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CN101472592A - 用9-羟基玫瑰树碱衍生物逆转恶性表型 - Google Patents

用9-羟基玫瑰树碱衍生物逆转恶性表型 Download PDF

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CN101472592A
CN101472592A CNA2007800223046A CN200780022304A CN101472592A CN 101472592 A CN101472592 A CN 101472592A CN A2007800223046 A CNA2007800223046 A CN A2007800223046A CN 200780022304 A CN200780022304 A CN 200780022304A CN 101472592 A CN101472592 A CN 101472592A
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C·奥克莱尔
V·波拉尔
A·马克西缅科
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Bioalliance Pharma SA
École Normale Supérieure Paris-Saclay
Original Assignee
Bioalliance Pharma SA
Ecole Normale Superieure de Cachan
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Abstract

本发明涉及9－羟基玫瑰树碱衍生物用于治疗癌症的用途。9－羟基玫瑰树碱衍生物经证实特别可用于治疗转移癌或避开传统细胞毒性化疗的癌症。

Description

用9-羟基玫瑰树碱衍生物逆转恶性表型
本申请要求2006年8月21日提交的美国临时申请No.60/838,860的权益，其公开内容完全经此引用并入本文，就像在本文中完全阐述一样。
本发明涉及9-羟基玫瑰树碱衍生物用于治疗癌症的用途。这些9-羟基玫瑰树碱衍生物经证实特别可用于治疗转移癌或避开传统细胞毒性化疗的癌症。
在非癌细胞中，与细胞外基质和与相邻细胞的粘附在细胞存活、生长、分化和运动性的控制中起到主要作用(K.A.Beningo等人，J.Cell Biol.153(2001)，第881-888页；S.M.Frisch和R.A.Screaton，Curr.Opin.Cell Biol.13(2001)，第555-562页和F.M.Watt，EMBO J.21(2002)，第3919-3926页)。在致癌性转化后，在细胞形态和细胞骨架组织、细胞运动性和生长因子依赖性或粘附依赖性细胞增殖方面发生显著变化(关于综述，参见G.Pawlak和D.M.Helfman，Curr.Opin.Genet.Dev.11(2001)，第41-47页)。肌动蛋白细胞骨架的扰乱和粘着斑数量的附随降低是伴随着由各种致癌基因引起的细胞转化的常见特征。非贴壁依赖性生长(anchorage-independent growth)和致肿瘤性与在转化细胞中观察到的肌动蛋白丝网络重排的联系表明肌动蛋白细胞骨架在肿瘤生成中的基础作用(P.Kahn等人，Cytogenet.Cell Genet.36(1983)，第605-611页)。粘附性相互作用涉及通过连接斑蛋白连接到细胞骨架上的专门跨膜受体(关于综述，参见Nagafuchi，Curr.Opin.CellBiol.13(2001)，第600-603页)。几种肌动蛋白结合蛋白，包括α-辅肌动蛋白、纽蛋白(vinculin)、原肌球蛋白和抑制蛋白的合成在转化细胞中下调且这些蛋白在肿瘤细胞中的过度表达抑制了转化表型，这使它们被视为肿瘤抑制剂。
玫瑰树碱是从夹竹桃科(Apocynaceae family)常绿树中分离出的天然植物生物碱产物，其具有式(I)
Figure A200780022304D00081
玫瑰树碱被发现具有细胞毒性和抗癌活性(Dalton等人，Aust.J.Chem.，1967.20，2715)。
在位置9被羟基化的玫瑰树碱衍生物(9-羟基ellipticinium)据发现在许多实验肿瘤上具有比玫瑰树碱高的抗瘤活性。(Le Pecq等人，Proc.Natl.Acad，Sci.，USA，1974，71，5078-5082)但据发现表现出有限的治疗人类癌症的活性(Le Pecq等人，Cancer Res.，1976，36，3067)。
进行研究以确定适用于人类疗法的玫瑰树碱衍生物，并制成甲基羟基玫瑰树碱(Celiptium，依利醋铵)或N2-甲基-9-羟基ellipticinium(NMHE)，其已经用于治疗一些人类癌症，特别是用于治疗乳腺癌的骨转移。由此开发出衍生自9-羟基玫瑰树碱的一系列化合物并具有式(II)
Figure A200780022304D00082
其中R和R1是氢或烃基，R2是任选取代的烃基，且X-是季化阴离子。这些化合物已经描述在专利US 4,310,667中。
这些化合物的平面多环结构据发现通过插入与DNA相互作用。此外，这些化合物据发现牵涉多种作用模式，包括DNA结合、氧化性氧物类(oxidative oxyen species)的生成、和酶功能改性；最显著为拓扑异构酶II和端粒酶的功能改性(参见例如Auclair，1987，Achives of Biochemistry and Biophysics，259，1-14)。
在药理学上，许多毒副作用已经表明是成问题的。特别地，甲基羟基玫瑰树碱(Celiptium)被发现引起肾毒性。但是，一些玫瑰树碱衍生物，例如2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium-氯化物(Auclair等人，1987，Cancer Research，47，6254-6261)被发现在动物中具有改进的安全性和抗癌活性。尽管2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium-氯化物的改进的性能使其被选为I期试验，但后来放弃了这种化合物的开发。
另一些9-羟基玫瑰树碱衍生物，如2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐、2-(二异丙基氨基-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐和2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium已经例如描述在美国专利US 4,310,667中。
对人类癌症有效并具有有限毒副作用的药物的开发仍是关键的需要。挑战特别在于，要成功地找出主要通过非细胞毒性方法发挥作用的抗癌药。在此研究领域中，发明人假定细胞表型的变化，更尤其是细胞骨架结构的变化(这是肿瘤发展的主要分子机制之一)是相关的靶过程。
本发明人已经出乎意料地证实，有限数量的9-羟基玫瑰树碱衍生物具有由引起肌动蛋白网络重排并由此由于粘附性补救和运动性控制而引起肿瘤细胞表型逆转的非细胞毒性方法(即不与细胞中的生物损害直接相联)介导的抗癌活性。此外，以非细胞毒性浓度，即对细胞增殖和细胞存活都没有显著影响的浓度获得表型逆转。
因此，本发明人确定的9-羟基玫瑰树碱衍生物提供了主要通过非细胞毒性方法发挥作用的抗癌药。
玫瑰树碱衍生物
被确定以非细胞毒性浓度引起恶性表型逆转的9-羟基玫瑰树碱衍生物具有式(III)：
Figure A200780022304D00101
其任选为酸加成盐形式，
其中
X是具有2或3个碳原子的烃基，任选支化，并任选被OH、NRR’、CN、OR、COOR取代，其中R和R′独立地为H或C1-C4烃基；
Y是-NR1R2，其中R1和R2独立地为H或C1-C6烃基，或R1和R2与和它们相连的N原子一起形成饱和或不饱和的5-或6-元杂环，其中-NR1R2可以是由可药用无机或有机酸的加成产生的季铵盐形式，以致式(I)的化合物是酸加成盐形式；
或Y是苄基、苯基或C5或C6芳基或5-或6-杂芳基
Z-是可药用无机或有机酸的阴离子；
-X-Y侧链按适当连接到T、U、V或W上；
T、U、V和W是C原子或N原子以形成吡啶基环且其余T、U、V和/或W是C原子，
条件是-X-Y侧链连接到作为N原子的T、U、V和W之一上，
要理解的是，
Figure A200780022304D0010095141QIETU
按适当代表单键或双键，以使与稠合吡啶基环形成的体系是芳族的并形成所得阳离子
Figure A200780022304D00102
或
Figure A200780022304D00103
根据一个实施方案，本发明的9-羟基玫瑰树碱衍生物具有式(IV)：
Figure A200780022304D00104
其中X是具有2或3个碳原子的烃基，任选支化，并任选被OH、NRR’、CN、OR、COOR取代，其中R和R′独立地为H或C1-C4烃基；
Y是-NR1R2，其中R1和R2独立地为H或C1-C6烃基，或N，R1和R2任选一起形成饱和或不饱和的5-或6-元杂环，其中-NR1R2可以是由可药用无机或有机酸的加成产生的季铵盐形式，以致式(I)的化合物是酸加成盐形式；
或Y是苄基、苯基或C5或C6芳基或5-或6-杂芳基；且
Z-是可药用无机或有机酸的阴离子。
本文所用的“烃基”是指在链中具有大约1至大约20个碳原子的可以直链或支链的脂族烃基。优选烃基在链中具有1至大约12个碳原子，再优选1至6个碳原子。支链是指一个或低碳烃基，如甲基、乙基或丙基连接到直烃基链上。《低碳烃基》是指链中大约1至大约4个碳原子，其可以是直链或支链的。烃基可以用一个或多个《烃基取代基》取代，这些烃基取代基可以相同或不同并包括例如卤素、环烃基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、芳酰基氨基、羧基。
