CN101454347B

CN101454347B - 流感抗原、疫苗组合物和相关方法

Info

Publication number: CN101454347B
Application number: CN2007800080983A
Authority: CN
Inventors: 维达季·尤西波夫; 瓦季姆·梅特; 康斯坦丁·穆西查克
Original assignee: Fraunhofer USA Inc
Current assignee: Fraunhofer USA Inc
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2027-02-13
Also published as: WO2007095318A2; CA2642054A1; KR20080106433A; EP1984405A2; EP1984405A4; US20070275014A1; BRPI0707733B1; US8124103B2; WO2007095318A3; BRPI0707733A2; CN101454347A; JP2009526526A; CA2642054C; AU2007215080A1

Abstract

本发明涉及免疫学和蛋白工程领域的交叉，且详细来说涉及适用于预防由流感病毒所致的感染的抗原和疫苗。本发明提供重组蛋白抗原、组合物和用于产生和使用这些抗原和疫苗组合物的方法。

Description

流感抗原、疫苗组合物和相关方法

相关申请案

本申请案涉及2006年2月13日申请的U.S.S.N.60/773,378(′378申请案)和2006年6月15日申请的U.S.S.N.60/813,955(′955申请案)且依据35USC 119(e)主张其优先权；′139申请案和′955申请案的整体内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

无

背景技术

流感具有长久历史，其特征在于反复不断的流行性、传染性、复发性和爆发性。流感是高度接触传染病，其可以同等地对发展中和发达国家造成破坏。流感病毒对人群带来一种主要威胁。尽管每年都进行疫苗接种工作，但流感感染仍然导致实质发病率和死亡率。虽然几乎每年都发生流感流行病，但幸运的是大范围流行病并不经常发生。然而，最新流感菌株已经出现，使得我们再次面对流感大范围流行病的可能性。目前造成亚洲以及东欧区域的家禽流行病的H5N1型禽流感病毒已经持续地传遍全球。感染的快速传布以及禽类到人类个体的交叉物种传播增加人群爆发和大范围流行病风险的可能性。所述病毒具有高度致病性，导致超过50％的禽类死亡率以及已被确诊的少数人类病例。如果所述病毒实现人类向人类传播，那么其将具有导致快速且分布广泛的疾病和死亡的可能性。

疫苗接种是针对流感的主要防御。流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的片段负链RNA病毒。病毒抗原是高效免疫原，能够引发全身性与粘膜抗体反应。通常将流感病毒血凝素糖蛋白(hemagglutinin glycoprotein，HA)视为关于刺激中和抗体和疫苗设计的最重要病毒抗原。已展示病毒神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的存在对于针对病毒产生多臂保护性免疫反应至关重要。已经开发抑制神经氨酸酶活性的抗病毒素且其可为另一种针对感染的抗病毒治疗。认为离子通道蛋白M2是适用于产生流感抗病毒素和疫苗的第三种组分。

由从抗原更换产生的不同HA和NA表示流感病毒亚型。此外，由抗原漂移或产生新颖且不同抗原决定基的HA或NA分子的突变作用产生相同亚型的新菌株。尽管已证明15种HA抗原亚型，但这些亚型中仅三种，即H1、H2和H3已经广泛地在人类中循环。在工业化和不发达国家中，疫苗接种在追求高质量生活中已变得极为重要。大多数可获得疫苗仍遵循模拟感染形态以诱导可防止相关感染的免疫反应的基本原则。然而，各种亚型和组合的减毒病毒的产生可既耗时又价格不菲。新技术的出现，病原体分子生物学、发病机制和其与个体免疫系统的相互作用的深入了解已产生疫苗发展和疫苗传递的新方法。因此，尽管技术进步已提高产生改良的流感抗原疫苗组合物的能力，仍然需要提供疫苗和新抗原的另一个来源以用于产生疫苗来解决出现的亚型和菌株。需要提供廉价和高度可获得来源的这些治疗剂组合物的流感病毒亚型的改良疫苗设计和发展以及制备和使用这些组合物的方法。

发明内容

本发明提供在植物中产生的流感抗原和疫苗组分。本发明提供以与热稳定蛋白融合的形式产生的一种或一种以上流感抗原。本发明进一步提供含有流感抗原的疫苗组合物。此外，本发明提供包含至少两种不同的流感抗原的流感疫苗。在某些实施例中，本发明的组合物包括一种或一种以上植物组分。进一步提供用于产生和使用本发明的抗原和疫苗组合物的方法。

附图说明

图1-血凝素(HA)蛋白和蛋白域的示意图。左上部的数字1、2和3对应于本文所述的域1、2和3。域1、2和2、1折叠在一起以形成茎干域(SD)。域3为球状域(GD)。项目1-6中呈现的范围对应于HA的氨基酸位置。

图2-pET32质粒的图谱。左上部指示用于克隆标靶抗原的改良质粒中缺乏的T7启动子与T7终止子之间的区域。

图3-插入改良pET32a载体中的pET-PR-LicKM-KDEL和pET-PR-LicKM-VAC构建体的示意图。

图4-pBI121载体组织的示意图。

图5-切除GUS基因且添加从TMV获得的质粒后，从pBI载体获得pBID4质粒的示意组织。

图6-存在或无置入载体中的靶向序列的情况下，地衣多糖酶序列中HA、HA的域和NA融合的示意图。

图7A、B-表达LicKM和融合蛋白的植物提取物的地衣多糖酶检定。(7A)地衣多糖酶在本氏烟草(Nicotiana benihamiana)中的瞬时表达。样品：泳道1：阴性对照；泳道2：pBI-LicKM(比活性：5.5U/mg总蛋白)；泳道3、4：pBI-IV-LicKM(比活性：11.3U/mg总蛋白)；泳道5、6、7：pBI-IV-PR-LicKM(比活性：54.0U/mg总蛋白)。(7B)地衣多糖酶HA融合蛋白在植物中的酶谱(箭头)。样品：pBI-D4-PR-LicKM-HA(GD)-KDEL。图8-使用抗HA和抗LicB抗体，表达Lic-HA融合蛋白的植物提取物的西方分析。泳道：泳道1：MagicMark标样；泳道2：流感病毒对照；泳道3：来自植物的PR-LicKM-HA(GD)；泳道4：来自大肠杆菌的PR-LicKM-HA(GD)；泳道5：来自植物的LicKM-炭疽保护性抗原(anthrax PA)(阴性对照)。

图9-表达Lic-NA融合蛋白的植物提取物的地衣多糖酶检定。泳道：泳道1：LicKM对照；泳道2、3：LicKM-NA；泳道4、5：PR-LicKM-NA；泳道6、7：PR-LicKM-NA-KDEL。

图10-表达Lic-HA融合蛋白的植物提取物的西方分析。泳道：泳道1：LicKM对照，5ng；泳道2：PR-LicKM-NA-KDEL，接种后第5天；泳道3：PR-LicKM-NA-KDEL，接种后第7天；泳道4：PR-LichKM-NA-KDEL，接种后第9天；泳道5：PR-LichKM-NA-KDEL，接种后第12天；泳道6：LicKM-NA，接种后第7天；泳道7：PR-LicKM-NA，接种后第7天。

图11-使用植物表达的HA地衣多糖酶融合蛋白的红血球血凝作用检定。

图12-存在或无佐剂的情况下，以测试H5N1流感疫苗免疫的小鼠的抗体反应。

图13-存在或无佐剂的情况下，从经H5N1测试疫苗免疫的小鼠获得的血清稀释液的血凝作用活性抑制。

图14A-D-在H3N2流感测试疫苗和对照处理组中H3N2病毒攻击后的症状。(14A)临床症状得分的总平均最大结果。(14B)病毒攻击后鼻洗涤液中细胞计数的总平均最大结果。(14C)动物体重减轻的总平均最大结果。(14D)动物的温度变化的总平均最大值。

图15-在H3N2流感测试疫苗和对照处理组中H3N2病毒攻击后的病毒脱落。第1组描述阴性对照处理组的结果；第2组描述以测试物品1(CMB F1)处理的动物的结果；第3组描述以测试物品2(CMB F2)处理的动物的结果；第4组描述以测试物品3(CMBF3)处理的动物的结果；且第D组描述阳性对照处理动物的结果。N是指各组中评估的动物数(每组8只)。

图16-植物中产生的流感A/怀俄明(Wyoming)/3/03病毒抗原的表征。(16A)使用针对来自流感A/怀俄明/3/03病毒的纯化HA产生的绵羊血清，LicKM-(SD)和LicKM-(GD)的ELISA分析。分别使用同源病毒(A/W/3/03)和植物产生的NA作为阳性和阴性对照。(16B)使用针对LicKM(抗LicKM)产生的兔血清和针对流感A/怀俄明/3/03病毒的纯化HA(抗HA)产生的绵羊血清，LicKM-HA(SD)(泳道4)和LicKM-HA(GD)(泳道3)的免疫印迹法分析。LicKM(泳道2)和同源病毒(泳道1)用作对照。(16C)使用针对NIBRG-18重组病毒(抗H7N2)和NIBRG-17重组病毒(抗H7N1)产生的绵羊血清，NA的ELISA分析。使用针对NIBRG-18(抗H7N2)的绵羊血清评估的同源病毒(A/W/3/03)用作阳性对照。(16D)以针对NIBRG-18(抗H7N2)或NIBRG-17(抗H7N1)产生的绵羊血清预培育后，神经氨酸酶活性的菌株特异性抑制。展示三个复本的平均酶活性与标准偏差。

图17-来自经VC1加佐剂、VC2无佐剂或VC2加佐剂免疫的雪貂的血清的血凝作用抑制效价。在第一个剂量之前(免疫前)、第一个剂量(D1)后14天、第二个剂量(D2)后14天、第三个剂量(D3)后10天和攻击后(Post-Ch)4天收集血清样品。展示几何平均效价与标准偏差。

图18-经VC1加佐剂、VC2无佐剂或VC2加佐剂免疫的雪貂的攻击后监测。展示平均值与标准偏差，且使用ANOVA与针对多个测试的布弗尼(Bonferroni)校正进行数据统计分析。将统计显著性定义为p≤0.05。(18A)感染后脱落的病毒的峰值。(18B)感染后的最大重量损失。(18C)感染后的最高温度上升。(18D)感染后症状得分的峰值。(18E)感染后，每毫升鼻洗涤液样品的总白细胞计数的峰值。

具体实施方式

本发明涉及适用于制备针对流感感染的疫苗的流感抗原，和包含与热稳定蛋白操作性连接的所述流感抗原的融合蛋白。本发明涉及所提供抗原的产生方法，其包括(但不限于)在植物系统中产生。另外，本发明涉及包含本发明的抗原和融合蛋白的载体、融合蛋白、植物细胞、植物和疫苗组合物。更进一步提供针对个体流感感染诱导免疫反应的方法，其包含将本发明的疫苗组合物投与个体。

流感抗原

本发明的流感抗原蛋白包括任何能够针对流感病毒引发免疫反应的免疫原性蛋白或肽。通常，所关注的免疫原性蛋白包括流感抗原(例如流感蛋白、融合蛋白等)、其免疫原性部分或其免疫原性变体和上述任何物质的组合。

根据本发明使用的流感抗原可包括全长流感蛋白或流感蛋白的片段，和/或包含全长流感蛋白或流感蛋白的片段的融合蛋白。无论单独还是以融合蛋白形式利用流感蛋白的片段，所述片段都保留免疫活性(例如与抗流感抗体的交叉反应性)。基于针对病毒感染诱导免疫保护反应的能力，血凝素和神经氨酸酶为在产生疫苗方面所关注的一级抗原。诸如膜离子通道M2等其它抗原可用于产生疫苗(例如组合疫苗)以提高免疫保护的功效。

因此，本发明提供表达异源蛋白(例如流感抗原(例如流感蛋白或其片段、包含流感蛋白或其片段的融合蛋白))的植物细胞和植物。本发明的异源蛋白可包含所关注的任何流感抗原，其包括(但不限于)血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、膜离子通道M2(M2)、血凝素(HA)的一部分、神经氨酸酶(NA)的一部分和膜离子通道(M2)的一部分，或血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、膜离子通道M2(M2)、血凝素(HA)的一部分、神经氨酸酶(NA)的一部分和/或膜离子通道(M2)的一部分的融合蛋白、片段或组合。

在所属领域中已知多种不同流感HA、NA和M2蛋白(例如，来自不同亚型或菌株或分离物)的氨基酸序列且其在诸如基因库(GenBank)等公共数据库中可获得。以下提供现今尤其关注的两种流感亚型的HA和NA的例示性全长蛋白序列以及M2的序列：

V：越南(Vietnam)H5N1

HA(HAV)SEQ ED NO.：1：

AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTH

NGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFND

YEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIK

RSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGT8TLNQRLVPRIATRSKVNGQ

SGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA

INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQG

MVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLER

RIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELG

NGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSL

ALALMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

NA(NAV)SEQ ID NO.：2：

MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKL

AGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGT

VKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYN

GIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDA

PNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGT

GSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDI

VAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWS

WPDGAELPFTIDK

W：怀俄明(Wyoming)H3N2

HA(HAW)SEQ ID NO.：3：

MKTIIALSYILCLVFSQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSST

GGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRS

LVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPN

NEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYW

TIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI

TYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGT

GQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSY

NAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNG

TYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIR

CNICI

NA(NAW)SEQ ID NO.：4：

MPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVY

LTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCY

QFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWL

HVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKAD

TKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSS

YVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYE

TFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYELIRGRKQETEVLW

TSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI

流感香港(Hong Kong)M2蛋白SEQ ID NO.：5：LTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP

流感蛋白

血凝素

在某些实施例中，在本发明的疫苗组合物中利用全长血凝素(HA)。在一些实施例中，使用一个或一个以上HA的域。在某些实施例中，利用两个或三个或三个以上域作为一个或一个以上融合多肽中的一个或一个以上独立或连接在一起的多肽。某些例示性实施例提供包含HA的全长、域1-2和域2-1(本文中称为HA1_2)或域3的流感抗原。

H4越南[H5N1]：

H5N1 HA信号肽SEQ ID NO.：6：AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKS

H5N1 HA域1-2SEQ ID NO.：7：

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL

H5N1 HA域3SEQ ID NO.：33：

CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELK

HLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNN

TNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRME

FFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC

H5N1 HA域2-1SEQ ID NO.：8：

NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAI

AGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEA

VGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRL

QLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI

H5N1 HA跨膜域SEQ ID NO.：9：

LSIYSTVASSLALALMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

HAA/怀俄明(H3N2)

H3N2 HA信号肽SEQ ID NO.：10：MKTIIALSYILCLVFS

H3N2 HA域1-2SEQ ID NO.：11：

QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGI

H3N2 HA域3SEQ ID NO.：12：

CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVA

SSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEK

FDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIV

KPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC

H3N2 HA域2-1SEQ ID NO.：13：

NSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIEN

GWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSE

VEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDM

GNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL

H3N2 HA跨膜域SEQ ID NO.：14：

WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI

在某些实施例中，在本发明的疫苗抗原中利用全长神经氨酸酶(NA)抗原。在一些实施例中，使用NA的域。在某些实施例中，在本发明的抗原中提供两个或三个或三个以上域。某些例示性实施例提供包含全长NA但缺乏锚定肽序列的流感抗原。

神经氨酸酶

NA越南

H5N1 NA锚定肽SEQ ID NO.：15：MNPNQKIITIGSICMVTGIVS

H5N1 NA SEQ ID NO.：16：

LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKD

NSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEA

PSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES

ECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEIT

CVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGF

SFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHP

ELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK

H3N2 NA锚定肽SEQ ID NO.：17：

MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHF

H3N2 NA SEQ ED NO.：18：

KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFS

KDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMN

ELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKI

LRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYP

GVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGH

GVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYS

GIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI

尽管本文中提供例示性流感抗原的序列，且已针对例示性菌株提供HA和NA和M2的每一个的所述域，但应理解可替代地采用任何具有HA和/或NA和/或M2的域的免疫原性特征的序列。所属领域的技术人员将能够易于产生与所提供抗原具有至少75％、80％、85％或90％或90％以上一致性的序列。在某些实施例中，流感抗原包含包括那些与HA和/或NA和/或M2的域，或HA和/或NA和/或M2的域的一部分具有至少95％、96％、97％、98％或98％以上一致性的蛋白，其中抗原蛋白保留免疫原性活性。举例来说，与流感抗原具有足够一致性的保留免疫原性特征的序列能够结合与本文中提供的域(抗原)反应的抗体。免疫原性特征通常包括相关氨基酸或侧基的立体呈递。所属领域的技术人员可易于鉴别在序列上具有适度差异的序列(例如，在边界和/或某些序列替代物中具有差异，然而，仍保留免疫原性特征)。举例来说，可将边界接近(例如，在约15个氨基酸、14个氨基酸、13个氨基酸、12个氨基酸、11个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或1个氨基酸内)本文中在所指定氨基酸序列的任一末端指定的域边界的序列视为包含根据本发明的相关域。因此，本发明涵盖使用流感抗原的序列以包含接近域指定的残基。举例来说，已将HA的域工程改造且表达为同框融合蛋白以作为本发明的抗原(参见本文的例证)。另外，应理解可使用本文中提供的构建体和方法产生具有免疫原性的流感抗原(例如HA、NA、M2)的氨基酸序列的任何域、部分域或区域。此外，可分别和/或连续地组合域或子域以产生流感抗原。

已利用来自如本文中详细描述的特定亚型的血凝素、神经氨酸酶和M2的序列作为例示性抗原。存在各种亚型的流感病毒且当新亚型出现时，其经持续鉴别出。所属领域的技术人员应理解本文中提供的方法和组合物可适合于利用其它亚型的序列。本文中提供的方法和组合物涵盖且涵盖所述变化。

与热稳定蛋白的流感多肽融合蛋白质

在本发明的某些方面，提供包含融合多肽的流感抗原，所述融合多肽包含与热稳定蛋白操作性连接的流感蛋白(或其片段或变体)。可在所属领域中已知的任何可用表达系统中产生本发明的融合多肽。在某些实施例中，在植物或其部分(例如植物、植物细胞、根、芽等)中产生本发明的融合蛋白。

人类或动物细胞中未天然发现的酶或其它蛋白尤其适合于用于本发明的融合多肽中。当融合时赋予融合产物热稳定性的热稳定蛋白是适用的。热稳定性允许所产生蛋白保持构形，且将所产生蛋白保持在室温下。这一特征有利于融合多肽的简易、节省时间和节省成本的回收。根据本发明适用的热稳定酶的代表性家族为葡聚糖水解酶家族。这些酶特异性地裂解混合连接的多糖中邻近于1，3-β键的1，4-β糖苷键(汉(Hahn)等人，1994美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，91：10417)。在诸如燕麦和大麦等谷物中发现这些酶，且在包括热纤梭菌(C.thermocellum)的许多真菌和细菌物种中也发现了这些酶(金科瓦(Goldenkova)等人，2002，分子生物学(Mol.Biol.)36：698)。因此，用于本发明的融合多肽的所需热稳定蛋白包括糖苷酶。例示性热稳定糖苷酶蛋白包括以选自表A中所阐明的基因库登记号的基因库登记号所表示的蛋白，通过完全并入各参考登记号的基因库登录信息，将其内容各自以引用的方式并入本文中。用于本发明的融合蛋白中的例示性热稳定酶包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)P29716、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋红嗜热盐菌(Rhodthermus marinus)P45798，其是以引用其基因库登记号的方式各自并入本文中。实例中所说明的代表性融合蛋白利用从热纤梭菌分离的改良热稳定酶，然而，根据本发明可类似地利用任何热稳定蛋白。

