的碳水化合物结合模块(CBM)。所述术语“碳水化合物结合模块”或“CBM”是指以非共价与存在于纤维固体中的碳水化合物结合的任何蛋白或肽序列。优选地，所述碳水化合物结合模块是与所述纤维固体中的纤维素结合的纤维素结合域(CBD)。

天然发现的CBD在例如纤维素酶以及在非水解酶的蛋白中作为不连续域。迄今为止已经鉴定了超过25个家族的CBD序列。用于实施本发明的CBD可衍生自任意来源的CBD。例如，所述CBD可以来源自细菌或真菌，但是CBD已经在许多的其他生物中被分离到。可产生CBD的微生物的非限制性实例包括曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合。用于实施本发明的优选的CBD序列是I型CBD，它来源自真菌。或者，所述编码CDB的DNA序列可以通过本领域技术人员已知的方法合成制得，所述方法例如磷酰胺酸法(Beaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters，1981，22：1859-1869，该文献通过引用的方式纳入本文)。

所述术语“可操作地连接的”是指所述β-葡萄糖苷酶和所述结合域之间的连接，该连接使得所述结合域粘附于所述水性浆液中的纤维固体上。所述连接可以通过一个接头，或者所述结合域可以连接至所述β-葡萄糖苷酶上而无插入的接头区。

可用于实施本发明的粘合剂的又一个实例是与所述β-葡萄糖苷酶和所述纤维固体都连接的化学物。这种化合物的非限制性实例包括，但不限于，聚阳离子、聚阴离子、絮凝剂和两性分子。再者，该化学物可以是蛋白或蛋白片段——例如上述的被用作结合域的那些，或者化学物——例如上述的被用于化学修饰的那些。

所述术语“接头”是指这样的氨基酸序列，即它与纤维素酶或β-葡萄糖苷酶的纤维素结合域毗连，并将其连接至所述酶的催化活性域。所述接头区可以是亲水的和不带电荷的并富含某些氨基酸，包括甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或它们的组合。优选地，所述接头结构赋予所述序列以柔性。虽然不希望囿于理论，但是本发明人认为所述柔性结构有利于所述催化域的活性。然而，如对本领域技术人来说显而易见的是，接头并不是必须一定存在的。

β-葡萄糖苷酶或纤维素酶结合纤维素的能力可以通过使用预处理的木质纤维素材料的纤维素结合测定进行确定。这种测定是本领域技术人员所通晓的，包含在20℃至40℃的温度下，在水性溶液中使用粘合剂将5克预处理的木质纤维素材料与50mgβ-葡萄糖苷酶接触5至15分钟；然后通过过滤从所述酶分离所述纤维固体并测量溶液中剩余酶的量。所述粘合剂与所述β-葡萄糖苷酶和所述纤维固体结合，从而使得所述β-葡萄糖苷酶随所述纤维固体保留于所述水解反应器中。

任意来源的β-葡萄糖苷酶都可用于实施本发明。例如，所述β-葡萄糖苷酶可来源自曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合。优选地，所述β-葡萄糖苷酶衍生自木霉属或曲霉属。来源自木霉属的β-葡萄糖苷酶具有74,000的分子量(这通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量)并具有8.3的等电点(这通过非变性等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测量)。所述β-葡萄糖苷酶可以是所述宿主固有的，或者是其他属或种固有并插入至所述宿主以表达的。

具有CBM(例如CBD)的β-葡萄糖苷酶可以是通过这样的遗传构建体产生的融合蛋白，即该遗传构建体包含启动子序列、编码β-葡萄糖苷酶的序列和编码CBM的序列。所述遗传构建体在一个合适的表达系统中表达，所述表达系统例如细菌的真菌表达系统，如曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合。另外，具有CBM的天然存在的β-葡萄糖苷酶可用于实施本发明。天然存在的β-葡萄糖苷酶可分离自曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合。例如，天然存在的具有CBD的β-葡萄糖苷酶已经从白腐真菌黄孢原毛平革菌(Phanaerochaete chrysosporium)中纯化并表征(Lymar et al.，Appl.Environ.Micro.，1995，61：2976-2980，其内容在此通过引用的方式纳入本文)。

添加至所述水性浆液中的β-葡萄糖苷酶的剂量水平可以是每克纤维素约5至约400β-葡萄糖苷酶单位，或介于其之间的任意量，或者每克纤维素约35至约200β-葡萄糖苷酶单位，或介于其之间的任意量。所述β-葡萄糖苷酶单位依照Ghose的方法(见上文)测量。

优选存在足够高的β-葡萄糖苷酶浓度以确保纤维二糖不会在水解过程中集聚而抑制纤维素酶作用。本领域技术人员应理解，木霉属以及其他产生纤维素酶的微生物通常只产生有限量的β-葡萄糖苷酶。可用应用Whiteand Hindle，美国专利6,015,703(该专利通过引用的方式纳入本文)中列出的方法使由木霉属产生的β-葡萄糖苷酶的水平升高。或者，可以在单独的曲霉属发酵中产生β-葡萄糖苷酶并将其添加至所述纤维素酶混合物中。

应了解，不是所述酶组合物中所有的β-葡萄糖苷酶都与所述固体结合。例如，存在于所述酶组合物中具有CBD的β-葡萄糖苷酶的量可以是所存在的总β-葡萄糖苷酶的约75％至100％(w/w)，或介于它们之间的任意范围；约85％至100％(w/w)，或介于它们之间的任意范围；约90％至100％(w/w)，或介于它们之间的任意范围。例如，具有CBD的β-葡萄糖苷酶的量相对于存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶量可以是约75、78、80、83、85、87、90、93、95、97或100％(w/w)。

所述纤维素酶和β-葡萄糖苷酶可以在水性溶液中处理，或者被加工成粉末或颗粒形式。可以在任意时间点将所述酶添加至所述水性浆液中，然后将所述水性浆液导入水解反应器。或者，可以将所述酶直接添加至所述水解反应器中，但是优选在导入所述水解反应器之前添加酶以使混合充分。可以使用本领域技术人员熟悉的混合装置将所述酶混合至所述水性浆液中。

图1A是这样的一个非限制性实例，即如何对如上文所述预处理的木质纤维素原料进行纤维素酶水解。在纤维素酶水解之前，将所述水性原料浆液10冷却。这可以通过使用第一热交换器20来进行，该热交换器与葡萄糖产流体30或其他适宜的流体换热。然后可以使用第二流体例如第二热交换器50中的冷水45进一步冷却所述水性浆液10。然后将所述浆液10泵入水解配料罐(make-up tank)60中，同时被泵入的还有具有纤维素结合域的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶70，以及调节pH的氨水80。在该实例中，将所述水解配料罐60的内容物混合，并通过管120从所述配料罐60泵出至水解罐130中。所述配料罐60可用于调节pH并达到所需的浆液温度。

本领域技术人员来说显而易见的是，可以在别处将所述酶与所述预处理的木质纤维素原料混合，所述别处例如进料至所述配料罐60的管线中，包括但不限于，第一热交换器20的上游、所述第一热交换器20和第二热交换器50之间的点、所述原料即将进入所述配料罐60之前的点。还可以在所述预处理的木质纤维素原料浆液10从所述配料罐60出来之后将所述酶添加其中；例如可以将它们添加至管120中。

所述术语“水解反应器”是指用于通过纤维素酶部分地或完全地水解所述预处理的木质纤维素原料浆液的反应容器。必须适宜地建造所述水解反应器以适应所述水解。可以对水解反应器加装蒸汽、热水或其他热源的外套以保持所需的温度。所述水解反应器可以是高径比大于2:1的塔，或者是高径比小于2:1的罐。

本文使用的术语“固体保留型水解反应器”是指这样的水解反应器，即该水解反应器保留纤维固体的时间比水性浆液水相的时间长，以增加所述纤维素酶和β-葡萄糖苷酶与纤维素的反应时间。通过沉降、过滤、离心或者从所述纤维固体部分地或完全地分离所述水相的其他方法，将所述纤维固体保留在所述固体保留型水解反应器中。

所述水解可以在作为包含一个或多个水解反应器的水解体系的一部分的固体保留型水解反应器中进行。所述术语“水解体系”涵盖水解反应器以及加料罐、泵或其他辅助装置。在所述水解体系中选用的水解反应器的数量取决于水解反应器的价格、水性浆液的体积以及其他因素。对于商业级的乙醇厂，水解反应器的数量一般是4至12个。

固体保留型水解反应器可以是一种非混合的水解反应器，也就是说在所述水解反应过程中不对所述反应器内含物进行机械搅拌。一种适宜于实施本发明的非混合的水解反应器的实例是共同未决的美国专利申请60/637,189(Foody et al.)描述的上流式反应器，该申请通过引用的方式纳入本文。所述固体保留型水解反应器还可以是混合反应器，在这种情况下，在水解反应过程中对所述反应器内含物进行机械搅拌。在所述水解罐中的有效混合可以通过泵轮或泵实现，这是本领域中公知的。