“芳基”是指大约5至大约14个碳原子，优选大约6至大约10个碳原子的芳族单环或多环体系。芳基任选被一个或多个取代基取代，这些取代基可以相同或不同并且如本文所定义。示例性芳基包括苯基或萘基，或取代苯基或取代萘基。
本文所用的术语“杂芳基”是指通过除去一个氢原子形成的5至14，优选5至10元芳族杂单环、双环或多环。实例包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基、异噁唑基等。
“可药用”是指其在合理医学判断范围内适用于接触人和低等动物的细胞而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的益处/风险率相称。
可药用的无机或有机酸可以选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、六氟磷酸、硝酸、碳酸、柠檬酸、水杨酸、甲磺酸、乙酸、草酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、天门冬氨酸、谷氨酸、乳酸、丙二酸、苯甲酸、环己烷氨基磺酸和肉桂酸。(参见例如S.M.Berge，等人，《Pharmaceutical Salts，》J.Pharm.Sci.，66：第1-19页(1977))。在上列通式(III)和(IV)中：
-Z-是衍生自上述酸的相应的单电荷阴离子。
优选地，在上式(III)和(IV)中，Z-是甲烷磺酸根(也称作甲磺酸根CH3SO3 -)；且另外
--NR1R2可以是由如上定义的可药用无机或有机酸的加成产生的季铵盐形式，优选为甲磺酸，以使式(I)的化合物可以带有两个正电荷。
在上述9-羟基玫瑰树碱衍生物中，X优选为乙基或丙基。
当Y是芳基时，Y可以有利地选自吡啶和嘧啶，
当Y是-NR1R2时，有利地，R1和R2各自可以是乙基，或Y可以是哌啶或吡咯烷基团。
根据某些实施方案，X是乙基且Y选自二乙基氨基、吡咯烷基、苄基、苯基、哌啶、吡啶和嘧啶。
也根据某些实施方案，X是丙基且Y选自二乙基氨基、吡咯烷基、苄基、苯基、哌啶、吡啶和嘧啶。
优选的9-羟基玫瑰树碱衍生物如下：
Figure A200780022304D00121
和
Figure A200780022304D00122
及其所得季铵盐，
其中Z-选自上述单电荷阴离子。
更具体地，对于本发明的用途，9-羟基玫瑰树碱衍生物可以是2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium氯化物、2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐、2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium氯化物、2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐和它们的所得季铵盐。
此外，优选的9-羟基玫瑰树碱衍生物是2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐、2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium氯化物和2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐和它们的所得季铵盐。
更优选地，本发明的9-羟基玫瑰树碱衍生物是
Figure A200780022304D00131
制备9-羟基玫瑰树碱衍生物的方法已经例如描述在美国专利US4,310,667中。
治疗方法
上述9-羟基玫瑰树碱衍生物引起肿瘤细胞中肌动蛋白细胞骨架的重塑，由此造成降低的细胞运动性和细胞粘附的恢复。这种方法在体内引起由各种机制、包括最终由可能参与TCL毒效应的宿主免疫响应造成的肿瘤细胞的选择性凋亡。
因此，本发明涉及式(III)或(IV)的9-羟基玫瑰树碱衍生物用于制造癌症治疗药剂的用途。本发明还涉及通过逆转肿瘤细胞的转化表型来治疗癌症的方法，包括对需要其的对象施用治疗有效量的如上定义的9-羟基玫瑰树碱衍生物。但是，在此用途和方法中，9-羟基玫瑰树碱衍生物可能优选不是2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium氯化物、2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐、2-(二异丙基氨基-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐或2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐。
本发明进一步涉及式(III)或(IV)的9-羟基玫瑰树碱衍生物用于制造旨在逆转肿瘤细胞转化表型的药剂的用途。本发明还涉及逆转肿瘤细胞的转化表型的方法，包括对需要其的对象施用治疗有效量的如上定义的9-羟基玫瑰树碱衍生物。
本文所用的术语“对象”是指哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选地，本发明的对象是人。
在本发明中，本文所用的术语“治疗”是指逆转、减轻、抑制该术语适用的失调症或病症或这类失调症或病症的一个或多个症状的进展或预防其发生。
“治疗有效量”是指足以改善特定失调症或疾病的症状的化合物的量。有利地，本发明的治疗方法可以使用非细胞毒性量的9-羟基玫瑰树碱衍生物，即对细胞增殖和细胞存活都没有显著影响的浓度实施。
本文所用的术语“转化表型”是指(i)在细胞形态方面，和/或(ii)在细胞骨架组织方面，和/或(iii)在细胞运动性方面和/或(iv)在生长因子依赖性或粘附依赖性细胞增殖方面可能发生的变化。所述转化表型是肿瘤细胞的标志。
细胞形态变化的实例包括表现出更圆的形状、更少的细胞质凸出(extensions)、降低的铺展面积和降低的细胞/细胞接触的细胞。细胞骨架组织的变化特别是肌动蛋白细胞骨架的扰乱，其典型地与粘着斑数量的附随降低相联。
“逆转肿瘤细胞的转化表型”是指使肿瘤细胞恢复正常(即非肿瘤)细胞的表型。通过9-羟基玫瑰树碱衍生物对转化表型的逆转特别由肌动蛋白网络重排引起。
转化表型的逆转可以由技术人员使用本领域已知的检验法评估。
这些方法包括例如：
-半固体或软琼脂生长检验(致克隆性检验)；
-细胞运动性检验；
-如国际专利申请WO 2004/057337中所述测量细胞溶解产物中的固定聚合肌动蛋白(stationary polymeri zedactin)的方法。该方法包括肿瘤攻击性指数。简言之，该方法包括在非变性条件下溶解细胞，调节溶胞产物的总蛋白质浓度，加入内源性肌动蛋白(例如ATP)的聚合所必需的荧光标记肌动蛋白单体和组分，并测量聚合肌动蛋白；
-根据传统程序，依照显微观察，通过肌动蛋白、zyxin、辅肌动蛋白或B-连接素(catenin)标记来评估细胞的形态改变和细胞骨架组织。
本发明的药剂或方法引起肿瘤细胞的选择性凋亡并由此提供癌症的非细胞毒性治疗法。
根据本发明，肿瘤细胞可以是源自任何肿瘤，例如原发或转移肿瘤、实体瘤或软组织瘤或白血病的细胞。实体瘤或soft瘤细胞的实例包括膀胱癌、乳癌、骨癌、脑癌、子宫颈癌(cervical)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、肺癌、神经系统癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、胰腺癌(pancres)和皮肤癌的细胞。白血病包括例如慢性骨髓增生性疾病、骨髓增生异常综合征、急性非淋巴细胞白血病、B-细胞急性淋巴细胞白血病、T-细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴增殖病。
预计最响应9-羟基玫瑰树碱衍生物的肿瘤细胞是以与细胞骨架破坏、提高的细胞运动性和/或降低的细胞-细胞粘附(如在侵略性肉瘤中和在转移早期阶段发生的上皮-间叶细胞转化过程中观察到的那样)联系在一起的侵袭性表型为特征的那些。
本发明的优点在于，由于其逆转细胞的恶性表型的能力，本文所述的9-羟基玫瑰树碱衍生物构成真实的抗侵袭剂。因此，根据一个实施方案，肿瘤细胞是转移细胞。相应地，本发明的药剂或方法旨在治疗转移。
此外，本文定义的9-羟基玫瑰树碱衍生物具有由非细胞毒性方法介导的抗癌活性。这些化合物可以有利地施用以治疗避开传统细胞毒性化疗的对象的癌症，该化疗使用DNA复制抑制剂，如DNA结合剂，特别是烃基化或插入药物，抗代谢物，如DNA聚合酶抑制剂、或拓扑异构酶I或II抑制剂，或使用抗-致有丝分裂剂，如生物碱。这些细胞毒性化合物包括例如放线菌素D、阿霉素、博来霉素、脱羧铂氨(carboplatin)、顺式铂氨(cisplatin)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、doxorubicin、依托泊甙(etoposide)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤美法仑、甲氨蝶呤、紫杉醇、泰素帝、长春碱和长春新碱。
本文所用的术语“避开细胞毒性化疗的对象”特别是指细胞毒性疗法在其内不改变肿瘤进展的对象。
本文定义的一种或多种9-羟基玫瑰树碱衍生物可以同时或接连施用于要治疗的对象。
此外，该9-羟基玫瑰树碱衍生物可以与分化剂(differentiatingagent)，特别是与维生素A、其合成类似物和代谢物(类维生素A)、维生素D或其类似物、或过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)配体联合(即同时或接连)施用。
类维生素A可以是例如全反式视黄酸(ATRA)、N-(4-羟基苯基)维甲酰胺(4HPR)、13-顺式-视黄酸(13-CRA)或9-顺式-视黄酸(9-CRA)。