表A：热稳定糖苷酶蛋白

当根据本发明设计融合蛋白和多肽时，当然需要保留抗原的免疫原性。另外，在本发明的某些方面需要提供提供融合蛋白热稳定性的构建体。这一特征有利于标靶抗原的简易、节省时间和节省成本的回收。在某些方面，可选择提供其它优势的抗原融合搭配物，所述优势包括提高免疫原性、并入多个疫苗决定子的可能性、缺乏对疫苗接种个体的预先免疫原性暴露。所关注的融合肽的其它有利性质包括提供并入一个或一个以上抗原的操作简易性的蛋白，以及具有对疫苗制剂赋予产生、纯化和/或调配简易性的能力的蛋白。所属领域的一般技术人员应理解立体呈递可影响这些有利特征中的每一种。因此，免疫性或优选性质的保留可影响(例如)融合搭配物的选择和/或融合位置的选择(例如N末端、C末端、内部、其组合)。或者或另外，优选可影响经选择用于融合的片段的长度，无论其为抗原长度，还是所选择融合搭配物的长度。

发明人已证明多种抗原与热稳定蛋白的成功融合。举例来说，已使用又称为地衣多糖酶(lichenase)的热稳定载运体分子LicB用于产生融合蛋白。LicB是来自热纤梭菌的1，3-1，4-β葡聚糖酶(LicB)(基因库登记号：X63355[gi：40697])。LicB属于球状蛋白家族。基于LicB的立体结构，其N和C末端彼此接近地位于表面上，非常接近于有效域。LicB还具有暴露于表面上的远离有效域定位的环结构。已产生构建体使得蛋白的环结构和N和C末端可用作流感抗原多肽的插入位点。流感抗原多肽可经表达为N或C末端融合蛋白质或表面环的插入物。重要的是，LicB在低pH值和高温下(高达75℃)保持其酶活性。因此，使用LicB作为载运体分子提供优势，包括标靶特异性免疫原性的可能提高、并入多个疫苗决定子的可能性和可以经鼻、经口或非经肠方式传递的疫苗的直接调配。此外，LicB融合蛋白质在植物中的产生应降低动物或人类病原体的污染风险。参见本文中提供的实例。

可在包括活体外与活体内系统的多种表达系统的任一个中产生本发明的包含流感抗原的融合蛋白。所属领域的技术人员将易于理解通常需要优化核酸序列以用于特定表达系统。举例来说，在本文提供的例证中，提供用于在植物中表达流感抗原-LicB融合蛋白质的优化序列。参见实例1。因此，任何编码根据本发明的流感抗原融合蛋白和其片段的相关核酸都打算涵盖在本发明的核酸构建体内。

对于在植物系统中产生，可利用表达流感抗原(例如流感蛋白或其片段或融合蛋白质)的转基因植物。或者或另外，可使用在所属领域中众所周知产生稳定生产作物的方法产生转基因植物。另外，可利用使用瞬时表达系统的植物产生流感抗原。当利用植物表达系统时，利用植物中转基因或瞬时表达，可根据系统对所需抗原的适用性，利用核表达、叶绿体表达、线粒体表达或病毒表达中的任一个。此外，可利用其它用于产生根据本发明的抗原和融合蛋白的表达系统。举例来说，可使用哺乳动物表达系统(例如哺乳动物细胞系(例如CHO等))、细菌表达系统(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫表达系统(例如杆状病毒)、酵母表达系统和活体外表达系统(例如网状组织溶解产物)表达本发明的抗原和融合蛋白。

产生流感抗原

根据本发明，可在任何所需系统中产生流感抗原(包括流感蛋白、其片段、变体和/或融合蛋白质)；产生不局限于植物系统。载体构建体和表达系统在所属领域中众所周知且可适合于结合使用本文中提供的流感抗原。举例来说，可在已知表达系统中产生流感抗原(包括片段、变体和/或融合蛋白质)，所述表达系统包括哺乳动物细胞系统、转基因动物、微生物表达系统、昆虫细胞系统和植物系统(包括转基因和瞬时植物系统)。尤其如果以融合蛋白形式产生流感抗原，那么可能需要在非植物系统中产生所述融合蛋白。

在本发明的一些实施例中，期望在植物系统中产生流感抗原。植物相对易于遗传操作，且具有数种优于诸如人类流体、动物细胞系、重组微生物和转基因动物等替代源的优点。植物对于蛋白具有类似于哺乳动物的完善的翻译后修饰机构(但应注意到植物与哺乳动物的糖基化模式之间存在某些差异)。这使得能够在植物组织中产生生物活性试剂。同时，植物可经济地产生极大量生物质，而无需复杂设施。此外，植物不受动物病原体污染。如脂质体和微囊一般，预期植物细胞提供抗原继代防胃肠道的保护。

可经由使用各种产生系统利用植物来产生异源蛋白。一种所述系统包括使用转基因/遗传修饰植物，其中将编码标靶产物的基因永久地并入植物的基因组中。转基因系统可产生作物产生系统。已在转基因植物中表达多种外来蛋白(包括许多哺乳动物起源的蛋白和许多疫苗候选物抗原)且其展示具有功能活性。(塔科特(Tacket)等人，2000，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，182：302；和山瓦拉(Thanavala)等人，2005，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，102：3378)。另外，向未经免疫的人类志愿者投与表达乙肝主要表面抗原的未经加工的转基因植物导致发生免疫反应(库塔(Kapusta)等人，1999，美国实验生物学联合会会志(FASEB J.)，13：1796)。

一种用于在植物中表达多肽的系统利用经工程改造以表达外来序列(例如瞬时表达)的植物病毒载体。这一方法允许使用健康非转基因植物作为快速产生系统。因此，遗传工程改造植物和经重组植物病毒感染的植物可充当“绿色工厂”以迅速产生和制备所关注的特异性蛋白。植物病毒具有某些使得其作为外来蛋白产生的表达载体具有吸引力的优势。已充分表征植物RNA病毒的数个成员，且感染性cDNA克隆可以用来促进遗传操纵。感染性病毒遗传物质进入易感宿主细胞后，其复制成高含量且在整个植物中迅速传布。存在数种使用植物病毒表达载体产生标靶多肽的方法，包括将标靶多肽并入病毒基因组中。一种方法包括工程改造感染细菌、动物或植物的病毒的外壳蛋白以充当抗原肽的载运体分子。所述载运体蛋白具有装配且形成在表面上显示所需抗原表位的重组病毒样颗粒的能力。由于疫苗候选物的微粒性质有利于从植物组织的简易且节省成本的回收，因此这一方法允许节省时间地产生疫苗候选物。其它优势包括增强的标靶特异性免疫原性，并入多个疫苗决定子的可能性和调配成可以经鼻、经口或非经肠方式传递的疫苗的简易性。举例来说，含有携带与外壳蛋白融合的病毒的抗原决定基的重组植物病毒颗粒的菠莱叶已在投与后产生免疫反应(莫德斯卡(Modelska)等人，1998，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，95：2481；和友斯博(Yusibov)等人，2002，疫苗(Vaccine)，19/20：3155)。

植物表达系统

根据本发明可利用对并入和/或维持异源核酸敏感且能够产生异源蛋白的任何植物。总的来说，通常需要利用在定义条件下、例如在温室中和/或在水系统中能够生长的植物。可能需要选择通常不由人类或驯养动物消费的植物和/或通常不为人类食物链的部分的植物，以便其可在外界生长而无需考虑可能不当摄取所表达聚核苷酸。然而，在一些实施例中，可能需要采用可食用植物。在特定实施例中，将需要利用在植物的可食用部分累积所表达多肽的植物。

通常，将由欲表达的特定聚核苷酸确定某些所需植物特征。仅举数个实例，当聚核苷酸编码欲以高产量产生的蛋白时(例如当将表达抗原蛋白时，情况通常如此)，通常需要选择具有相对较高生物质的植物(例如烟草，其具有其它优势，在于其对病毒性感染高度敏感，具有短生长期且不在人类食物链中)。如果聚核苷酸编码全部活性要求特定翻译后修饰(或由特定翻译后修饰抑制)的抗原蛋白，那么某些植物物种实现相关修饰(例如特定糖基化)的能力(或无能)可指导选择。举例来说，植物能够实现某些翻译后修饰(例如糖基化)，然而，植物将不产生哺乳动物翻译修饰后中所发现的硅化(sialation)模式。因此，抗原的植物产生可导致产生不同于替代系统中所产生的相同蛋白序列的实体。

在本发明的某些实施例中，利用作物植物或作物相关植物。在某些特定实施例中，使用可食用植物。

根据本发明使用的植物包括被子植物、苔藓植物(例如苔纲(Hepaticae)、藓纲(Musci)等)、蕨类植物(例如蕨类、楔叶类、石松植物)、裸子植物(例如针叶树、铁树(cycase)、银杏树(Ginko)、葛尼木类)和藻类(例如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)和裸藻纲(Euglenophyceae))。例示性植物为以下科的成员：豆科(Fabaceae)(豆属(Leguminosae)；例如豌豆、紫花苜蓿、大豆)；禾本科(Gramineae)(禾本属(Poaceae)；例如玉米、小麦、稻谷)；茄科(Solanaceae)，尤其西红柿属(Lycopersicon)(例如西红柿)、茄属(Solanum)(例如马铃薯、茄子)、番椒属(Capsium)(例如胡椒)或烟草属(Nicotiana)(例如烟草)；伞形科(Umbelliferae)，尤其胡萝卜属(Daucus)(例如胡萝卜)、旱芹属(Apium)(例如芹菜)，或芸香科(Rutaceae)(例如橙)；菊科(Compositae)，尤其莴苣属(Lactuca)(例如莴苣)；十字花科(Brassicaceae，Cruciferae)，尤其芸苔属(Brassica)或芥子属(Sinapis)。在某些方面，本发明的植物可为芸苔属或芥菜属(Arabidopsis)植物。某些例示性十字花科家族成员包括油菜(Brassica campestris)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、甘蓝型油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘蓝(B.oleraceae)、芥菜型油菜(B.tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)和萝卜(Raphanus sativus)。某些可转化改良且作为发芽秧苗可食用的适当植物包括紫花苜蓿、绿豆、萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、叶状植物(诸如卷心菜或生菜)、水田芥或水芹、草本植物(诸如欧芹、薄荷或三叶草)、花椰菜、西兰花、大豆、小扁豆、诸如向日葵的可食用花等。

将载体引入植物

通常根据已知技术将载体传递到植物。举例来说，可将载体本身直接施加到植物(例如经由研磨剂接种、机械化喷雾接种法、真空侵入、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外，可(例如从已感染植物)制备病毒颗粒，且可根据已知技术将其施加到其它植物。

已知多种病毒感染各种植物物种且可用于根据本发明的聚核苷酸表达(参见例如，病毒分类和命名法(The Classification and Nomenclature of Viruses)，“国际病毒分类委员会第6次报告(Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses)”，(摩非(Murphy)等人编)施普林格(Springer Verlag)：纽约，1995，其整体内容以引用的方式并入本文中；格日森(Grierson)等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，布莱克(Blackie)，伦敦，第126-146页，1984；格鲁兹曼(Gluzman)等人，分子生物学通讯：病毒载体(Communications in Molecular Biology：Viral Vectors)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约，第172-189页，1988；和马修(Mathew)，植物病毒在线(Plant Viruses Online)(http://image.fs.uidaho.edu/vide/)。在本发明的某些实施例中，传递共同允许病毒载体复制(和视情况细胞到细胞移动和/或长距离移动)的多个不同载体，而不是向植物细胞传递单一病毒载体。转基因植物的基因组可编码某些或所有蛋白。在本文中进一步详细描述的某些方面，这些系统包括一种或一种以上病毒载体组分。

载体系统包括两种异源植物病毒的组分以获得易于感染多种植物类型但造成极低或无感染传布风险的系统。先前已描述例示性系统(参见例如PCT公开案WO 00/25574和美国专利公开案2005/0026291，两者以引用的方式并入本文中)。如本文所述，在本发明的特定方面，例如通过侵入或机械接种、喷雾等将病毒载体施加到植物(例如植物、植物的部分、芽等)。如果欲通过将病毒基因组直接施加到植物实现感染，那么可使用任何可用技术未制备基因组。举例来说，许多根据本发明适用的病毒具有ssRNA基因组。可通过活体内或活体外基因组的DNA拷贝的转录或RNA拷贝的复制制备ssRNA。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网状组织溶解产物等)的易获得性，以及保持RNA载体的DNA拷贝的便利性，预期通常将通过尤其使用T7或SP6聚合酶的活体外转录制备本发明的ssRNA载体。

在本发明的某些实施例中，引入多个不同病毒载体而不是将单一病毒载体类型引入植物。这些载体可(例如)关于诸如复制、细胞到细胞移动和/或长距离移动等功能彼此反位互补。载体可含有编码本发明的流感抗原的不同聚核苷酸。可如上对于单一聚核苷酸或多肽所述，对表达多个编码一种或一种以上流感抗原的多肽的植物或其部分进行选择。

植物组织表达系统

如以上所讨论，根据本发明可在任何所需系统中产生流感抗原。载体构建体和表达系统为所属领域中众所周知且可适合于结合使用本文中提供的流感抗原。举例来说，已知转基因植物产生且可根据所属领域中已知的技术改变构建体的产生和植物产生。在某些实施例中，需要植物中的瞬时表达系统。这些系统中的两个包括克隆根和克隆植物系统和其衍生物的产生，以及发芽秧苗系统的产生。

克隆植物

克隆根保持RNA病毒表达载体且经延长时间段和多个继代培养均匀地在整个根中稳定产生标靶蛋白。与植物相反，如果在细胞到细胞移动或长距离移动期间经由重组消除标靶基因，那么在根培养物中病毒载体的完整性得以保持且标靶蛋白随时间产生的水平与在初始筛选期间所观察到的水平相似。克隆根允许简易地产生用于抗原和疫苗组合物的经口配方的异源蛋白材料。先前已描述用于产生多种从植物获得且适用于产生抗原的克隆实体(例如本发明的抗原蛋白)的方法和试剂且其在所属领域中已知(参见例如PCT公开案WO 05/81905，其以引用的方式并入本文中)。克隆实体包括能够产生抗原(例如本发明的抗原蛋白)的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物。本发明进一步提供用于在从各种植物组织(例如根、叶)获得的克隆细胞系和自单细胞(克隆植物)获得的完全植物中表达抗原聚核苷酸和多肽产物的方法和试剂。这些方法通常基于多种类型的植物病毒载体的使用。

举例来说，在一方面，本发明提供获得表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆根系的方法，其包含以下步骤：(i)将包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体引入植物或其部分；和(ii)从植物产生一种或一种以上克隆根系。可(例如)通过以引起毛根形成的农杆菌(Agrobacterium)(例如发根农杆菌(A.rhizogenes))感染植物或植物部分(例如所收集叶片)产生克隆根系。可以各种方法筛选克隆根系以鉴别保持病毒的根系、以高水平表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的根系等。本发明进一步提供克隆根系，例如根据本发明的方法产生的克隆根系，且进一步涵盖使用克隆根系表达聚核苷酸和产生编码本发明的流感抗原的多肽的方法。

本发明进一步提供产生表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆根细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将细胞保持在适于根细胞增殖的条件下。本发明提供克隆根细胞系和使用克隆根细胞系表达聚核苷酸且产生多肽的方法。

在一方面，本发明提供产生表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将培养物中的细胞保持在适于植物细胞增殖的条件下。本发明进一步提供产生表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤：(i)将包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体引入保持在培养物中的植物细胞系的细胞中；和(ii)富集含有病毒载体的细胞。可通过(例如)(i)从培养物移出一部分细胞；(ii)稀释所移出细胞以便降低细胞浓度；(iii)允许所稀释细胞增殖；和(iv)筛选含有病毒载体的细胞来进行富集。可使用克隆植物细胞系产生根据本发明的流感抗原。

本发明包括许多用于产生克隆植物的方法，所述植物的细胞含有包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体。举例来说，本发明提供产生表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将所释放细胞保持在适于形成植物的条件下。本发明进一步提供产生表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)产生克隆植物细胞系，其细胞含有基因组包含编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体；和(ii)将细胞保持在适于形成植物的条件下。一般而言，根据本发明的克隆植物可表达任何编码本发明的流感抗原的聚核苷酸。可使用这些克隆植物产生抗原多肽。

如上所述，本发明提供用于在克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系(例如从叶、茎等获得的细胞系)和克隆植物中表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的系统。使用基因组包括编码本发明的流感抗原且与启动子操作性连接(即在启动子控制下)的聚核苷酸的植物病毒载体将编码本发明的流感抗原的聚核苷酸引入植物祖细胞中。根据以下进一步描述的数种技术中的任一种从含有病毒的细胞建立克隆根系或克隆植物细胞系。可通过感染、以病毒转录产物或感染性cDNA克隆接种、电穿孔、T-DNA介导的基因转移等，将植物病毒载体或其部分引入植物细胞中。

以下部分描述用于产生表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物的方法。“根系”不同于“根细胞系”之处在于根系产生实际根样结构或根，而根细胞系选自由并未形成根样结构的根细胞组成。打算使用术语“系”表示所述系的细胞可增殖且将遗传信息传递给后代细胞。细胞系的细胞通常在不会成为诸如那些在完整植物中发现的组织结构的部分的情况下在培养物中增殖。打算使用术语“根系”表示根结构中的细胞可在不会成为完整植物的部分的情况下增殖。应注意术语“植物细胞”涵盖根细胞。然而，为区分本发明的用于产生根系和根细胞系的方法与那些用以从非根组织直接产生植物细胞系的方法(与从克隆根系或从克隆根系获得的克隆植物产生克隆植物细胞系相对比)，如本文中所用的术语“植物细胞”和“植物细胞系”通常指由非根植物组织组成的细胞和细胞系。植物细胞可为(例如)叶、茎、幼芽、花部分等。应注意如本文中所推断，可从所产生的克隆植物获得种子。当将从这些种子获得植物时，这些种子可能含有病毒载体。用于获得种子储备物的方法为所属领域中众所周知(参见例如美国专利公开案2004/093643)。

克隆根系

本发明提供用于产生使用植物病毒载体直接表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆根系的系统。根据多种已知方法中的任一种，将一个或一个以上包括编码本发明的流感抗原且与启动子操作性连接的聚核苷酸的病毒表达载体引入植物或其部分中。举例来说，可以病毒转录产物接种植物叶片。可将载体本身直接施加到植物(例如经由研磨剂接种、机械化喷雾接种法、真空侵入、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外，可(例如从已感染植物)制备病毒颗粒或可根据已知技术将其施加到其它植物。

