CN102746391A - 一种砷抗性相关蛋白PvArrp1及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种砷抗性相关蛋白PvArrp1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质（PvArrp1蛋白），获自蜈蚣草（Pteris vittata L.），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对砷胁迫的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。将本发明提供的蛋白的编码基因导入植物，可以显著降低植物体内砷的积累，并显著增强植物对砷胁迫的抗性，本发明为培育耐砷和低砷积累经济作物或农作物提供了有效的途径，对于农业领域具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种砷抗性相关蛋白PvArrp1及其编码基因和应用。
背景技术
砷是一种有毒的化学元素，其常见的存在形式为砷酸盐[Arsenate,As(V)]或亚砷酸盐[Arsenic,As(III)]。
砷污染在国内外都是一个非常突出的环境问题，我国是世界上砷污染最严重的国家之一。人类的经济活动可以直接导致较为严重的砷污染，包括矿石的冶炼、煤的燃烧、矿渣的抛弃、制革废物、染料生产、木材防腐、含砷农药、生化武器和杀虫剂的使用等。环境中的砷对人类和动植物都有很大的危害，可以通过呼吸道、食物或皮肤接触进入人体，目前砷污染已经造成了全球很多地方与砷毒害相关的流行疾病。
在含砷土壤中种植的植物中积累会积累砷，人类通过食用这些植物的可食用部分（包括根，茎，叶，果实，种子等）而间接摄入砷，从而危害人的健康。鉴于砷在环境中的广泛存在，且目前还没有十分有效的方法原位去除土壤和地下水中的砷，通过生物技术手段降低植物体内砷的积累具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种砷抗性相关蛋白PvArrp1及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质（PvArrp1蛋白），获自蜈蚣草（Pteris vittata L.），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对砷胁迫的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因（PvArrp1基因）也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(1）或(2）或(3）或（4）所述的DNA分子：
（1）序列表中序列2自5’末端第1至1137位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物砷胁迫抗性相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷胁迫抗性相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选。
所述重组表达载体具体可为将所述基因导入pSN1301质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到对砷胁迫的抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的生物中。携带有所述基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。
所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。
所述砷具体可以砷酸盐或亚砷酸盐的形式存在。所述亚砷酸盐具体可为亚砷酸钠。所述砷酸盐具体可为砷酸钠。
本发明还保护所述蛋白或所述基因在调控植物对砷胁迫的抗性中的应用。
将本发明提供的PvArrpl基因导入植物，可以显著降低植物体内砷的积累，并显著增强植物对砷胁迫的抗性，本发明为培育耐砷和低砷积累经济作物或农作物提供了有效的途径，对于农业领域具有重大价值。
附图说明
图1为植株移至新的1/2GM固体培养基上并培养7天后的表型。
图2为植株移至含10μM亚砷酸钠（AsIII）的1/2GM固体培养基上并培养7天后的表型。
图3为植株移至含150μM砷酸钠（AsV）的1/2GM固体培养基并培养7天后的表型。
图4为植株在10μM AsIII胁迫下根伸长量的统计。
图5为植株在10μM AsIII胁迫下鲜重的统计。
图6为植株在300μM AsV胁迫下根伸长量的统计。
图7为植株在300μM AsV胁迫下鲜重的统计。
图8为植株在5μM AsIII处理7d后根部总砷含量测定。
图9为植株在5μM AsIII处理7d后地上部分总砷含量测定。
图10为植株在10μM AsV处理7d后根部总砷含量测定。
图11为植株在10μM AsV处理7d后地上部分总砷含量测定。
图12为PvArrpl-GFP融合蛋白在拟南芥根部的亚细胞定位。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
蜈蚣草（Pteris vittata L.）：公众可以从中国科学院植物研究所获得；参考文献：Yang XX,Chen H,Dai XJ,Xu WZ,He ZY,Ma M.2009.Evidence of vacuolarcompartmentalization of arsenic in the hyperaccumulator Pteris vittata.Chinese Science Bulletin 54(22):4229-4233.。
pSN1301质粒：公众可以从中国科学院植物研究所获得；参考文献：Guo J,Dai X,Xu W,Ma M.2008.Overexpressing GSH1 and AsPCS1 simultaneously increases thetolerance and accumulation of cadmium and arsenic in Arabidopsis thaliana.Chemosphere 72(7):1020-1026.。
农杆菌菌株c58：公众可以从中国科学院植物研究所获得；参考文献：Lv S,WangH,Yu B,Meng W,Cao S.2012.Cloning of Arabidopsis HIS1-3 gene and constructionof its expression vector.Journal of Hefei University of Technology.NaturalScience 35(1):120-123.。
哥伦比亚生态型拟南芥（Col）：购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。