如果所述固体保留型水解反应器是塔，那么它可以是上流式塔，其中所述水性浆液和酶直接在所述塔的底部进入塔，并被向上泵通过所述塔。或者，所述塔可以是下流式塔，其中所述水性浆液被向下泵通过所述塔。所述上流式塔或下流式塔可以是非混合的。或者，可以以非连续水平(discreet level)进行混合。

无论使用多大数目或什么类型的水解反应器，所述纤维固体都至少在一个固体保留型水解反应器中保留比所述水相更长的时间。可以通过多种途径实现所述纤维固体在所述固体保留型水解反应器中的驻留，这将在下文中讨论。无论所述纤维固体如何被保留于所述固体保留型水解反应器中，所述β-葡萄糖苷酶与所述纤维固体的结合都使所述β-葡萄糖苷酶与所述纤维固体一块被保留，而不随所述水相被取出。相对于从所述水解中取出β-葡萄糖苷酶后的纤维二糖浓度，这样可减少纤维二糖的浓度。

随着所述水解的进行，纤维素、木素和其他不溶性组分组成了所述水性浆液的“纤维固体”。除纤维素外，可存在于所述固相中的不溶解组分包括没有被所述纤维素酶消化的未转化固体，以及非木质纤维组分或对纤维素酶惰性的其他化合物(例如木素和二氧化硅化合物)。

随着所述酶法水解的继续，所述水相中的葡萄糖浓度会升高。另外，还存在低浓度的纤维二糖，但优选低浓度。可存在于所述水相中的其他可溶性组分包括葡萄糖低聚体、木糖和木糖低聚体、糖降解产物(如糖醛和羟基-甲基糖醛)、有机酸(如乙酸)以及衍生自木素的酚类化合物。所述术语“水相”包括所述酶水解浆液的水性部分，而并非意在将其局限于所述浆液的分离水相。

可以进行所述水解，使得所述水相存在于所述固体保留型水解反应器中的总时长是约6小时至约200小时。优选地，所述水相在所述水解中的时长是12小时至96小时。更优选地，所述水相在所述水解中的时长是12小时至48小时。

所述纤维固体可在所述固体保留型水解反应器中被保留比所述水相长约6小时至约148小时，或者介于其之间的任意时间；或者比所述水相长约12小时至约148小时，或者介于其之间的任意时间。例如，所述纤维固体可在所述固体保留型水解反应器中被保留比所述水相长约6、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或148小时。

计算所述水相在所述水解反应器中的时长，或者所述水相的驻留时间依赖于多种因素。然而，就本说明书的目的来说，通过以下方式简单地确定所述水相在所述水解反应器中的时长：所述反应器的工作容积(workingvolume)除以进入所述反应器中的容积浆液流补料速率(volumetricslurry flow feed rate)。基于所述进料物、出料物及所述水解反应器中的固体浓度，确定未水解固体保留于所述水解反应器中的时长，这是本领域技术人员所熟知的。

通过以下方式计算所述固体在水解反应器中的保留时间：(i)使用一种与所述固体结合的示踪化合物，或者(ii)测量所述体系中木素固体的浓度。由于方法(i)可更直接地测量所述固体的保留时间，该方法是优选的。

与木质纤维素固体结合的示踪剂实例为牛血清白蛋白(BSA)，但从原理上，任何与木素结合且可探测的化合物都适宜于该目的。如果使用BSA作为实例示踪剂，将它以每克固体50-500mg蛋白的比例添加至所述水解反应器的进料流体中，持续5分钟，不另外干扰所述水解。然后每10分钟从所述反应器的出料物中取5至50mL的样品。所述样品经过滤，并被用水冲洗。通过Kjeldahl氮分析测量所述固体上的BSA蛋白浓度，所述分析是本领域技术人员熟知的。所述固体的平均保留时间对应于所述反应器排出50％BSA的时间。

所述第二种测量保留时间的方法是，在整个反应器的至少5个部位取样并测量木素浓度。所述部位最好在所述反应器容器的高度范围内选择。通过克拉松木素测定法(Klason lignin assay)测量所述木素浓度。然后，所述平均固体保留时间为：以平均木素浓度除以进料的木素浓度，再乘以液体保留时间。

参照图1A，在一个非限制性实例中，将含葡萄糖和未水解纤维固体的水解浆液从所述固体保留型水解反应器130的顶部经管线170移出，并导入微孔过滤单元180中。所述微孔过滤单元180从所述水解的浆液水相分离出含纤维素的纤维固体。本领域技术人员还应了解，所述纤维固体含有渗入其中的液体。如果需要，可将这些分离的纤维固体(管线195)在第二水解反应器200中再悬浮，并继续进行水解。

如前述，在所述水解过程中，纤维素酶结合于所述预处理的木质纤维素原料的纤维素上。结合于所述预处理的木质纤维素原料的β-葡萄糖苷酶也将结合于所述纤维固体上。因此，当从所述浆液的水相分离出所述纤维固体的时候，不但外切纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)，而且β-葡萄糖苷酶都将与所述纤维固相同时被留下。

可用多种方法将所述纤维固体在所述水解反应器中保留比所述水相更长的时间。这些方法可包括几乎完全从所述水相分离出所述纤维固体的方法，以及仅部分地从所述水相分离出所述纤维固体的方法。例如，可以通过膜过滤、离心、真空过滤或加压过滤所述纤维固体几乎完全地从所述水相分离出，并将其返加至所述反应器中。一种优选的膜过滤方法是微孔过滤，一种优选的离心方法涉及将所述浆液泵过水力旋流器(hydroclone)。这些分离技术导致将纤维固体颗粒基本上完全从所述水相分离出。上流式水解反应器、上流式沉降澄清器或者搅拌足够轻以使所述纤维固体沉降的水解反应器的应用将适宜用于实施本发明，因为这些操作将纤维固体颗粒部分地从所述水相分离出，从而把所述纤维固体在该体系中保留比所述水相更长时间。在用这些体系实施本发明中，所述β-葡萄糖苷酶将保持与所述纤维固体的结合，并被保留在所述水解中。所述未水解的纤维固体可以与所述水解浆液的水相或水性部分一起作为单流体被移出，或者它们可以分别作为单独的流体被移出。如果所述水性部分被从所述纤维固体分离出，那么需要理解，该分离可以是不完全的，使得包含所述纤维固体的流体可以包含水相的一部分，并且所述水相可以包含纤维固体。

实现本发明的一个并非意在限制的优选方法包括在如WO2006/063467(其内容在此通过引用的方式纳入本文)描述的沉降反应器中进行所述水解。一个整合了上流式水解反应器的水解体系的实例显示于图1B中。与图1A中相同的参照编号表示相同的工艺步骤。如图1B中所示，将所述水性浆液经管线120进料至水解反应器130中。这可以通过一条向下通过所述反应器中部的管线进行，并通过分料器140在底部添加所述浆液。或者，所述浆液料可以直接至位于所述反应器底部的分料器140中。所述水性浆液以慢到足以使得纤维固体沉降的垂直速度向上流经所述反应器。其结果是，所述水相以比所述纤维固体更短的时间通过所述反应器。所述结合的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶与所述纤维固体一块被留在所述反应器中。所述结合的β-葡萄糖苷酶可确保纤维二糖在所述水解中被转化成葡萄糖，而不会抑制纤维素酶。所述未水解的固体在管线170随所述水相被从所述反应器中转运出，并且通过微孔过滤单元180从所述水相被分离出。所述葡萄糖流体经管线185被送递至发酵，而所述未水解的固体被转运(管线195)至管线160以进行固体处理。(见图1A和1B)。

在另一个实施本发明的方法中，通过用微孔过滤从所述水相中分离出所述纤维固体，然后将其返加至所述反应器中，所述纤维固体保留于所述水解反应器中比所述液相更久。微孔过滤是最粗的膜过滤种类，所述膜过滤还包括超滤和纳米过滤并且被用于分离液体中悬浮的小颗粒。根据孔截止直径(pore diameter cutoff)将用于微孔过滤的膜分类，孔截止直径是所述膜留住的最小颗粒的直径。所述孔截止直径一般在约0.1至10微米的范围内。

在从所述含葡萄糖的水解产物分离出所述纤维固体的步骤后得到的分离固体物可包含约50％至约80％的水分。所述含湿量取决于使用的分离方法、所选的对所述固体脱水的程度以及除水的效率。所述分离的固体可经水冲洗以提高被除去的葡萄糖量。