如果通过将病毒基因组直接施加到植物实现感染，那么可使用任何可用技术制备病毒基因组。举例来说，许多根据本发明适用的病毒都具有ssRNA基因组。可通过活体内或活体外基因组的DNA拷贝的转录或RNA拷贝的复制制备ssRNA。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网状组织溶解产物等)的易获得性，以及保持RNA载体的DNA拷贝的便利性，预期通常将通过尤其使用T7或SP6聚合酶的活体外转录制备本发明的ssRNA载体。可使用感染性cDNA克隆。可根据所属领域中已知的方法使用(例如)农杆菌渗透法(agroinfiltration)，使用农杆菌介导的基因转移将诸如病毒载体(整个病毒基因组或其部分)等病毒核酸转移到植物细胞。

然后，可在适于病毒转录产物复制的条件下保持(例如培养或生长)植物或植物部分。在本发明的某些实施例中，病毒传布到初始接种的细胞外，例如从细胞到细胞局部地传布，和/或从初始接种的叶片系统地传布到其它叶片。然而，在本发明的某些实施例中，病毒未传布。因此，病毒载体可含有编码功能性MP和/或CP的基因，但可缺乏一种或全部所述基因。通常，将病毒载体引入(感染)植物或其部分中的多个细胞。

将病毒载体引入植物后，收集叶片。通常，可在引入病毒载体后任一时刻收集叶片。然而，将病毒载体引入植物后，可能需要将植物保持一段时间，例如一段对于病毒复制和视情况病毒从初始引入其的细胞传布来说足够的时间。通过(例如)以下进一步描述的已知方法制备克隆根培养物(或多个培养物)。

通常，可使用任何可用方法从已引入病毒载体的植物或植物组织制备克隆根培养物。一种所述方法采用在某些细菌质粒中存在的基因。在感染且将DNA转移到多种生物体的各种种类的农杆菌中发现这些质粒。作为一个属，农杆菌可将DNA转移到大型且不同组的植物类型，其包括许多双子叶与单子叶被子植物物种和裸子植物(参见例如，戈尔文(Gelvin)，2003，微生物与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)，67：16和其中的参考文献，其全部以引用的方式并入本文中)。植物细胞的遗传转化的分子基础是从细菌转移且整合入存在于各种农杆菌内的大型肿瘤诱导(Ti)或生根(Ri)质粒的区域的植物核基因组。当存在于质粒中时，将这一区域称为T区域，且当从质粒切除时称为T-DNA。通常，将单股T-DNA分子转移到天然存在的农杆菌感染状态的植物细胞且最终并入(以双股形式)基因组中。基于Ti质粒的系统广泛用于将外来遗传物质引入植物和用于产生转基因植物。

以各种农杆菌感染植物且转移T-DNA具有许多作用。举例来说，根癌农杆菌(A.tumefaciens)造成冠瘿病，而发根农杆菌造成在感染位点出现毛根，即称为“毛根病”的病状。各根是从单一遗传转化的细胞形成。因此，根中的根细胞为克隆细胞，且各根表示克隆细胞群体。发根农杆菌感染所产生的根的特征在于高生长速率和遗传稳定性(格里(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotech.Adv.)，18:1和其中的参考文献，其全部以引用的方式并入本文中)。另外，这些根能够再生遗传稳定植物(前述格里2000)。

通常，本发明涵盖使用任何农杆菌菌株，尤其发根农杆菌菌株，其能够诱导从植物细胞形成根。如上所述，Ri质粒的一部分(Ri T-DNA)是引起毛根病的原因。尽管Ri质粒的这一部分向植物细胞的转移可便利地通过用具有Ri质粒的农杆菌感染来实现，但本发明涵盖使用将相关区域引入植物细胞的替代性方法。这些方法包括将遗传物质引入植物细胞的任何可用方法，包括(但不限于)基因枪法、电穿孔、PEG介导的DNA吸收、Ti基载体等。可通过使用病毒载体将Ri T-DNA的相关部分引入植物细胞中。可将Ri基因纳入含有编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的相同载体中，或纳入不同病毒载体中，其可与含有编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的载体为相同或不同类型。应注意，如所属领域中已知，可能不需要整个Ri T-DNA用于产生毛根，且本发明涵盖使用Ri T-DNA的部分，条件是这些部分含有足够的遗传物质以诱导根形成。可将其它遗传物质(例如在Ri质粒而不是T-DNA中存在的基因)转移到本发明的植物细胞，尤其是表达产物有利于T-DNA整合入植物细胞DNA中的基因。

为制备本发明某些实施例的克隆根系，使所收集叶片部分在适于感染和转化的条件下与发根农杆菌接触。将叶片部分维持在培养物中以使毛根形成。各根为克隆的，即根的细胞是从其中转移有Ri T-DNA的单一祖细胞获得。根据本发明，这些祖细胞的一部分将含有病毒载体。因此，从所述祖细胞获得的根中的细胞可含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或实质上所有(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于子细胞在克隆根内遗传病毒载体，因此将病毒载体保持在根中各处并不需要病毒载体在根内移动。可从叶片部分移出个别克隆毛根且进一步培养。这些根在本文中又称为根系。分离后，分离的克隆根继续生长。

已使用本发明的方法产生多种不同克隆根系。使用含有编码本发明的流感抗原(例如编码流感多肽或其片段或融合蛋白)的聚核苷酸的病毒载体产生这些根系。通过西方印迹法(Western blot)测试根系。根系显示多种不同表达水平的各种多肽。选择显示高表达的根系且进一步培养。随后再次测试这些根系且其展示经长时间段保持高表达水平，表明稳定性。表达水平与经用以产生克隆根系的相同病毒载体感染的完好植物的表达相当或更大。另外，根系表达的稳定性优于经相同病毒载体感染的植物中所获得的稳定性。2-3次传代后，高达80％的这些病毒感染植物恢复为野生型。(这些传代包括以转录产物接种植物，允许感染(局部或系统性)确立，采取叶片样品且接种随后测试表达的新鲜植物)。

可大规模地培养根系用于产生如下文进一步讨论的本发明多肽的抗原。应注意通常可将克隆根系(和从克隆根系获得的细胞系)维持在不包括通常用于培养根和植物细胞的各种化合物(例如植物生长激素，诸如生长素、细胞分裂素等)的培养基中。这一特征极大地降低与组织培养相关的费用，且发明人预期其将显著促进使用植物产生蛋白的经济可行性。

可用多种方法中的任一种选择表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆根。西方印迹法、ELISA检定等可用于检测编码多肽。在诸如GFP等可检测标记物情况下，可执行诸如目视筛选等替代性方法。如果使用含有编码可选择性标记物的聚核苷酸的病毒载体，那么可施行适当选择(例如，可在适当抗生素或营养条件和经鉴别且分离的存活根存在的情况下，培养由此获得的叶片材料和/或根)。某些病毒载体含有两种或两种以上编码本发明的流感抗原的聚核苷酸，例如两种或两种以上编码不同多肽的聚核苷酸。如果这些聚核苷酸中的一种为可选择或可检测标记物，那么通过选择或检测标记物的表达而选择或检测的克隆根将具有也表达第二聚核苷酸的高可能性。也可以使用PCR和其它核酸检测方法进行含有特定聚核苷酸的根系的筛选。

或者或另外，可通过接种由于病毒感染将形成局部病变的宿主植物(例如过敏宿主植物)来筛选克隆根系中病毒的存在。举例来说，可在50μl磷酸盐缓冲液中将5mg根组织均质化且用以接种烟草植物的单一叶片。如果病毒存在于根培养物中，那么在2到3天内所感染叶片上将出现特征性病变。这意谓根系含有携带编码本发明的流感抗原(标靶基因)的聚核苷酸的重组病毒。如果无局部病变形成，那么不存在病毒，且根系作为阴性不合格。这一方法高度节省时间和成本。初始筛选病毒的存在后，可藉由(例如)西方印迹法或ELISA使含有病毒的根经历第二次筛选以选择高表达者。可应用其它筛选，例如筛选迅速生长、特定培养基中或特定环境条件下的生长等。通常，这些筛选方法可应用在本文所述的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和/或克隆植物的任一个的发育中。

如对于所属领域的技术人员将显而易见，可对本发明方法的描述进行多种改进以用于产生含有病毒载体的克隆根系。这些改进处于本发明的范围内。举例来说，尽管通常需要在引入Ri T-DNA基因之前将病毒载体引入完整植物或其部分中，但在本发明的某些实施例中，在引入病毒载体前引入Ri-DNA。另外，有可能使完整植物与发根农杆菌接触，而不是收集叶片部分然后将其暴露于细菌。

可使用从具有病毒载体的植物或其部分的单细胞产生克隆根系的其它方法(即，不使用发根农杆菌或来自Ri质粒的遗传物质的方法)。举例来说，已知以某些植物激素或植物激素的组合处理会导致从植物组织产生根。

从克隆根系获得的克隆细胞系

如上所述，本发明提供用于产生克隆根系的方法，其中根系细胞含有病毒载体。如所属领域中众所周知，可从根产生多种不同细胞系。举例来说，可使用多种已知方法从由根获得的个别根细胞产生根细胞系。可从根中的各种不同根细胞类型获得这些根细胞系。通常，收集根材料且解离(例如以物理方式和/或酶促消化)以释放个别根细胞，然后进一步培养。完整原生质体形成通常不必要。视需要，可在极稀细胞浓度下涂铺根细胞，以便从单一根细胞获得根细胞系。以此方式获得的根细胞系为含有病毒载体的克隆根细胞系。因此，这些根细胞系显示编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的稳定表达。可藉由(例如)在适当植物激素存在的情况下培养解离根细胞，以类似方式从克隆根获得克隆植物细胞系。可使用筛选和连续回合的富集来鉴别以高水平表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的细胞系。然而，如果获得细胞系的克隆根系已以高水平表达，那么所述其它筛选可能不必要。

如在克隆根系情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆根细胞系的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或实质上所有(至少98％)细胞将含有病毒载体。应注意由于克隆根细胞系内的子细胞遗传病毒载体，因此保持病毒载体并不需要病毒载体在细胞之中移动。如下所述，可使用克隆根细胞系产生编码本发明的流感抗原的聚核苷酸。

克隆植物细胞系

本发明提供用于产生使用植物病毒载体直接表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆植物细胞系的方法。根据本发明的方法，将一个或一个以上包括编码本发明的流感抗原且与启动子操作性连接的聚核苷酸的病毒表达载体引入维持在细胞培养物中的植物细胞系的细胞中。在所属领域中已知来自各种植物类型的许多植物细胞系，可使用其中任一种。可根据用于实践本发明的已知方法产生新近获得的细胞系。根据许多方法中的任一种，将病毒载体引入植物细胞系的细胞中。举例来说，可制备原生质体然后将病毒转录产物电穿孔入细胞中。可使用其它将植物病毒载体引入植物细胞系的细胞中的方法。

一种用于产生根据本发明的克隆植物细胞系和适于引入植物细胞(例如原生质体)中的病毒载体的方法可如下使用：在引入病毒载体后，可将植物细胞系维持在组织培养物中。在此时，病毒载体可复制，且编码本发明的流感抗原的聚核苷酸可得到表达。藉由(例如)连续富集法从培养物获得克隆植物细胞系。举例来说，可视情况在稀释同时，从培养物移出样品以便细胞浓度较低，且以个别液滴形式涂铺于皮氏培养皿(Petri dish)中。然后，保持液滴以允许细胞分裂。

应理解，视培养物的初始密度和稀释量而定，液滴可含有可变数目的细胞。如果需要在仅一轮富集后获得表达编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的克隆细胞系，那么可稀释细胞使得大多数液滴含有0或1个细胞。然而，选择浓度使得各液滴中存在多个细胞，且然后筛选液滴以鉴别那些含有表达细胞的液滴可能更为有效。通常，可采用任何适当筛选程序。举例来说，可使用诸如GFP等可检测标记物的选择或检测。可使用西方印迹法或EL1SA检定。个别液滴(100μl)含有过量细胞用于进行这些检定。进行多轮富集以连续地分离较高表达细胞系。可使用用于单细胞克隆的标准方法，通过进一步限制稀释来产生单克隆植物细胞系(即，从单一祖细胞获得的群体)。然而，不必分离个别克隆系。可使用含有多个克隆细胞系的群体用于表达编码一种或一种以上本发明的流感抗原的聚核苷酸。

通常，上述用于产生克隆根系的某些考虑因素适用于克隆植物细胞系的产生。举例来说，可使用多种含有一种或一种以上编码本发明的流感抗原的聚核苷酸的病毒载体，也可使用多个不同载体的组合。可使用相似筛选法。如在克隆根系和克隆根细胞系情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆植物细胞系的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或实质上所有(至少98％)细胞将含有病毒载体。应注意由于克隆植物细胞系内的子细胞遗传病毒载体，因此保持病毒载体并不需要病毒载体在细胞之中移动。如下所述，可使用克隆植物细胞系产生编码本发明的流感抗原的多肽。

克隆植物

可从根据上述各种方法产生的克隆根、克隆根细胞系和/或克隆植物细胞系产生克隆植物。用于从根、根细胞系和植物细胞系(诸如本文所述的克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系)产生植物的方法为所属领域众所周知(参见例如皮尔斯(Peres)等人，2001，植物细胞、组织、有机培养物(Plant Cell，Tissue，Organ Culture)，65：37；和本文中在别处引用的植物分子生物学和生物技术标准参考著作)。因此，本发明提供一种产生克隆植物的方法，其包含以下步骤：(i)根据上述本发明方法中的任一种产生克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物细胞系；和(ii)从克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物产生完全植物。克隆植物可根据标准方法繁殖且生长。

如在克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆植物的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、所有(100％)或实质上所有(至少98％)细胞将含有病毒载体。应注意，由于克隆植物内的子细胞遗传病毒载体，因此保持病毒载体并不需要病毒载体的移动。

芽和发芽秧苗植物表达系统

先前已描述用于产生多种适用于产生根据本发明的流感抗原的芽和发芽秧苗的系统和试剂且其在所属领域中已知(参见例如，PCT公开案WO 04/43886，其以引用的方式并入本文中)。本发明进一步提供可食用的发芽秧苗作为含有流感抗原的生物质。在某些方面，直接提供生物质用于消费含有抗原的组合物。在某些方面，生物质在消费前藉由(例如)均质化、粉碎、干燥或提取进行加工。在某些方面，从生物质纯化流感抗原且调配成医药组合物。

另外提供用于在可以活体消费或收集的发芽秧苗(例如芸苔(Brassica)属的芽、发芽秧苗)中产生流感抗原的方法。在某些方面，本发明包括使种子在封闭的可调控环境中(例如在户内、在容器中等)生长为可食用发芽秧苗。种子可为含有编码流感抗原的表达盒的遗传工程改造种子，所述流感抗原的表达由外源诱导型启动子驱动。可使用可由(例如)光、热、植物激素、营养素等诱导的多种外源诱导型启动子。

在相关实施例中，本发明提供在发芽秧苗中产生流感抗原的方法，所述方法首先通过使用农杆菌转化系统以编码流感抗原的表达盒使植物转化产生发芽秧苗的种子储备物，其中流感抗原的表达由诱导型启动子驱动。可从转化植物中获得转基因种子，使其在封闭的可调控环境中生长并诱导以表达流感抗原。

在某些实施例中，提供包括用编码流感抗原的病毒表达盒感染发芽秧苗的方法，所述流感抗原的表达可由病毒启动子或诱导型启动子中的任一个驱动。使发芽秧苗在封闭的可调控环境中生长2到14天或至少直到已获得对消费或收集来说足量的流感抗原。

本发明进一步提供在发芽秧苗中产生流感抗原的系统，所述系统包括气候可控制的容纳单元和含有编码一种或一种以上流感抗原的表达盒的发芽秧苗，其中表达由组成型或诱导型启动子驱动。所述系统可提供优于不可控制的户外环境或温室的独特优点。因此，本发明使得生长物能够精确合乎流感抗原表达的诱导。这可大大降低产生流感抗原的时间和成本。

在某些方面，瞬时转染的芽含有编码本发明流感抗原的病毒载体序列。使秧苗生长一段时间以允许在芽中产生病毒核酸接着生长一段产生多个病毒拷贝的时间，从而导致产生流感抗原。

在某些方面，使含有编码流感抗原的核酸的经遗传工程改造的种子或胚芽在封闭的可调控环境中生长到发芽秧苗阶段。封闭的可调控环境可为种子可在户内生长的容纳单元或房间。封闭的可调控环境的所有环境因素都可控制。由于芽的生长不需要光，且光照费用较高，因此可使经遗传工程改造的种子或胚芽在不存在光的情况下在户内生长到发芽秧苗阶段。

本发明的封闭的可调控环境中可调控的其它环境因素包括温度、湿度、水、营养素、气体(例如，O₂或CO₂含量或空气循环)、化学物质(小分子，诸如糖和糖衍生物；或激素，诸如植物激素赤霉酸或脱落酸等)等。

根据本发明的某些方法，编码流感抗原的核酸的表达可由外源诱导型启动子控制。使外源诱导型启动子响应于外部而不是内部刺激来增强或降低核酸表达。多种环境因素可充当经遗传工程改造的芽的表达盒所携载核酸的表达的诱导子。启动子可为热诱导型启动子，诸如热休克启动子(heat-shock promoter)。举例来说，使用热休克启动子，可使封闭环境的温度简单上升以诱导核酸表达。其它启动子包括光诱导型启动子。如果封闭的可调控环境中的光总是开启的，那么可维持光诱导型启动子作为组成型启动子。或者或另外，可在发育期间的特定时间通过简单地开启光启动核酸表达。启动子可为用于诱导核酸表达的化学诱导型启动子。根据这些实施例，可简单地将化学物质喷洒或喷雾在种子、胚芽或秧苗上以诱导核酸表达。可精确控制喷雾和喷洒且引导到预定的标靶种子、胚芽或秧苗上。封闭环境缺乏可使化学物质远离预定标靶分散的风流或气流，因此化学物质停留在预定标靶上。

根据本发明，可选择诱导表达的时间以使截至收集时间的发芽秧苗中的流感抗原表达最大。在特定生长阶段的胚芽中诱导表达、例如在萌芽后特定天数时胚芽中诱导表达可在收集时间时使得流感抗原的合成最大。举例来说，在萌芽后4天启动子诱导表达可使得蛋白合成比3天后或5天后启动子诱导表达多。所属领域的技术人员应了解可由常规实验实现表达最大化。在某些方法中，在萌芽后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天时收集发芽秧苗。

在表达载体具有组成型启动子而不是诱导型启动子的情况下，可在发芽秧苗转化后的某个时间收集发芽秧苗。举例来说，如果发芽秧苗在发育初期(例如胚芽阶段)经病毒转化，那么可在转化后表达达到最大值的时间，例如转化后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天收集发芽秧苗。视种子的萌芽而定，芽在转化后可能发育1、2、3或3个月以上。

通常，流感抗原表达开始后，允许种子、胚芽或发芽秧苗生长直到表达足量流感抗原。在某些方面，足量是当生食所收集生物质时将向患者提供治疗益处的量。或者或另外，足量是可从生物质浓缩或纯化流感抗原并调配成在投与后向患者提供治疗益处的医药组合物的量。流感抗原通常不是自然界中发芽秧苗中所表达的蛋白。无论如何，流感抗原通常以高于自然界中发芽秧苗中将出现的浓度的浓度表达。

