CN101492665B

CN101492665B - 固相载体化的交联酶聚集体及其制备方法

Info

Publication number: CN101492665B
Application number: CN2008100565942A
Authority: CN
Inventors: 郭军; 伍宁丰; 张伟; 范云六; 田�健
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-01-22
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2028-01-22
Also published as: CN101492665A

Abstract

本发明公开了固定化的交联酶聚集体及其制备方法。该交联酶聚集体固定于多孔微球上，其制备方法包括：将需要固定的游离态酶分散于多孔微球中；在多孔微球内依次进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球，即得。本发明固定化酶的方法可用于固定各种类型或来源的酶，固定化方法简便易行，容易操作，无需特殊设备，生产成本低，所制备的交联酶聚集体稳定性高，抗胰蛋白酶能力强，具有一定的物理形态和稳定结构，可回收并反复使用，在工业化生产中能用于连续性生产。

Description

固相载体化的交联酶聚集体及其制备方法

技术领域

本发明涉及固定化酶，尤其涉及固定于固相载体上的交联酶聚集体及其制备方法，属于酶的固定化领域。

背景技术

从上个世纪60年代开始酶的固定化研究以来，人们从各个方面对酶的固定化技术进行探讨和研究，已经成功地运用了物理和化学的方法对酶进行了固定化，其中许多的技术和产品在工业生产中得到了应用。但固定的对象基本上都是游离酶，由于游离酶是对环境要求较高，比较脆弱的可溶性蛋白质，一般情况下，对热、强酸、强碱均不稳定。在常用的固定化方法中，由于较强烈的化学反应，通常对蛋白质的性质造成极大的影响，由于酶又具有一定的高级空间结构，极易受到表面活性剂、载体表面物理性状、化学接枝等因素的影响，对酶的空间结构或活性中心造成不可逆的破坏，使得酶活力下降、或失活，严重影响了固定化酶的效果和使用。

2002年荷兰Delft大学Sheldon小组提出用蛋白质沉淀剂沉淀酶蛋白，得到具有稳态结构的酶聚集体，再用戊二醛交联，制备了交联酶聚集体(Cross Linked EnzymeyAggregates，CLEAs)。对七种商业化的脂肪酶进行了聚集体交联，得到了具有较好酶活性的无载体固定化酶(P.Lopez-Serrano，L.Cao，F.van Rantwijk & R.A.Sheldon etal.Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity：application tolipases.Biotechnology letters，2002，24：1379-1383)。2003年董晓毅对脲酶进行了聚集体交联，获得了具有较好稳定性的交联脲酶聚集体(董晓毅、夏仕文交联脲酶聚集体的制备和初步应用[J].生物工程学报，2003，19(3)：332 336)。

聚集体交联酶(CLEAs)是继交联溶解酶(CLEs)、晶体交联酶(CLECs)后发展起来的一种固定化的酶，属于无载体固定化的范围。由于聚集体交联酶中酶分子处于稳态结构，所以形成的固定化酶具有热稳定性高，抗胰酶能力强等特点。但由于聚集体交联酶是无载体固定化，具有高度的分散性，所以丢失了固定化酶的最主要的特点：反应完毕后难于回收利用；没有一定的物理形态，在工业化生产中不能用于连续性生产。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服聚集体交联酶所存在的不能回收再利用的缺点，提供一种固定于载体上的交联酶聚集体，该交联酶聚集体除具有热稳定性高，抗胰酶能力强等优点外，还具有一定的物理形态和稳定结构，可以回收利用，能够连续应用于生产。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种固定于固相载体上的交联酶聚集体，其中，所述的固相载体是多孔微球。

所述的多孔微球可以由各种材质制成，例如，可以由有机材料(例如有机高分子多孔材料等)、无机材料(多孔玻璃、多孔陶瓷等)等材料制成；用所述的多孔微球作为交联酶聚集体的固相化载体，无需对其进行特殊处理，只要其主要孔隙大于待固定的蛋白质分子大小的1～2倍即可。优选的，本发明所述的多孔微球的平均孔径为10nm～300nm之间，更优选为30nm。

适用于本发明的可固定化酶的范围非常广泛，只要是能够被蛋白质沉淀剂沉淀的酶(或者说采用现有的聚集体交联技术可将其制备成聚集体交联酶，这类的酶都可适用于本发明)基本上均可作为本发明固定化酶的对象，例如，可以是有机磷降解酶、乳糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶等，优选为有机磷降解酶、乳糖酶。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述固定于固相载体上的交联酶聚集体的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备固定于固相载体上的交联酶聚集体的方法，包括酶蛋白的沉淀、交联，其特征在于：首先让需要固定的游离态酶分散于多孔微球中；再依次在多孔微球内进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球，即得。

优选的，所述的分散方法包括：将游离态酶溶于缓冲液中后加入多孔微球，缓慢搅拌，让游离态酶分散于多孔微球中；更优选的，将游离态酶溶于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为0.1-1.5mg/ml的酶溶液(更优选为配制成0.4-0.5mg/ml的酶溶液)，在4～25℃温度条件下缓慢搅拌1～3小时，让游离态酶分散于多孔微球中。

