CN101480391B

CN101480391B - 槐果碱在制备治疗由柯萨奇a病毒所引起疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN101480391B
Application number: CN 200810032514
Authority: CN
Inventors: 陈曙霞
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2008-01-10
Filing date: 2008-01-10
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2028-01-10
Also published as: CN101480391A

Abstract

本发明公开了槐果碱或其可药用盐在制备治疗由柯萨奇A病毒(Coxsaickie Virus A)所致心肌炎或脑膜炎的药物中的应用。槐果碱或其可药用盐能有效阻止柯萨奇A病毒的生物合成，并进入细胞内发挥抗病毒作用，可提高治疗愈率，减少死亡率。而且没有明显的细胞毒性作用，槐果碱药源丰富，且制备简便，成本低廉，适用于工业化生产。

Description

槐果碱在制备治疗由柯萨奇A病毒所引起疾病的药物中的应用

技术领域：

本发明涉及医药领域，尤其涉及槐果碱或其可药用盐的应用，特别是一种槐果碱在制备治疗由柯萨奇A病毒所引起心肌炎或脑膜炎的药物中的应用。

背景技术：

近年来病毒性心肌炎明显增多，主要由肠道病毒引起。肠道病毒主要为地区性或散点流行，家庭接触方法传染为主。肠道病毒对易感人群是高度的传染性，儿童是最敏感的人群，在包括咽部在内的消化道上皮细胞和淋巴组织内繁殖。在缺乏免疫力的儿童或成人中，病毒进一步扩散到血液循环，引起病毒血症。此时病人出现发热，这时病毒一方面进入全身网状内皮细胞和淋巴组织继续繁殖，也可侵入敏感的器官或组织如脊髓、脑、脑膜、心肌和皮肤等引起特殊的临床表现。

许多病毒可引起心肌炎，有认为有24种以上肠道病毒(如柯萨奇病毒(Coxsackic virus)、埃可病毒(Echo VIRUS)、脊髓灰质炎病毒(由于灰髓炎病毒的疫苗，未见有发病)。柯萨奇病毒分为二组，柯萨奇B病毒，有CVB_1-6型其中CVB_1-5均可致病，尤其是CVB_2-4型为病毒性心肌炎的主要病因。但柯萨奇A病毒引起病毒性心肌炎者亦为数不少。柯萨奇A病毒(CVB_1-24型，其中CVB_{4、7、9、10、23}易致病，尤其是7型、9型，容易引起心肌炎、肺炎及脑膜炎。埃可病毒亦为肠道病毒同样可引起病毒心肌炎。且目前为止尚未有效抗COXB、COXA及Echo病毒的药物。为寻找对抗COXB、COXA及Echo病毒的有效药物，我们通过实验从众多的中药中仅筛选出一味苦参。苦参中的有效成分槐果碱-Sophocarpine它低毒而有明显对抗COXB、COX_A及Echo病毒的作用。苦参是我国历史悠久的传统药物之一，始创于我国最早的医药文献《神农本草经》，具有清热燥湿、祛风杀虫的功效。主治心腹痞满胀气、症瘕积聚、黄疸等。我国药典1997年版及部分地方药品标准已将《苦参草流浸片》收载主治菌痢及肠炎《中草药(中册)》，1976年8月第一版(494~495)。晚近的动物实验证明，苦参生物碱对中枢神经有抑制、镇痛及降湿作用，能提高机体免疫力，并有抗癌作用。苦参提取物生物碱能治疗乙肝，改善临床症状及肝功能，使部分患者HBeAg转阴的效果。有文献记载苦参生物碱具有平喘及抗心律失常的作用。苦参中的有效成分槐果碱(Sophocarpine)它低毒而有明显对抗COXB、COXA及埃可病毒的作用。关于槐果碱对抗COXB病毒及其药物制备已公布在本人的一项已授权专利99119850.6中。此外，本申请的发明人也发现了槐果碱对抗冠状病毒(SARSvirus)相关技术内容在另一项已授权专利03151269.0中。本申请的发明人还发现槐果碱能对抗埃可病毒(Echo virus)腺病毒(Adeco-virus)以及流感乙型病毒(influenza virus B)，它既能对抗RNA病毒，又能对抗DNA病毒，因此它是一种广谱抗病毒药物，相关技术内容在本申请人的另一项专利申请200410089431.6有所揭示(已公开)。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种槐果碱在制备治疗由柯萨奇A病毒所引起疾病的药物中的应用，所述的这种槐果碱或其可药用盐要解决现有技术中没有有效的药物治疗柯萨奇A病毒所引起心肌炎或脑膜炎的技术问题。