诱导流感抗原表达后，允许继续生长直到发芽秧苗阶段，此时收集发芽秧苗。可收集活发芽秧苗。收集活发芽秧苗具有数个优点，包括最小工作量和破坏。可使本发明的发芽秧苗以水栽方式生长，使得收集成为从水栽法溶液中取出发芽秧苗的简单事情。虽然本发明的发芽秧苗的生长不需要土壤，但如果所属领域的技术人员认为必要或需要，那么可以提供土壤。因为芽可无需土壤而生长，所以在收集时不需要清洗发芽秧苗材料。能够在不洗涤或擦洗的情况下直接从水栽法环境中收集发芽秧苗使对所收集材料的破坏最小。植物的破坏和枯萎诱发细胞凋亡。细胞凋亡期间，某些蛋白水解酶变得具有活性，其会降解发芽秧苗中所表达的医药蛋白，从而导致蛋白的治疗活性降低。细胞凋亡诱导的蛋白水解可显著降低成熟植物的蛋白产率。使用本发明的方法，当不进行收集时可避免细胞凋亡直到从植物提取蛋白时为止。举例来说，可研磨、压碎或掺合活芽以制备发芽秧苗生物质于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中的浆液。可将缓冲液维持在约4℃下。在某些方面，将发芽秧苗生物质风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。如同在成熟植物中一般，这些方法中的某些(诸如风干)可导致医药蛋白的活性损失。然而，因为发芽秧苗非常小且具有大表面积与体积比，所以这很可能不发生。所属领域的技术人员应了解，可利用许多使所表达的蛋白的蛋白水解最小化的收集生物质的技术，且可将这些技术应用于本发明。

在某些实施例中，发芽秧苗可食用。在某些实施例中，收集后(例如，收集后即刻、收集后最短时间内)消费表达足量流感抗原的发芽秧苗以使得在消费发芽秧苗之前绝对无加工发生。以此方式，使在向需要治疗的患者投与流感抗原之前的任何收集诱导的流感抗原蛋白水解分解最小化。举例来说，可向患者直接传递就绪待消费的发芽秧苗。或者或另外，向需要治疗的患者传递经遗传工程改造的种子或胚芽并由患者使其生长到发芽秧苗阶段。在一个方面，向患者或治疗患者的医生提供一批经遗传工程改造的发芽秧苗，如此可培养表达某些所需流感抗原的发芽秧苗的连续储备。这对无法承担或交付昂贵医药的发展中国家的人群来说可能格外有价值。本发明发芽秧苗生长的简易性使得本发明的发芽秧苗尤其合乎所述发展中国家人群的需要。

封闭环境的可调控性质赋予本发明优于使植物在户外环境生长的优点。使在植物中表达医药蛋白的经遗传设计发芽秧苗生长通常提供比使遗传工程改造植物生长快的医药产品(因为植物在较小时收获)和少的工作量、风险和调控考虑因素。本发明所使用的封闭的可调控环境降低或消除自然界中植物异花受粉的风险。

举例来说，热诱导型启动子可能不在户外使用，因为户外温度不能控制。户外温度上升到超过某一水平的任一时刻，启动子都将开启。类似地，每当户外温度下降时，启动子都将关闭。所述温度转换可在一天内发生，例如白天开启表达，且晚上关闭表达。热诱导型启动子(诸如本文中所述的启动子)甚至将不适合用于易受几乎与户外同等程度的气候转换影响的温室中。经遗传工程改造植物在温室中的生长成本相当高昂。相反，在本发明系统中，每个变量都可控制，如此每次收集都可实现最大量表达。

在某些实施例中，可使本发明的发芽秧苗在可在发芽秧苗发育期间的任一时刻浇水、喷雾或喷洒的盘中生长。举例来说，可使盘配备有一个或一个以上可在发芽秧苗发育期间在特定时间且以精确量传递和/或去除水、营养素、化学物质等的浇水、喷雾、喷洒和排水设备。举例来说，种子需要足够水分来保持潮湿。过量水分穿过盘孔排出且进入房间地面的排水沟中。在将排出水排放返回到环境中之前，通常酌情处理以去除有害化学物质。

盘的另一个优点在于其可被容纳在极小的空间内。因为发芽秧苗的生长不需要光，所以含有种子、胚芽或发芽秧苗的盘可一个叠一个地垂直紧密堆叠，从而在为了达到这些目的特定构造的容纳设施中每单位占地面积提供大量生物质。另外，盘的堆叠可在容纳单元内以水平行排列。秧苗生长到适于收集的阶段(约2到14天)后，将个别秧苗盘以人工或自动方式(诸如，传送带)移到加工设施中。

本发明的系统独特之处在于其提供为流感抗原来源的发芽秧苗生物质。无论直接消费还是加工成医药组合物形式，因为发芽秧苗在封闭的可调控环境中生长，所以发芽秧苗生物质和/或从生物质获得的医药组合物都可以低成本提供给消费者。另外，发芽秧苗的生长条件可控制的事实使得产品质量和纯度一致。本发明的封闭的可调控环境避免可能阻止科学家在户外生长经遗传工程改造农产品的环境保护局(EPA)的许多安全规程。

转化芽

可使用多种方法转化植物细胞并产生经遗传工程改造发芽秧苗。两种可利用的要求在活体外产生转基因植物细胞系，接着使细胞系再生成完全植物的转化植物的方法包括根癌农杆菌介导的基因转移和基因枪法或电穿孔。病毒转化是在获得合乎需要的产物之前无实验或生育滞后，更快速且不太昂贵的转化可收集的胚芽和发芽秧苗的方法。对于这些技术中的任一种，所属领域的技术人员应了解怎样调整和优化传统上已经用于植物、种子、胚芽或发芽秧苗的转化方案。

农杆菌转化表达盒

农杆菌是革兰氏阴性根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表性属。这一物种造成植物肿瘤，诸如冠瘿病和毛根病。在作为肿瘤特征的去分化植物组织中，农杆菌产生称为冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物并由植物分解代谢。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制组件的便利来源。根据本发明，可使用农杆菌转化系统产生仅在比成熟植物较早时收集的可食用发芽秧苗。农杆菌转化方法可容易地用于再生表达流感抗原的发芽秧苗。

转化植物通常包括通过与携带植物/细菌载体的根癌农杆菌一起共培养使在组织培养物中生长的植物细胞转化。载体含有编码流感抗原的基因。农杆菌将载体转移到植物宿主细胞中，然后使用抗生素处理清除农杆菌。选择表达流感抗原的转化植物细胞，使之分化并最终再生成为完全植株(海伦斯(Hellens)等人，2000，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)，42：819；皮龙·史密兹(Pilon-Smits)等人，1999，植物生理学(Plant Physiolog.)，119：123；巴菲尔德(Barfield)等人，1991，植物细胞报告(Plant Cell Reports)，10：308；和瑞瓦(Riva)等人，1998，生物技术杂志(J.Biotech)，1(3)；其各自以引用的方式并入本文中。

用于本发明中的表达载体包括编码经设计用于在植物中操作的流感抗原的基因(或表达盒)以及表达盒的上游和下游的伴侣序列(companion sequence)。伴侣序列通常具有质粒或病毒起源且向载体提供必要的特征以将DNA从细菌转移到所需植物宿主中。

基本细菌/植物载体构建体可理想地提供宽宿主范围的原核生物复制起点、原核生物可选标记物。合适的原核生物可选标记物包括对诸如氨苄西林(ampicillin)或四环素(tetracycline)等抗生素的抗性。载体中可存在所属领域中众所周知的编码其它功能的其它DNA序列。农杆菌介导的DNA到植物染色体的转移需要农杆菌T-DNA序列。通常去除T-DNA的肿瘤诱导基因并用编码流感抗原的序列替换。保留T-DNA边界序列，因为其启动T-DNA区域整合入植物基因组中。如果流感抗原的表达不容易被检测到，那么细菌/植物载体构建体可包括适于确定植物细胞是否经转化的可选标记物基因，例如nptII卡那霉素(kanamycin)抗性基因。Ti序列在相同或不同细菌/植物载体(Ti质粒)上。Ti序列包括编码一组负责T-DNA切除、转移和整合于植物基因组中的蛋白的病原性基因(谢尔(Schell)，1987，科学(Science)，237：1176)。适于允许异源序列整合于植物基因组中的其它序列可包括用于同源重组的转座子序列(transposon sequence)等。

某些构建体将包括编码抗原蛋白的表达盒。在给定转化中可使用1、2或多个表达盒。除含有流感抗原编码序列外，重组表达盒还含有至少以下组件：启动子区域、植物5′未翻译序列、起始密码子(视表达基因是否具有其自身而定)以及转录和翻译终止序列。另外，本发明的表达盒或嵌合基因中可包括转录和翻译终止子。表达盒中酌情可包括允许蛋白加工和易位的信号分泌序列。例如，劳顿(Lawton)等人(1987，植物分子生物学(Plant Mol Biol)，9：315)和美国专利5,888,789(所述两篇文献以引用的方式并入本文中)中描述多种启动子、信号序列以及转录和翻译终止子。另外，通常利用抗生素抗性的结构基因作为选择因子(弗雷利(Fraley)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，80：4803，其以引用的方式并入本文中)。表达盒的5′和3′末端处的独特限制酶位点允许易于插入预先存在的载体中。描述用于农杆菌介导的转化且携带至少一个T-DNA边界序列的其它二元载体系统(PCT/EP99/07414，其以引用的方式并入本文中)。

再生

可收集、干燥、清洁转化植物的种子并测试其存活力和所需基因产物的存在和表达。这一点被测定后，通常就将种子储备物保存在在必要时将使用的适当温度、湿度、卫生和安全条件下。然后可(例如)如伊维恩斯(Evans)等人(植物细胞培养手册(Handbookof Plant Cell Cultures)，第1卷：麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.)纽约(New York)，1983，其以引用的方式并入本文中)和瓦斯尔(Vasil)(编，植物细胞培养和体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，学术出版社(Acad.Press)，奥兰多，佛罗里达州(Orlando，FL)，第I卷，1984和第III卷，1986，其以引用的方式并入本文中)所述，从所培养原生质体中再生完全植物。在某些方面，植物仅再生到发芽秧苗阶段。在一些方面，再生完全植物以产生种子储备物，且从种子储备物的种子产生发芽秧苗。

可由本发明转化原生质体可分离且经培养以产生完全再生植物的所有植物，如此回收含有转移基因的完全植物。已知几乎所有植物都可从培养细胞或组织再生，包括(但不限于)产生可食用幼芽的植物的所有主要物种。一些合适植物包括紫花苜蓿、绿豆、萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、叶状植物(诸如卷心菜或生菜)、水田芥或水芹、草本植物(诸如欧芹、薄荷或三叶草)、花椰菜、西兰花、大豆、小扁豆、可食用花(诸如向日葵)等。

再生方法随植物物种的不同而不同。然而，所属领域的技术人员应了解首先提供含有异源基因拷贝的转化原生质体的悬浮液。形成愈伤组织且可从愈伤诱发芽，接着生根。或者或另外，可从原生质体悬浮液诱导胚芽形成。这些胚芽如同天然胚芽一样萌芽以形成植物。将种子浸泡在水中或用水喷雾种子以使种子的水分含量增加到35-45％之间启始萌芽。为使萌芽继续进行，通常在控制温度和气流条件下将种子维持在经水饱和的空气中。培养基通常将含有各种氨基酸和激素，诸如生长素和细胞分裂素。向培养基中添加谷氨酸和脯氨酸是有利的，尤其对诸如紫花苜蓿等物种来说。幼芽和根通常同时发育。有效再生将视培养基、基因型和培养历史而定。如果这三个变量受到控制，那么再生完全可重现和可重复。使从转化植物细胞长成的成熟植物自花授精，且鉴别非分离纯合转基因植物。近亲繁殖的植物产生含有本发明抗原编码序列的种子。根据本发明，可使这些种子萌芽并生长到发芽秧苗阶段以产生流感抗原。

在相关实施例中，本发明的种子可形成为种子产物且与关于如何使秧苗生长到适当发芽秧苗阶段以投与或收集于医药组合物中的说明书一起出售。在某些相关实施例中，可从本发明的近亲繁殖的植物发展体现所需特性的杂交种或新种类。

直接整合

本发明可通过基因枪法或电穿孔将DNA片段直接整合于植物细胞基因组中(例如参见，奇科特(Kikkert)等人，1999，植物：组织培养协会杂志(Plant.J.Tiss.Cult.Assoc，)35：43；巴特斯(Bates)，1994，分子生物技术(Mol.Biotech.)，2：135)。更具体来说，可由多种技术将表达本发明流感抗原的载体引入到植物细胞中。如上所述，载体可包括用于植物细胞中的可选标记物。载体可包括允许在二级宿主中选择和繁殖的序列，诸如含有复制起点和可选标记物的序列。二级宿主通常包括细菌和酵母。在一实施例中，二级宿主是细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)，复制起点是colEl型复制起点)，且可选标记物是编码氨苄西林抗性的基因。所述序列在所属领域中众所周知且可购得(例如，克隆泰克(Clontech)，帕洛阿尔托，加利福尼亚州(Palo Alto，CA)；或斯群他根(Stratagene)，拉霍亚，加利福尼亚州(La Jolla，CA))。

本发明的载体可经修饰为含有与根癌农杆菌载体具有同源性的区域、来自根癌农杆菌的T-DNA边界区域和上述抗原编码核酸或表达盒的中间植物转化质粒。其它载体可包括根癌农杆菌的缓和(disarmed)植物肿瘤诱发质粒。

根据这一实施例，本发明载体的直接转化可能包括通过使用微量吸液管机械转移重组DNA将载体直接微量注射于植物细胞中(例如参见，克罗斯威(Crossway)，1985，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，202：179，其以引用的方式并入本文中)。可使用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中(例如参见，克莱恩斯(Krens)等人，1982，自然(Nature)，296：72)。另一将核酸引入植物中的方法通过小珠粒或粒子基质内或表面上具有核酸的小粒子的高速弹道渗透(例如参见，克莱因(Klein)等人，1987，自然(Nature)，327：70和克努德森(Knudsen)等人，植物(Planta)，185：330)。另一引入方法是使原生质体与其它实体(小型细胞、细胞、溶酶体或其它可融合脂质表面体)融合(例如参见，费雷利(Fraley)等人，1982，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，79：1859)。本发明载体可由电穿孔法引入植物细胞中(例如参见，佛姆(Fromm)等人，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，82：5824)。根据这一技术，在含有基因构建体的质粒存在的情况下电穿孔植物原生质体。高磁场强度的电脉冲可逆性地渗透生物膜，从而允许引入质粒。电穿孔植物原生质体重整细胞壁分割且形成植物愈伤组织，愈伤组织可再生以形成本发明的发芽秧苗。所属领域的技术人员应了解如何利用这些方法转化可用于产生可食用发芽秧苗的植物细胞。

病毒转化

类似于常规表达系统，可使用植物病毒载体产生全长蛋白，包括全长抗原。根据本发明，可使用植物病毒载体感染种子、胚芽、发芽秧苗等并在其中产生抗原。可使用病毒系统表达从短肽到大型复杂蛋白等所有东西。尤其，例如麦克考米克(McCormick)等人(1999，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，96：703；库玛盖(Kumagai)等人，2000，基因(Gene)，245：169和维奇(Verch)等人，免疫方法杂志(J.ImmunolMethods)，220：69；其全部以引用的方式并入本文中))描述使用烟草花叶病毒载体。因此，植物病毒载体具有已证明的表达短肽以及大型复杂蛋白的能力。

在某些实施例中，利用宿主/病毒系统产生表达流感抗原的转基因幼芽。由病毒感染产生的转基因幼芽提供已经证明安全的转基因蛋白来源。举例来说，幼芽未受动物病原体污染。不同于(例如)烟草，来自可食用幼芽的蛋白至少在理论上可不经纯化即用于经口应用，因此成本显著降低。另外，病毒/幼芽系统提供较简单、价格较低廉的扩大规模和制造的路径，因为将转基因引入可在数日内生长到工业规模的病毒中。相反，转基因植物在足够的种子或植物材料可供大规模试验或工业化利用之前可能需要长达5-7年。

根据本发明，植物RNA病毒作为外来蛋白表达的载体具有某些使其引人注意的优点。大量植物RNA病毒的分子生物学和病理学经充分表征，且存在相当多的关于病毒生物学、遗传学和调控序列的知识。大多数植物RNA病毒具有小基因组，且感染性cDNA克隆可用于促进遗传操纵。感染性病毒材料进入易感宿主细胞后，其复制达到高水平，且快速传遍整个发芽秧苗(培育后1到10天)。病毒粒子可容易且经济地从受感染发芽秧苗组织回收。病毒具有使得能够使用单一构建体感染数种易感物种的宽宿主范围。这些特征可容易地转移到幼芽上。

通常可通过用所需序列替换一个病毒基因、通过将外来序列在适当位置处插入病毒基因组或通过使外来肽与病毒的结构蛋白融合从植物RNA病毒表达外来序列。此外，可组合任何这些方法以通过反位互补(trans-complementation)病毒的生活机能来表达外来序列。存在许多不同策略作为使用烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus，AlMV)和其嵌合体在病毒感染植物中表达外来序列的手段。

AlMV的基因组代表病毒的雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)且由三个基因组RNA(RNAs1-3)和亚基因组RNA(RNA4)组成。基因组RNAs1和RNAs2分别编码病毒复制酶蛋白P1和P2。基因组RNA3编码细胞到细胞移动蛋白P3和外壳蛋白(coat protein，CP)。从基因组RNA3合成的亚基因组RNA4翻译CP，且CP为起始感染所需。研究已证明CP参与多种功能，包括基因组激活、复制、RNA稳定性、症状形成和RNA封装(例如参见波尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，46：73；范德沃森(Van Der Vossen)等人，1994，病毒学(Virology)，202：891；俞斯波维(Yusibov)等人，病毒学(Virology)，208：405；俞斯波维(Yusibov)等人，1998，病毒学(Virology)，242：1；波尔(Bol)等人，(综述，100篇参考文献(Review,100refs.))，1999，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol)，80：1089；德格拉夫(De Graaff)，1995，病毒学(Virology)，208：583；贾斯帕斯(Jaspars)等人，1974，病毒研究进展(Adv.Virus Res.)，19：37；洛谢费里斯(Loesch-Fries)，1985，病毒学(Virology)，146：177；尼尔曼(Neeleman)等人，1991，病毒学(Virology)，181：687；尼尔曼(Neeleman)等人，1993，病毒学(Virology)，196：883；范德库衣(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，183：731和范德库衣(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，185：496)。

使病毒从种子、胚芽或发芽秧苗的接种部分长距离移动到未接种部分和系统性感染通常需要封装病毒粒子。根据本发明，接种可在植物发育的任何阶段发生。在胚芽和芽中，接种病毒的传布将非常快。AlMV病毒颗粒由独特的CP(24kD)封装，形成超过1种类型的粒子。粒子的尺寸(长度为30到60nm且直径为18nm)和形状(球形、椭球形或杆状)视封装RNA的尺寸而定。装配后，认为AlMV CP的N-末端位于病毒粒子的表面上且似乎不干扰病毒装配(波尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，6：73)。另外，在N末端处具有另一38个氨基酸的肽的ALMV CP在活体外形成粒子且保留生物活性(俞斯波维(Yusibov)等人，1995，普通病毒学杂志(J..Gen.Virol)，77：567)。