在固体保留型水解反应器中水解之后，将所述纤维固体分离、再悬浮，并继续水解。将所述纤维固体再悬浮于适宜于进一步水解所述再悬浮浆液的水相中。用于再悬浮所述固体的水性溶液优选是水，但也可以使用其他水性溶液。所述水可以是淡水、生产用水或蒸汽冷凝液。为再悬浮而添加的水性溶液量可以与水解前存在于所述水性浆液中的量相同，或优选略少于该量。最小量是泵或输送以及混合所述浆液的必需量。所述再悬浮的浆液不合葡萄糖以及其他可溶性降制剂，或者它们的浓度被显著降低。在没有葡萄糖、纤维二糖和抑制剂的情况下，或者通过降低它们的浓度，可以以提高的效率进行所述进一步水解步骤。

以下参照图1A，可以通过以下途径进行所述再悬浮，即将所述分离的固体与水210一起经管线195导入至第二水解反应器200中，然后将它们再悬浮，产生再悬浮的浆液。所述固体可以以约3％至约30％(w/w)的固体浓度，或者介于它们之间的任意浓度，例如，约10％至约20％(w/w)的悬浮固体，或者介于它们之间的任意浓度，再悬浮于所述液体中。在所述再悬浮浆液中悬浮的固体的浓度优选等于或略高于在分离固体前在所述预处理的原料浆液中悬浮的固体的浓度。

在将所述纤维固体再悬浮之后，使所述水解继续进行以将所述纤维素转化成含葡萄糖的水解产物。可以使所述再悬浮浆液的水解再进行约24-120小时；例如可以使所述再悬浮的浆液的水解进行约12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、90或120小时。所述第二水解反应器200的底部可以逐渐变细，以形成一个使最重的固体可以沉降并经管线230通过泵220移出的通道(见图1B)。然后可以将这些固体物送递用于木素处理160。

再次参照图1A，可以经管线240从所述第二水解反应器200顶端回收所述水解的浆液，然后导入至沉降罐250中，其中在所述水解浆体的水相中包含葡萄糖并且在纤维固体中包含未水解的固体和任何未水解的含纤维素颗粒。所述纤维固体沉降至所述沉降罐250的底部。所述含葡萄糖的水相30可以经泵移出。所述未水解的固体可以从所述沉降罐250经管线280泵出。

术语“水解产物”是指在酶法水解过程中产生的产物包括但不限于存在于所述水相中的葡萄糖。除葡萄糖之外，所述水解产物的水相还可以包含纤维二糖、葡萄糖寡聚体或它们的组合。少量的未转化的纤维素和非纤维素材料或者对纤维素酶惰性的其他材料，可能被携带至所述水相中。可以从所述葡萄糖流体中分离出这些固体物，产生无固体颗粒的制剂。

虽然上述的体系应用了两个水解反应器，但是所述具有纤维固体保留并且进行或不进行再悬浮浆液继续水解的方法可以在单个或超过两个的水解反应器中进行。

还需要了解，在所述任选的进一步水解步骤后，可进一步水解所述再悬浮的浆液；从所述水解的浆液中分离所述固相；并将所述分离的固体再悬浮，产生再悬浮的浆液。这些步骤可以重复1-5次，或者介于其之间的任意次，优选1-2次。

再者，在整个所述处理步骤中，可以将所述分离的固体送递至一个或多个上流式或下流式水解反应器中。例如，可以将所述分离固体物的第一部分回收至一个上流式反应器中，并将所述分离固体物的第二部分添加至一个下流式反应器中。

然后，可以将在从含葡萄糖的水解产物分离出所述纤维固体的步骤后得到的分离固体添加至从所述水解过程的另一部分获得并含葡萄糖的第二水性溶液，产生合并的糖流体。例如，参照图1A，将所述含葡萄糖的水性溶液经管线195移出并添加至葡萄糖流体30中。或者，对所述初始水解和所述再悬浮水解的过程中产生的水相分别进行发酵或进一步处理。

可以将通过水解所述预处理的木质纤维素原料中的纤维素产生的葡萄糖发酵成乙醇。发酵葡萄糖和其他糖成乙醇可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行，并且可能受到包括酵母和细菌或基因修饰微生物的多种微生物的影响，例如，但不限于，W0 95/13362、W0 97/42307中描述的那些，或者如Alcohol Production From Lignocellulosic Biomass：The IogenProcess(In：The Alcohol Textbook，Nottingham University Press，2000)中所述；它们被通过引用的方式纳入本文。

下述实施例中将对本发明作进一步阐述。但应当理解的是，这些实施例的目的只在于示例说明，不应当用于以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：在上流式水解反应器中用具有CBD的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶水解预处理的原料

参照图1B，用含20％水分的小麦秆以91t/hr制备预处理的原料浆液。根据Foody，美国专利4,461,648的教导，将所述秆用锤磨机磨碎成20目(mesh)并用230℃的蒸汽和稀释于422,000kg/hr水中的3314kg/hr硫酸93％(w/w)加热。当所述预处理的木质纤维素原料浆液10从所述预处理反应器出来时，使用与水性葡萄糖流体30或其他适宜流体换热的热交换器20将其冷却。然后使用第二流体例如热交换器50的冷水45进一步将所述预处理原料浆液10冷却至约45℃至约55℃的温度。然后将所述预处理原料浆液10泵入水解配料罐60中，同时被泵入的还有酶的水性溶液70，所述酶水性溶液包含来自真菌木霉属的剂量为每克纤维素19IU的纤维素酶以及剂量为每g纤维素145IU的如实施例5所述制备具有CBD的β-葡萄糖苷酶。这是所述水解塔的进料。但应指出的是，还可以在别处添加所述酶70；例如，可以在为所述水解反应器进料的任何管线内添加所述酶70。即将添加酶之前还可以将氨水80以1463kg/hr的速率添加至所述浆液10中，以将pH调整至约4.5至5.0。用搅拌器100将所述水解配料罐60的内容物混合，然后将所述浆液10用第一泵110沿管120从所述配料罐60泵出，至7个类似的水解反应器之一，其中水解反应器130是这种并联操作的反应器之一。

所述水解反应器130包含布料器140，用于维持所述酶处理的浆液的均匀分布。如共同未决的美国专利申请60/637,189中所述，水解反应器130是一个非混合的上流式沉降反应器。所述反应器是直径60英尺、高60英尺的罐。将所述浆液10以300gpm的速率和约10％(w/w)的纤维固体浓度添加至所述水解反应器130的底部。所述罐逐渐变细，以形成一个使最重的固体沉降并经管线145通过泵142移出的通道。可以将这些固体物经管线160送出用于木素处理，或者被分别地回收或排弃。所述水相和纤维固体流上所述罐中，所述纤维固体以慢于所述液体的速度在所述罐中沉降和上升。

在所述水相约72小时的停留时间并且浓度12％(w/w)的纤维固体约130小时的停留时间后，将所述浆液从所述罐中排出。所述纤维素转化率为约95％。将所述水解的浆液——即其包含60g/L葡萄糖的水相以及主要包含木素和二氧化硅及未水解纤维素的纤维固体——经管线170从所述水解反应器130的顶部移出，并以300gpm的速率导入微量过滤单元180中。所述微量过滤单元180从所述水相分离出含纤维素、木素以及结合的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的纤维固体。所述水相包含少量的酶及葡萄糖流体，将它经管线185移出并送出用于通过酵母发酵成乙醇。将管线195中的包含结合的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的所述分离纤维固体与管线160中的较重固体结合，被送递至用于固体处理。

实施例2：在继续水解的上流式水解反应器中用具有CBD的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶水解预处理的原料

本实施例涉及用具有CBD的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶水解预处理的原料，然后从所述水相分离未水解的纤维固体并且再悬浮所述纤维固体。在第二水解反应器中水解所述包含结合的β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的再悬浮纤维固体。

用具有CBD的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶水解预处理的原料是在如实施例1所述的上流式水解反应器中进行。然而，在本例中，选取所述水解反应器的尺寸，使得在约24小时的停留时间、约55％的纤维素转化后将所述液体排出罐，产生部分水解的浆液150。将所述部分水解的浆液150——其包含30g/L葡萄糖的水相以及主要含有木素和二氧化硅及未水解纤维素的纤维固体——经管线170从所述第一水解反应器130的顶部移出，并以900gpm的速率导入微量过滤单元180中。

所述微量过滤单元180从所述部分水解浆液的水相分离出包含纤维素、木素、结合的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的固体。所述水相包含少量的酶及葡萄糖流体，经管线185将它移出并添加至葡萄糖流体30中。将管线195中包含结合的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的所述分离纤维固体与水210一块导入至第二水解反应器200中，以产生再悬浮的浆液，然后进料至亦为上流式水解反应器的第二水解反应器200中。所述第二反应器的进料速率是约450gpm，且所述液体驻留时间是约48小时。与所述第一水解反应器130类似，所述第二水解反应器200的底部逐渐变细，以形成一个使最重的固体可以沉降并经管线230通过泵220移出的通道。然后可以将这些固体物经管线160送出用于木素处理或者被分别移出或排弃。

