CN101485882A - 一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂，尤其是涉及含有假丝酵母尿酸氧化酶的液体或冻干的组合物药用制剂。本发明的组合物包括活性成分假丝酵母尿酸氧化酶、甘氨酸、半胱氨酸和缓冲体系；该组合物是无菌的，可以通过皮下、静脉或肌肉注射进入人体或动物体内发挥作用。

Description

一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂

技术领域

本发明涉及一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂，尤其是涉及含有假丝酵母尿酸氧化酶的液体或冻干的组合物药用制剂。

背景技术

假丝酵母尿酸氧化酶UOX全长303个氨基酸，分子量为34.19kDa，理论等电点为8.4。尿酸氧化酶(UOX)是嘌呤代谢途径上的关键酶之一。不同种类的生物分解嘌呤碱的能力不一样，因而代谢产物亦各不相同。人和猿类及一些排尿酸的动物以尿酸作为嘌呤碱代谢的终产物。假丝酵母和大鼠等多种生物则能产生尿酸氧化酶，该酶进一步分解尿酸，形成尿囊素。后者在水中的溶解度远大于尿酸，从而有利于大鼠等哺乳动物清除体内尿酸。在长期的进化过程中，人类的尿酸氧化酶基因发生突变，不能正常编码尿酸氧化酶，因此当体内尿酸水平增加时容易引起以血液尿酸水平增高为特征的痛风或者尿酸性肾病。在临床上，由于UOX能够有效地分解尿酸，降低血液尿酸浓度，因此可以用来治疗高尿酸症。

为了使假丝酵母尿酸氧化酶作用于人体或动物，必须将其配制成一定的药用制剂形式以供临床使用，并且这种制剂能够保证尿酸氧化酶在长期的保存过程中物理化学性质的稳定和生物学活性稳定。与众多蛋白质药物一样，将假丝酵母尿酸氧化酶做成制剂需要考虑多方面因素，以保证制品的质量、工艺可行性、经济可行性以及法规可行性等。溶解性是许多蛋白质药用制剂需要考虑的因素之一，如何选用经济、可靠、有效的增溶剂或制备工艺对于制备出合格的制剂很重要。

法国Sanofi公司开发了高尿酸血症治疗药物“拉布力酶”，它是一种重组黄曲霉菌尿酸氧化酶冻干粉针剂，在2001年6月在德国和英国首次上市，但其产品价格较为昂贵。Sanofi公司于1996年在中国申请了发明专利并已获得授权，专利名称为“含有尿酸氧化酶的稳定液体组合物及用于制备该液体组合物的冻干组合物”，专利号为96110721.9，其专利中描述的药物组合物突出特点是含有助乳化剂、分散剂poloxamer 188，以此来维持药物的溶解性。美国有5种不同规格的泊洛沙姆(124，188，237，338，407)，只有泊洛沙姆188作为静脉注射剂的乳化剂使用，其它规格的泊洛沙姆均用于口服或外用制剂中。世界范围内，泊洛沙姆还缺乏足够的临床使用，以验证其可靠性。目前泊洛沙姆辅料尚未进口我国，即我国目前尚无注射规格的泊洛沙姆上市，我国尚未认可该辅料。因此，国内蛋白质制剂不能使用该药物作为辅料。

另外，不同分子的尿酸氧化酶具有不同的一级和二级结构，其分子稳定性和性质相差较大，某一制剂处方对不同结构的蛋白质无通用价值。假丝酵母尿酸氧化酶含有多个半胱氨酸，其分子内和分子间错配在制剂研究中也值得关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂，采用特定的的处方组成，能够保持药物稳定性和活性，降低成本。

本发明中所述的活性成分假丝酵母尿酸氧化酶可通过基因重组获得，制备方法可以参考中国专利031091504。根据生物制品制剂工艺及其处方的基本标准以及我公司已上市产品的赋型经验和UOX的分子特性，分别从外观、澄明度、生物活性等要求方面入手，以下处方配置方面入手摸索制剂工艺处方：

1.考察的赋型剂：甘露醇、蔗糖、甘氨酸。

2.考察的活性保护剂：丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸。

3.考察的助溶剂：吐温、甘油、聚氧乙烯蓖麻油、SDS等。

4.考察的缓冲体系：Tris-HCL(pH7.5、8.0、8.5和9.0)

                  50mM PB缓冲液(pH7.0、7.5、和8.0)

                  硼酸(pH7.0、7.5、8.0、8.5)。

在辅料的选用上，我们放弃了目前在中国尚未被接受的poloxamer 188，与已知文献差别显而易见。

上述添加剂不同比例进行处方组成并冻干，冻干后按顺序依次检测如下指标：外观、用注射用水溶解后澄明度、生物活性(采用体外尿酸氧化法，具体参考已经上市药品拉布力酶的活性测定方法)、水分等指标。