AlMV具有宽宿主范围，包括大量农业上有价值的作物植物，包括植物种子、胚芽和幼芽。这些特征一起使ALMV CP成为载运体分子的极佳候选物，且使AlMV成为在发育的幼芽阶段在植物中表达外来序列的有吸引力候选载体。此外，从诸如TMV等异源载体表达后，AlMV CP在不干扰病毒感染性的情况下封装TMV基因组(俞斯波维(Yusibov)等人，1997，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，94：5784，其以引用的方式并入本文中)。这允许使用TMV作为与外来序列融合的AlMV CP的载运体病毒。

烟草花叶病毒属的原型TMV具有由经17.0kD CP封装的单一正义RNA组成的基因组，其产生杆状粒子(长度为300nm)。CP是TMV的唯一结构蛋白且为受感染宿主中病毒封装和长距离移动所需(塞托(Saito)等人，1990，病毒学(Virology)，176：329)。从基因组RNA翻译183kD和126kD蛋白且其为病毒复制所需(石川(Ishikawa)等人.，1986，核酸研究(Nucleic Acids Res).，14：8291)。30kD蛋白是病毒的细胞到细胞移动蛋白(美什(Meshi)等人，1987，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)，6：2557)。从亚基因组mRNA翻译移动蛋白和外壳蛋白(亨特(Hunter)等人，1976，自然(Nature)，260：759；布鲁宁(Bruening)等人，1976，病毒学(Virology)，71：498；和比奇(Beachy)等人，1976，病毒学(Virology)，73：498；其各自以引用的方式并入本文中)。

转化植物组织的其它方法包括转化植物的花。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转化可通过将植物花浸泡在根癌农杆菌的溶液中来达成(库提斯(Curtis)等人，2001，转基因研究(Transgenic Res.)，10：363；青(Qing)等人，2000，分子育种：植物改良中的新策略(Molecular Breeding：New Strategies in Plant Improvement)，1：67)。在“浸泡”植物所产生的种子群体中形成转化植物。在花发育期间的特定时间点，气孔存在于子房壁中，根癌农杆菌穿过气孔进入子房的内部。位于子房内部后，根癌农杆菌使个别胚珠增殖并转化(德斯菲克斯(Desfeux)等人，2000，植物生理学(Plant Physiology)，123：895)。转化胚珠沿袭子房内种子形成的典型路径。

抗原的产生和分离

通常可使用所属领域中已知的标准方法培养或生长本发明的植物、植物细胞和/或植物组织(例如，克隆植物、克隆植物细胞、克隆根、克隆根系、芽、发芽秧苗、植物等)以产生抗原。已采用多种培养基和生物反应器来培养毛根细胞、根细胞系和植物细胞(例如参见，格里(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotechnol.Adv.)，18：1；雷奥(Rao)等人，2002，生物技术进展(Biotechnol Adv.)，20：101和前述两者中的参考文献，其全部以引用的方式并入本文中)。可以任何合适的方式使克隆植物生长。

在某一实施例中，本发明的流感抗原可由任何已知方法产生。在某些实施例中，流感抗原表达于植物或其部分中。根据所属领域中已知的常规条件和技术分离和纯化蛋白。这些技术包括诸如提取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等方法。本发明涉及使用所属领域中已知和本文中提供的多种植物表达系统(包括本文中所述的病毒植物表达系统)中的任一种纯化流感抗原和可承受地扩大流感抗原的产生规模。

在本发明的许多实施例中，将希望分离流感抗原用于疫苗产品。当本发明蛋白从表达其的植物组织或其部分(例如，根、根细胞、植物、植物细胞)产生时，对于从植物材料部分或完全分离中的任一情况来说，可使用本文中进一步详述的方法或所属领域中已知的任何适用方法。当希望从表达表达产物的一些或所有植物细胞或组织中分离表达产物时，可采用任何可利用的纯化技术。多种分馏和分离程序为所属领域的一般技术人员所熟悉(例如参见，斯考普斯(Scopes)等人，蛋白纯化：原理与实践(Protein Purification.Principles and Practice)，第3版，杰逊(Janson)等人，1993；蛋白纯化：原理、高分辨率方法和应用(Protein Purification：Principles，High Resolution Methods，andApplications)，威利-VCH(Wiley-VCH)，1998；施普林格(Springer-Verlag)，纽约(NY)，1993；和罗意(Roe)，蛋白纯化技术(Protein Purification Techniques)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2001；其各自以引用的方式并入本文中)。通常将希望使产物变得超过约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯。关于适用于从植物组织或流体纯化物质的某些方法的讨论，例如参见美国专利6,740,740和6,841,659。

所属领域的技术人员应了解，获得所需流感抗原产物的方法是提取。可提取植物材料(例如，根、叶片等)以从残余生物质中移出所需产物，从而增加产物的浓度和纯度。可在缓冲溶液中提取植物。举例来说，可将植物材料以1∶1重量比转移到一定量的已经(例如)磷酸盐缓冲液缓冲的冰冷水中。需要时可添加蛋白酶抑制剂。可通过剧烈掺合或研磨使植物材料瓦解，同时悬浮于缓冲溶液中，且通过过滤或离心移出所提取的生物质。可进一步由其它步骤纯化溶液中所携带的产物或通过冷冻干燥或沉淀转化为干粉。提取可通过挤压进行。植物或根可通过在挤压机中挤压或通过将其穿过相距紧密的滚筒压碎来提取。根据所属领域中众所周知的方法收集和加工从压碎植物或根中挤出的流体。通过挤压提取使得产物以更浓的形式释放。然而，产物总产率可能比在溶液中提取产物时低。疫苗

本发明提供用于治疗用途的医药抗原蛋白，诸如作为流感感染的治疗性和/或预防性治疗的疫苗具有活性的流感抗原(例如，流感蛋白或其免疫原性部分，或包含流感蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白)。另外，本发明提供兽医用途，因为所述流感抗原在兽医应用中具有活性。在某些实施例中，可由本发明的植物或其部分(例如，根、细胞、芽、细胞系、植物等)产生流感抗原。在某些实施例中，所提供的流感抗原表达于植物、植物细胞和/或植物组织(例如，芽、发芽秧苗、根、根培养物、克隆细胞、克隆细胞系、克隆植物等)中，且可从植物直接使用或经部分纯化或纯化以用于医药投与个体的制剂的形式使用。

本发明提供表达流感抗原的植物、植物细胞和植物组织，其当投与有需要的个体时保持医药活性。例示性个体包括脊椎动物(例如，哺乳动物，诸如人类)。根据本发明，个体包括兽医学个体，诸如牛、羊、犬、猫等。在某些方面，将治疗有效量的可食用植物或其部分(例如芽、根)经口投与个体。在某些方面，在如本文所述的医药制剂中提供一种或一种以上流感抗原。

本发明的疫苗组合物包含一种或一种以上流感抗原。在某些实施例中，将至少两种本发明的流感抗原包括于所投与疫苗组合物中。

根据本发明，以流感抗原疫苗治疗个体打算引发生理学效应。疫苗蛋白针对病症或疾病可具有治愈性或缓和性特性，且可经投与以改善、减轻、缓解疾病或病症，延迟疾病或病症的发作，逆转或降低疾病或病症的症状或严重程度。包含流感抗原的疫苗可具有预防性特性且可用于预防或延迟疾病发作，或减轻所出现的所述疾病、病症或病理学病状的严重程度。以根据本发明的抗原治疗个体所引发的生理学效应可包括有效免疫反应，使得生物体感染受阻。

在某些实施例中，通过经口和/或粘膜途径传递本发明的疫苗。经口和/或粘膜传递具有预防粘膜组织感染(这是许多病原体感染的首要途径)的可能性。经口和/或粘膜传递可引发全身性免疫反应。在用于经口投与刺激粘膜免疫系统且可引发全身性免疫性的抗原的异源表达系统的开发方面已经取得很大进展。然而，关于传递经口疫苗的先前尝试已证明需要大量抗原实现功效。因此，大量标靶抗原的经济产生是产生有效经口疫苗的前提。表达抗原(包括热稳定抗原)的植物的出现代表解决这些难题的更现实方法。

可以多种方式将本发明的医药制剂投与个体，诸如经口、经鼻、经肠、非经肠、肌肉内或静脉内、经直肠、经阴道、局部、经眼、经肺或通过接触敷用。在某些实施例中，通过将植物直接投与个体，将在植物或其部分中表达的流感抗原经口投与个体。在某些方面，提取和/或纯化植物或其部分中表达的疫苗蛋白且用于制备医药组合物。可能需要调配这些分离产物用于其预期用途(例如作为药剂、疫苗组合物等)。在某些实施例中，将需要调配产物与某些或所有表达其的植物组织。

如果需要调配产物与植物材料，那么通常将需要使用对相关受体(例如人类或其它动物)不具有毒性的植物。适当考虑保持所表达产物的活性的情况下，可根据所属领域中已知的技术简单收集相关植物组织(例如细胞、根、叶片)且加工。在本发明的某些实施例中，可食用植物(和尤其植物的可食部分)中需要具有表达的流感抗原，以便可随后食用所述材料。举例来说，如果经口传递后(当适当地调配时)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中产生抗原蛋白且调配所表达流感抗原用于连同某些或所有表达蛋白的植物材料一起经口传递。

可根据已知技术调配所提供疫苗抗原(即本发明的流感抗原)。举例来说，可连同一种或一种以上有机或无机、液体或固体、医药学上适当载剂材料一起调配有效量的疫苗产物。根据本发明产生的疫苗抗原可以诸如片剂、胶囊、药片、分散液、悬浮液、溶液、凝胶药丸、药丸、囊片、乳膏剂、软膏剂、气溶胶、粉状产品袋、液体溶液、溶剂、稀释剂、表面活性剂、等渗剂、稠化或乳化剂、防腐剂和固体粘合剂等剂型使用，只要所述剂型不破坏蛋白的生物活性即可。

通常，组合物可包含多种不同医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂中的任一种，或一种或一种以上所述载剂、佐剂或媒剂的组合。如本文中所用，术语“医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂”包括与医药投与相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。可充当医药学上可接受的载剂的材料包括(但不限于)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原质水；等渗盐水；林葛尔氏溶液(Ringer′ssolution)；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁等其它无毒性可相容润滑剂，以及根据调配者的判断着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂可存在于组合物中(同样参见，雷明顿医药科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第十五版，埃里克W.马丁(E.W.Martin)，麦克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚，1975)。举例来说，可借助于常规混合粒化糖衣药丸制备法、溶解、冻干或相似方法提供医药组合物形式的疫苗抗原产物。

其它疫苗组分

本发明的疫苗可另外包括任何适当佐剂以当投与个体时增强疫苗的免疫原性。举例来说，所述佐剂可包括(但不限于)皂皮树(QS)提取物，包括食品级QS的纯化子部分，诸如Quil A和QS-21；明矾、氢氧化铝、磷酸铝、MF59、Malp2、弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)；完全弗氏佐剂；3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)。其它佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如如WO 96/02555中所揭示的未甲基化CpG序列。预期诸如上文提及的不同佐剂的组合提供为TH1细胞反应的优选刺激剂的佐剂。例如QS21可连同3D-MPL一起调配。QS21：3DMPL的比率通常将为约1∶10到10∶1、1∶5到5∶1和通常实质上1∶1。最佳协同作用的所需范围可为2.5∶1到1∶1 3D-MPL：QS21。适用于人类疫苗调配物的纯化QS提取物的剂量为每公斤体重0.01毫克到10毫克。

应注意到某些热稳定蛋白(例如地衣多糖酶)本身可证明免疫反应增强活性，使得所述蛋白在具有流感抗原的融合蛋白质中的使用或独立使用可视为佐剂使用。因此，本发明的疫苗组合物可进一步包含一种或一种以上佐剂。某些疫苗组合物可包含两种或两种以上佐剂。此外，视配方和投与途径而定，特定配方和/或组合中可能需要某些佐剂。

在某些情况下，可能需要通过减缓皮下或肌肉内注射的疫苗产物(例如蛋白)的一种或一种以上组分的吸收来延长本发明的疫苗的作用。这可通过使用具有弱水溶性的晶态或非晶态材料的液体悬浮液来实现。产物的吸收率则视其溶解速率而定，而溶解速率又可视大小和形式而定。或者或另外，通过将产物溶解或悬浮于油性媒剂中实现非经肠投与的产物的延迟吸收。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解聚合物中形成蛋白的微胶囊基质来制备可注射储槽形式。视产物与聚合物的比率和所采用特定聚合物的性质而定，可控制释放速率。可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。可通过在与身体组织相容的脂质体或微乳液中截留产物制备储槽式可注射配方。可使用替代聚合物传递媒剂用于经口配方。举例来说，可使用诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原质、聚原酸酯和聚乳酸等生物可降解、生物相容性聚合物。可(例如)组合聚合物传递媒剂将抗原或其免疫原性部分调配成微粒。

可将疫苗抗原的经肠投与制剂以固体、半固体、悬浮液或乳液形式引入，且可与任何医药学上可接受的载剂(诸如水、悬浮剂和乳化剂)混合。尤其当作为预防措施投与时，可借助于泵或缓释形式投与抗原，以便预防个体疾病发生或改善或延迟已确诊疾病。可将补充活性化合物并入组合物中或与组合物一起投与，例如针对欲治疗的疾病或临床病状独立地具有活性的化合物，或增强本发明化合物的活性的化合物。可使用食用香料和着色剂。

视情况连同植物组织一起，本发明的疫苗产物尤其充分适合于作为医药组合物经口投与。可使用经口液体配方且其对于儿童群体可具有特定效用。视所需治疗产品的特性和其所需形式而定，可以多种方式(例如风干、冷冻干燥、提取等)中的任一种加工所收集植物材料。可经口单独摄取或连同食物或饲料或饮料一起摄取如上所述的这些组合物。用于经口投与的组合物包括植物；植物提取物；和从以干粉形式提供的感染植物纯化的蛋白、食物、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水醇溶液、乳液或悬浮液，其包括盐水和缓冲介质非经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林葛尔氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖或不挥发性油的林葛尔氏溶液。干粉的实例包括任何已干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的植物生物质。举例来说，可通过将植物置于商业空气干燥器中约120华氏度下，直到生物质含有小于5重量％水份来风干植物。可储存所干燥植物用于进一步加工成大块固体或通过研磨进一步加工成具有所需粒度的粉末。或者或另外，冷冻干燥可用于对风干敏感的产物。可通过将产物置于真空干燥器中且在真空下干燥冷冻直至生物质含有小于约5重量％的水份来冷冻干燥产物。可如本文所述进一步加工干燥材料。

可将从植物获得的材料作为草本制剂或连同一种或一种以上草本制剂一起投与。适用的草本配方包括液体和固体草本制剂。草本制剂的某些实例包括酊剂、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎剂、干燥制剂(例如风干、喷雾干燥或冷冻干燥)、粉末(例如冻干粉末)和液体。可在任何诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂量等标准传递载剂中提供草本制剂。所属领域的技术人员将了解各种可用于本发明的配方和传递草本制剂的形式。

本发明的根系、细胞系、植物、提取物、粉末、干燥制剂和纯化蛋白或核酸产物等可在存在或无如上所述的一种或一种以上赋形剂情况下呈囊封形式。诸如片剂、糖衣药丸、囊剂、药丸和颗粒剂等固体剂型可使用涂层和外壳(诸如肠溶衣)、释放控制涂层和医药调配技术中众所周知的其它涂层来制备。在所述固体剂型中，可将活性剂与至少一种诸如蔗糖、乳糖或淀粉等惰性稀释剂混合。所述剂型可包含(与正常生产一样)除惰性稀释剂以外的其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，诸如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂及药丸情况下，剂型可包含缓冲剂。其可视情况含有遮光剂且可具有活性成份仅或优选地在肠道的某一部分中和/或以延迟方式释放的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和石蜡。

在某些方法中，将表达根据本发明的流感抗原的植物或其部分或其生物质作为医用食物经口投与。如果呈固体形式，那么通常通过生食消费所述可食用组合物，或如果呈液体形式，那么通过饮用消费。可在无预加工步骤情况下，或在最小限度的烹饪制备后，直接摄取植物材料。举例来说，可使疫苗蛋白在可直接食用的芽中表达。举例来说，疫苗抗原在紫花苜蓿芽、绿豆芽或菠菜或莴苣叶片芽等中表达。在一实施例中，可加工植物生物质且摄取加工步骤后回收的材料。

根据本发明适用的加工方法为通常用于食物或饲料工业的方法。这些方法的最终产物通常包括实质量的所表达抗原且其可便利地食用或饮用。可将最终产物与其它诸如盐、载剂、风味增强剂、抗生素等食物或饲料形式混合，且以固体、半固体、悬浮液、乳液或液体形式消费。这些方法可包括保存步骤，诸如巴氏消毒法、蒸煮或添加保存和防腐剂。在本发明中可使用且加工任何植物以产生可食用或可饮用植物物质。可使用探针或产物的特异抗体，通过所属领域中的标准方法(例如凝胶电泳、ELISA或西方印迹法分析)测试从植物获得的制剂中流感抗原的量。可使用这个测定将所摄取疫苗抗原蛋白的量标准化。举例来说，可通过(例如)混合具有不同水平的产物的产物批次以便待饮用或食用以摄取单一剂量的材料的量可标准化，测定且调节疫苗抗原的量。然而，本发明的封闭的可调控环境应使进行所述标准化程序的需要最小。

优选地，可由消化系统吸收植物细胞或组织中产生且由个体食用的疫苗蛋白。仅经最低限度地加工的植物组织摄取的一个优势是提供蛋白在植物细胞中的囊封或隔离。因此，在达到肠之前产物可接收至少某些免于在上消化道中消化的保护，且较高比例的活性产物将可用于吸收。

可治疗性地或预防性地投与本发明的医药组合物。组合物可用以治疗或预防疾病。举例来说，可治疗患有疾病或处于发展疾病的风险中的任何个体。应理解未诊断具有任何疾病症状的情况下，个体可视为处于发展疾病的风险中。举例来说，如果已知个体已经或将要处于具有暴露于流感感染的相对高风险的情形中，那么个体将被视为处于发展疾病风险中。类似地，如果个体家族的成员或朋友已经诊断患有流感感染，那么可将个体视为处于发展疾病风险中。

用于经口投与的液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除含有活性剂之外，液体剂型还可含有通常用于所属领域的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和其混合物。除包括惰性稀释剂之外，经口组合物还可包括佐剂，诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

用于经直肠或经阴道投与的组合物可为栓剂或保留灌肠剂，其可通过将本发明的组合物与在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此融化于直肠或阴道腔中且释放活性蛋白的适当无刺激性赋形剂或载剂(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备。