然后将葡萄糖以及任何含未水解纤维素的颗粒和含木素的颗粒经管线240从所述第二水解反应器200的顶部排出，并导入沉降罐250中。所述固体在所述沉降罐250底部沉降，且含葡萄糖的所述水解产流体30经泵260移出。所述沉降的固体被泵270经管线280从所述沉降罐250泵出。然后这些固体被送递用于木素处理160。流体30被送递至所述第一热交换器或者用于通过酵母发酵成乙醇。

实施例3：通过包括具有纤维素结合域(CBD)的β-葡萄糖苷酶的酶进行纤维素水解

本实施例描述通过底物的固体分离和再悬浮对预处理的纤维素进行水解。使用具有CBD的β-葡萄糖苷酶水解的性能优于使用不具有CBD的β-葡萄糖苷酶的性能。

通过用0.6％硫酸(w/w)连续预处理原料并且以蒸汽加热至183℃达3分钟，准备了预处理的小麦秆。所述预处理的原料经过量的水冲洗，并经真空过滤以除去大部分的水。所述冲洗后的原料块包含30％的固体，并且所述固体包含51％的纤维素，余量主要包含木聚糖、木素和二氧化硅。

来自木霉深度培养发酵物的两种纤维素酶混合物被用于该实验中。两种混合物都包含提高水平的β-葡萄糖苷酶，以保证在水解过程中不积聚纤维二糖。β-葡萄糖苷酶的水平通过White and Hindle，美国专利6,015,703的方法提高。一种混合物包含163g/L蛋白和131IU/mL滤纸纤维素酶活性。该批(“常规的”)包含缺乏纤维素结合域的天然β-葡萄糖苷酶。所述β-葡萄糖苷酶活性通过Ghose(1987)的标准测定测量为1235IU/mL。第二批(“具有CBD的βg”)包含32.5g/L的蛋白，20.7IU/mL的滤纸纤维素酶活性，以及250IU/mL的β-葡萄糖苷酶活性。实施例5更详细地描述了具有CBD的β-葡萄糖苷酶的制备。

通过使用250mL的螺旋盖烧瓶进行了纤维素水解。所述总水解重量是每烧瓶100g，浓度相当于5％纤维素的预处理小麦秆中以每克纤维素16或24mg蛋白的剂量添加的酶，余量包含pH4.8的50mM的柠檬酸钠缓冲液，其中含0.5％苯甲酸钠作为防腐剂。在添加所述酶之前，在50℃下通过振荡烧瓶将所述预处理小麦秆底物在所述缓冲液中水化过夜。在所述水解过程中，所述烧瓶在50℃的转动摇床中以250rpm振荡。

对于使用过滤和再悬浮的水解，在24小时的时候将所述烧瓶从所述摇床上移出，然后将其内含物经过玻璃微纤维滤纸真空过滤。测量所述滤液体积为40-50mL，用等体积pH 4.8的50mM柠檬酸钠缓冲液替换所述滤液。与在过滤和再悬浮之前进行的水解类似，然后继续所述振荡水解96小时。对于常规的水解，振荡着进行所述水解120小时而不进行过滤或再悬浮。

对于所有水解，周期性地取出800μL样品并转移至微型离心过滤器中，并以12,000rpm离心2分钟，从所述水相分离不溶性固体。收集所述上清液用于葡萄糖分析。在离心前通过煮沸5分钟来检验大部分样品，以确保纤维二糖未积聚。

通过酶法测量所述上清液中的葡萄糖浓度。通过在HPLC上测量确认低纤维二糖浓度(<1g/L)。在每次水解结束后进行基于使用浓硫酸的水解的纤维素测定，并基于葡萄糖测量确认未转化纤维素的浓度。

图2A示出了使用具有CBD的β-葡萄糖苷酶的纤维素酶的水解结果，其中纤维素酶剂量为每克纤维素中16mg蛋白。所述再悬浮的水解优于不经再悬浮而进行的常规水解。其原因是24小时后过滤所述水解物除去了大量存在的葡萄糖。通过除去所述葡萄糖，消除了所述终产物对纤维素酶的抑制，并且与所述常规水解中存在葡萄糖的情况相比，所述水解以较高的速率进行并且可达到更高的转化水平。有效水解所需的β-葡萄糖苷酶结合于纤维素并被携带至所述再悬浮水解液中。

图2B示出了与图2A相似的结果，不同之处是所述酶剂量为24mg/g，而不是图2A中的16mg/g。

图3示出了用常规纤维素酶的水解，其中所述β-葡萄糖苷酶缺乏CBD。以16和24mg/g的剂量进行所述水解24小时。在此时，将所述浆液过滤，并且将所述水解物再悬浮并继续水解。再悬浮之后的水解速率很低，产生很少的葡萄糖。这种较低的水解速率的原因是所述β-葡萄糖苷酶缺乏CBD且不与所述纤维素结合，更确切地是在过滤过程中随滤液流失。纤维二糖的积聚会抑制纤维素酶并降低水解速率。

实施例4：具有CBD的β-葡萄糖苷酶与漂白的小麦秆纤维素的结合

通过阴离子交换色谱及随后的阳离子交换色谱从全纤维素酶混合物中纯化β-葡萄糖苷酶和具有CBD的β-葡萄糖苷酶。在4℃或50℃下，所述纯化蛋白与用柠檬酸缓冲液调节至pH 4.8的2.56g/L预处理小麦秆，或者仅与pH 4.8的柠檬酸缓冲液孵育30分钟。在孵育后，将所述样品离心并将上清液级分通过SDS-PAGE进行分析(图4A和4B)。

如图4A中所示，在存在或不存在预处理小麦秆的情况下在4℃下孵育后，在上清液中检测到相同量的β-葡萄糖苷酶。这被66kDa处的带所表明，并表明了缺乏CBD的β-葡萄糖苷酶不与所述预处理的小麦秆结合。相反，纯化β-葡萄糖苷酶-CBD完全与预处理的小麦秆结合，在所述上清液中没有检测到它们，这被以下结果表明：即在不存在预处理的小麦秆情况下有70kDa的带，并且在存在预处理的小麦情况下所述带消失。这说明，CBD是β-葡萄糖苷酶结合至所述纤维固体所需的。在50℃下得到了类似的结果(图4B)。

实施例5：β-葡萄糖苷酶/CBD融合物在里氏木霉(Trichoderma reesei)中的表达

该实施例描述了从里氏木霉株M2C38及基因修饰的衍生体分离基因组DNA，构建基因组DNA文库，克隆多个基因，来自里氏木霉株M2C38的遗传构建体，以及β-葡萄糖苷酶/CBD遗传构建体在里氏木霉株BTR213中的转化和表达。

里氏木霉株M2C38和BTR213是Iogen Corporation的专利株(proprietary strain)，它们衍生自里氏木霉株RutC30(ATCC 56765.Montenecourt and Eveleigh，Adv.Chem.Ser.，1979，181：289-301)，后者又衍生自里氏木霉株Qm6A(ATCC 13631 Mandels and Reese，J.Bacteriol.，1957，73：269-278)。

在该实例中，限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA多聚酶1的Klenow片段购自Gibco/BRL、New England Biolabs、Boehringer Mannheim或Pharmacia，并依照这些厂商的建议使用。具有校读活性的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)根据厂商的方案被用于所有多聚酶链式反应(PCR)中。潮霉素B购自CalBiochem。

5.1克隆里氏木霉bgl1、cbh1、cbh2、xln2和pgk基因。

为了分离基因组DNA，用无菌接种环将从马铃薯葡萄糖琼脂平板收集的里氏木霉孢子接种于50mL的马铃薯葡萄糖肉汤(Difco)中。在28℃下以200rpm将培养物振荡2-3天。将菌丝体在GFA玻璃微纤维过滤器(Whatman)上过滤并用冷的去离子水清洗。将真菌块在液氮中冻结并且用预冷的研钵和研杵研磨成粉末；将0.5g粉末化的生物菌体再悬浮于5mL pH7.5的100mM Tris、50mM EDTA加1％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中。将裂解产物离心(4℃，5000g离心20分钟)以使细胞碎片成片状沉淀。将上清液用1倍体积的缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA，pH 8)-饱和的苯酚萃取，然后用1倍体积的缓冲液-饱和的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取以去除可溶蛋白。通过添加0.1倍体积pH 5.2的3M醋酸钠及2.5倍体积冷的95％乙醇从溶液中沉淀DNA。在-20℃下孵育至少1小时后，通过离心(4℃，5000g离心20分钟)使DNA沉淀成片，用10mL 70％乙醇冲洗，在空气中晾干并再悬浮于1mL pH 8.0的10mM Tris、1mM EDTA溶液中。通过加入核糖核酸酶A(Boehringer Mannheim)至终浓度0.1mg/mL并在37℃下孵育1小时消化RNA。依次用1倍体积的缓冲液饱和的苯酚和1倍体积的缓冲液饱和的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取以从该DNA溶液中去除核糖核酸酶。再次用0.1倍体积pH 5.2的3M醋酸钠及2.5倍体积冷的95％乙醇沉淀所述DNA，通过离心使之成片，用70％的乙醇冲洗，在空气中晾干并再悬浮于50μL pH 8.0的10mM Tris、1mM EDTA溶液中。通过测量溶液在260nm下的吸光度确定DNA的浓度(p.Cl in Sambrook，Fritsch and Maniatis，＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition＂，Cold Spring Harbor Press 1989，在后文中称为Sambrooket al.)。