本发明提供了槐果碱或其可药用盐在制备治疗由柯萨奇A病毒所引起的心肌炎或脑膜炎的药物中的应用，其中，所述的槐果碱的结构式为(I)

进一步的，所述的槐果碱的可药用盐为槐果碱的溴酸盐、或者槐果碱的盐酸盐或者槐果碱的氟酸盐。

进一步的，所述的槐果碱或其可药用盐的药物的剂型为所述的药物剂型为医学上认可的任何一种剂型。

进一步的，所述的槐果碱或其可药用盐的药物剂型为粉剂、或者注射液、或者胶囊、或者片剂、或者口服液。

本发明的槐果碱的制备方法包括如下步骤：

(1)将苦豆子粉碎，加入5％～10％的氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，加入7％～15％硫酸萃取，获得总生物碱。

(2)总生物碱通过甲苯萃取，然后加入5％～10％的盐酸提取槐果碱。

(3)调节PH5～10，抽滤，再以丙酮重结晶，获得槐果碱精品

(4)将槐果碱精品溶解于注射水中，过滤，含量测定，调节PH4～4.5。

(5)通过0.65微孔滤膜灌装封口。经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得针剂。

本发明所述的槐果碱能有效阻止柯萨奇A病毒的生物合成(包括蛋白质合成)并进入细胞内发挥抗病毒作用。

由于病毒性心肌炎发生后在心肌活检中不易分离出任何病毒，特异性抗原亦难发现，以往病毒性心肌炎病因主要依赖血清学检查，如特异性中和抗体及IgM。但由于抗体可随时间推移而降低、消失。因而急性期后血清学检测的敏感性及特异性降低，近年来由于采用了原位杂交及聚合酶链反应(Polymersae Chain Reaction-PCR)等检测心内膜心肌活检及尸体中的病毒基因，发现COXA病毒并不少见，而肯定了COXA病毒亦为病毒性心肌炎的病原之一。

COXA组病毒(coxsaicki A-virus)分24型，其中7型、9型易引起病毒性心肌炎、心包炎及病毒性脑膜炎等病变。是婴幼儿病毒性心肌炎和脑炎的重要病因。CVA₂₃型可致成人暴发性心肌炎(有时与流感病毒双重感染)，引起阵发性房性心动过速、房朴、房颤、频发室性早博、房室传导阻滞等严重心律失常甚或猝死，急性心力衰竭及收缩心功能不全。COXA组病毒可以引起脑膜炎(一般称无菌性脑膜炎)起病为中等度发热，有时类似感冒症状，常伴有头痛、恶心、呕吐，偶而有肌肉酸痛，重者出现颈背强直，脑脊液细胞数增加及蛋白质增高。如在夏季有时与流行性乙型脑炎病例不易鉴别。用PCR法可在脑脊液中查到COXA病毒基因，或分离病毒。上海在1964年曾从无菌性脑膜炎的脑脊液中分离到COXA₉，1960～1970年随访期也从无菌性脑膜炎的脑脊液中分离到COXA₉、COXB₄病毒等。

为此，我们对槐果碱对抗COXA病毒的作用进一步作了研究。观察了槐果碱在Hela细胞上抗COXA₉的作用，观察了结晶紫活性细胞染色法测定不同浓度的槐果碱对感染COXA₉的Hela细胞存活率的保护作用，还观察了四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定槐果碱对感染COXA₉病毒的Hela细胞能量代谢的保护作用。都发现槐果碱有明显对抗COXA₉病毒的作用以及对感染细胞的保护作用。