用于局部、经粘膜或经皮投与本发明疫苗组合物的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。当可能需要时，在无菌条件下混合活性剂或其制剂与医药学上可接受的载剂和任何所需防腐剂或缓冲液。对于经粘膜或经皮投与，在调配物中可使用适合于待渗透的障壁的渗透剂。这些渗透剂通常在所属领域中已知且包括(例如对于经粘膜投与)清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可经由使用经鼻喷雾剂或栓剂实现经粘膜投与。对于经皮投与，如所属领域中通常已知，可将抗原或其免疫原性部分调配成软膏剂、药膏、凝胶或乳膏剂。预期眼用配方、滴耳剂和滴眼剂在本发明的范围内。另外，本发明预期使用具有提供疫苗蛋白向身体的受控传递的附加优点的经皮贴片。通过将疫苗产品悬浮或分配在适当培养基中制备这些剂型。可使用吸收增强剂增加疫苗蛋白在皮肤上的通量。可通过提供速率控制膜或通过将疫苗蛋白分散于聚合物基培养基或凝胶中来控制速率。

以实现所需结果必需的量和时间投与本发明的组合物。在本发明的某些实施例中，医药组合物的“治疗有效量”为可有效治疗、削弱或预防个体疾病的量。因此，如本文中所用的“可有效治疗、削弱或预防疾病的量”是指治疗、削弱或预防任何个体疾病的医药组合物的无毒但足够的量。举例来说，“治疗有效量”可为治疗、削弱或预防感染(例如病毒性感染、流感感染)等的量。

视个体的种类、年龄和总体状况、疾病阶段、特定医药混合物、其投与模式等而定，所需确切量可随个体不同。可将本发明的流感抗原(包括表达抗原的植物和/或其制剂)调配成单位剂型，以便于剂量的投与和均一性。如本文中所用的措辞“单位剂型”是指适合于欲治疗患者的疫苗组合物的物理上离散单位。然而，应了解本发明的组合物的总日用量将在正确医学判断范围内由主治医生决定。用于任何特定患者或生物体的特定治疗有效剂量水平可视多种因素而定，包括感染严重程度或风险；所采用特定化合物的活性；所采用特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别；患者的饮食；患者的药物代谢动力学状况；投与时间；投与途径；和所采用特定抗原的排泄速率；治疗持续时间；与所采用疫苗组合物组合或同时使用的药物；和医疗技术中众所周知的类似因素。

应了解可在组合疗法(例如组合疫苗疗法)中使用本发明的疫苗组合物，即可与一个或一个以上其它所需医药和/或疫苗接种程序同时、在其之前或之后投与医药组合物。组合疗法中欲采用的疗法(例如，疫苗、流感感染的治疗性治疗)的特定组合通常将考虑所需治疗剂和/或程序与欲实现的所需治疗效果的相容性。应理解所采用的疗法和/或疫苗对于相同病症(例如，投与另一流感疫苗的同时投与本发明的抗原)来说可实现所需效果，或其可实现不同效果。

在某些实施例中，疫苗组合物包含至少两种流感抗原。举例来说，某些疫苗组合物可包含至少两种本发明的流感抗原(例如，本发明的含有HA域和NA域的抗原)。在某些方面，所述组合疫苗可包括一种包含流感抗原的热稳定融合蛋白；在某些方面，提供两种或两种以上包含流感抗原的热稳定融合蛋白。

如果利用组合疫苗，那么应了解可使用流感抗原的任何组合用于所述组合。组合物可包括多种流感抗原，包括本文中提供的多种抗原。此外，组合物可包括一种或一种以上本文中提供的抗原与一种或一种以上其它抗原。流感抗原的组合包括从一种或一种以上各种亚型或菌株获得的流感抗原，使得免疫赋予针对一种以上感染类型的免疫反应。流感抗原的组合可包括至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或更多从不同亚型或菌株获得的抗原。在某些组合中，将至少2种或至少3种来自不同亚型的抗原组合于一个疫苗组合物中。此外，组合疫苗可利用流感抗原和来自一种或一种以上独特传染原的抗原。

试剂盒

在一方面，本发明提供包括根据本发明的流感抗原的医药包装或试剂盒。在某些实施例中，医药包装或试剂盒在一个或一个以上以视情况本发明的医药组合物的一种或一种以上其它成份填充的容器中包括产生根据本发明的流感抗原的活发芽秧苗、克隆实体或植物，或含有疫苗的制剂、提取物或医药组合物。在某些实施例中，医药包装或试剂盒包括在一个或一个以上视情况以本发明的医药组合物的一种或一种以上其它成份填充的容器中包含根据本发明的纯化流感抗原的医药组合物。在某些实施例中，医药包装或试剂盒包括其它经批准用作组合疗法的治疗剂(例如流感抗原、流感疫苗)。视情况与所述容器相关联的可为由管理医药产品的制造、使用或销售的政府机关所指定形式的布告，所述布告反映政府机关对用于人类投与的制造、使用或销售的批准。

提供包括治疗剂的试剂盒。仅作为一个非限制性实例，可以经口配方形式提供流感疫苗且作为疗法投与。或者或另外，可以可注射配方形式提供流感疫苗以用于投与。在某些实施例中，可以可吸入型配方形式提供流感疫苗以用于投与。可在试剂盒中提供医药剂量或其说明书用于投与患有或处于流感感染风险中的个体。

以下代表性实例打算辅助说明本发明，且并不打算也不应解释为限制本发明的范围。实际上，根据本文件的全部内容，包括以下实例和本文中引用的科学和专利文献的参考，本发明的各种改进和除本文所示且描述的实施例之外的许多其它实施例对于所属领域的技术人员将显而易见。以下实例含有在各种实施例和其等效物中可适合于实践本发明的信息、例证和指导。

例证

实例1-产生疫苗候选物构建体

从流感病毒血凝素产生抗原序列

合成编码流感病毒类型越南H5N1和怀俄明H3N2中每一种的HA茎干域(SD)1-2和HA球状域(GD)3的核苷酸序列且证实其为恰当的。以限制性核酸内切酶BgIII/HindIII消化所产生核酸，用于BgIII/HindIII的位点已经工程改造于编码域的序列的两端。将所得DNA片段同框融合到编码工程改造热稳定载运体分子的序列。

HA越南[TH5N1]

(SD域1-2)：HA1_2V：(SEQ ID NO.：19)：

AGATCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATAC

AATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACA

ACGGAAAGTTGGGAGGAGGAAACACTAAGTGCCAGACTCCAATGGGAGCTATTAACTC

TTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGA

AGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCACAAAGAGAGAGGAGA

AGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAAG

GAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCT

GCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTAT

TATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTIGAGA

GGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTA

CAACGCTGAGCTTCTTGTGCTTATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTA

ACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAGGAGCT

TGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAGTCTGTTA

GGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGA

GATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTAAGCTT

(SD域1-2)：HA1_2V：(SEQ ID NO.：20)：

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKINTKCQTPMGAINSSMPFHNIH

PLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYH

HSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNLERRIENLNKKMED

GFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCD

NECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI

(GD域3)：HA3V：(SEQ ID NO.：21)：

AGATCTTGCGATCTTGATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGA

TGGCTTCTTGGAAACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATT

GTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGTTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGA

GGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAA

AGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGG

GAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCA

ACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAAT

TCACCATCCAAATGATGCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACA

TTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTA

AGGTGAACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGAT

GCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGT

GAAGAAGGGAGATTCTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAAGCTT

(GD域3)：HAV3：(SEQ ID NO.：8)：

CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELK

HLLSRNHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNN

TNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRME

FFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC

(全长)：HAS_V：(SEQ ID NO.：22)：

GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTG

TCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTGATCAAATCTGCATTG

GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGAC

TGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTGCGATCTTG

ATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAACC

CAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAAC

CCAGTTAATGATCTTTGCTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCT

TCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATC

TCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTT

CAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTT

ACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAATTCACCATCCAAATGAT

GCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTC

TACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAAT

CTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAG

TCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTC

TACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTCCAA

TGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGT

GCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCA

CAAAGAGAGAGGAGAAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTG

AGGGAGGATGGCAAGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCA

GGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTA

ACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAG

TTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCC

TTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTTCTTGTGTTGATGGAGAACGAGAGGACTCTT

GATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGA

TAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGT

GCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGA

CTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTCA

CCATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC

HAA/怀俄明(H3N2)

(SD域1-2)：HA1_2W：(SEQ ID NO.：23)：

AGATCTCAAAAGTTGCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCA

CGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAA

ACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACTGGAGGAATTGGAGGAGGAAACTCTGAG

TGCATTACACCTAATGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGAT

TACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAA

TGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATT

GAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCATCAGAATTCTG

AGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAAC

GGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGG

AGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAA

GATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTAT

TGATCTTACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGG

AGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGC

TTGCATTGAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTC

TTAACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATT

CTTAAGCTT

(SD域1-2)：HA1_2：(SEQ ID NO.：24)：

QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGINSECITPNGSIPN

DKPFQNVNRITYGACPRVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWY

GFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYV

EDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKC

DNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL

(GD域3)：HA3W：(SEQ ID NO.：25)：

AGATCTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCACTCTTATTGATGCT

CTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGA

AAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAG

GAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGG

AGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTTTCTTCTC

TAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTIAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCC

AAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATT

CTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAGGT

CTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGGGATATTTCTTCT

AGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCTTATTAACTCTACT

GGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGAAAGTCATCTATTAT

GAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAAGCTT

(GD域3)：HA3W：(SEQ ID NO.：12)：

CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVA

SSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEK

FDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIV

KPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC

(全长)：HASW：(SEQ ID NO.：26)：

GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTG

TCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAAGTTGCCAGGAA

ACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCAAACGGAACTATTG

TGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCA

TCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCAC

TCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGG

ATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATT

ACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTT

TCAACTGGGCTGGAGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAAC

AAGTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTT

AACGTGACTATGCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCA

CCCAGTTACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGT

GTCTACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGA

GGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTC

TTATTAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGA

AAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCATTAC

TCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGATTACTTATG

GAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATGAGGAA

TGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATG

GATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAAC

TGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGT

TGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCT

GAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATC

TTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGA

CTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGC

TGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTG

AGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAAC

AGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTCTTCATCA

TCACCACCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC

从流感病毒神经氨酸酶产生抗原序列

合成编码流感病毒类型越南H5N1(NAV)和怀俄明H3N2(NAW)中每一种的神经氨酸酶的核苷酸序列且证实其为恰当的。以限制性核酸内切酶SalI消化所产生核酸，用于SalI的位点已工程改造于编码域的序列的两端。将所得DNA片段同框融合入编码工程改造热稳定载运体分子的序列的C末端。

NAV(N1)：(SEQ ID NO.：27)：

GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGT

CTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACCTTAT

GCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTTGGGTGTCACACTCTATTCACACTGGAAACCA

GCATCAGTCTGAGCCAATTTCTAACACTAACCTTTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGT

TAAGTTGGCTGGAAACTCTTCTCTTTGCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAAGGA

TAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGGGAGCCATTCATTT

CTTGCTCTCACCTTGAGTGCCGTACTTTCTTCCTTACTCAGGGTGCTCTTCTTAACGATAA

GCACTCTAACGGAACTGTGAAGGATAGGTCTCCACACAGGACTCTTATGTCTTGTCCAG

TTGGAGAAGCTCCATCTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTG

CTTGCCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAACGGAGCT

GTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAAGTCTTGGAGGAACAA

CATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGCGTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGAT

GACTGATGGACCATCTAATGGACAGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGA

AAGGTTGTGAAGTCTGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTG

CTATCCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGATCTAACA

GGCCATGGGTGTCATTCAATCAGAACCTTGAGTACCAGATTGGTTACATTTGCTCTGGA

GTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGAACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATC

TAATGGAGCTGGAGGAGTGAAGGGATTCTCTTTCAAGTACGGAAACGGAGTTTGGATTG

GAAGGACTAAGTCTACTAACTCTAGGAGTGGATTCGAGATGATTTGGGACCCAAACGG

ATGGACTGAGACTGATTCTTCTTTCTCTGTGAAGCAGGATATTGTGGCTATTACTGATTG

GAGTGGATACTCTGGATCTTTCGTTCAGCACCCAGAGCTTACTGGACTTGATTGCATTAG

GCCATGCTTCTGGGTTGAACTTATTAGGGGAAGGCCAAAGGAGTCTACTATTTGGACTT

CTGGATCTTCTATTTCTTTCTGCGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAG

ATGGAGCTGAGCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAG

GATGAGCTTTGACTCGAG

NAV：(SEQ ID NO.：16)：

LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKD

NSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEA

PSPYNSRFEESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES

ECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEIT

CVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGF

SFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHP

ELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK

NAW(N2)：(SEQ ID NO.：28)：

GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGT

CTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACAAGCA

GTACGAGTTCAACTCTCCACCAAACAACCAGGTTATGCTTTGCGAGCCAACTATTATTG

AGAGGAACATTACTGAGATTGTGTACCTTACTAACACTACTATTGAGAAGGAGATTTGC

CCAAAGTTGGCTGAGTACCGTAATTGGTCTAAGCCACAGTGCAACATTACTGGATTCGC

TCCATTCTCTAAGGATAACTCAATTAGGCTTTCTGCTGGAGGAGATATTTGGGTTACAA

GGGAGCCATACGTTTCTTGCGATCCAGATAAGTGCTACCAGTTCGCTCTTGGACAAGGA

ACTACTCTTAACAACGTGCACTCTAACGATACTGTGCACGATAGGACTCCATACCGTAC

TCTTTTGATGAACGAGCTTGGAGTTCCATTCCACCTTGGAACTAAGCAAGTGTGCATTGC

TTGGTCATCTTCATCTTGCCACGATGGAAAGGCTTGGCTTCATGTTTGCGTGACTGGAGA

TGATGAGAACGCTACTGCTTCTTTCATCTACAACGGAAGGCTTGTGGATTCTATTGTTTC

TTGGTCTAAGAAGATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGTGTGCATTAACGGAACTT

GCACTGTGGTTATGACTGATGGATCTGCTTCTGGAAAGGCTGATACAAAGATTCTTTTC

ATTGAGGAGGGAAAGATTGTGCACACTTCTACTCTTTCTGGATCTGCTCAGCATGTTGA

GGAGTGTTCTTGCTACCCAAGGTATCCAGGAGTTAGATGTGTGTGCCGTGATAACTGGA

AGGGATCTAACAGGCCAATTGTGGATATTAACATTAAGGATTACTCTATTGTGTCATCTT

ATGTGTGCTCTGGACTTGTTGGAGATACTCCAAGGAAGAACGATTCTTCTTCATCTTCAC

ACTGCCTTGATCCAAATAACGAGGAGGGAGGACATGGAGTTAAGGGATGGGCTTTCGA

TGATGGAAACGATGTTTGGATGGGAAGGACTATTTCTGAGAAGTTGAGGAGCGGATAC

GAGACTTTCAAAGTGATTGAGGGATGGTCTAACCCAAATTCTAAGCTGCAGATTAACAG

GCAAGTGATTGTGGATAGGGGAAACAGGAGTGGATACTCTGGAATTTTCTCTGTGGAGG

GAAAGTCTTGCATTAACAGATGCTTCTACGTGGAGCTTATTAGGGGAAGGAAGCAGGA

GACTGAGGTTTTGTGGACTTCTAACTCTATTGTGGTGTTCTGCGGAACTTCTGGAACTTA

CGGAACTGGATCTTGGCCAGATGGAGCTGATATTAACCTTATGCCAATTGTCGACCATC

ATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAG

NAW：(SEQ ID NO.：18)：

KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFS

KDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMN

ELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKI

LRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYP

GVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGH

GVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYS

GIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI

产生热稳定载运体构建体

全长原生热纤梭菌地衣多糖酶LicB依次由前导肽(Lp)、N末端部分(A)、表面环(1)、C末端部分(C)、Pro-Thr匣和纤维小体结合域(C-BD)组成。从LicB编码基因移除Lp、Pro-Thr匣和C-BD编码序列，使分子以环状完全变化以翻转N和C末端(谬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza and Other RespiratoryViruses)，1：1)且并入独特限制性核酸内切酶位点用于克隆N和C末端的标靶序列以及克隆入表面环(1)中。证实所得工程改造载运体分子序列且指定为LicKM。

SEQ ID NO.：29：

GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTA

AGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGA

ATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATT

GATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGG

TGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATAC

TTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTA

TAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAG

GAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAG

TATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATAC

TCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGC

TAACGGTTCTGTITTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTCTAACGGAAA

GATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATTGACTCGA

GCTC

SEQ ID NO.：30：

MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGK

DTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNI

PVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFS

NFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHH

对于某些构建体，将LicKM的N和C末端的PR1a信号肽和KDEL序列工程改造。这些构建体的核酸和氨基酸序列展示于SEQ ID NO.：31和SEQ ID NO.：32中。

SEQ ID NO.：31：

GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCT

CTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTT

ATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAG

TTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGAC

CATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACT

AAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCT

TGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATAT

TGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTC

CTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGA

TATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGG

TAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGAT

TCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAG

CCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTC

GACCATCATCATCATCATCATAAGGATGAACTTTGACTCGAGCTC

SEQ ID NO.：32：

MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAA

KNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQD

FHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQ

AEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSN

GKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL

产生重组抗原构建体

使用从pBR322质粒获得且经工程改造以利用T7噬菌体基因10的促进高水平转录和翻译特征的pET表达载体。噬菌体编码的RNA聚合酶对在除T7噬菌体基因组以外的基因组中极少遭遇的T7启动子序列高度特异(图2)。pET-32已用于将HA和NA构建体融合入已在这一载体中克隆的经修饰地衣多糖酶序列的环区域中。在经修饰的pET-32载体中的Pac I和XhoI位点之间(其中T7启动子和T7终止子之间的区域已切除)克隆具有上游序列PR-1A(“病原体相关蛋白1A”)、具有内质网(KDEL)或空泡保持序列(VAC)和下游His₆标记的地衣多糖酶基因的催化域。以此方式，获得pET-PR-LicKM-KDEL和pET-PR-LicKM-VAC(图3)。

将DNA片段HA域或NA亚克隆入LicKM的环(1)部分以在恰当阅读框中提供融合蛋白质用于翻译。构筑LicKM-NA融合蛋白质。使用SalI位点将NAW或NAV的DNA片段亚克隆入LicKM的C末端以在恰当阅读框中提供融合蛋白质用于翻译。