使用从里氏木霉菌株M2C38分离的基因组DNA构建两个质粒文库和一个噬菌体文库。在质粒pUC119中构建所述质粒文库(Viera and Messing，＂Isolation of single-stranded plasmid DNA＂，Methods Enzymol.153：3，1987)，步骤如下：将体积100μL的10μg基因组DNA在37℃下用2单位/μg的HindIII、BamH1或EcoR1限制性内切酶消化20小时。将该消化的DNA于0.04M Tris-醋酸盐、1mM EDTA中用0.75％琼脂糖凝胶电泳进行分离并用溴化乙锭染色。将对应于目的基因大小(基于发表的信息和DNA印迹)的凝胶片切下并经过电洗脱以回收DNA片段(Sambrook et al.，第6.28-6.29页)。通过在含有20-50μg/mL的载体：插入DNA摩尔比为2:1的DNA、1mM ATP及5单位T4DNA连接酶且总体积为10-15μL的连接反应液中于4℃下反应16小时，将这些富集的DNA片段连接至pUC119中以形成基因文库。使用Cell Porator System(Gibco/BRL)依照厂商的方案将该连接反应物电穿孔大肠杆菌菌株HB101，并在含70μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂上筛选转化体。

通过菌落转移杂交(colony lift hybridization)鉴定了携带来自于重组体pUC119-HindIII、-BamHI或-EcoRI文库的cbh1、cbh2或bgl1克隆的大肠杆菌HB101转化体：将1-3×10⁴个菌落转移至HyBond^TM尼龙膜(Amersham)上；将膜的菌落面向上置于用0.5M NaOH、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR238)上5分钟以裂解细菌细胞并变性DNA；然后通过将膜的菌落面向上置于用pH 7.5的1.5M Tris、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟进行中和；将膜在空气中晾30分钟，然后通过在80℃下烘烤2小时将所述DNA固定于膜上。

在含有10-50ng靶DNA、0.2mM每种d(GCT)TP、0.5μM dATP、20-40μCiα-³²P-dATP、10pmole寡核苷酸引物和0.5单位Taq聚合酶且总体积为20μL的标记反应物中，通过从HindIII、BamH1或EcoR1片段的富集池中分别PCR扩增bgl1、cbh1和cbh2编码区的短片段(0.7-1.5kB)制备了³²P-标记的探针。该反应经过6-7个扩增循环(95℃，2分钟；56℃，1.5分钟；70℃，5分钟)。通过加入0.5mL10％(w/v)三氯醋酸和0.5mg酵母tRNA沉淀所述扩增的³³P-标记的DNA。通过微量离心使DNA成片沉淀，用1mL70％的乙醇冲洗2次，在空气中晾干并再悬浮于pH7.5的1M Tris、1mM EDTA溶液中。

将已经固定有重组pUC119质粒的尼龙膜在热封口的袋中于60-65℃下于pH7.5的1M NaCl、1％ SDS、50mM Tris、1mM EDTA溶液中用含100μg/mL变性的剪切鲑精DNA预杂交1小时。在热封口的袋中于60-65℃下于相同缓冲液中用仅含50μg/mL变性的剪切鲑精DNA及5×10⁶-5×10⁷cpm变性的bgl1、cbh1或cbh2探针杂交16-20h。将膜用1M NaCl、0.5％SDS于60℃下冲洗1次，持续15分钟；用0.3M NaCl、0.5％SDS于60℃下冲洗2次，每次持续15分钟；用0.03M NaCl、0.5％SDS于55℃下冲洗1次，持续15分钟。将膜再次放入热封口的袋中并在-70℃下暴露于Kodak RPX射线胶片下16-48小时。依照厂商的方案将X-射线胶片显影。挑选显示强信号或弱信号的菌落并在含70μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基中培养。使用碱裂解法(Sambrook，et al.，第1.25-1.28页)从这些培养物中分离质粒DNA，并通过限制性消化、DNA杂交(Sambrook，et al.，第9.38-9.44页)和PCR分析(Sambrook，et al.，第14.18-14，19页)进行分析。

通过用1.0kb的bgl1探针进行的pUC119-HindIII文库的菌落转移杂交鉴定了携带bgl1基因的克隆，所述探针是使用设计用于扩增公开的bgl1序列(Barnett，Berka，and Fowler，见＂Cloning and Amplification of theGene Encoding an Extracellular β-glucosidase from Trichodermareesei：Evidence for Improved Rates of Saccharification ofCellulosic Substrates＂Bio/Technology，第9卷，June 1991，第562-567页，在本文中称为＂Barnett，et al.＂)的bp 462-1403的寡核苷酸引物制备的。分离了bgl1克隆pJEN200，它包含6.0kb的对应于启动子、结构基因和终止序列的HindIII片段。通过用0.7kb的cbh1探针进行的pUC119-BamH1文库的菌落转移杂交鉴定了携带cbh1基因的克隆，所述探针是使用设计用于扩增公开的cbh1序列(Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo and Innis，＂Molecular cloning ofexo-cellobiohydrolyase 1 derived from Trichoderma reesei strainL27＂，Bio/Technology1：691-696，1983，在下文中称为Shoemaker et al.)的bp597-1361的寡核苷酸引物制备的。分离了cbh1克隆pCOR132，它包含5.7kb的对应于启动子(4.7kb)和1kb的cbh1结构基因的BamH1片段。通过这，将2.5kb的含有cbh1启动子(2.1kb)和5′末端cbh1编码区(0.4kb)的EcoR1片段亚克隆至pUC119中，生成pCB152。通过用1.5kb的cbh2探针进行的对pUC119-EcoR1文库的菌落转移杂交鉴定了携带cbh2的克隆，所述探针是使用设计用于扩增公开cbh2序列(Chen，Gritzali andStafford，＂Nucleotide sequence and deduced primary structure ofcellobiohydrolase II from Trichoderma reesei＂，Bio/Technology 5：274-278，1987，在下文中称为Chen et al.)的bp580-2114的寡核苷酸引物制备的。分离了cbh2克隆pZUK600，它包含4.8kb的对应于启动子(600bp)、结构基因(2.3kb)和终止子(1.9kb)的EcoR1片段。

在λ载体λDASH(Stratagene，Inc.)中构建噬菌体文库，步骤如下：用2、1、0.5和0.5单位/μg的BamHI在37℃下消化基因组DNA(3μg)1小时，产生9-23kB大小的片段。将每次消化产生的DNA通过以下步骤纯化：用1倍体积的Tris-饱和的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取，然后用10μL pH5.2的3M醋酸钠及250μl 95％乙醇(-20℃)沉淀。通过微量离心使该消化的DNA成片沉淀，用0.5mL冷的70％乙醇冲洗，在空气中晾干并再悬浮于10μL无菌的去离子水中。通过琼脂糖凝胶电泳(在0.04M Tris-醋酸盐、1mM EDTA中的0.8％琼脂糖)确认9-23kB大小的DNA片段的富集。在含有2单位T4DNA连接酶和1mM ATP的总体积为5μl的反应液中于4℃下反应过夜，将消化的DNA(0.4μg)连接至1μg以BamH1(Stratagene)预消化的λDASH臂中。使用GigaPack

II Gold包装蛋白(packaging extracts)(Stratagene)依照厂商的方案将连接混合物包装至噬菌体颗粒中。用大肠杆菌宿主菌株XL1-Blue MRA(P2)滴定该文库，发现其含有3×10⁵个独立克隆。

使用DIG标记和探测试剂盒(Boehringer Mannheim)并依照厂商方案，通过随机引物标记从PCR扩增的cbh1、xln2和pgk基因的编码区制备了异羟基洋地黄毒苷配基-11-dUTP(Digoxigen-11-dUTP)标记的探针。通过对λDASH文库的噬斑转印杂交鉴定了含有cbh1、xln2和pgk基因的基因组克隆。对于每个目的基因，将1×10⁴个克隆转移至Nytran