维生素D或其类似物特别包括25-二羟基维生素D3(1，25-(OH)2D3)，其是通常由维生素D3、或1α-羟基-维生素D3、1α.-羟基维生素D2、1α-羟基维生素D5、氟化维生素D衍生物形成的二羟基化代谢物。
PPAR配体特别是PPARα或PPARγ活化剂。选择性PPARr激动剂包括典型的TZDs(曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮和环格列酮(ciglitizone)；参见Forman等人，1995，Cell，83：803-812；Lehmann等人，1995，J.Biol.Chem.270：12953-12956)和非-TZD-型激动剂。后者的代表包括N-(2-苯甲酰基苯基)-L-酪氨酸衍生物，如GW 1929、G1 262570和GW 7845，它们是迄今确定的最有力和选择性的PPARγ激动剂(参见Henke等人，1998，J.Med.Chem.，41：5020-5036；Cobb等人，1998，J.Med.Chem.，41：5055-5069)。GW 0207，一种2，3-二取代吲哚-5-羧酸也是有力和选择性的PPARγ激动剂(Henke等人，1999，Bioorg.Med.Chem.Lett.，9：3329-3334)。贝特类或法呢醇是PPARα激动剂的实例。
因此，根据本发明的可用的9-羟基玫瑰树碱衍生物也可以与另一治疗化合物混合形成药物组合物(含或不含稀释剂或载体)，其在施用时提供活性成分组合的同时施用，实现本发明的联合疗法。特别地，本发明提供了包含如上定义的式(III)或(IV)的9-羟基玫瑰树碱衍生物和如上定义的分化剂的药物组合物。
除了同时施用外，根据本发明的可用的9-羟基玫瑰树碱衍生物也可以与另一治疗化合物，特别是如上定义的分化剂分别或接连施用。因此，本发明进一步提供了包含式(III)或(IV)的9-羟基玫瑰树碱衍生物和分化剂的产品作为同时、分别或接连用于治疗癌症，特别是用于逆转肿瘤细胞的转化表型的联合制品。
尽管9-羟基玫瑰树碱衍生物可以单独施用，但其优选作为药物组合物存在。根据本发明可兽用或人用的该药物组合物包含至少一种如上定义的9-羟基玫瑰树碱衍生物以及一种或多种可药用载体和任选其它治疗成分。
在某些优选实施方案中，联合治疗中必需的活性成分可以组合在单一药物组合物中以同时施用。
本文所用的术语“可药用”及其语法变型，在描述组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用并且表示这些材料能在不产生不希望的生理副作用如恶心、眩晕、反胃等的情况下施用于哺乳动物。
含有溶解或分散在其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域中公知的且无需在剂型方面受到限制。通常，这类组合物制成可注射(液体溶液或悬浮液)；但是，也可以制备适合在使用前在液体中制成溶液或悬浮液的固体形式。该制品也可以乳化。特别地，该药物组合物可以以固体剂型配制，例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂、糖锭剂或颗粒剂。
赋形剂的选择和赋形剂中活性物质的含量通常根据活性化合物的溶解度和化学性质、特定给药模式和在制药实践中要观察的规定确定。例如，与润滑剂(如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石)结合的赋形剂(如乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙)和崩解剂(如淀粉、褐藻酸和某些络合硅酸盐)可用于制备片剂。为了制备胶囊，有利地使用乳糖和高分子量聚乙二醇。当使用水悬浮液时，它们可以含有乳化剂或促进悬浮的试剂。也可以使用稀释剂，如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇和氯仿或其混合物。
药物组合物可以在合适的制剂中通过局部或全身给药施用于人和动物，包括口服、直肠、经鼻、口腔、舌下、阴道、肠道外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)、脑池内和腹膜内。要理解的是，优选途径可以例如随接受者状况而变。
制剂可以通过制药领域中公知的任何方法以单位剂型制备。这类方法包括将活性组分与构成一种或多种辅助成分的载体合并的步骤。一般而言，通过将活性成分与液体载体和/或细碎固体载体均匀和直接地结合且随后如果必要将该产品成型来制备该制剂。
以单剂或分剂量施用于对象的9-羟基玫瑰树碱衍生物的总日剂量可以在量上为例如每日大约0.001至大约100毫克/公斤体重，优选0.01至10毫克/公斤/日，再优选0.01至1毫克/公斤/日，特别是0.1至1毫克/公斤/日，或1至10毫克/公斤/日。日剂量的实例是0.05毫克/公斤，0.125毫克/公斤，0.25毫克/公斤，0.5毫克/公斤，1毫克/公斤，1.25毫克/公斤，2.5毫克/公斤，5毫克/公斤和10毫克/公斤。单位剂量组合物可以含有可用于构成日剂量的量或其约数。但是，要理解的是，任何特定患者的特定剂量取决于各种因素，包括体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间和途径、吸收和排泄速率、与其它药物的联合和要治疗的特定疾病的严重性。
参照下列实施例进一步例示本发明。
附图
图1显示BA016DD537(2-(β-哌啶子基乙基)-9-羟基ellipticinium氯化物)的结构。
图2是在NIH 3T3 EF提取物中通过BA016DD537稳定肌动蛋白的时程的示意图。BA016DD537在0时间与聚合缓冲剂和NIH 3T3 EF提取物一起添加。反应混合物以如下用符号表示的浓度含有BA016DD537：100nM BA016DD537(▲)，200nM BA016DD537(□)，对照恶性NIH 3T3EF细胞(
Figure A200780022304D0019095614QIETU
)，对照正常NIH 3T3细胞(■)。数据代表平均标准偏差；n＝3。
图3是在NIH 3T3EF提取物中通过100nM BA016DD537(□)、200nM BA016CA107(□)和200nM BA016CA77(*)稳定肌动蛋白的时程的示意图。药物在0时间与聚合缓冲剂和NIH 3T3 EF提取物一起添加。也显示了对照恶性NIH 3T3 EF细胞(△)、对照正常NIH 3T3细胞(○)。数据代表平均标准偏差；n＝3。
图4是用BA016DD537处理或未处理的，在NIH 3T3 EF细胞中的肌动蛋白纤维的荧光显微检查，并与对照NIH 3T3细胞比较。BA016DD537增加了转化NIH 3T3 EF细胞中的肌动蛋白纤维。通过使用FITC-鬼笔环肽使肌动蛋白长丝可见化和使用Dapi使核可见，通过原位免疫荧光法分析正常和恶性NIH 3T3细胞。(A)对照恶性NIH 3T3EF细胞；(B)对照正常NIH 3T3细胞；(C)用100nM BA016DD537处理的恶性NIH 3T3 EF细胞；(D)用200nM BA016DD537处理的恶性NIH 3T3 EF细胞。
图5显示用BA016FZ539(2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐)处理的MIA PaCa-2细胞的形态变化。A：对照，B：用4μM的BA016FZ539处理了3天的细胞(x200)。
图6显示用BA016DD537(2-(β哌啶子基-2-乙基)-9-羟基ellipticinium氯化物)在13CRA和ATRA存在或不存在下处理的B16BL6细胞的增殖试验。所用视黄酸(retinoic acid)的浓度设定为10nM。
实施例
实施例1：肌动蛋白动力学的调节
在肿瘤细胞中的肌动蛋白动力学已知受损，随后F-肌动蛋白与G-肌动蛋白的比率降低。已经在肿瘤细胞提取物中使用可以得到F-肌动蛋白伸长速率常数(k)和F-肌动蛋白稳态浓度(ΔmA)的荧光各向异性检验法量化肌动蛋白动力学。
材料和方法：
所有反应在22℃下进行，并在Beacon 2000(Panvera)中在520纳米下恢复荧光各向异性信号(在490纳米下激发)。在BeckmanL5-50B超离心机中将Alexa 488肌动蛋白(Molecular Probes)在4℃下以35 000rpm离心2小时，从而沉降残留肌动蛋白聚合物。留在上清液中的荧光被认为可能归因于在之前所述的条件下不会成粒的单体或小肌动蛋白丝(5-10个单体)。提取80％的上清液；通过荧光测量(在490纳米下激发和在520纳米下信号恢复)指定浓度。使用未超离心Alexa 488肌动蛋白作为标样计算超离心的肌动蛋白浓度。将上清液等分，在液氮中冷冻并储存在-80℃下。
在实验之前，将超离心的Alexa 488肌动蛋白等分试样在G缓冲剂(5mM Tris pH 8.1，2mM CaCl2，0.2mM DTT，0.2mM ATP)中稀释至1毫克/毫升浓度。将3微升的稀释Alexa 488肌动蛋白在168微升G缓冲剂中混合，并在添加4微升聚合缓冲剂(2.5M KCl，50mMMgCl2，25mM ATP)、存在或不存在化学分子的5微升G缓冲剂和正常NIH 3T3细胞或恶性NIH 3T3 EF细胞在2毫克/毫升下的20微升细胞提取物之前测量肌动蛋白单体各向异性。Alexa 488肌动蛋白的最终浓度为4nM。未标记/标记的肌动蛋白的比率为大约140/4nM。在200秒内每10秒进行测量。减去肌动蛋白单体各向异性值，产生各向异性增强(ΔmA)。用公式Y＝Ymax.[1-exp(-K.X)]拟合数据。曲线在0开始并升至Ymax，其相当于稳态各向异性值(ΔmA eq)，使用速率常数K。Y是扣减了单体各向异性的各向异性值，且X是时间。
结果：
BA016DD537对这些参数的影响如下：
表1：BA016DD537浓度对NIH 3T3 EF提取物中的各向异性增强的影响
 