通过COXA₉病毒感染的Balb/c小鼠的病毒血症模型、心肌炎模型及脑炎模型，观察槐果碱在体内对COXA₉病毒的对抗作用。结果发现它对COXA₉病毒的增殖抑制作用达99％，并能明显减轻心肌炎及脑的组织病理的变化，有明显的治疗作用。

本发明和已有的技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的槐果碱或其可药用盐能有效阻止柯萨奇A病毒的生物合成，并进入细胞内发挥抗病毒作用，可提高治疗愈率，减少死亡率。而且没有明显的细胞毒性作用，槐果碱药源丰富，且制备简便，成本低廉，适用于工业化生产。

附图说明：

图1是COXA9病毒所致Balb/c小鼠病毒性心肌炎的照片，可见心外膜大片心肌及心肌层炎症病变。

图2显示了槐果碱治疗组(10mg/kg)心外膜炎症明显减轻，心肌层少量炎性灶。

图3显示了槐果碱治疗组(20mg/kg)心外膜心肌及心肌层未见明显炎症。

图4是COXA9病毒所致Balb/c小鼠的脑室膜炎的照片。

图5显示了槐果碱治疗组(10mg/kg)脑室膜炎病变减轻。

图6显示了槐果碱治疗组(20mg/kg)未见脑室膜炎。

具体实施方式：

实施例1

槐果碱的制备方法包括如下步骤：

(3)调节PH5～10，抽滤，再以丙酮重结晶，获得槐果碱精品

实施例2 槐果碱体外抗COXA9病毒的试验

毒种制备：COXA₉病毒株，由中国科学院昆明医学生物研究所赵树栋提供。取培养第四天已长成单层的Hela细胞，用无小牛血清的RPMI-1640培养基洗二次，每瓶细胞接种0.3ml10^-2TCID COX A₉病毒37℃吸附1小时，倾去上清液，加入10ml无小牛血清RPIM-1640培养基，37°5％CO₂孵育培养，待细胞完全病变后，取出细胞并反复冻融6次，。收集作为新的接种物进行传代。如此连续传代4～5次后，将最后一次冻融物收集置-30℃储存备用。

微量细胞培养法测定病毒滴度：将病毒冻融液用无小牛血清RPIM-1640培养基作连续10倍稀释。从10^-1～10^-8共8个稀释度，在40孔微量测定板上，每个稀释度作4个复孔，每孔滴入量为25μl，然后每孔再补充25μl无小牛血清RPIM-1640培养基，最后加入浓度为3×10⁵/ml的Hela细胞悬液，每孔50μl(培养基中小牛血清为4％)同时作正常细胞对照，将板置37℃，含5％CO2孵育箱培养，第四天判读结果。以病毒最高稀释度出现50％以上细胞病变为滴度终点。

微量细胞培养法测定COXA₉病毒滴度

病毒稀释度

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-6

10^-7

10^-8

细胞对照

细胞病变孔/总细胞孔数

4/4

3/4

1/4

0/4

按Reed-Muench公式计算，病毒滴度为10^-6.5TCID⁵⁰(Tissue culture infections dose)。

实施例3 槐果碱对Hela细胞的毒性试验

槐果碱为100mg/ml(上海交通大学医学院附属仁济医院提供禾丰制药厂制作)以无小牛血清RPIM-1640培养液稀释至1％的药液浓度(10000μg/ml为母液，无菌低温保存。

将浓度为1％槐果碱注射液用无小牛血清RPIM-1640培养液稀释成不同浓度(从1∶2起连续倍比稀释至1∶1024)分别加孔，每个稀释度为4个复孔(并设正常对照)培养4天，每日观察细胞毒性，计算半数中毒剂量(TD₅₀)和最大无毒剂量(TD₀)。