(Schleicher and Schull)尼龙膜上。通过将膜的噬斑面向上置于用0.5M NaOH、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟裂解噬菌体颗粒并变性噬菌体DNA；然后通过将膜的噬斑面向上置于用pH 7.5的1.5M Tris、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟进行中和；将膜在空气中晾30分钟，然后通过在80℃下烘烤2小时将DNA固定于膜上。将膜在热封口的袋中于65℃下用含6×SSPE、5×Denhardt、1％SDS加100μg/mL变性的剪切鲑精DNA的溶液预杂交2小时。然后将膜在热封口的袋中于65℃下用含50μg/mL变性的剪切鲑精DNA及0.5μg异羟基洋地黄毒苷配基-dUTP标记探针的相同缓冲液杂交过夜。将膜用2×SSPE、0.1％SDS于室温下冲洗15分钟2次，用0.2×SSPE、0.1％SDS于65℃下冲洗15分钟2次，用2×SSPE冲洗5分钟1次。依照厂商的方案，通过与抗-异羟基洋地黄毒苷配基/碱性磷酸酶抗体缀合合物、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和4-硝基蓝四氮唑(Boehringer Mannheim)的反应鉴定了阳性杂交克隆。通过用异羟基洋地黄毒苷配基-dUTP标记探针的第二轮筛选进一步纯化了阳性杂交克隆。按照Sambrook et al.(1989)第2.118-2.121页中的描述，分离单克隆及纯化噬菌体DNA不同之处是CsCl梯度步骤由使用1倍体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)及1倍体积的氯仿:异戊醇(24:1)的萃取所替代。用0.1倍体积pH5.2的3M醋酸钠及2.5倍体积冷的95％乙醇沉淀DNA。用0.5mL冷的70％乙醇冲洗沉淀的噬菌体DNA，在空气中晾干并再悬浮于50μL pH8.0的10mMTris、1mM EDTA溶液中。通过将纯化噬菌体DNA限制性消化及使用与用于筛选λDASH文库的相同的异羟基洋地黄毒苷配基-dUTP标记探针进行DNA印迹杂交(Sambrook，et al.，第9.38-9.44页)，鉴定包含目的基因的限制片段。通过与用于噬斑转印的相同的方法杂交所述膜并显影阳性杂交的片段。一旦鉴定了来自每个λDASH克隆的所需限制片段，重复进行限制性消化，将片段于TAE中用0.8％琼脂糖凝胶分离并切下所需的带。使用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia)依照厂商的方案从凝胶片上洗脱所述DNA。

通过使用含有公开cbh1序列(Shoemaker et al.)的bp45-2220的cbh1探针进行的对λDASH文库(实施例2)的菌落转移杂交，鉴定了携带cbh1基因的克隆。通过将从λDASH cbh1克隆纯化的噬菌体DNA进行限制性消化分离了1.8kb的含cbh1编码区(0.5kb)的3’端和cbh1终止子(1.3kb)的BamHI片段。将该片段亚克隆入大肠杆菌质粒载体pUC119的BamH1位点，生成质粒pCB1Ta。通过使用含有公开xln2序列(Saarelainen，Paloheimo，Fagerstrom，Suominen and Nevalainen，＂Cloning，sequencing andenhanced expression of the Trichoderma reesei endoxylanase II(pI9)gene xln2＂，Mol.Gen.Genet.241：497-503，1993，在后文中称为Saarelainen et al.)的bp 100-783的xln2探针进行的对λDASH文库(实施例2)的菌落转移杂交，鉴定了携带xln2基因的克隆。通过将从λDASHxln2克隆纯化的噬菌体DNA进行限制性消化分离了5.7kb的含xln2的启动子(2.3kb)、编码区(0.8kb)和终止子(2.6kb)的Kpn1片段。将该片段亚克隆入pUC119的Kpn1位点，生成质粒pXYN2K-2。通过使用含有公开pgk序列(Vanhanen，Penttila，Lehtovaara and Knowles，＂Isolation andcharacterization of the 3-phosphoglycerate kinase gene(pgk)fromthe filamentous fungus Trichoderma reesei＂，Curr.Genet.15：181-186，1989)的bp 4-1586的pgk1探针进行的对λDASH文库(实施例2)的菌落转移杂交，鉴定了携带pgk基因的克隆。通过将从λDASHpgk克隆纯化的噬菌体DNA进行限制性消化分离了5.0kb的含pgk基因的启动子(2.9kb)、编码区(1.6kb)和终止子(0.5kb)的EcoR1片段。将该片段亚克隆入pUC119的EcoR1位点，生成质粒pGK5.0。

5.2构建β-葡萄糖苷酶过表达载体pC/XBG-CBD-TV

本实施例描述了构建这样的一种载体，即该载体被设计成表达成熟β-葡萄糖苷酶编码区和包含木霉属纤维二糖水解酶I的接头-纤维素结合域的肽的融合蛋白。在该构建体中，融合蛋白的表达由木霉属纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子和木聚糖酶(xln2)分泌信号肽指导。

使用引物以Pwo聚合酶从所述基因组bgl1克隆pJEN200中扩增缺少C-末端丙氨酸残基的β-葡萄糖苷酶编码区(bp 474-2679)，以在公开的bgl1序列(Barnett et al.)的上游恰好bp474处插入Xba1位点，在bp2676处插入Kpn1位点，后者在终止密码子后1个密码子处。该扩增片段不经过消化即被亚克隆至pUC19的Sma1位点，生成质粒pBgns1。通过用Xba1和Kpn1消化从pBgns1中释放缺少终止密码子的bgl1片段，并插入至用Xba1和Kpn1消化的pCB219N中生成pBgns2。为了制备pCB219N，使用对应于公开的cbh2基因(Chen et al.，1987)3’非翻译区的bp2226-2242同源且在5’端包含Kpn1位点的引物以及与pZUK600中cbh2的3′端的EcoR1位点下游退火的pUC正向引物(Cat.No.1224，New England Biolabs)，从pZUK600模板扩增cbh2终止子片段。在设计的Kpn1和EcoR1位点消化该片段，并插入至pUC119的相应位点，生成pCB219。将EcoR1-Not1接头(Cat.No.35310-010，Gibco/BRL)插入至pCB219的单EcoR1位点，生成pCB219N。

使用包含直接位于公开的xln2序列(Saarelainen et al.)的bp102下游的Nhe1位点的xln2专用引物以及与xln2基因5′端的Kpn1位点的上游退火的pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，以Pwo聚合酶从所述基因组xln2亚克隆pXYN2K-2中扩增包含xln2基因启动子和分泌信号的2.3kb片段(bp-2150至+99，其中+1表示ATG起始密码子)。该xln2PCR产物经EcoR1(它作为来自pXYN2K-2的pUC119聚合接头的一部分被扩增)和Nhe1消化，并被插入至质粒pBR322L中，该质粒是通过在Sph1和Sal1位点之间插入Sph1-Not1-Sal1接头从质粒pBR322制备的。然后用Klenow钝化所形成的质粒pBR322LXN中的xln2启动子5′端的EcoR1，并添加Spe1接头(Cat.No.1086，New England Biolabs)生成pBR322SpXN。通过HindIII消化cbh1基因组亚克隆pCB152分离包含cbh1启动子的bp-1399至-204的1.2kb HindIII片段。该片段被用于替换载体pBR322SpXN中包含xln2启动子的bp-1400至bp-121的HindIII片段，生成质粒pBR322C/X。

用XbaI和NotI切割pBgns2质粒，并分离包含无终止密码子的bgl1编码区以及之后的cbh2终止子的4.2kb片段。将该序列插入至用NheI和NotI(NheI和XbaI具有相容的突出端)切割的质粒pBR322C/X中。进行这种克隆形成了这样的表达盒，即可以在cbh1启动子和xln2分泌信号肽控制下从该表达盒表达无终止密码子的成熟β-葡萄糖苷酶。该表达盒质粒为pC/XBgns，且在所述bgl1编码区和所述cbh2终止子之间具有单Kpn1位点。

为了获得cbh1接头和CBD区，使用引物通过PCR扩增含有公开cbh1基因(Shoemaker et al.)bp1665至bp 1882bp的DNA片段，在所述片段的5′端同时插入Kpn1和Spe1位点并在3′端插入Kpn1位点。定位所述5′Kpn1位点，以使得pC/XBgns中的bgl1编码区的阅读框和cbh1接头+CBD的阅读框精确融合。所述3′Kpn1位点紧接着位于所述天然cbh1编码区终止密码子之后。这个215bp的PCR产物经Kpn1消化并插入至pC/XBgns的单Kpn1位点中，产生最终的表达盒载体pC/XBg-CBD。作为插入所述限制位点的结果，该构建体表达的最终融合蛋白将在bgl1编码序列的Va l713和cbh1的编码区的Ile474之间包含3个额外的氨基酸(Pro-Thr-Ser)。