1/2GM固体培养基：在1/2MS液体培养基的基础上，每升添加10g蔗糖、0.5gMES和8g琼脂；pH5.9。
1/2GM固体无糖培养基：在1/2MS液体培养基的基础上，每升添加0.5gMES和8g琼脂；pH5.9。
实施例1、PvArrp1蛋白及其编码基因的发明
蜈蚣草（Pteris vittataL.），属于蕨类植物凤尾蕨科凤尾蕨属。
发明人从蜈蚣草从发现了一个与砷抗性相关的蛋白，将其命名为PvArrp1蛋白。PvArrp1蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。将编码PvArrp1蛋白的基因命名为PvArrpl基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
一、重组表达载体的构建
1、提取蜈蚣草叶片的总RNA。
2、以步骤1提取的总RNA反转录为cDNA。
3、以步骤2得到的cDNA为模板，用PvArrplS和PvArrp1A组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PvArrp1S：5’-ATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3’；
PvArrp1A：5’-CTAAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGA-3’。
PCR扩增程序：98℃10s、55℃30s、72℃70s，35个循环；72℃10min；10℃保存。
4、以步骤3的PCR扩增产物为模板，采用PvArrplS1/PvArrp1A1组成的引物对，得到PCR扩增产物。
PvArrp1S1：5’-
ggatccATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3’；
PvArrp1A1：5’- ggtaccCTAAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGA-3’。
方框标记的序列为与pSN1301质粒发生同源重组的序列，分别为针对pSN1301质粒的BamHI酶切位点上游的部分序列的同源臂和针对pSN1301质粒的KpnI酶切位点下游的部分序列的同源臂，所以PCR扩增产物可以与pSN1301质粒发生同源重组，用BamHI和KpnI酶切位点之间的序列取代pSN1301质粒的BamHI和KpnI酶切位点之间的小片段
PCR扩增程序同步骤3。
5、用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切pSN1301质粒，回收骨架载体（约13kb）。
6、将步骤4的PCR扩增产物和步骤5的载体骨架进行重组连接（采用CloneEZ重组克隆试剂盒并按说明书进行），得到重组质粒pSN1301-PvArrp1。根据测序结果，对重组质粒pSN1301-PvArrpl进行结构描述如下：将pSN1301质粒BamHI和KpnI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的PvArrpl基因。
7、以步骤3的PCR扩增产物为模板，采用PvArrplS2/PvArrp1A2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PvArrp1S2：5’-
ctcgagATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3’；
PvArrp1A2：5’-
ggtaccAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGAAAG-3’。
方框标记的序列为与pGFP121质粒发生同源重组的序列，分别为针对pGFP121质粒的XhoI酶切位点上游的部分序列的同源臂和针对pGFP121质粒的KpnI酶切位点下游的部分序列的同源臂，所以PCR扩增产物可以与pGFP121质粒发生同源重组，用XhoI和KpnI酶切位点之间的序列取代pGFP121质粒的XhoI和KpnI酶切位点之间的小片段。
PCR扩增程序同步骤3。
8、用限制性内切酶XhoI和KpnI双酶切pGFP121质粒（将pBI121质粒的GUS基因替换为GFP基因得到的重组质粒），回收骨架载体（约13kb）。
9、将步骤7的PCR扩增产物和步骤8的载体骨架进行重组连接，得到重组质粒pGFP121-PvArrp1。根据测序结果，对重组质粒pGFP121-PvArrpl进行结构描述如下：将pGFP121质粒XhoI和KpnI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2自5’末端第1-1137位核苷酸所示的PvArrpl基因。
二、转基因植物的获得
1、将重组质粒pSN1301-PvArrpl导入农杆菌菌株c58，得到重组农杆菌。
2、通过花浸泡法(Clough,S.J.,and Bent,A.F.(1998).Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J 16,735-743.)将重组农杆菌导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T1代种子。
3、T1代种子收获后在1/2GM固体无糖培养基（含20mg/L潮霉素）中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株（T2代植株）。
分别取T1代植株和T2代植株，先进行GUS染色鉴定。GUS染色鉴定的方法：待植株长至6-8片真叶时，剪取叶片进行GUS染色，呈现蓝色的的叶片对应的植株进行分子鉴定。分子鉴定的方法：提植株叶片的总RNA并反转录为cDNA，用PvArrp1S和PvArrp1A组成的引物对组成的引物对对来自各个样本的cDNA进行PCR鉴定（靶序列为约1.1kb的条带），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T1代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。
T2代转基因植株自交产生T3代种子。
随机选取两个转基因植株株系（L9株系和L11株系）的T3代种子进行步骤四的鉴定。
三、转空载体对照植株的获得
用pSN1301质粒代替重组质粒pSN1301-PvArrp1进行步骤二的操作，得到转空载体对照植株。
四、转基因植物和对照植株的各个性能鉴定
将L9株系的T3代种子、L11株系的T3代种子、转空载体对照植株的T3代种子和哥伦比亚生态型拟南芥分别进行如下鉴定（正常光照培养即光照16小时，黑暗8小时）：
1、表型鉴定