通过实验研究，比较了大量的不同辅料组合，本发明最终提供了一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂的理想组合，组合物包括活性成分假丝酵母尿酸氧化酶、甘露醇、保护剂和缓冲剂。

筛选路线如下：

缓冲体系一

常用的PB作为缓冲溶液，终浓度为50mM，选pH7.0、7.5、8.0(注：pH8.0已接近PB缓冲能力上限，国外同类产品Rasburicase选用缓冲体系为pH8.0，40mM PB)，赋型剂分别选用甘露醇、蔗糖、甘氨酸，各自用量分别为2％，5％，7％，各分装20支，共9组180支，进行正交试验(见表一)。

表一 50mM PB缓冲液，UOX 1.8mg/ml/支

由试验结果可见，缓冲体系pH为7.0，7.5时溶解后澄明度太差，均浑浊，达不到要求。pH8.0时甘露醇，蔗糖为赋型剂的样品用生理盐水溶解后看不见明显的浑浊，但在伞棚灯下可见乳光，同样达不到要求，而且各赋型剂终浓度为2％时外观赋性较差，甚至出现萎缩，外形不完整。试验发现没有合乎要求的配方。

缓冲体系二

选择硼酸。试验设计硼酸终浓度为50mM，pH为7.0、7.5、8.0，根据试验一，甘露醇终浓度可选择5％、7％，在不影响赋型基础上，选择较低量5％。

表二 50mM硼酸缓冲液，UOX 1.8mg/ml/支

 

pH值	甘露醇5％	澄明度	生物活性	水分
					7.0	块状疏松固体，外观良好	合格，符合药典标准	基本测不到活性	<3％

 

7.5	块状疏松固体，外观良好	合格，符合药典标准	基本测不到活性	<3％
					8.0	块状疏松固体，外观良好	合格，符合药典标准	基本测不到活性	<3％
8.5	块状疏松固体，外观良好	合格，符合药典标准	基本测不到活性	<3％

由表二可见，硼酸为缓冲液，外观及溶解后均较理想，但活性基本为零，测定溶解后蛋白pH值发现已降至4.0左右，分别测硼酸溶液、甘露醇溶液、蛋白溶液，及配制成的半成品pH值，发现半成品pH值也已降至4.0，而硼酸溶液、甘露醇溶液、蛋白溶液pH值无变化，将硼酸溶液与甘露醇混合后发现pH降为4.0，可见二者发生反应导致pH降低进而使酶失活。因而放弃使用硼酸作缓冲液。

缓冲体系三

选择较高pH值缓冲液，可选的有Tris-HCL，Gly—Na0H，由于纯化过程选用的是Tris-HCL，因而成品冻干选用同类缓冲液较为合适。选择pH7.5、8.0、8.5、9.0，终浓度50mM，5％甘露醇，试验结果见表三。

表三 50mM Tris-HCL缓冲液，5％甘露醇，UOX(终浓度1.8mg/ml)

 

pH值	外观	澄明度	生物活性	水分
					7.5	镂空，不饱满	浑浊	71％	<3％
8.0	块状疏松固体，轻敲无碎屑	混浊	73％	<3％
					8.5	萎缩，无固定形状	难溶	52％	<3％
9.0	块状疏松固体，轻敲无碎屑	溶解后灯检有乳光	71％	<3％

可见pH8.0、9.0时外观良好，但澄明度均达不到要求，且活性下降较明显。最终确定缓冲体系为，pH9.0。

制剂处方中保护剂的选择

为保护活性、使溶解后澄明度达到要求，加入甘氨酸，甘氨酸为疏水性氨基酸，有利于疏水性蛋白溶解，提高澄明度。

表四.按表二pH9.0配方加入甘氨酸

 

	活性U/瓶(均值)	活性保留率
			冻干前	15.86
加50mM甘氨酸冻干后	15.37	97％
			不加甘氨酸冻干后	11.25	71％

由表四可见，甘氨酸在冻干过程中对UOX活性有保护作用，但加入甘氨酸后，溶解后澄明度仍然达不到标准。

为保护UOX蛋白分子，防止其在冻干过程中聚合或氧化，需加入另一种保护剂，选择加入SDS，Arg，L-Cys，Glu。其中SDS已禁止用于静脉注射液，本试验只作为对照研究，Arg为碱性氨基酸，Glu为酸性氨基酸，可用来调节pH值，L-Cys具有抗氧化作用，可防止二硫键错配。试验结果见表五。