使用Pwo聚合酶从质粒pVU1005(Van den Elzen，Townsend，Lee andBedbrook，＂A chimaeric hygromycin resistance gene as a selectablemarker in plant cells＂，Plant Mol.Biol.5：299-302，1989)中扩增用作里氏木霉选择性标记的大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因(hph)。设计引物以分别在hph编码区(公开hph序列的bp 211-1236，Gritz and Davies，＂Plasmid-encoded hygromycin b resistance：the sequence ofhygromycin B phosphotransferase gene and its expression inEscherichia coli and Saccharomyces cerevisiae＂Gene 25：179-188，1983)的5′和3′端引入Sph1和Kpn1位点。所述PCR产物经Sph1和Kpn1消化，并被插入至pUC119的聚合接头区的相应位点中。所得到的质粒pHPT100被用作起始质粒用于构建所述选择盒。在该质粒中引入两个新的接头区，以有利于在木霉属宿主中插入表达hph基因必需的启动子和终止子片段。在所述hph序列5′端HindIII和SphI位点之间插入HindIII-XbaI-XhoI-SphI接头，并在所述hph序列3′端KpnI和SacI位点之间插入KpnI-NotI-SacI接头之间插入。该构建体被称为pHPT102。设计用于扩增pgk启动子(Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，＂Promoter structure and expression of the 3-phosphoglycerate kinasegene(pgkl)of Trichoderma reesei＂，Gene 106：129-133，1991)的引物，以分别在所述启动子的位置-970和+1处引入XhoI位点和SphI位点。这些位点在随后被用于将pgk启动子插入至pHPT102的XhoI和SphI位点中，生成pHPT115。使用与在bp 1877-1882包含Kpn1位点的cbh13′非翻译区(公开的cbh1序列的bp 1864-1899)退火的引物以及与pCB1Ta中cbh1终止子3′端EcoR1位点的下游退火的pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，以Pwo聚合酶从pCB1Ta中扩增1.3kb cbh1终止子片段。所述cbh1终止子PCR产物经Kpn1消化，并插入至pHPT115的单Kpn1位点中，生成选择性盒质粒pHPT136。

为了制备所述转化载体，通过以下方式从pC/XBg-CBD中分离包含xln2启动子的5′远端区、cbh1启动子的bp-1399至-204、xln2启动子的bp-121至+99和分泌信号肽、β-葡萄糖苷酶/CBD融合物的编码区以及cbh2终止子的5.8kb表达盒：用Not1消化，用Klenow DNA聚合酶钝化所述Not1位点并用Spe1消化。将该5.8kb Spe1/Not1片段插入至这样的pHPT136的hph分泌盒的单上游中，即该pHPT136经Xho1消化，以Klenow DNA聚合酶钝化并且经Xba1消化(Spe1和Xba1具有相容的突出端)。在所述hph分泌盒中cbh1终止子的3′末端的单Not1位点将所述最终转化载体pC/XBg-CBD-TV线性化，并将其作为线性载体经如下所述的微粒轰击引入里氏木霉BTR213中。

5.3经微粒轰击转化里氏木霉BTR213

将Biolistic PDS-1000/He系统(BioRad；E.I.DuPont de Nemours andCompany)用于转化里氏木霉株BTR213的孢子，所有步骤如厂商的推荐进行。M-10钨颗粒(0.7μm的中间粒径)被用作微载体。如下的参数被用于优化所述转化：1100psi的破裂压强、29mm Hg的氦压强、0.95cm的间距、16mm的巨载体穿行距离以及9cm的靶距离。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上用1×10⁶个孢子制备平板。在28℃下孵育轰击的平板。在轰击4小时后，通过铺加添加40单位/mL HygB的选择性PDA培养基对孢子进行初级选择。在28℃下孵育轰击的平板。在3-6天的培养后可观察到转化体；然而，需要进一步孵育以获得孢子形成。

在孢子形成开始后，进行第二选择过程以分离单转化体。用接种环从所述平板上采集孢子，并再悬浮于无菌水中。然后将该悬浮物滤过以玻璃微纤维插塞的无菌注射器。这使得孢子通过，而将不需要的菌丝体留下。需要确定该悬浮物中的孢子浓度，随后将稀释物铺于添加0.75％Oxgall(Difco)和HygB(20单位/mL)的PDA平板上，得到每平板20-50个孢子。将Oxgall作为菌落限制剂，从而使得单菌落在这些第二选择平板上分离。在2-3天后可观察到分离的菌落。

5.4在液体培养物中产生β-葡萄糖苷酶

将木霉属的单菌落转移至PDA平板上用于繁殖每个培养物。孢子形成是均匀地接种振荡烧瓶所必需的，这些烧瓶被用于测验所述培养物产生β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的能力。所述培养基的组分如下：

表2：培养基组分

组分	浓度
组分	浓度	(NH₄)₂SO₄	6.35g/L
KH₂PO₄	4.00g几	(NH₄)₂SO₄	6.35g/L
KH₂PO₄	4.00g几	MgSO₄·7H₂O	2.02g/L
CaCl₂·2H₂O	0.53g/L	MgSO₄·7H₂O	2.02g/L
CaCl₂·2H₂O	0.53g/L	玉米浆	6.25g/L
CaCO₃	10.00g/L	玉米浆	6.25g/L
CaCO₃	10.00g/L	碳源^**	5-10g/L
微量元素^*	1mL/L	碳源^**	5-10g/L

*微量元素溶液含5g/L FeSO₄·7H₂O；1.6g/LMnSO₄·H₂O；1.4g/LZnSO₄·7H₂O。

**5g/L葡萄糖加10g/L Solkafloc(当使用cbh1或其他纤维素酶启动子时)、10g/L木聚糖(当使用xln2启动子时)或与指导β-葡萄糖苷酶表达的启动子相容的其他碳源。碳源可以在pH2至7下作为水性溶液单独灭菌，然后加入至其余溶液中。

每个1升烧瓶中的液体体积是150mL，初始pH为5.5，并且在接种前将每个烧瓶于121℃下通过蒸汽高压灭菌器灭菌30分钟。

对于天然细胞和转化的细胞，如上文5.3节中所述从PDA平板分离孢子，并在每个烧瓶中接种1-2×10⁶个孢子。在28℃下以200rpm振荡所述烧瓶6天。通过滤过GF/A玻璃微纤维(Whatman)收集包含分泌性蛋白的滤液。使用Bio-Rad蛋白测定(Cat.No.500-0001)并以木霉属纤维素酶作为标准确定所述蛋白浓度。如Ghose，1987中所述确定β-葡萄糖苷酶活性。

5.5使用Solka floc碳源通过里氏木霉株BTR213和1059A产生β-葡萄糖苷酶

使用实施例5D的步骤以10g/L Solka floc和5g/L葡萄糖作为碳源培养天然株BTR213和来自该宿主的转化株1059A。结果显示于表2中。

所述天然株产生0.19 IU的β-葡萄糖苷酶/mg蛋白。

从cbh1启动子和xln2分泌信号表达β-葡萄糖苷酶/CBD融合物的转化体1059A产生7.6IU/mg的β-葡萄糖苷酶。这表明比天然株增加40倍，所述天然株代表大多数的β-葡萄糖苷酶水平。

表3：由150mL的烧瓶培养物中里氏木霉株BTR213和1059A产生β-葡萄糖苷酶的活性

株	启动子	分泌信号	β-葡萄糖苷酶	B-葡萄糖苷酶(IU/mg)
株	启动子	分泌信号	β-葡萄糖苷酶	B-葡萄糖苷酶(IU/mg)	RutC30	bgl1	bgl1	天然	0.14
RC-302	cbh1	xln2	β-G/CBD融合	19	RutC30	bgl1	bgl1	天然	0.14

Claims

1.一种用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的酶组合物，所述酶组合物包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料上的粘合剂，其中所述水解通过以下步骤实现：

(iii)从所述固体保留型水解反应器中取出未水解的纤维固体和包含水解产物的水相，

其中所述未水解的纤维固体在所述固体保留型水解反应器中的保留时间比所述水相平均长约6小时至约148小时。

2.根据权利要求1的酶组合物，其中所述粘合剂为一种可操作连接至所述一种或多种β-葡萄糖苷酶上的碳水化合物结合模块。

3.根据权利要求2的酶组合物，其中所述碳水化合物结合模块是一种纤维素结合域。

4.根据权利要求1的酶组合物，其中所述纤维素酶由曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或它们的组合产生。