实例2-产生疫苗候选物抗原载体

将标靶抗原构建体LicKM-HA(SD)、LicKM-HA(GD)或LicKM-NA独立地亚克隆入所选择病毒载体(pBI-D4)。pBI-D4为从pBI 121获得的二元载体，其中编码大肠杆菌β-D葡糖苷酸酶(GUS)的报告基因已经“聚连接子”置换，其中在Xba I与Sac I位点之间，从TMV获得的载体已经克隆(图4)。pBI-D4为TMV基构建体，其中待表达的外来基因(例如标靶抗原，诸如LicKM-HA(SD)、LicKM-HA(GD)、LicKM-NA)替换TMV的外壳蛋白(CP)基因。所述病毒保留TMV 126/183kDa基因、移动蛋白(MP)基因和CP亚基因组mRNA启动子(sgp)，其扩展入CP开放阅读框(ORF)。CP的起始密码子已经突变。病毒缺乏CP且因此在在整个宿主植物中无法经由韧皮部移动。然而，病毒性感染的细胞到细胞移动保持功能性且病毒可以所述方式缓慢地向上部叶片移动。多克隆位点(PacI-PmeI-AgeI-XhoI)已在sgp末端经工程改造用于表达外来基因，且其后接着为TMV 3′非翻译区域(NTR)。在病毒序列的5′末端融合35S启动子。载体序列位于pBI121的BamHI与SacI位点之间。锤头状核糖酶位于病毒序列的3′处(陈(Chen)等人，2003，分子育种(Mol.Breed.)，11：287)。这些构建体包括编码LicKM-HA-SD、LicKM-HA(GD)或NA的序列与编码来自烟草PR 1a蛋白的信号肽的序列、6x His标记和ER保留锚定序列KDEL或空泡序列的融合蛋白质(图5)。对于含有编码PR-LicKM-HA(SD)-KDEL、PR-LicKM-HA(GD)-KDEL和PR-LicKM-NA-KDEL的序列的构建体，将编码DNA作为PacI-XhoI片段引入pBI-D4中。此外，将HAW(HA怀俄明)、HAV(HA越南)、NAW(NA怀俄明)和NAV(NA越南)作为PacI-XhoI片段直接引入pBI D4中。随后证实核苷酸序列跨过最终表达构建体的亚克隆接点(图6)。

实例3：植物产生和抗原产生

农杆菌侵入植物

可使用通过农杆菌侵入获得的农杆菌介导的瞬时表达系统(图培(Turpen)等人，1993，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)，42：227)。以含有经工程改造以表达LicKM-HA或LicKM-NA的病毒载体的发根农杆菌或根癌农杆菌(GV3101)侵入本氏烟草(V.benthamiana)的健康叶片。

以构建体pBI-D4-PR-LicKM-HA(SD)-KDEL、PR-LicKM-HA(GD)-KDEL和pBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL转化发根农杆菌菌株A4(ATCC 43057)。如卡普拉(Kapila)等人(1997，植物科学(Plant Sci.)，122：101)所述生长且诱导农杆菌培养物。使2ml发酵剂培养物(starter-culture)(从新鲜群落挑取)在含有25μg/ml卡那霉素的YEB(5g/l牛肉提取物、1g/l酵母抽提物、5g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、2mM MgSO₄)中在28℃下生长整夜。按1∶500将发酵剂培养物稀释入含有25μg/ml卡那霉素、10mM 2-4(-吗啉基)乙磺酸(MES)pH 5.6、2mM附加MgSO₄和20μM乙酰丁香酮的500ml YEB中。然后，使所稀释培养物在28℃下生长整夜达到约1.7的O.D.₆₀₀。在3,000×g下将细胞离心15分钟且再悬浮于MMA培养基(MS盐、10mM MES pH 5.6、20g/l蔗糖、200μM乙酰丁香酮)中达到2.4的O.D.₆₀₀，在室温下保持1-3小时且用于农杆菌侵入。使用不带针的一次性注射器以农杆菌悬浮液注射本氏烟草叶片。侵入后4-7天(例如6天)收集侵入叶片。

通过评估地衣多糖酶活性检定和免疫印迹法分析，筛选植物中标靶抗原表达的存在(图7、8、9和10)。酶谱分析揭示HA与NA嵌合蛋白在所测试的本氏烟草侵入叶片中的表达。表达与地衣多糖酶活性相关联(图7和9)。与融合蛋白有关的活性谱带展示比地衣多糖酶对照高的分子量，和农杆菌感染后由植物表达的产物的相同分子量，从而证实完全融合产物的存在。

克隆根和克隆根系产生

在0.1％NH₄Cl中灭菌和在无菌dH₂O中6次洗涤后，从叶片获得1cm×1cm宽的本氏烟草叶片外植体。以刀片在侧稍略微损伤外植体且与含有pBID4-Lic-HA-KDEL或pBID4-Lic-NA-KDEL的毛根农杆菌菌株A4一起共培养。以农杆菌整夜培养物(O.D._600nm＝0.8-1)将外植体培育2分钟，在3000rpm和4℃下离心10分钟且在20mM乙酰丁香酮存在的情况下再悬浮于MMA培养基中达到最终O.D._600nm＝0.5。培育结束时，在无菌纸上干燥外植体且在1％葡萄糖和20mM乙酰丁香酮存在的情况下转移到0.8％琼脂MS平板上。将平板用封口膜封好且在室温下保持2天。然后，在500mg/l头孢噻肟(Cefotaxim)(Cif)、100mg/l特漫汀(Timentin)(Tim)和25mg/l卡那霉素存在的情况下将外植体转移到MS平板上。约5周后，从经含有pBID4-Lic-HA-KDEL和pBID4-Lic-NA-KDEL构建体的毛根农杆菌转化的本氏烟草叶片外植体获得转基因根的产生。

转化后，可切断毛根且在不含激素的固体K₃培养基上成行放置。4到6天后，分离生长最活跃的的根且转移到液体K₃培养基中。在黑暗中在24℃下，在旋转振荡器上培养所选择根且每周分离克隆系并进行继代培养。可通过评估地衣多糖酶活性检定和免疫印迹法分析来筛选根和/或克隆系中标靶抗原表达的存在。

实例4：产生疫苗候选物

在感染后4、5、6和7天收集本氏烟草侵入的叶片材料的100mg样品。刚好在-80℃收集以用于制备后续粗植物提取物或用于融合蛋白纯化后，分析新鲜组织的蛋白表达。

以1/3w/v比率(1ml/0.3g组织)将新鲜样品再悬浮于冷PBS 1×加蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))中且以研杵研磨。使均质物在SDS凝胶负载缓冲液中沸腾5分钟，且然后通过在12.000rpm下在4℃下离心5分钟净化。将上清液转移到新鲜管中，且在12％SDS-PAGE上分离20μl、1μl或其稀释物且通过西方分析使用抗His₆-HA小鼠或兔抗地衣多糖酶多克隆抗体分析，和/或通过酶谱分析来分析以评估指示功能性地衣多糖酶活性的酶活性。酶谱法是用于量测酶活性的电泳法。所述方法基于经由在培育期期间溶解的酶降解的底物浸透的十二烷基硫酸钠凝胶。凝胶染色以暗红色背景上的白色谱带揭示酶活性位点。在某一范围内，谱带强度可与所负载酶的量线性相关。

如果融合蛋白中的HA蛋白电泳迁移率对应于理论MW(地衣多糖酶酶MW为约28kD)，那么经含有质粒pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL或pBID4-LicKM-HA(GD)-KDEL的根癌农杆菌或毛根农杆菌侵入的本氏烟草植物中的HA表达产生对应于嵌合蛋白LicKM-HA(SD)-KDEL或LicKM-HA(GD)-KDEL的分子量的特定谱带。

可通过免疫印迹法在手动侵入的组织上与真空侵入的组织上进行粗提取物中表达的嵌合蛋白Lic-HA-KDEL和Lic-NA-KDEL的定量。

纯化抗原

通过均质化研磨经含有pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL、pBID4-LicKM-HA(GD)-KDEL和pBID4-全长-NA-KDEL构建体的重组根癌农杆菌侵入的植物的叶片。使用3体积w/v比率的含有“无EDTA”的蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))和曲通(Triton)X-1001％的提取缓冲液且在4℃下振荡30分钟。通过在4℃下在每10分钟9000×g下离心净化提取物。随后，上清液依次经由微孔布过滤，在4℃下在20.000×g下离心30分钟且经0.45μm滤纸过滤，然后色谱纯化。

使用硫酸铵沉淀法收集所得提取物。简单来说，将(NH₄)₂SO₄添加到提取物中直到20％饱和，在冰上培育1小时且在18,000×g下旋转15分钟。丢弃颗粒且缓慢添加(NH₄)₂SO₄直到60％饱和，在冰上培育1小时且在18,000×g下旋转15分钟。丢弃上清液且将所得颗粒再悬浮于缓冲液中，然后在冰上保持20分钟，随后在18,000×g下离心30分钟且相对于10000体积的洗涤缓冲液透析上清液整夜。

在室温下在重力下，通过使用IMAC(“固定化金属亲和色谱(Immobilized MetalAffinity Chromatography)”，通用电气医疗集团(GE Healthcare))纯化His标记的LicKM-HA(SD)-KDEL、LicKM-HA(GD)-KDEL和全长-NA-KDEL嵌合蛋白。在非变性条件下进行纯化。收集0.5毫升洗脱份蛋白，将其合并，添加20mM EDTA，在4℃相对于PBS 1×透析整夜且通过SDS-PAGE分析。

或者，然后将洗脱份收集在一起，添加20mM EDTA，在4℃相对于NaH₂PO₄10mM透析整夜且通过阴离子交换色谱纯化。对于LicKM-HA(SD)-KDEL、LicKM-HA(GD)-KDEL和全长-NA-KDEL纯化，使用阴离子交换柱Q琼脂糖凝胶快流(QSepharose Fast Flow)(艾默生医药科学(Amersham Pharmacia Biosciences))。在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离LicKM-HA(SD)-KDEL、LicKM-HA(GD)-KDEL和全长-NA-KDEL亲和力或离子交换纯化嵌合蛋白的样品，接着进行库马斯(Coomassie)染色。也将分离蛋白电泳转移到PDVF膜上，以用于使用多克隆抗地衣多糖酶抗体且连续地使用抗兔IgG辣根过氧化物酶结合抗体进行西方印迹分析。

通过免疫印迹法使用pAbα-地衣多糖酶和pAbα-His₆分析透析后所收集的洗脱份。所表达嵌合蛋白保持His标记且通过软件评估纯化蛋白的最终浓度。

血凝作用检定

使用来自两个不同来源的三种种类的红血球(RBC)证明流感疫苗在植物产生的制剂中的血凝活性。所检定疫苗材料称为流感A/怀俄明/03/03(H3N2病毒)或流感A/越南/1194/2004(H5N1病毒)的“域3”(球状域)。

在磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)中将鸡、火鸡和马的RBC单独洗涤3次，且以PBS调节到0.5％v/v。仅以PBS测试圆底96孔微量滴定平板用于质量保证，证明仅法尔肯(Falcon)平板一致地提供阳性结果与阴性结果之间的清楚描绘。以0.5mg/mL起始在2个重复中检定疫苗材料且藉由逐步将25μl材料吸入25μl PBS稀释将平板2倍。然后，将一个物种的RBC/平板的25μl 0.5％悬浮液分配到平板的所有孔中。振荡平板以分布RBC且在4℃下培育4小时，然后确定阴性结果中的阳性结果。

流感A/越南/1194/2004(H5N1病毒)的域3对禽类RBC而不是马RBC一致且可再现地提供阳性结果。在复制和实验重复中的终点稀释度一致地为8，表明H5域3可使禽类RBC在62.5μg的浓度下血凝(图11)。实例5：免疫原性研究

初始免疫原性研究

进行初始免疫原性研究以测定植物产生的LicKM-抗原融合蛋白质是否可以诱导经腹膜内免疫的小鼠特异性血清IgG和所诱导抗体是否可以活体外中和流感病毒。如上所述，所述研究使用从农杆菌侵入的本氏烟草叶片富集的75％纯度的LicKM、LicKM-HA(SD)、LicKM-HA(SD)和重组NA。

以100μg/剂量的重组LicKM-HA(SD)、LicKMHA(GD)和50μg/剂量的重组NA将8周龄雌性BALB/c小鼠免疫。在第1天，腹膜内投与3次免疫原免疫，14天后第一次加强，随后在10天后第二次加强。第一个剂量包括1∶1体积比的弗氏完全佐剂，第二个剂量不包括任何佐剂。阴性对照组接收250μg/剂量的重组LicKM。每组有3只小鼠。第一次给药前1天收集免疫前血清，且随后在第二次加强后在第28天收集血清。使用ELISA检定测定流感特异性IgG抗体效价(图12)。

针对流感疫苗产生的免疫血清对血凝活性的抑制

评估如上所述免疫小鼠的免疫前血清和第二次加强后血清的抗体效价抑制失活流感病毒的血凝活性的能力。将4HA单位的失活流感A/越南/1194/2004病毒(H5N1病毒)与免疫前血清或第二次疫苗加强后收集的血清的25μl稀释物组合。如实例4中所述评估禽类RBC中血凝活性的抑制。所得抗体效价可有效抑制病毒的血凝作用。图13中所描述且表1中所概括的例示性结果证明所产生抗体可防止病毒的血凝活性。

表1：针对实验性流感疫苗产生的免疫血清的血凝作用抑制

疫苗接种组	血凝作用抑制效价(血清稀释度-1)
		PBS对照	＜10
免疫前血清	160
		疫苗w/o佐剂	2560
疫苗w/佐剂	2560

实例6：流感疫苗接种的模型系统

A.肌肉内疫苗接种

已使用用于流感感染研究的确立动物模型雪貂来测定流感疫苗的功效(例如，博弈德(Boyd)等人，1975；陈(Chen)等人，1995；辛博勒(Scheiblauer)等人，1995；思维特(Sweet)等人，1980，微生物学综述(Microbiol.Rev.)，44：303；迈斯博(Maassab)等人，1982，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，146：780；汤姆斯(Toms)等人，1977；韦勃斯特(Webster)等人，1994；费同(Fenton)等人，1981；和韦勃斯特(Webster)等人，1994)。利用雪貂动物模型的传播研究不仅证明流感病毒的供体到受体传布，而且也证明了突变作用对病毒毒性的影响(赫洛克(Herlocher)等人，2001；和赫洛克(Herlocher)，2002)。已用失活无佐剂流感疫苗成功地测试用于本文所述的研究的异源引发疫苗攻击(prime-vaccine-challenge)模型。

产生测试物品

评估植物产生的抗原在雪貂中的免疫原性和保护功效。测试物品由植物中产生的纯化标靶抗原组成。将流感类型A(A/怀俄明/3/03[H3N2])的菌株的HA域工程改造为具有热稳定性载运体分子的融合蛋白质且在如上所述的植物基表达系统中产生。在如上所述的植物基表达系统中产生来自相同菌株的NA。测试物品不含有任何核酸、毒性物质或传染原。

尤其，将编码HA的氨基酸17到67加上294到532(其一起构成茎干域)的核苷酸序列(威尔逊(Wilson)等人，1981，自然(Nature)289：366)插入LicKM中(基因库登记号DQ776900)以提供LicKM-HA(SD)。类似地插入编码HA的氨基酸68到293(其构成球状域)的核苷酸序列(前述威尔逊(Wilson)等人)以提供LicKM-HA(GD)。将编码烟草发病机制相关蛋白PR1α的信号肽的序列(批菲特那(Pfitzner)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，15：4449)包括在融合蛋白质的N末端。将编码聚组氨酸亲和纯化标记(6xHis)和内质网保留信号(KDEL)的序列包括在C末端。将LicKM融合蛋白质引入杂交载体pBID4中(前述威尔逊(Wilson)等人)，其允许病毒基因组从花椰菜花叶病毒35S启动子转录，接着进行病毒复制且标靶序列从烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白亚基因组mRNA表达(希普萨德(Shivprasad)等人，1999，病毒学(Virology)，255：312)，且其从农杆菌二元质粒pBI121获得(陈(Chen)等人，2003，分子育种(Mol，Breed.)，11：287)，用于在叶片中瞬时表达标靶。另外，在未预先融合到LicKM的情况下，将编码相同流感菌株的NA的氨基酸38到469的序列引入pBID4中。如上所述，将PR1a的信号肽包括在N末端且将6xHis加KDEL包括在C末端。

通过电穿孔将含有流感抗原的工程改造载体引入根癌农杆菌菌株GV3101中。通过在播种后约6周接种叶片来将重组根癌农杆菌的悬浮液引入本氏烟草植物中，以便将标靶序列引入叶片组织中。使植物在盆栽土壤中在12小时光/12小时黑暗条件下在21℃生长。视表达构建体而定，接种后4到7天收集叶片。通过在包含50mM磷酸钠pH 7.0；100mM氯化钠；10mM二乙基二硫代氨基甲酸钠；和10mM β-巯基乙醇的缓冲液中研磨叶片来制备蛋白提取物。通过硫酸铵沉淀，接着固定化金属亲和色谱(例如通过使用6xHis标记)和阴离子交换色谱(每一步骤后都透析)富集重组抗原直到至少80％纯度。

通过ELISA分析(图16A)和在变性条件下通过免疫印迹法(图16B)评估植物产生的抗原与参考抗血清的反应。对于ELISA，以从植物纯化的LicKM-HA(SD)、LicKM-HA(GD)或NA涂布96孔平板，或以失活流感A/怀俄明/3/03病毒涂布96孔平板。将所涂布平板与针对A/怀俄明/3/03病毒的纯化HA产生的绵羊抗血清、针对NIBRG-18(H7N2)重组病毒产生的绵羊抗血清或针对NIBRG-17(H7N1)重组病毒产生的绵羊抗血清一起培育。对于免疫印迹法分析，通过SDS-PAGE分离100ng LicKM-HA(SD)、100ng LicKM-HA(GD)和对应于100ng HA的量的失活流感A/怀俄明/3/03，转移到聚偏二氟乙烯膜且与针对LicKM产生的兔抗血清或针对来自A/怀俄明/3/03病毒的纯化HA产生的绵羊抗血清一起培育。根据标准WHO方案WHO/CDS/CSR/NCS 2002.5Rev.1检定NA活性。在进行神经氨酸酶检定之前，通过预培育植物产生的NA与针对同源(NIBRG-18[H7N2])或异源(NIBRG-17[H7N1])重组病毒产生的绵羊抗血清来评估NA活性的抑制。

在ELISA与免疫印迹法检定中，参考血清比LicKM-HA(GD)更强烈地识别LicKM-HA(SD)，但针对LicKM产生的多克隆兔血清在相似程度上识别各融合蛋白质(图16B)。另外，植物产生的NA由针对重组H7N2病毒产生的参考多克隆绵羊血清识别(图16C)且其展示由参考血清以菌株特异性方式抑制的酶活性(图16C)。

疫苗接种

应英国动物(科学程序)法(UK Animal(Scientific Procedures)Act)，1986所要求，在英国总办事处(UK Home Office)批准下进行雪貂研究。如表2中所示，将4.5月龄、在研究启始时重441到629g且以高密度雪貂实验室饮食(LabDiet)5L15(英国，伦敦，IPS产品供应商(IPS Product Supplies，London，UK))维持的雄性艾鼬或白化变种雪貂(英国，海格特，海格特农场(Highgate Farm，Highgate，England))分配给治疗组。