槐果碱对Hela细胞的毒性

槐果碱稀释度

1∶2

1∶4

1∶8

1∶16

1∶32

1∶64

1∶128

1”256

1∶512

1∶1024

细胞病变

+

±

-

注：当槐果碱稀释至1∶8以下时，即浓度在312μg/ml以下时，对Hela细胞无毒性。

TD₅₀为624μg/ml，TD₀为312μg/ml。

实施例4 槐果碱注射液在Hela细胞上对抗COXA₉病毒的作用

(一)微量法测定槐果碱在Hela细胞上抗COXA₉病毒试验

槐果碱在Hela细胞上抗COXA₉病毒的作用(COXA₉病毒浓度为100TCID₅₀)

槐果碱稀释度

1∶8

1∶16

1∶32

1∶64

1∶128

1∶256

1∶512

1∶1024

细胞病变

-

±

+

注：当剂量1；8即312μg/ml以下的槐果碱注射液时均有明显的抗COXA₉病毒的作用，直至1∶512(即5μg/ml)时仍有抗COXA₉病毒的作用。

实施例5 槐果碱对COXA₉病毒感染Hela细胞的的能量及存活率的保护作用测定

MTT微量检测法(四甲基偶氮唑盐)测定槐果碱对COXA₉病毒对感染Hela细胞能量代谢的保护作用。

结晶紫染色法(crystal violet)：测定槐果碱对COXA₉病毒对感染Hela细胞存活率的保护作用。

测定槐果碱对感染COXA₉病毒的Hela细胞的能量代谢和存活率的保护作用，要求对COXA₉病毒的浓度进行模索。

取培养第4天的Hela细胞制成悬液，弃培养液，用无小牛血清RPIM-1640培养液冼两次，以感染复数为5的COXA₉病毒悬液37℃吸咐2次弃病毒液，再以无小牛血清RPIM-1640培养液冼两次，然后分别加入槐果碱100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563μl/ml的小牛血清RPIM-1640培养液200μl，设药物对照组(槐果碱200μl/ml)、病毒对照组、细胞对照组，37°5％CO₂孵育15小时。

COXA₉病毒浓度的模索

方法

COXA₉病毒-感染复数

0

2

2.5

4

5

10

20

MTT比色法(D570nm)

0.495±0.026

0.431±0.067

0.400±0.433

0.387±0.058

0.370±0.044

0.340±0.035

0.334±0.026

结晶紫染色(OD600nm)

1.580±0.091

1.464±0.12

0.448±0.244

1.309±0.065

1.290±0.140

1.252±0.133

1.125±0.122

注：不同病毒感染复数下测定值的变化，二种不同方法结果如表。结果表明，随病毒浓度的升高，MTT法测得的细胞代谢率越低，两者呈负相关(r＝-0.805)，结晶紫染色法测得细胞存活率亦越低，两者亦呈直线负相关(r＝-0.883)。

根据以上模索的结果，选定COXA₉病毒感染复数为5时(MOI＝5)测槐果碱注射液对COXA₉病毒感染的Hela细胞保护作用为确当。

槐果碱对COXA₉病毒感染的Hela细胞的保护作用

槐果碱浓度	COXA₉病毒感染复数为5时(MOI：5)
			MTT比色法(D570nm)	结晶紫染色法(OD600nm)
	100(μg/ml)	0.498±0.018			2.083±0.42
50(μg/ml)			0.489±0.02	1.801±0.148
	25(μg/ml)	0.483±0.045			1.707±0.148
12.5(μg/ml)			0.473±0.041	1.600±0.173
	6.25(μg/ml)	0.428±0.026			1.57±0.115
3.125(μg/ml)			0.401±0.022	1.514±0.203
	1.563(μg/ml)	0.398±0.054			1.500±0.101
细胞对照			0.518±0.026	2.193±0.282
	病毒对照	0.351±0.012			1.134±0.060
药物对照			0.500±0.033	2.000±0.163

上表所示：：当COXA₉病毒感染复数为5时，槐果碱在1.563～100μg/ml之间均对Hela细胞有保护作用。能量合成代谢、细胞存活数均随药物浓度的升高而增加，呈正相关，r分别为0.913和0.985。