第一组：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d,然后将小苗移至新的1/2GM固体培养基上培养7d。
第二组：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，然后将小苗移至含10μM亚砷酸钠（AsIII）的1/2GM固体培养基上培养7d。
第三组：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，然后将小苗移至含150μM砷酸钠（AsV）的1/2GM固体培养基上培养7d。
第一组植株移至新的1/2GM固体培养基上并培养7天后的照片见图1。第二组植株移至含10μM亚砷酸钠（AsIII）的1/2GM固体培养基上并培养7天后的照片见图2。第三组植株移至含150μM砷酸钠（AsV）的1/2GM固体培养基并培养7天后的照片见图3。各组处理中，转空载体对照植株的生长情况均与哥伦比亚生态型拟南芥的生长情况一致。结果表明，转基因植株在含有AsIII或AsV的环境中的生长情况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥。外源表达PvArrp1基因在正常生长条件下并不影响拟南芥生长，但在As II I和AsV处理条件下可显著增强拟南芥的砷抗性，缓解砷处理对拟南芥生长的抑制。
2、根伸长量和鲜重的鉴定
第一组（AsIII 0μM，AsV 0μM）：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，测量小苗的根长（L1）后继续培养7d，再次测量小苗的根长（L2）并称重。
第二组（AsIII10μM）：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，测量小苗的根长（L1）后将小苗移至含10μM亚砷酸钠（AsIII）的1/2GM固体培养基上培养7d，再次测量小苗的根长（L2）并称重。
第三组（AsV 300μM）：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，测量小苗的根长（L1）后将小苗移至含300μM砷酸钠（AsV）的1/2GM固体培养基上培养7d，再次测量小苗的根长（L2）并称重。
根伸长量（mm）=L2-L1；是指移苗之后在7d的培养中主根长度的增加量。
每个株系每组实验取6粒种子进行上述步骤，进行三次重复试验，结果取平均值。
第一组植株和第二组植株的根伸长量见图4，鲜重见图5。第一组植株和第三组植株的根伸长量见图6，鲜重见图7。各组处理中，转空载体对照植株的根生长量和鲜重均与哥伦比亚生态型拟南芥一致。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，在10μM AsIII条件下培养7天，L9和L11的根伸长量增加超过10倍，鲜重增加了约1倍，在300μMAsV条件下，L9和L11的根伸长量增加超过2倍，鲜重增加了约1倍。结果表明，转基因植株在含有AsIII或AsV的环境中的生长情况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥。
3、植株含砷量的鉴定
第一组：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，然后将小苗移至含5μM亚砷酸钠（AsIII）的1/2GM固体培养基上培养7d。
第二组：将种子消毒后点播于1/2GM固体培养基上，平放避光置于4℃2d，然后移至培养箱中22℃正常光照培养3d，然后将小苗移至含10μM砷酸钠（AsV）的1/2GM固体培养基上培养7d。
每个株系取50粒种子进行上述步骤，进行三次重复试验，结果取平均值。
将培养7天后的植株从培养基上取下，每个植株分别进行以下操作：用超纯水洗三次后分别将地上部分和地下部分（根部）放入烘箱，80℃烘6h，称干重。将称过的材料放入消煮管加入混合酸[硝酸：浓硫酸：高氯酸=4:1:0.5（体积比），均为优级纯]1ml，室温放置冷消煮过夜（加入酸后室温静置称为冷消煮），然后250℃消煮4h，用用蒸馏水定容至20ml，滤纸过滤后用电感耦合等离子体发射光谱仪iCAP6300(ThermoElectron corporation,USA)测定砷含量。
第一组植株的根部总砷含量见图8，地上部分总砷含量见图9。第二组植株的根部总砷含量见图10，地上部分总砷含量见图11。各组处理中，转空载体对照植株的根部总砷含量和地上部分总砷含量均与哥伦比亚生态型拟南芥一致。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，在5μM AsIII条件下培养7天，L9和L11根部总砷含量分别降低了92%和91%，地上部分总砷含量分别降低了63%和68%，在10μM AsV条件下培养7天，L9和L11根部总砷含量分别降低了62%和61%，地上部分总砷含量分别降低了18%和24%。结果表明，转基因植株在含有AsIII或AsV的环境中的总砷含量显著低于哥伦比亚生态型拟南芥。
五、PvArrp1蛋白的定位
用重组质粒pGFP121-PvArrp1代替重组质粒pSN1301-PvArrp1进行步骤二的操作，得到转基因植物。转基因植物的苗根部的双光子荧光观测结果见图12，结果显示，GFP荧光定位在细胞膜上。
Claims (9)
1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对砷胁迫的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1）或（2）或(3）或（4）所述的DNA分子：
（1）序列表中序列2自5’末端第1至1137位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物砷胁迫抗性相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷胁迫抗性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将所述基因导入pSN1301质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到对砷胁迫的抗性高于所述目的植物的转基因植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求5所述重组载体导入所述目的植物中。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
9.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因，在调控植物对砷胁迫的抗性中的应用。
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