表2：治疗组

^*TCID₅₀(“组织培养感染剂量”)＝一系列实验室孔的半数含有活性生长病毒时的病毒稀释水平。

通过以含有植物产生的流感抗原的组合的候选疫苗配方(VC1加佐剂、VC2和VC2加佐剂)引发并加强两次(在第0天、第14天和第28天)使三个8只雪貂的组皮下免疫(表1)。VC1动物接受100μg LicKM-HA(SD)和100μg LicKM-GD加1.3mg明矾。VC2动物接受100μg LicKM-(SD)、100μg LicKM-(GD)和50μg NA，加1.3mg明矾(“加佐剂”)或不加明矾(“无佐剂”)。在一起传递的100μg LicKM-(SD)和100μg LicKM-(GD)对应于约100μg HA。阴性对照动物仅接受明矾佐剂，且对阳性对照动物给与单一鼻内剂量的流感A/怀俄明/3/03病毒(在第0天，0.5ml，浓度为每ml 10^5.5TCID₅₀)。免疫后，每日监测动物的病变或刺激、活动性、红斑和总体行为。

最终剂量10天后，在麻醉下，以0.5ml流感A/怀俄明/3/03病毒在每ml 10^5.5TCID₅₀的浓度下经鼻内攻击动物。在疫苗接种时、攻击时和攻击后4天从表面尾静脉收集血样，且攻击后4天收集鼻洗涤液。测定同源流感A/怀俄明/3/03病毒和异源流感A/悉尼(Sydney)/5/97(H3N2)、A/加利福尼亚(California)/7/04(H3N2)和A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99(H1N1)病毒的血清HI效价。

根据表3中阐述的时间表进行流感疫苗接种、程序和病毒攻击。在接受植物产生的疫苗候选物的任何动物中都未注意到不利影响。将应答器植入动物用于单独鉴别和监测体温。在研究时间表(表3)中详述的时间点，在3个独立时刻进行给药。将提前制备的测试材料等分用于各剂量。在即将投与之前将测试材料与佐剂混合。表3：研究时间表

分析

记录临床征象(健康得分)、体重和温度改变。感染后，每日一次检查各动物的病变或刺激、活动性、红斑和总体行为，并记录观察结果用于确定健康得分。各动物得分如下：打喷嚏或鼻抽动(1分)；外鼻孔流脓(1分)；自发性活动或游戏减少(1分)；无自发性活动或警觉性降低(2分)。“自发性活动或游戏减少”和“无自发性活动或警觉性降低”是互斥得分点。计算各动物从感染日开始的体重最大减轻。也计算各动物从感染日开始的体温最大增加。通过治疗组计算任一天各动物的最大健康得分、体重减轻和温度变化的平均值和标准偏差并通过ANOVA比较。计算各动物的包含感染后每天的总健康、体重减轻和温度变化得分的AUC样量度；适当时，计算治疗组平均值、中值和标准偏差并通过ANOVA或克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)比较。活病毒攻击后，各治疗组证明从如临床征象所指示的攻击的回复以及温度和体重变化。保护接受测试疫苗的动物组且其在以同源流感病毒攻击后展示极少或无疾病症状。两种测试疫苗候选物都向动物提供完全保护(图14)。

病毒攻击后收集鼻洗涤液。测量鼻洗涤液回收的体积，并监测鼻洗涤液的重量。通过台盼蓝(Trypan blue)染色(用以测定总细胞计数)并对白血球计数在攻击后鼻洗涤液中评估发炎细胞反应。以感染后各采样日的对数转换数据的平均值、中值和标准偏差总结鼻洗涤液内的细胞计数；适当时，通过ANOVA或克鲁斯凯-沃利斯检验比较治疗组。类似于上述临床征象，鼻洗涤液的监测表明接受各测试治疗疫苗的治疗组证明防感染保护等于或大于阳性对照组(图14)。

使用对鼻洗涤液样品的马丁达比犬肾脏(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞滴定来测定病毒脱落。通过以土耳其红血球进行血凝作用检定来确定MDCK细胞滴定检定的终点。使用卡波(Karber)计算确定各样品的log₁₀TCID₅₀/ml。对感染后鼻洗涤液样品测定鼻洗涤液样品的病毒脱落。将各动物脱落的最大效价对数转化，计算治疗组平均值、中值和标准偏差并通过克鲁斯凯-沃利斯检验比较。将各治疗组中在任一时刻具有任何病毒脱落的动物的比例列表，并使用χ²检验对比所述组的独立性。将脱落病毒的结果描述在图15中。仅阴性对照治疗组产生显著病毒脱落(图15)。

如实例5中所述，使用疫苗接种前和疫苗接种后针对同源病毒(流感A/怀俄明/3/2003(H3N2)病毒)的血清样品进行血凝作用抑制检定(HAI)以证实动物在基线的血清阴性和动物是否在免疫和感染后血清转变。将HAI效价列表，并鉴别在第0天与最后一天之间上升≥4倍的动物。

将来自免疫动物的血清的血凝作用抑制(HI)活性视为保护相关数(布朗(Brown)等人，2004，生物学进展(Dev.Biol.)，巴塞尔(Basel)，115：1；和霍伯森(Hobson)等人，1972，卫生学杂志(J.Hyg.)，70：767)。将一个所述实验的结果提供于表4中。经针对H3N2的测试疫苗或阳性对照免疫的组中的所有动物具备强标靶特异性免疫反应与高血清血凝抑制活性。第一个剂量的疫苗后，VC2加佐剂产生高HAI效价。无佐剂的VC2产生保扩性反应，但效价不如第一个剂量后具有佐剂的情况高。然而，第二个剂量后，效价达到与具有佐剂的CMB1相似的水平。VC1加佐剂也产生保护性水平的抗体，第二个剂量的疫苗后其显著更高(表4)。

表4：雪貂HAI数据总结

将第二次HA检定实验的结果提供于图17中。在任何动物的免疫前血清或NC动物的血清中未观测到HI活性(图17)。然而，第一个剂量后，以VC2加佐剂接种的所有雪貂的血清显示在1∶320到1∶2560范围内的高HI效价(平均效价1273)(图17)。第一个剂量后，在接受VC1加佐剂的动物中观察到较少反应者和较低HI效价(图17)，这表明NA可能调节免疫反应。接受VC2的8只动物中的5只提供在1∶160到1∶1280范围内的HI效价，而商业失活流感疫苗在不存在佐剂的情况下通常诱导(如果存在)极低HI效价(波特(Potter)等人，1972，英国实验病理学杂质(Br.J.Exp.Pathol)，53：168；波特(Potter)等人，1973，卫生学杂志(J.Hyg)(伦敦(Lond.))，71：97；和波特(Potter)等人，1973，Arch.Gesamte Virusforsch，42：285)。第二个剂量的VC1加佐剂、VC2或VC2加佐剂后，所有雪貂的血清具有在1∶640到1∶2560范围内的HI效价，且第三个剂量后，这些值保持类似得高(图17)。所有这些动物的血清都具有超过1∶40的效价，某些人将其视为符合人类保护的最小HI效价(布朗(Brown)等人，2004，生物学进展(Dev.Biol.)，巴塞尔(Basel)，115：1；和霍伯森(Hobson)等人，1972，卫生学杂志(J.Hyg.)，70：767)。

接受两个或三个剂量的植物产生的疫苗候选物中的任一种的雪貂血清的HI效价等于或大于经鼻内感染的阳性对照动物的血清效价(图17)，且超过其它雪貂研究中所观察到的效价。举例来说，据报道接受2个剂量后，经商业失活H3N2流感疫苗肌肉内免疫的雪貂产生1∶20的HI效价(拉姆贝克(Lambkin)等人，2004，疫苗(Vaccine)，22：4390)。经VC1加佐剂、VC2或VC2加佐剂免疫的雪貂的血清对异源H3N2病毒菌株A/悉尼/5/97和A/加利福尼亚/7/04比A/怀俄明/3/03具有低4到20倍的效价，但这些效价都超过符合保护的1∶40阈值，这表明这些疫苗候选物针对异源H3N2菌株进行保护的能力。对流感A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)观测到低于1∶10的HI效价，表明HI抗体反应的H3亚型特异性。

进行跟踪免疫原性和保护性功效研究以评估植物产生的HA和NA抗原在经活卵生长的流感A/怀俄明/3/03病毒鼻内攻击免疫的雪貂中的保护性功效。

攻击后，通过监测鼻洗涤液中脱落病毒的效价达4天来测定各动物的攻击后病毒性感染的程度。仅一个接受三种候选疫苗配方中的任一种的动物展示可检测的病毒脱落，且然后即使在小于10²TCID₅₀的情况下也如此，而NC组的动物在10⁶到10⁷TCID₅₀范围内展示病毒脱落(图18A)。PC组中病毒脱落的水平在10²到10³TCID₅₀范围内，大于候选疫苗组中任何动物的水平(图18A)。

在接受任一种候选疫苗配方的动物中观测到保护证据。与NC组中的体重减轻相比，接受VC1加佐剂、VC2加佐剂或同源病毒的雪貂的感染后体重减轻获得极大降低(图18B)。接受VC2的动物的体重减轻的降低较不显著(图18B)。另外，与对于NC或PC组中动物所观察到的体温升高相比，经任一种候选疫苗配方免疫的雪貂的体温升高获得降低(图18C)。此外，与NC组相比，在接受候选疫苗配方的动物中，症状得分的平均峰值、指示攻击后数种流感相关症状的频率的指标得到降低(图18D)。类似地，与NC组中的动物相比，候选疫苗受体中视为上呼吸道感染的标志的雪貂鼻洗涤液中的白血球计数得到降低(图18E)。

攻击研究表明植物产生的HA和NA抗原赋予雪貂高度保护性免疫性，展示对于疫苗发展具有前景。在今后的研究中，将阐明当单独投与时LicKM-SD和LicKM-GD的保护性作用，和NA在进一步促进免疫反应方面的作用。

B.鼻内疫苗接种

鼻内免疫后在Balb/c小鼠或雪貂模型动物中评估候选疫苗的免疫原性。研究设计类似于以上实例中所论述的肌肉内免疫。简单来说，在约第0天、第14天和第28天，在存在或不存在佐剂(例如氢氧化铝、MALP-2等)的情况下，以三个剂量(100μg/剂量)的标靶抗原经鼻内将小鼠或雪貂组(约8-10只动物/组)免疫。在投与抗原之前各疫苗接种日和第三个剂量后10天收集血清样品和鼻洗涤液。在最后一个剂量后，通过鼻途径以已知感染动物并产生伴有发烧的呼吸道感染症状的流感病毒同源菌株攻击免疫动物。通过测定在病毒攻击后所测量的病毒脱落水平、感染后体重减轻、体温升高、症状得分的平均峰值和鼻洗涤液中的白血球计数来检查免疫反应的性质。检查NA和/或HA的抗体的存在以及HI和病毒中和活性。

C.剂量递增研究

可使用剂量递增研究进一步评估抗原和佐剂的最佳组合物和剂量、投与途径以及免疫方案。预期在这一研究中测试六个测试疫苗组合物中的三个。使用肌肉内途径(表3)和鼻内途径进行研究。类似于以上实例中论述的肌肉内和鼻内免疫法，在存在或不存在佐剂(例如氢氧化铝、MALP-2等)的情况下，以各种剂量的测试疫苗经鼻内免疫动物组(约8-10只动物/组)。关于例示性给药时间表参见表5。

如同在其它研究中一样，在投与抗原之前各疫苗接种日和第三个剂量后10天收集血清样品和鼻洗涤液。在最后一个剂量后，通过鼻途径以已知感染动物并产生伴有发烧的呼吸道感染症状的流感病毒同源菌株攻击免疫动物。可通过检查病毒脱落水平；感染后体重减轻；体温升高；症状得分的平均峰值；鼻洗涤液中的白血球计数；针对NA、HA和/或M2的抗体的存在；血凝作用抑制；和/或病毒中和活性来测定免疫反应的性质。

表5：动物的剂量递增研究的例示性设计

组	疫苗候选物组合物#	疫苗接种途径	动物数	剂量数	每个剂量的VC微克数
						1	标准	i.m.*	8
2	1	i.m.	8	3	10
						3	1	i.m.	8	2	50
4	1	i.m.	8	1	100
						5	LicKM	i.m.	8	2	100

						6	2	i.m.	8	3	10
7	2	i.m.	8	2	50
						8	2	i.m.	8	1	100

						9	3	i.m.	8	3	10
10	3	i.m.	8	2	50
						11	3	i.m.	8	1	100

^*i.m.＝肌肉内注射

Claims

1.一种经分离的抗原，其包含与LicKM蛋白融合的流感A整合膜蛋白组分；

其中所述整合膜蛋白组分包含至少一个选自由血凝素(HA)的免疫原性部分、神经氨酸酶(NA)的免疫原性部分和M2的免疫原性部分所组成的群组的免疫原性部分；

且

其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30或SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的经分离的抗原，其中所述整合膜蛋白组分由至少一个HA的免疫原性部分和/或至少一个NA的免疫原性部分组成，所述HA的免疫原性部分选自由下列各序列组成的群组：SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：7、SEQID NO.：8、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：12、SEQ ID NO.：13、SEQ ID NO.：20和SEQ ID NO.：24，所述NA的免疫原性部分选自由SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：16和SEQ ID NO.：18组成的群组。

3.根据权利要求1所述的经分离的抗原，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的经分离的抗原，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求2所述的经分离的抗原，其中所述整合膜蛋白组分包含HA的免疫原性部分和NA的免疫原性部分。

6.一种疫苗组合物，其包含医药学上可接受的载剂和第一抗原，所述第一抗原包含与LicKM蛋白融合的流感A整合膜蛋白组分；

其中所述整合膜蛋白组分包含至少一个选自由HA的免疫原性部分、NA的免疫原性部分和M2的免疫原性部分组成的群组的免疫原性部分；

其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30或SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列；且

其中所述组合物在投与个体后能够引发免疫反应。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述整合膜蛋白组分中的至少一者由至少一个HA的免疫原性部分和/或至少一个NA的免疫原性部分组成，所述HA的免疫原性部分选自由下列各序列组成的群组：SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ IDNO.：7、SEQ ID NO.：8、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：12、SEQID NO.：13、SEQ ID NO.：20和SEQ ID NO.：24，及/或至少一个所述NA的免疫原性部分选自由SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：16和SEQ ID NO.：18组成的群组。

8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述整合膜蛋白组分包含HA的免疫原性部分和NA的免疫原性部分。

11.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述整合膜蛋白组分包含全长HA和全长NA。

12.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其进一步包含第二抗原，所述第二抗原不同于所述第一抗原，且包含至少一个选自由HA的免疫原性部分、NA的免疫原性部分和M2的免疫原性部分组成的群组的免疫原性部分。

13.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述第一抗原在由转基因植物和瞬时表达所述抗原的植物选出的植物中产生。

14.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含从植物细胞、植物、种子、果实或其提取物纯化、部分纯化或未经纯化的抗原。

15.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其进一步包含至少一种疫苗佐剂。

16.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由明矾、MF59、皂苷和MALP2组成的群组。

17.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其进一步包含第三抗原，其中所述第三抗原包含与SEQ ID NO.：30或SEQ ID NO.：32所示的LicKM蛋白融合的流感A整合膜蛋白组分，且其中所述第三抗原的所述整合膜蛋白组分包含至少一个不同于所述第一抗原和第二抗原的免疫原性部分，且选自由HA的免疫原性部分、NA的免疫原性部分和M2的免疫原性部分所组成的群组的免疫原性部分。

18.一种疫苗组合物，其包含至少两种抗原，所述各抗原包含流感A整合膜蛋白组分，其中所述整合膜蛋白组分包含至少一个选自由HA的免疫原性部分、NA的免疫原性部分和M2的免疫原性部分组成的群组的免疫原性部分，其中至少一个抗原与LicKM蛋白融合，所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30或SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述整合膜蛋白组分中的至少一者由至少一个HA的免疫原性部分和/或至少一个NA的免疫原性部分组成，所述HA的免疫原性部分选自由下列各序列组成的群组：SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ IDNO.：7、SEQ ID NO.：8、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：12、SEQID NO.：13、SEQ ID NO.：20和SEQ ID NO.：24，及/或至少一个所述NA的免疫原性部分选自由SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：16和SEQ ID NO.：18组成的群组。

20.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30所示的氨基酸序列。

21.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列。

22.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中所述整合膜蛋白组分包含HA的免疫原性部分和NA的免疫原性部分。

23.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中所述整合膜蛋白组分包含全长HA和全长NA。

24.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述抗原在由转基因植物和瞬时表达所述抗原的植物选出的植物中产生。

25.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含从植物细胞、植物、种子、果实或其提取物纯化、部分纯化或未经纯化的抗原。

26.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其进一步包含至少一种疫苗佐剂。

27.根据权利要求26所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由明矾、MF59、皂苷和MALP2组成的群组。

28.一种抗流感A疫苗组合物的用途，其用于制造用以针对个体的流感A感染诱导保护性免疫反应的药物；

其中所述组合物包含抗原，所述抗原包含与LicKM蛋白融合的流感A整合膜蛋白组分；

其中所述药物以有效量投与个体，以刺激所述个体产生抗原特异性抗体，或刺激所述个体的细胞免疫反应；从而诱导保护性免疫反应。

29.根据权利要求28所述的用途，其中经口、经鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投与所述药物。

30.根据权利要求29所述的用途，其中通过供给植物细胞而向所述个体经口投与所述药物。

31.根据权利要求28所述的用途，其中所述个体为人类。

32.根据权利要求28所述的用途，其中所述个体为禽、猪或马。

33.一种产生抗原蛋白的方法，所述抗原蛋白包含与LicKM蛋白融合的流感A整合膜蛋白组分，所述方法包含：

a.制备核酸构建体，所述核酸构建体编码包含与LicKM蛋白融合的流感A整合膜蛋白组分的抗原；

b.将步骤a的所述核酸引入细胞；和

c.在有利于表达所述抗原蛋白的条件下培育所述细胞；从而产生所述抗原蛋白；

其中所述整合膜蛋白组分包含至少一个选自由HA的免疫原性部分和NA的免疫原性部分组成的群组的免疫原性部分；且

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述整合膜蛋白组分由至少一个HA的免疫原性部分和/或至少一个NA的免疫原性部分组成，所述HA的免疫原性部分选自由下列各序列组成的群组：SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：7、SEQ ID NO.：8、SEQ ID NO.：33、SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：12、SEQ ID NO.：13、SEQ ID NO.：20和SEQ ID NO.：24，及/或至少一个所述NA的免疫原性部分选自由SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：16和SEQ ID NO.：18组成的群组。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：30所示的氨基酸序列。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述LicKM蛋白具有SEQ ID NO.：32所示的氨基酸序列。

37.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗原蛋白的表达是在病毒启动子的控制下。

38.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包含载体核酸序列和/或编码病毒蛋白的序列。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述载体为二元载体。

40.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞为植物细胞。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述植物细胞选自由下列各物组成的群组：紫花苜蓿、萝卜、芥菜、绿豆、西兰花、水田芥、大豆、小麦、向日葵、卷心菜、三叶草、矮牵牛、西红柿、马铃薯、烟草、菠菜和小扁豆细胞。

42.根据权利要求33所述的方法，其中在克隆根细胞中或在发芽秧苗中产生所述抗原蛋白。

43.根据权利要求33所述的方法，其进一步包含回收所产生的部分纯化或纯化抗原蛋白。

44.一种经分离的核酸构建体，其包含编码根据权利要求1至5中任一权利要求所述的抗原的核酸序列。

45.一种宿主细胞，其包含根据权利要求44所述的核酸构建体。