所述酶蛋白的沉淀、交联等方法与现有的制备交联酶聚集体时酶蛋白的沉淀、交联的方法相同；优选的，所述的酶蛋白的沉淀按照以下方法进行：加入的蛋白质沉淀剂在4～25℃的温度条件下缓慢搅拌3～5小时；所加入的蛋白质沉淀剂包括但不限于：硫酸铵、叔丁醇或乙醇等；所加入的浓度范围在33％～80％(v/v)。

所述的交联优选按照以下方法进行：加入双功能交联剂在4～25℃温度条件下缓慢搅拌15～24小时；所加入的双功能交联剂包括但不限于：戊二醛、苯基二异硫氰或双重氮联苯胺-2等；所加入的浓度范围在0.1％～2.5％(v/v)之间。

刚性的多孔微球由于自身材料的特性，具有良好的化学稳定性和一定的机械强度。本发明合理利用多孔微球的孔隙特性，使聚集体交联酶在形成的过程中固定于载体的孔隙中，不规则的孔隙使形成的稳态固体酶保留在载体中，达到了固定化酶的目的，而小于蛋白质分子的孔隙就成为化学反应体系中底物、产物的传质和对流的通道。

本发明解决了聚集体交联酶所存在的不能回收再利用的缺点，赋予了聚集体交联酶一定的物理形态和稳定结构，又保留了聚集体交联酶的优点，适应于工业化批次和连续化生产，开拓了聚集体交联酶工业化应用的前景。

本发明固定化酶方法简单，简便易行，反应条件易于最佳化，无需特殊设备。本发明方法所制备的固定化酶稳定性高，抗胰蛋白酶能力强，可反复使用，可填充各种形状的装置，具有较高的液体流速，易于在工业化生产中使用。

附图说明

图1对硝基酚标准曲线；

图2邻硝基酚(ONP)标准曲线；

图3固定化的交联有机磷降解酶聚集体和液体有机磷降解酶的热稳定性比较；

图4固定化的交联有机磷降解酶聚集体的牢固度测试(振荡摇床的转速为200转/分)；

图5固定化的交联有机磷降解酶聚集体批次法连续反应测试；

图6固定化的交联乳糖酶聚集体的牢固度测试(振荡摇床的转速为200转/分)；

图7固定化的交联乳糖酶聚集体批次法连续反应测试。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 固定化的交联有机磷降解酶聚集体的制备

称取有机磷降解酶溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成蛋白浓度为0.4mg/ml的酶溶液，加入多孔微球(聚苯乙烯型非极性吸附树脂，型号为ADS-5；平均孔径为30nm，粒径大于100μm；性能：对蛋白质、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附；在热、酸、碱、有机溶剂等条件下均有很高的稳定性。天津南开和成科技有限公式生产)，在4℃下缓慢搅拌3小时；再加入硫酸铵至饱和度为67.5％，在4℃下缓慢搅拌5小时；加入戊二醛(25％)溶液至最终浓度为2.2％，在4℃下缓慢搅拌18小时；过滤取出多孔微球，反复漂洗至溶液澄清。

实施例2

称取乳糖酶溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成蛋白浓度为0.5mg/ml的酶溶液，加入多孔微球(聚苯乙烯型非极性吸附树脂，型号为ADS-5。平均孔径为30nm，粒径大于100μm；性能：对蛋白质、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附；在热、酸、碱、有机溶剂等条件下均有很高的稳定性。天津南开和成科技有限公式生产)，在4℃下缓慢搅拌3小时。加入硫酸铵至饱和度为67.5％，在4℃下缓慢搅拌5小时。加入戊二醛(25％)溶液至最终浓度为2.2％，4℃下缓慢搅拌18小时。过滤取出多孔微球，反复漂洗至溶液澄清。

试验例1 本发明固定化的交联酶聚集体的性能测试

一、试验材料

受试样品1：实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体；

受试样品2：实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体；

二、测试项目

1.有机磷降解酶酶活测定方法

对硝基酚标准曲线的绘制：

取0.08346g对硝基酚，先用少量95％乙醇溶解，然后用水定容至100mL(6mmol/L)。在试管中分别加入0、2.5、5、7.5、10、15、20、30、40、50μL的对硝基酚溶液和1000、997.5、995、992.5、990、985、980、970、960、950μL的50mmol/LTris-Cl(pH8.0)缓冲液，总体积为1mL，然后每管加入1mL10％三氯乙酸，再加入1mL10％Na₂CO₃溶液，总体积为3mL，410nm测定光吸收值。同时，绘制对硝基酚标准曲线(图1)。

游离酶和实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体的活力测定：

游离酶的测定：在试管中加入5μL(10mg/mL)甲基对硫磷溶液，pH8.0、900μL(50mmol/L)Tris-HCl缓冲液和100μL经适度稀释的酶液，37℃保温10分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃溶液显色，410nm测定光吸收值。按照下述公式计算酶活力：