正常NIH3T3细胞 恶性NIH3T3 EF细胞 在100nMBA016DD537存在下的恶性NIH 3T3 EF细胞 在200nMBA016DD537存在下的恶性NIH 3T3 EF细胞
ΔmA 59.46 40.47 52.38 61.17
k.sec-1 0.1225 0.0960 0.1636 0.1737
对于NIH 3T3EF提取物，观察在2-(β-哌啶子基乙基)-9-羟基ellipticinium氯化物(BA016DD537)存在下与在BA016DD537不存在的情况下测得的各向异性相比的各向异性增强(图2)。
NIH 3T3 EF细胞与原生NIH 3T3细胞相比，表现出更低的肌动蛋白伸长的准一级速率常数以及在稳态下的更低F-肌动蛋白量。因此认为，由NIH 3T3 EF细胞制成的胞质部分是便于筛选可以调节肌动蛋白动力学的材料，包括优先结合到肌动蛋白丝上的那些，例如BA016DD537的材料。当添加到检验培养基中时，BA016DD537提高了肌动蛋白-F伸长速率常数和肌动蛋白-F稳态值。图2显示了在添加递增浓度的BA016DD537后观察到的典型动力学。在200nM BA016DD537存在下，NIH 3T3 EF胞质部分的肌动蛋白动力学类似于使用NIH 3T3胞质部分观察到的那些。因此，可以使用BA016DD537作为肌动蛋白聚合促进剂。
实施例2：通过9-羟基-2(β-乙基)-ellipticinium乙酸盐(BA016CA107)和9-羟基-2(β-甲基)-ellipticinium乙酸盐(Celiptium，BA016CA77)调节肌动蛋白动力学和细胞运动性的体外抑制
甲基羟基玫瑰树碱(Celiptium)已知为抗癌药。通过稳态荧光各向异性测量法(材料和方法，实施例1)将9-羟基-2(β-乙基)-ellipticinium乙酸盐(BA016CA107)和甲基羟基玫瑰树碱(Celiptium)(BA016CA77)的作用机制与BA016DD537的进行比较。也研究它们抑制细胞运动性的能力(材料和方法，实施例4)。
结果：
如图3中所示，BA016CA77和BA016CA107不会提高肌动蛋白-F伸长速率常数和肌动蛋白-F稳态值。在200nM BA016CA77或BA016CA107存在下，NIH 3T3 EF胞质部分的肌动蛋白动力学类似于使用无处理的NIH 3T3 EF胞质部分观察到的那些。因此，BA016CA77和BA016CA107不能用作肌动蛋白聚合促进剂。
表2：BA016DD537、BA016CA77和BA016CA107浓度对NIH 3T3 EF提取物中的各向异性增强的影响
 