5.根据权利要求4的酶组合物，其中所述纤维素酶由木霉属产生。

6.根据权利要求1的酶组合物，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶由曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或它们的组合产生。

7.根据权利要求6的酶组合物，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶由木霉属或曲霉属产生。

8.根据权利要求3的酶组合物，其中所述纤维素结合域是家族I纤维素结合域。

9.根据权利要求3的酶组合物，其中所述纤维素结合域是细菌或真菌纤维素结合域。

10.根据权利要求3的酶组合物，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶包含一种将所述纤维素结合域可操作地连接于所述β-葡萄糖苷酶的接头。

11.根据权利要求1的酶组合物，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶是天然存在的。

12.根据权利要求1的酶组合物，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶是基因修饰的融合蛋白。

13.根据权利要求3的酶组合物，其中存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶的约75％至约100％(w/w)包含纤维素结合域。

14.根据权利要求13的酶组合物，其中存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶的约90％至约100％(w/w)包含纤维素结合域。

15.根据权利要求1的酶组合物，其中所述纤维素酶包括选自纤维素酶CBHI和CBHII及它们的组合的纤维二糖水解酶，以及选自纤维素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它们的组合的内切葡聚糖酶。

16.根据权利要求1的酶组合物，其中存在于所述酶组合物中的总纤维素酶的约75％至约100％(w/w)与所述水解步骤(步骤(ii))中的纤维固体结合。

17.根据权利要求1的酶组合物，还包含一个这样的步骤，即从含葡萄糖的水解产物中分离未水解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的水性溶液。

18.根据权利要求17的酶组合物，还包含将所述分离的纤维固体再悬浮于一种水性溶液中，并继续所述水解。

19.一种酶组合物用于酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的用途，所述酶组合物包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料上的粘合剂，其中所述酶组合物的用途包含：

20.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述粘合剂是一种可操作连接至所述一种或多种β-葡萄糖苷酶上的碳水化合物结合模块。

21.根据权利要求20的所述酶组合物的用途，其中所述碳水化合物结合模块是一种纤维素结合域。

22.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中所述固体保留型水解反应器是这样的水解体系的一部分，即该水解体系包含两个或多个水解反应器，并且这些水解反应器被以连续、并行或它们的组合的方式操作。

23.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中所述固体保留型水解反应器是一个沉降反应器，并且其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，至少部分的所述纤维固体在所述沉降反应器中沉降。

24.根据权利要求23的所述酶组合物的用途，其中所述沉降反应器是一个塔，并且其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述水性浆液向上流经所述塔。

25.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述纤维素酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。

26.根据权利要求25的所述酶组合物的用途，其中所述纤维素酶由木霉属产生。

27.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述一种或多种β-葡萄糖苷酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。

28.根据权利要求27的所述酶组合物的用途，其中所述一种或多种β-葡萄糖苷酶由木霉属或曲霉属产生。

29.根据权利要求21的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述纤维素结合域是家族I纤维素结合域。

30.根据权利要求21的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述纤维素结合域是细菌或真菌纤维素结合域。

31.根据权利要求21的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述一种或多种β-葡萄糖苷酶包含一种将所述纤维素结合域可操作地连接于所述β-葡萄糖苷酶的接头。

32.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述一种或多种β-葡萄糖苷酶是天然存在的。

33.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述一种或多种β-葡萄糖苷酶是基因修饰的融合蛋白。

34.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶的约75％至约100％(w/w)包含纤维素结合域。

35.根据权利要求34的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，存在于所述酶组合物中的总β-葡萄糖苷酶的约90％至约100％(w/w)包含纤维素结合域。

36.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述纤维素酶包括选自纤维素酶CBHI和CBHII及它们的组合的纤维二糖水解酶，以及选自纤维素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它们的组合的内切葡聚糖酶。

37.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，存在于所述酶组合物中的总纤维素酶的约75％至约100％(w/w)与步骤(ii)中的纤维固体结合。

38.根据权利要求19的所述酶组合物的用途，还包含一个这样的步骤，即从含葡萄糖的水解产物中分离未水解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的水性溶液。

39.根据权利要求38的所述酶组合物的用途，还包含将所述分离的纤维固体再悬浮于一种水性溶液中，并继续所述水解。

40.一种酶法水解纤维素以从预处理的木质纤维素原料产生含葡萄糖的水解产物的方法，所述方法包含：

(ii)在一个固体保留型水解反应器中用纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至纤维固体上的粘合剂水解所述水性浆液以产生所述含葡萄糖的水解产物，其中所述纤维素酶以及所述一种或多种β-葡萄糖苷酶结合于所述纤维固体上；以及

(iii)从所述固体保留型水解反应器中取出未水解的固体和包含水解产物的水相，

41.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述粘合剂是一种可操作连接至所述一种或多种β-葡萄糖苷酶上的碳水化合物结合模块。

42.根据权利要求41的方法，其中所述碳水化合物结合模块是一种纤维素结合域。

43.根据权利要求40的方法，其中在所述提供步骤(步骤(i))中，所述水性浆液具有约3％-约30％(w/w)的悬浮的或不溶解的固体含量。

44.根据权利要求40的方法，还包含一个这样的步骤，即从含葡萄糖的水解产物中分离未水解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的水性溶液。

45.根据权利要求40的方法，其中所述固体保留型水解反应器是这样的水解体系的一部分，即该水解体系包含两个或多个水解反应器，并且这些水解反应器被以连续、并行或它们的结合的方式操作。

46.根据权利要求44的方法，其中经微孔过滤、离心、真空过滤或加压过滤从所述水解产物中分离所述未水解的固体。

47.根据权利要求46的方法，其中经微孔过滤从所述水解产物中分离所述未水解的固体。

48.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))前将所述水性浆液浓缩。

49.根据权利要求45的方法，其中所述水解体系包含一个或多个选自以下的水解反应器：搅拌罐、非混合罐、搅拌塔和非混合塔。

50.根据权利要求49的方法，其中所述搅拌塔是上流式塔。

51.根据权利要求49的方法，其中所述非混合塔是上流式塔。

52.根据权利要求39的方法，其中所述过程是分批过程。

53.根据权利要求40的方法，其中所述过程是这样的连续过程，即连续地补入水性浆液并取出所述未水解固体和含所述水解产物的水相。

54.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述纤维固体中约70％至约100％的纤维素被转化成葡萄糖。

55.根据权利要求40的方法，还包含一个这样的步骤，即从所述含葡萄糖的水解产物中分离所述未水解的固体，产生分离的固体和含葡萄糖的第一水性溶液；将所述分离固体再悬浮于一种水性溶液中，产生一种再悬浮的浆液；在第二水解中继续水解所述再悬浮浆液；以及从所述第二水解得到含葡萄糖的第二水性溶液。

56.根据权利要求55的方法，其中所述再悬浮的浆液具有约10％至约15％(w/w)的固体浓度。

57.根据权利要求40的方法，其中在所述提供步骤(步骤(i))中，所述预处理的木质纤维素原料来自小麦秆、燕麦秆、大麦秆、玉米秸、大豆秸、菜籽秆、稻秆、甘蔗、甘蔗渣、柳枝稷、草芦、大米草或芒属。

58.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，以每克纤维素约1.0至约40.0IU的剂量添加纤维素酶。

59.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，以每克纤维素约35至约200IU的剂量添加所述一种或多种β-葡萄糖苷酶。

60.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述纤维素酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。

61.根据权利要求40的方法，其中在所述水解步骤(步骤(ii))中，所述β-葡萄糖苷酶由曲霉属、腐质霉属、木霉属、芽孢杆菌属、喜热裂孢菌属或它们的组合产生。

62.根据权利要求61的方法，其中所述β-葡萄糖苷酶由曲霉属或木霉属产生。

63.根据权利要求40的方法，其中进行所述水解步骤(步骤(ii))的总水相保留时间为约12至约200小时。

64.根据权利要求55的方法，其中所述继续水解步骤进行约12至约200小时。

65.根据权利要求55的方法，还包含发酵所述含葡萄糖的第一水性溶液、所述含葡萄糖的第二水性溶液或它们的组合，产生含乙醇的发酵液。

66.根据权利要求40的方法，其中存在的总纤维素酶的约75％至约100％(w/w)与所述水解步骤(步骤(ii))中的纤维固体结合。

67.酶组合物在酶法水解纤维素以从预处理木质纤维素原料的水性浆液中产生含葡萄糖的水解产物中的用途，所述酶组合物包含纤维素酶、一种或多种β-葡萄糖苷酶以及用于将所述β-葡萄糖苷酶结合至所述预处理的木质纤维素原料上的粘合剂，其中所述酶法水解在一个固体保留型水解反应器中进行。