N为酶液的稀释倍数；

一个酶活性单位(U)定义为：在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需的酶量。

固定化酶的测定：在试管中加入5μL(10mg/mL)甲基对硫磷溶液，pH8.0、995μL(50mmol/L)Tris-HCl缓冲液和60mg的受试样品1,37℃保温10分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃溶液显色，410nm测定光吸收值。按照上述公式计算酶活力。

2.乳糖酶酶活测定方法

邻硝基酚(ONP)标准曲线的绘制：

称取0.25g ONP溶解、定容于100ml 0.1M HAc-NaAc缓冲液中。在试管中分别加入0、50、100、150、200、250、300μL的ONPG溶液和1000、950、900、850、800、750、700μL的0.1mmol/L HAc-NaAc(pH5.2)缓冲液，总体积为1mL，然后每管加入1mL10％三氯乙酸，再加入2mL 1M Na₂CO₃溶液，总体积为4mL，420nm测定光吸收值。同时，绘制邻硝基酚(ONP)标准曲线(图2)。

游离酶和实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体的活力测定

游离酶的测定：在试管中加入800μL的0.25％邻硝基酚-β-D半乳糖苷(ONPG)，将加入以上底物的试管放入60℃水域中预热2min，加入200μL的经适度稀释的酶液，60℃保温15分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入2mL1M Na₂CO₃溶液显色，420nm测定光吸收值。按照下述公式计算酶活力：

N为酶液的稀释倍数

一个酶活性单位(U/ml)定义为：在60℃，每分钟分解邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷(ONPG)生成1μmol邻硝基酚ONP所需的酶量。

固定化酶的测定：在试管中加入1000μL的0.2％ONPG溶液和10mg的受试样品1,60℃保温15分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入2mL 1M Na₂CO₃溶液显色，420nm测定光吸收值。

3.热稳定性试验

分别取适量的有机磷降解酶液体酶和实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体，在70度水浴中分别保温0、30、60、90、120、150、180、210分钟后，按照酶活力测定方法测定酶活。

4.牢固度试验

在三角瓶中分别加入10克实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体、实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体，以及200ml pH7.5的磷酸缓冲液，置于37℃摇床中，转速为200r.p.m。振荡2小时后，取出约0.5克固定化多孔微球，置4℃备用。抽干三角瓶的缓冲液，加入新的缓冲液，再次振荡2小时，重复上述步骤取样。固定化酶在摇床中共连续振荡14小时。振荡结束后，按照上述测定酶活的方法分别测定酶活。

5.连续反应批次试验

(1)实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体的测定：

在7毫升西林瓶中加入60毫克实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体，995μL(50mmol/L，pH8.0)Tris-HCl缓冲液，5μL(10mg/mL)甲基对硫磷溶液，37℃保温10分钟。反应结束后，小心的吸出反应液，置于试管中，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃溶液显色，410nm测定光吸收值。

在保留有固定化酶的西林瓶中再加入995μL(50mmol/L，pH8.0)Tris-HCl缓冲液，5μL(10mg/mL)甲基对硫磷溶液，进行新一轮的反应，共重复反应50次。

(2)实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体的测定：

在7毫升西林瓶中加入10毫克实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体，加入1000μL的0.2％ONPG溶液，60℃保温15分钟。反应结束后，小心的吸出反应液，置于试管中，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入2mL 1M Na₂CO₃溶液显色，420nm测定光吸收值。

在保留有固定化酶的西林瓶中再加入1000μL的0.2％ONPG溶液，进行新一轮的反应，共重复反应40次。

三、测试结果

1、热稳定性试验

分别测定本实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体与有机磷降解酶的液体酶的热稳定性，测定结果表明，本实施例所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体的热稳定性高，要远远优于有机磷降解酶的液体酶的热稳定性(图3)。

2、牢固度试验

采用振荡摇床(振荡摇床的转速为200转/分)分别测定了受试样品1和受试样品2的固定化酶的牢固度，测定结果说明，本发明所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体和交联乳糖酶聚集体牢固度好(图4、图6)。

3、连续反应测试

通过批次法连续反应测试，表明受试样品1和受试样品2可反复使用，适应于工业化批次和连续化生产(图5、图7)。

Claims

1.一种交联酶聚集体，其特征在于：所述交联酶聚集体固定于多孔微球载体上；其制备方法包括：首先将游离态酶溶于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为0.1～1.5mg/ml的酶溶液，加入多孔微球载体，在4～25℃温度条件下缓慢搅拌1～3小时，让游离态酶分散于多孔微球载体中；再依次在多孔微球载体内进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球载体，即得；

其中，所述的游离态酶选自有机磷降解酶或乳糖酶；所述多孔微球载体是聚苯乙烯型非极性吸附树脂，型号为ADS-5，平均孔径为30nm，粒径大于100μm；所述的沉淀方法为：加入硫酸铵至饱和度为67.5％，在4℃下缓慢搅拌5小时；所述的交联方法为：加入25％的戊二醛溶液至最终浓度为2.2％，在4℃下缓慢搅拌18小时。