(1)药物对照组与病毒对照组相比有非常明显差异P＜0.001。

(2)细胞对照组与病毒对照组相比有明显差异P＜0.001。

(3)药物对照组与细胞对照组无明显差异P＞0.05。

说明槐果碱对COXA₉病毒感染的Hela细胞的能量合成代谢与细胞的存活率有充分保护作用。

实施例6 槐果碱对COXA₉病毒动物模型体内的抗病毒作用

病毒增殖抑制试验测定槐果碱在体内对COXA₉病毒的抑制作用。

COXA₉病毒感染Hela细胞后，病毒在细胞内繁殖，由于细胞用琼脂糖复盖，病毒只能经细胞-细胞途经传播。于是出现局部区域性的细胞破坏、裂解，细胞死亡后经固定染色，破坏区呈现空斑。每一个空斑由一个病毒感染单位形成，故空斑试验可准确测定病毒滴度。空斑减少实验可准确反映槐果碱抑制COXA₉病毒的增殖程度。本实验采用病毒增殖抑制法(即空斑减少试验)观察槐果碱在体内对COXA₉病毒的抑制作用。

实施例7 体内抗COXA₉病毒的作用

通过细胞培养法用病毒增殖抑制法(空斑形成法)测定槐果碱对COXA₉病毒增殖的抑制作用。

一.COXA₉病毒血症动物模型的的制作

槐果碱注射液：上海禾丰制药厂提供，规格：200mg/2ml，批号：030827。

COXA₉病毒来源：昆明医学生物研究所，赵树栋提供。

实验动物：Balb/c小鼠，3～4周龄，由上海中英合资西普尔必凯实验动物有限公司提供。

COXA₉病毒血症动物模型的制作：取Balb/c小鼠20只。

A组：COXA₉病毒感染模型10只

B组：槐果碱注射液治疗组10只

二组各在腹腔内接种0.1ml100TCID₅₀COXA₉病毒。A组接种后2小时始由尾静脉注射无菌生理盐水0.1ml二/日，B组于病毒接种后2小时始用槐果碱注射液10mg/kg/日，分二次/日尾静脉注射。二组均在接种后第三天在无菌条件下摘除小鼠眼球取血，放入无菌试管中，静置待血清析出，每组10只小鼠各取0.1ml血清等量混合，加入青链霉素，浓度为2000μ/ml，置4℃冰箱2小时以灭菌。

槐果碱在Balb/c模型小鼠病毒血症时用病毒抑制增殖法(空斑形成法)测定

标本稀释度(COXA₉病毒血症时的血清)
								空斑数	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	细胞对照
治疗组	融合	168	28	12	0	0	0
								COXA₉病毒组	融合	融合	456	124	24	0	0

上表所示槐果碱对COXA₉病毒的增殖抑制作用为90.4％～94％。

二.COXA₉病毒性心肌炎及脑炎体内模型的制作。

Balb/c雄性小鼠，3～4周龄50只，由上海中英合资西普尔必凯实验动物有限公司提供。腹腔内注射COXA₉病毒1000TCID₅₀0.1ml，造成心肌炎及脑膜炎模型。

实验分三组：正常对照组(N＝10)、病毒对照组(N＝10)、COXA₉病毒感染+药物组(N＝30)，10mg、20mg、30mg各10只，分别以0.1％、0.2％和0.3％槐果碱0.01ml+生理盐水0.1ml，每天分二次作尾静脉注射。感染后第8天将存活小鼠无菌眼眶取血(测中和抗体)，然后拉颈致死取心脏及脑子做二方面实验。

(一)中和抗体的检测；用细胞病变法在Hela细胞上测三个不同剂量槐果碱(10mg、20mg、30mg)测COXA₉病毒的中和抗体。

用Hela细胞测COXA₉病毒的中和抗体(第8天血小清)