正常NIH3T3细胞 恶性NIH3T3 EF细胞 在200nMBA016DD537存在下的恶性NIH3T3 EF细胞 在200nMBA016CA107存在下的恶性NIH3T3 EF细胞 在200nMBA016CA77存在下的恶性NIH3T3 EF细胞
ΔmA 59.46 40.47 61.17 42.14 38.33
k.sec-1 0.1225 0.0960 0.1737 0.0280 0.0416
在创伤愈合检验法中将用BA016CA77和BA016CA107药物处理的恶性细胞的行为与未处理的恶性细胞进行比较。处理过的恶性细胞被发现超出创伤边界迁移到其整个区域中(图4)。在非细胞毒性浓度下用药物处理的细胞以与未处理的恶性细胞相同的方式迁移。
总之，9-羟基-2(β-乙基)-ellipticinium乙酸盐和9-羟基-2(β-甲基)-ellipticinium乙酸盐(Celiptium)都没有被发现是活性的，由此表明位置2中侧链的性质在其调节肌动蛋白动力学的能力方面起到关键作用。
实施例3：在肿瘤细胞中补救F-肌动蛋白网络
材料和方法：
将恶性NIH 3T3 EF细胞以2000细胞/平方厘米的密度接种到玻璃盖玻片上。第二天，将BA016DD537以各种非细胞毒性浓度(100nM至200nM)施加到NIH 3T3 EF细胞中。三天后，在用荧光显微镜检查之前，将细胞在4℃下的含有3.7％甲醛的PBS中固定10分钟。将甲醛溶液用50mM NH4Cl中和。用在PBS中的0.4％ Triton X-100提取4分钟。将细胞用封闭缓冲液(在PBS中的3％牛血清白蛋白)培养1小时，然后在室温下用FITC-鬼笔环肽(Sigma)培养20分钟。将盖玻片安装在Vectashieldk(Zymed)中并通过荧光显微镜(Nikon)观察。
结果：
如图4中所示药物BA016DD537能够在非细胞毒性浓度下在肿瘤细胞中重建肌动蛋白网络。用非细胞毒性BA016DD537浓度处理的NIH3T3 EF细胞恢复与NIH 3T3细胞接近的形态：将细胞铺开，具有许多细胞间触点且肌动蛋白细胞骨架在应力纤维网络中良好地组织。
在相似实验条件下，9-羟基-2乙基)-ellipticinium乙酸盐和9-羟基-2(甲基)-ellipticinium乙酸盐(Celiptium)都没有被发现是活性的。
实施例4：细胞运动性的体外抑制
肿瘤细胞侵入和转移(癌症进程中的后期)明确地涉及细胞运动性。细胞运动以及笼统而言细胞形状变化的核心动力(centralengine)是细胞骨架，且动物细胞运转中涉及的细胞骨架关键组分是肌动蛋白。因此，肌动蛋白动力学调节可能造成细胞运动性受损，这又会限制侵入和转移。
由于这些原因，在细胞运动性检验中测试BA016DD537。
材料和方法：
进行创伤愈合检验以评测BA016DD537对恶性NIH 3T3 EF细胞和黑素瘤细胞系B16F10和B16BL6的运动性的影响。将所有细胞在37℃下在湿润5％ CO2气氛中培养。将大约100000-200000个细胞接种在6孔培养板中并在24小时后加入不同浓度的BA016DD537。细胞生长3天以汇合大约90-95％并用吸管端弄出小的划伤(大约200微米-1毫米宽)。去除细胞碎片，然后将培养物在完全培养基中在相同浓度BA016DD537存在下培养10小时。然后将培养物在4℃下的含有3.7％甲醛的PBS中固定10分钟。使用Zeiss软件，用相差光显微镜观察愈合。
结果：
表达融合蛋白EWS-FLI-1的扩散性黑素瘤细胞B16F10和B16BL6以及致瘤的NIH-3T3 EF细胞表现出高运动性表型。为了整体评测它们的能动性，我们在创伤愈合检验中将用BA016DD537处理的药物恶性细胞的行为与未处理的恶性细胞进行比较。未处理的恶性细胞超出创伤边界迁移到其整个区域中。相反，用BA016DD537处理的恶性细胞完全不会迁移到创伤中。BA016DD537以剂量依赖性方式抑制恶性细胞运动性。用浓度低至50nM的BA016DD537进行细胞处理造成B16F10黑素瘤和NIH 3T3 EF细胞迁移的完全抑制。我们也观察到BA016DD537在非细胞毒性浓度下对B16BL6细胞运动性的抑制。因此，所选BA016DD537药物的影响不归因于毒性效应。
实施例5：9-羟基玫瑰树碱衍生物的体外抗增殖效应
恶性细胞表现出根据非贴壁依赖性(anchorage independent)方式在半固体培养基，如甲基纤维素上生长的性质。
通过在半固体培养基中的集落形成的抑制，评估2-(β哌啶子基-2-乙基)-9-羟基ellipticinium氯化物(BA016DD537)和2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐(BA016FZ539)与表型逆转相关的抗癌活性。已经研究了几种细胞系。将集落形成的抑制与通过MTT还原测得的细胞增殖抑制进行比较。
材料和方法：
克隆(Cloning)检验法
将细胞嵌入用0.8％甲基纤维素补充的完全培养基(MethocelMC4000，Sigma)中，一式三份接种到35毫米皿(Greiner Bio-one Ref627102，Dominique Dutscher)中并在37℃下在湿润的5％ CO2气氛中培养。接种细胞数为1000个细胞/皿。在1至3周后，根据细胞系，计数宏观克隆数。
MTT检验法
使用[3-(4，5二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基-2H-溴化四唑鎓](Sigma)比色检验法进行生长研究。
根据细胞系，在添加递增浓度的BA016DD537或BA016FZ539之前，将大约1500至5000个细胞接种在96孔培养板中24小时。将该板在37℃下培养3天。在各孔中将10微升MTT储液(5毫克/毫升在磷酸盐缓冲盐水中)添加到90微升完全培养基中，培养在37℃下继续3小时。在各孔中加入100微升溶胞缓冲液(10％十二烷基硫酸钠，1％ HCl1N；pH 4.7)，并将该板培养过夜。使用综合EIA管理系统(IntegratedEIA Management System)(Labsystem)在570纳米波长下测定吸光度。使用未处理的细胞由OD读数计算增殖速率为100％。
所得典型结果显示在下表3至6中。
表3：通过BA016DD537抑制集落形成和细胞增殖
 