表五.向1.8mgUOX，50mM Tris—gly，5％甘露醇加入保护剂后冻干情况

由表五可见精氨酸和谷氨酸的加入并未改善制剂溶解后的澄明度问题，仍然有乳光；SDS可使活性明显下降，这可能与SDS使UOX链松散变性有关；随着半胱氨酸加入量升高，活性升高，溶解度提高。

为确定半胱氨酸的加入量，分别加入5、10、20、40mM L-Cys，冻干后检测，结果见表六；

表六.半胱氨酸加入量优选

 

序号	1	2	3	4
					L—Cys(mM)	5	10	20	40
活性(U/ml)	15.5	26.1	26.22	27.5
					外观	良好	良好	良好	良好
澄明度	合格	合格	合格	合格

结果发现加入10、20、40mM L-Cys外观及澄明度均合格，随着L-Cys量加大，活性并无明显差异，因而选择制剂成品中半胱氨酸的终浓度为10mM。

本发明所述的药用制剂处方最终确定的每支组分组成是：

重组假丝酵母尿酸氧化酶：          1-3.6mg/ml

缓冲体系：         Tris-Gly       10-80mM/l

                                  pH 7.5-10

赋型剂：           甘露醇         1-7％

保护剂：                 L—Cys     5-40mM/l

本发明所述的药用制剂，是一种稳定的液体或冻干组合物。组合物组分中，保护剂选用半胱氨酸，缓冲体系选用Tris-Gly，用于调节pH值。

本发明所述的药用制剂处方最为优选的每支组分组成是：

重组假丝酵母尿酸氧化酶：           1.8mg/ml

缓冲体系：     Tris-Gly            50mM/L

                                   pH 9

赋型剂：       甘露醇              5％

保护剂：       L—Cys              10mM/L

对比试验结果可以发现：Tris-HCL作缓冲体系，加入甘氨酸作保护剂，加入半胱氨酸可防止蛋白聚合导致的冻干后澄明度下降，半胱氨酸加入量选10mM即可，加大量并未起到更明显效果，甘露醇终浓度选用5％，该配方生物活性稳定，澄明度、水分达到要求。

本发明通过将各组份溶于注射用水或将冻干物溶于注射用水获得药物溶液，含假丝酵母尿酸氧化酶的药物溶液通过冻干获得稳定的冻干制剂。该组合物是无菌的，可以通过皮下、静脉或肌肉注射进入人体或动物体内发挥作用。

由于采用了上述技术方案，本发明提供了一种不同于现有技术的方法，筛选到一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的稳定的药用制剂，不仅可以达到临床使用的要求，而且可以使广大患者从中受益、减少医疗费用开支。

具体实施方式

通过以下实施例来对本发明的假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂做进一步具体说明，但不仅限于以下实例。

实施例1  稳定的假丝酵母尿酸氧化酶溶液的制备

原液制备：按照中国专利031091504方法制备的重组假丝酵母尿酸氧化酶，经超滤置换到下述缓冲液：甘氨酸100mM/L、Tris—HCl(pH9.0/100mM/L)、L-Cys(20mM/L)，制备成重组假丝酵母尿酸氧化酶浓度为3.6mg/ml的原液；

配液：取该原液500ml，加入25％甘露醇200ml，加入注射用水定容至1000ml；

过滤除菌：采用0.22微米的滤膜过滤；

分装：采用西林瓶分装成每支1ml的制剂；

冻干：冷冻干燥，制成最终制剂。

Claims (9)

1、一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的药用制剂，其特征在于该制剂包括活性成分假丝酵母尿酸氧化酶、赋型剂、保护剂和缓冲体系。

2、根据权利要求1所述的药用制剂，该组合物中赋型剂选用1-7％的甘露醇。

3、根据权利要求1所述的药用制剂，该组合物中保护剂选用5-40mM/L的L-半胱氨酸。

4、根据权利要求1所述的药用制剂，该组合物中缓冲体系选择pH值为7.5-9、浓度为10-50mM/L的Tris-Gly。

5、根据权利要求1所述的药用制剂，其中所述的活性成分假丝酵母尿酸氧化酶为基因重组物。

6、根据权利要求1所述的药用制剂，是一种液体组合物。

7、根据权利要求1所述的药用制剂，是一种冻干组合物。

8、根据权利要求1至7中任一项所述的药用制剂，该组合物组分组成是：

重组假丝酵母尿酸氧化酶：1-3.6mg/ml；

Tris-Gly：pH 7.5-10，10-80mM/L；

甘露醇：     1-7％；

L—半胱氨酸：5-40mM/L。

9、根据权利要求1至8中任一项所述的药用制剂，该组合物组分组成是：

重组假丝酵母尿酸氧化酶：1.8mg/ml；

Tris-Gly：pH 9，   50mM/L；

甘露醇：           5％；

L—半胱氨酸：      10mM/L。