血清稀释度

1∶2

1∶4

1∶8

1∶16

1∶32

1∶64

1∶128

1∶256

1∶512

细胞对照

病毒对照

10mg

+

-

+

20mg

±

+

-

+

30mg

+

-

+

COXA₉病毒中和抗检测结果10mg第8天是1∶64阳性，20mg是1∶128阳性，30mg是1∶128阳性，与所用槐果碱剂量有关(血清中出现中和抗体，说明病理模型的制作是成功的)。

(二)用TCID₅₀实验测不同剂量槐果碱(10mg、20mg、30mg)在Hela细胞上对COXA₉病毒感染心肌细胞匀浆中的TCID₅₀。观察槐果碱对COXA₉病毒的抑制作用。

用Hela细胞测COXA₉病毒感染心肌细胞匀浆中的TCID₅₀

Hela细胞病变孔数/总细胞孔数

标本稀释度(心肌)

槐果碱治疗组mg/kg

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-6

10^-7

10^-8

10mg

4/4

2/4

1/4

0/4

20mg

4/4

2/4

1/4

0/4

30mg

4/4

2/4

0/4

COXA₉病毒

4/4

2/4

0/4

正常对照组

0/4

槐果碱对COXA₉病毒性心肌炎匀浆中病毒滴度为10^-3，病毒对照组心匀浆中病毒滴度为10^-5。

治疗组TCID₅₀比对照组高2个稀释度，提示槐果碱有对抗COXA₉病毒的作用。槐果碱在Hela细胞培养上对COXA₉病毒的抑制率为99％。

(三)COXA₉病毒感染的Balb/c小鼠第8天模型，心脏及脑子的病理切片。心脏及脑组织的标本用10％的福尔马林固定，石腊包埋，连续切片10张，HE染色，观察心脏组织及脑组织白细胞浸润、细胞坏死及变性等病理变化，对比COXA₉病毒感染组以及槐果碱治疗组的结果。

(1)COXA₉病毒感染Balb/c小鼠心肌细胞槐果碱治疗组与感染组的病理变化(附照片一、二、三)。

结果：心脏切片COXA₉病毒所致Balb/c小鼠病毒性心肌炎见心外膜大片心肌及心肌层炎症病变(如图1所示)。槐果碱10mg/kg治疗组心外膜心肌炎症明显减轻，心肌层仅见少量炎性细胞(如图2所示)。槐果碱20mg/kg治疗组心外膜心肌及心肌层未见炎症(如图3所示)。

(2)COXA₉病毒Balb/c小鼠脑组织槐果碱治疗组与感染组病理变化(见图4、5、6)。

脑组织切片，COXA₉病毒所致Balb/c小鼠病毒性脑膜炎，病毒组示明显脑室膜炎(如图4所示)。槐果碱10mg/kg治疗组示脑室膜炎病变减轻(如图5所示)。槐果碱20mg/kg治疗组未见脑室膜炎(如图6所示)。

由此可见槐果碱对COXA₉病毒具有明显的抗病毒作用，用以治疗COXA₉病毒动物模型的心肌炎和脑膜炎是有效的。

Claims

1.槐果碱或其可药用盐在制备治疗由柯萨奇A9病毒所引起疾病的药物中的应用，其中，所述的疾病是心肌炎或脑膜炎，所述的槐果碱的结构式为(I)

2.如权利要求1所述的槐果碱或其可药用盐在制备治疗由柯萨奇A9病毒所引起疾病的药物中的应用，其中，所述的槐果碱的可药用盐为槐果碱的溴酸盐、或者槐果碱的盐酸盐、或者槐果碱的氟酸盐。

3.如权利要求1所述的槐果碱或其可药用盐在制备治疗由柯萨奇A9病毒所引起疾病的药物中的应用，其中，所述的药物剂型为医学上认可的任意剂型。

4.如权利要求3所述的槐果碱或其可药用盐在制备治疗由柯萨奇A9病毒所引起疾病的药物中的应用，其中，所述的药物剂型为粉剂、或者注射液、或者胶囊、或者片剂、或者口服液。