细胞毒性效应(MTT) 集落形成抑制(甲基纤维素)
NIH 3T3 EF IC50＝400nM IC50＝30nM
B16F10 IC50＝500nM IC50＝35nM
表4：在表达EWS/FLI-1原癌基因的细胞系上通过BA016FZ539抑制集落形成和细胞增殖
 
细胞毒性效应(MTT) 集落形成抑制(甲基纤维素)
NIH 3T3 EF IC50＝400nM IC50＝30nM
SK-N-MC IC50＝840nM IC50＝205nM
表5：通过BA016FZ539抑制人黑素瘤细胞系集落形成和细胞增殖
 
黑素瘤细胞系 细胞毒性效应(MTT) 集落形成抑制(甲基纤维素)
B16F10 IC50＝500nM IC50＝35nM
B16BL6 IC50＝212nM IC50＝29nM
A375 IC50＝2.9μM IC50＝97nM
C9 IC50＝2.1μM IC50＝132nM
451Lu IC50＝4.2μM IC50＝2μM
1205Lu IC50＝1.6μM IC50＝247nM
SKMEL28 IC50＝10.7μM IC50＝515nM
HT144 IC50＝9μM IC50＝125nM
表6：通过BA016FZ539抑制人胰腺癌细胞系集落形成和细胞增殖
 
胰腺细胞系 细胞毒性效应(MTT) 集落形成抑制(甲基纤维素)
Mia Paca-2 IC50＝7.6μM IC50＝640nM
PANC-1 IC50＝22μM IC50＝4.3μM
BA016DD537和BA016FZ539因此被发现表现出在半固体培养基中对集落形成的显著抑制活性。如使用MTT试验测得的那样，在非抗增殖浓度下发生集落形成的抑制。
实施例6：抗肿瘤活性
可以在小鼠中使用腹腔注射(i.p.)恶性细胞移植物然后腹腔注射处理来评估对B16黑素瘤的抗肿瘤活性。忽略各种biodisponibility参数的这种类型的规程给出大致关于对给定肿瘤可以预期的最大抗肿瘤活性的信息。
实验规程：
在J0下使用腹腔注射途径在B6D2F1小鼠中注射黑素瘤B16细胞(4 x 105)。也使用腹腔注射途径在各种浓度下从J1至J9每日注射溶解在无菌蒸馏水(0.5毫升)中的药物。对照小鼠仅根据相同规程接受蒸馏水。
每日计数处理过的小鼠和对照小鼠。在J9下计算T/C(处理过的小鼠的平均存活/对照小鼠的平均存活)。T/C>125％表明显著的抗肿瘤活性。
实验结果概括在下表7中：
表7：用甲基羟基玫瑰树碱(Celiptium)或BA016DD537处理的小鼠的平均存活与对照小鼠的平均存活的比率(T/C比率)
Figure A200780022304D00271
因此，BA016DD537对B16黑素瘤表现出显著抗肿瘤活性。3.12毫克/公斤的最佳剂量产生217％的T/C。使用这种规程，参比药物甲基羟基玫瑰树碱(Celiptium)没有显著的抗肿瘤活性。
实施例7：抗转移活性
B16F10鼠科黑素瘤细胞表现出的侵袭性表型(invasivephenotype)的特征在于，在通过静脉注射途径注射时肿瘤细胞在肺中有效形成转移的能力。为了评估抗扩散性，已经测试2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐在此方法中的作用。
实验规程：
使用静脉注射途径将100微升B16F10细胞悬浮液(4.105细胞)注入小鼠的眼窦后。将2-(β哌啶子基-2-基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐(BA016FZ539)溶液在细胞注射后24小时和72小时以5毫克/千克(第一实验)和7.5毫克/千克(第二实验)的剂量静脉注射给药。在对照组中，小鼠静脉注射生理血清。7天后，处死小鼠，切除肺并在解剖显微镜下计数转移性小瘤。
表8：通过BA016FZ539抑制B16F10细胞肺部转移的百分比
 
剂量J1，J3(毫克/公斤/inj.) 肺部转移发展的抑制(对照值的％)
实验1 5 21％(p＝0.0904)
实验2 7.5 39.6％(p＝0.3269)
在所用实验条件下，如静脉注射B16F10黑素瘤细胞后观察到的肺部转移的显著降低所示，BA016FZ539表现出显著的抗扩散活性。
实施例8：9-羟基玫瑰树碱衍生物对小细胞肺癌细胞系的体外抗增殖效应
通过如磺酰罗丹明试验测得的细胞增殖的抑制评估BA016FZ539(2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐)的抗肿瘤活性。
研究了三种小细胞肺癌细胞系：NC1-H510，NC1-H446和NC1-H187
小细胞肺癌(SCLC)构成每年诊断出的所有肺癌的15-25％(Bonfill等人1975-1977和1987-1989.Int JCancer 65：751-754，1996)。SCLC细胞系可以细分成2大类；表达神经内分泌标记的升高水平的典型SCLC细胞系(NC1-H187和NC1-H510)，和没有表达一种或多种神经内分泌标记的变异SCLC细胞系。
一些研究已经表明，与典型细胞系不同地，变异细胞系在体外抗辐射并具有提高的c-myc致癌基因表达(Carney等人，CancerResearch 45，2913-2923，June 1985)。
材料和方法：SRB检验
使用磺酰罗丹明B(SRB)比色检验法(Sigma)进行生长研究。
SRB检验用于基于细胞蛋白质含量测量的细胞密度测定。该方法已经针对在96孔板形式中的粘附细胞中的化合物毒性筛选进行优化(Skehan等人，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.1989，30：2436)。
将大约50 000NC1-H510、NC1-H446或NC1-H187细胞接种在96孔培养板中，同时加入递增浓度的BA016FZ539。
在培养期后，将细胞单层用10％(wt/vol)三氯乙酸固定，并染色30分钟，此后通过用1％(vol/vol)乙酸反复洗涤，除去过量染料。将蛋白质结合染料溶解在10mM Tris碱溶液中以使用微板读数器在510纳米下进行光学密度测定(OD)。
使用未处理的细胞作为100％，由OD读数计算增殖速率。
对于各种人小细胞肺癌细胞系的体外化学敏感性测试，将SRB蛋白质染色检验法与四唑鎓(MTT)比色检验法进行比较。
SRB检测法具有优于MTT检验法的几个优点。例如，一些化合物可以直接干涉MTT还原而对细胞存活力没有任何影响，而SRB染色几乎不受这类干涉的影响。此外，SRB染色与细胞代谢活动无关。
结果：
表9：通过SRB或MTT检验法测得的BA016FZ539对细胞增殖的抑制(Mean+/-SEM)
Figure A200780022304D00291
在表9中，可以观察到，变异SCLC细胞系(NCI-H446)表现出比典型SCLC细胞系(NCI-H510和NCI-H 187)更好的抗BA016FZ539性。
实施例9：9-羟基玫瑰树碱衍生物对胰癌细胞系的体外抗增殖效应
通过如磺酰罗丹明试验测得的细胞增殖的抑制评估BA016FZ539(2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐)的抗肿瘤活性。
研究了两种胰癌细胞系：MIA PaCa-2和PANC-1。
材料和方法：
在500μM至0.16μM的浓度范围内测试BA016FZ539对MIAPaCa-2和PANC-1胰腺细胞的生长的效应，并使用SRB比色检验法测量。
将大约5000MIA PaCa-2或PANC-1细胞接种到96-孔培养板中，同时加入递增浓度的BA016FZ539。
在显微观察下观察胰腺细胞系的构造和数量的改变(图5)。
结果：
表10：通过BA016FZ539抑制细胞增殖(Mean+/-SEM)
Figure A200780022304D00301
图5表明在MIA PaCa-2细胞系中通过BA016FZ539从转化表型(图5，A)向正常表型(图5，B)逆转。
这种效应仅在MIA PaCa-2细胞系中而未在PANC-1细胞系中观察到。在此，转化表型的逆转与细胞形态的变化，包括更多的细胞质凸出(extensions)和细胞铺展区域的增加联系在一起。因此，BA016FZ539对MIA PaCA-2细胞系表现出比对PANC-1细胞系更好的抗肿瘤活性(表10)。
总之，本文列出的数据表明，BA016FZ539对人癌细胞系施加多重抗肿瘤效应。BA016FZ539被发现显著抑制SCLC和胰腺细胞系中的细胞生长，IC50为6至20μM。这些结果也表明逆转胰腺细胞系MIAPaCa-2的恶性表型的能力。通过BA016FZ539处理的这些细胞表现出形态变化，表明细胞骨架组织的变化。
实施例10：细胞运动性的体外抑制
9-羟基玫瑰树碱衍生物可以与分化剂，特别是与维生素A、其合成类似物和代谢物(类维生素A)、维生素D或其类似物联合给药。类维生素A可以是例如全反式视黄酸(ATRA)、N-(4-羟基苯基)维甲酰胺(4HPR)、13-顺式-视黄酸(13CRA)或9-顺式视黄酸(9CRA)。
在此实施例中，研究BA016DD537(2-(β哌啶子基-2-乙基)-9-羟基ellipticinium氯化物)与这些类维生素A的联合效力。
材料和方法：
使用3-(4，5二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基-2H-溴化四唑鎓(MTT)比色检验法，针对B16BL6黑素瘤细胞系测试BA016DD537在类维生素A 13CRA和ATRA存在下对体外细胞存活力的抑制。
在加入1pM至100pM的递增浓度的BA016DD537之前，在不存在或存在10nM类维生素A的情况下，将大约1000个细胞接种在96孔培养板中24小时。将该板在37℃下培养3天。在各孔中，将10μl MTT储液(5毫克/毫升在磷酸盐缓冲盐水中)添加到90微升完全培养基中，培养在37℃下继续3小时。在各孔中加入100微升溶胞缓冲剂(20％十二烷基硫酸钠，10mM HCl，1 x PBS)，并将该板培养过夜。使用综合EIA管理系统(Labsystem)在570纳米波长下测定吸光度。
结果
B16BL6扩散性黑素瘤细胞表现出高侵袭性表型。协同检验的目的是在最低BA016DD537浓度下抑制肿瘤细胞存活力。在仅10nM类维生素A13CRA和ATRA存在下没有观察到细胞存活力抑制。在10nM类维生素A存在下用较低剂量BA016DD537处理细胞造成提高的肿瘤细胞存活力抑制(图6)。
同时，没有观察到在不存在类维生素A的情况下在最低浓度下的BA016DD537的活性。BA016DD537在100nM下的效力与在ATRA10nM存在下在1pM下的效力相同。因此，当与类维生素A联用时，BA016DD537的剂量可以降低100000倍，从而获得与在不存在类维生素A的情况下使用时相同的结果。
实施例11：两种9-羟基玫瑰树碱衍生物的生物活性的比较：单甲磺酸盐和二甲磺酸盐
使用两种独立实验评估两种玫瑰树碱衍生物，BA016FZ539(2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐或“单甲磺酸盐”)和相应的二甲磺酸盐衍生物
Figure A200780022304D00321
(下文称作“二甲磺酸盐”)的抗肿瘤活性。首先在鼠科黑素瘤细胞系B16F10上用克隆检验法评测在半固体培养基中的集落形成的抑制。
其次，使用SRB和MTT试验，量化在单甲磺酸盐和二甲磺酸盐存在下两种人胰腺细胞系(MIA PaCA-2和PANC1)和一种鼠科黑素瘤细胞系(B16F10)的细胞增殖。
材料和方法：
克隆检验
将细胞嵌入用0.8％甲基纤维素补充的完全培养基(MethocelMC4000，Sigma)中，一式三份接种到35毫米皿中并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中培养。接种细胞数为1000个细胞/皿。在9天后，计数鼠科黑素瘤细胞系B16F10的宏观克隆数。
MTT和SRB试验
使用MTT和SRB比色检验法(Sigma)进行生长研究。将大约1500个B16F10或3000胰腺细胞(MIAPaCa-2和PANC1)在添加递增浓度的单甲磺酸盐或二甲磺酸盐之前接种到96孔培养板中。
将板在37℃下培养3天，然后根据SRB或MTT规程处理(参见材料和方法)。
在这两种情况下，使用未处理的细胞作为100％，由OD读数计算增殖速率。
结果：
表11：细胞增殖的抑制
Nd：未测定
用SRB和MTT检验法测试B16F10，而PANC1仅用SRB检验法研究。单甲磺酸盐和二甲磺酸盐的IC50之间没有显著差异。
表12：B16F10集落形成的抑制
 
集落形成的B16F10抑制
单甲磺酸盐 IC50＝67nM
二甲磺酸盐 IC50＝21nM
单甲磺酸盐和二甲磺酸盐都对半固体培养基中的集落形成表现出类似的50％抑制浓度(IC50)，分别为67和21nM。
在这两种药物存在下在甲基纤维素中有效获得对扩散性鼠科黑素瘤细胞系B16F10生长的显著抑制效果。
我们的结果也证实，如使用MTT试验测得的那样，在非增殖浓度下实现集落形成的抑制(表12)。
总之，考虑到从克隆检验法和细胞增殖试验获得的结果，单甲磺酸盐和二甲磺酸盐具有相同的生物活性。
这些数据一起有力地表明，该玫瑰树碱衍生物具有作为抗肿瘤药开发的潜力。

Claims (29)

1.式(III)的9-羟基玫瑰树碱衍生物用于制造癌症治疗药剂的用途：
其任选为酸加成盐形式，
其中
X是具有2或3个碳原子的烃基，任选支化，并任选被OH、NRR’、CN、OR、COOR取代，其中R和R′独立地为H或C1-C4烃基；
Y是-NR1R2，其中R1和R2独立地为H或C1-C6烃基，或R1和R2与和它们相连的N原子一起形成饱和或不饱和的5-或6-元杂环，其中-NR1R2可以是由可药用无机或有机酸的加成产生的季铵盐形式，以致式(I)的化合物是酸加成盐形式；
或Y是苄基、苯基或C5或C6芳基或5-或6-杂芳基；且
Z-是可药用无机或有机酸的阴离子；
-X-Y侧链按适当连接到T、U、V或W上；
T、U、V和W是C原子或N原子以形成吡啶基环且其余T、U、V和/或W是C原子，
条件是-X-Y侧链连接到作为N原子的T、U、V和W之一上，
要理解的是，
Figure A200780022304C0002094522QIETU
按适当代表单键或双键，以使与稠合吡啶基环形成的体系是芳族的并形成所得阳离子
Figure A200780022304C00022
或
Figure A200780022304C00023
2.根据权利要求1的用途，其中所述9-羟基玫瑰树碱衍生物具有式(IV)：
其任选为酸加成盐形式，
其中X，Y和Z-如权利要求1中定义。
3.根据权利要求1或2的用途，其中X是乙基或丙基。
4.根据权利要求1至3的用途，其中Y是-NR1R2且R1和R2各自是乙基，其中-NR1R2可以是由可药用无机或有机酸的加成产生的季铵盐形式，以致式(I)的化合物是酸加成盐形式。
5.根据权利要求1至3任一项的用途，其中Y选自哌啶、吡咯烷基、吡啶和嘧啶，及其季铵盐。
6.根据权利要求1至4任一项的用途，其中所述9-羟基玫瑰树碱衍生物是
或其所得季铵盐。
7.根据权利要求1、2、3和5任一项的用途，其中所述9-羟基玫瑰树碱衍生物是
Figure A200780022304C00033
或其所得季铵盐。
8.根据权利要求1至7任一项的用途，其中Z-是甲磺酸根。
9.根据权利要求1、2、3、5和7任一项的用途，其中所述9-羟基玫瑰树碱衍生物是：
10.根据权利要求1至9任一项的用途，其中该药剂旨在逆转肿瘤细胞的转化表型。
11.根据权利要求1至10任一项的用途，其中所述肿瘤细胞以侵袭性表型为特征。
12.根据权利要求1至11任一项的用途，其中所述药剂旨在治疗转移。
13.根据权利要求1至12任一项的用途，其中所述药剂旨在治疗避开细胞毒性化疗的对象的癌症。
14.根据权利要求1至13任一项的用途，其中所述药剂与分化剂联合施用。
15.根据权利要求14的用途，其中所述分化剂选自维生素A及其合成类似物、类维生素A、维生素D及其类似物、和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)配体。
16.在可药用载体中包含如权利要求1至9任一项所定义的式(III)或(IV)的9-羟基玫瑰树碱衍生物和分化剂的药物组合物。
17.根据权利要求16的药物组合物，其中所述分化剂选自维生素A及其合成类似物、类维生素A、维生素D及其类似物、和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)配体。
18.包含如权利要求1至9任一项所定义的式(III)或(IV)的9-羟基玫瑰树碱衍生物和分化剂的产品，作为同时、分别或接连用于治疗癌症的联合制品。
19.根据权利要求18的产品，作为同时、分别或接连用于逆转肿瘤细胞的转化表型的联合制品。
20.根据权利要求18或19的产品，其中所述分化剂选自维生素A及其合成类似物、类维生素A、维生素D及其类似物、和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)配体。
21.式(III)的9-羟基玫瑰树碱衍生物：
Figure A200780022304C00051
其任选为酸加成盐形式，
其中
X是具有2或3个碳原子的烃基，任选支化，并任选被OH、NRR’、CN、OR、COOR取代，其中R和R′独立地为H或C1-C4烃基；
Y是-NR1R2，其中R1和R2独立地为H或C1-C6烃基，或R1和R2与和它们相连的N原子一起形成饱和或不饱和的5-或6-元杂环，其中-NR1R2可以是由可药用无机或有机酸的加成产生的季铵盐形式，以致式(I)的化合物是酸加成盐形式；
或Y是苄基、苯基或C5或C6芳基或5-或6-杂芳基；且
Z-是可药用无机或有机酸的阴离子；
-X-Y侧链按适当连接到T、U、V或W上；
T、U、V和W是C原子或N原子以形成吡啶基环且其余T、U、V和/或W是C原子，
条件是-X-Y侧链连接到作为N原子的T、U、V和W之一上，
要理解的是，按适当代表单键或双键，以使与稠合吡啶基环形成的体系是芳族的并且形成所得阳离子
Figure A200780022304C00053
或
Figure A200780022304C00054
条件是所述9-羟基玫瑰树碱衍生物不是2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium氯化物、2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐、2-(二异丙基氨基-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐、或2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐。
22.根据权利要求21的9-羟基玫瑰树碱衍生物，所述9-羟基玫瑰树碱衍生物具有式(IV)：
其任选为酸加成盐形式，
其中X，Y和Z-如权利要求19中定义，且
条件是所述9-羟基玫瑰树碱衍生物不是2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium氯化物、2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐、2-(二异丙基氨基-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐、或2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐。
23.根据权利要求22的9-羟基玫瑰树碱衍生物，其中X是乙基且Y是哌啶，条件是所述9-羟基玫瑰树碱衍生物不是2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium乙酸盐。
24.根据权利要求21至23任一项的9-羟基玫瑰树碱衍生物，其是2-(β哌啶子基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐或其所得季铵盐。
25.根据权利要求21至24任一项的9-羟基玫瑰树碱衍生物，其是：
26.根据权利要求21或22的9-羟基玫瑰树碱衍生物，其是2-(二乙基氨基-2-乙基)9-羟基ellipticinium甲磺酸盐或其所得季铵盐。
27.在可药用载体中包含根据权利要求21至26任一项的9-羟基玫瑰树碱衍生物的药物组合物。
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