CN101454022B

CN101454022B - 假性感染性黄病毒及其用途

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Publication number: CN101454022B
Application number: CN2007800150079A
Authority: CN
Inventors: I·弗罗洛夫; E·弗罗洛瓦; P·C·梅森
Original assignee: TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Current assignee: TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Priority date: 2006-02-27
Filing date: 2007-02-27
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2027-02-27
Also published as: IL193522A; CN101454022A; WO2007098267A2; WO2007098267A3; US9273288B2; US20130023031A1; JP2014121324A; EP1991709B1; EP1991709A4; JP2009528032A; ZA200807544B; KR20090008193A; AU2007217352A1; UA101597C2; EA200870304A1; MY151062A; AP2008004629A0; AU2007217352B2; IL193522A0; CO6141481A2

Abstract

本发明公开了缺失了衣壳基因的属于黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中所述复制缺陷假性感染性病毒仅仅在表达黄病毒的衣壳或衣壳、prM和被膜蛋白的细胞中繁殖。本发明还公开了大规模生产所述病毒的方法和这些假性感染性病毒作为疫苗的用途，所述疫苗用于预防由属于该家族的病毒感染人或动物引起的疾病。

Description

假性感染性黄病毒及其用途

发明背景

发明领域

本发明涉及分子生物学，病毒学和免疫学领域。一般而言，本发明公开了属于黄病毒科的复制缺陷病毒的构建和它们作为疫苗在预防由属于该科的病毒引起的疾病中的用途。更特别地，本发明提供了复制缺陷黄病毒或假性感染性黄病毒(PIV aka RepliVAX)并公开了其作为针对黄病毒相关疾病的预防性疫苗的用途。

相关领域的描述

黄病毒科的黄病毒属包含了多种重要的人和动物病原体，并且基于免疫学测试中的反应性差异分类为四种不同的抗原复合物。通常，黄病毒在禽类或哺乳动物扩增宿主和蚊子或蜱(tick)载体之间循环。

黄病毒基因组是缺少3’端聚(A)序列的阳性极性的单链戴帽的RNA。它编码单个多肽，所述单个多肽在翻译时或翻译后加工为病毒结构蛋白，C、prM/M和E，形成病毒颗粒，和病毒基因组复制和包装为感染性病毒体所需要的非结构蛋白，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5(Chambers，1990)。病毒体(virions)包含病毒基因组RNA的单个拷贝，所述病毒基因组RNA包装为含C蛋白的核壳，被具有M和E蛋白的异源二聚体的脂质体被膜包围。与许多其它被膜病毒相比，核壳和被膜刺突之间的反应不是非常特异性的，并且含M/E被膜可在源于异源黄病毒的核壳周围有效形成，证实了衣壳序列的有限水平的同源性(Lorenz，2002)。或者，在没有C的情况下prM和E的表达可导致形成亚病毒颗粒(SVPs)，其不包含RNA或C蛋白(Mason，1991)。

生产亚病毒颗粒的prM/M-E盒已成为本领域已知的几种疫苗候选物的基础。这些疫苗候选物包括亚基(Konishi，1992；2001；2002；Qiao，2004)，DNA(Phillpotts，1996；Kochel，1997；Schmaljohn，1997；Colombage，1998；Aberle，1999；Konishi，2000；Konishi，2000；Kochel，2000；Davis，2001)，活载体(Mason，1991；Konishi，1992；Pincus，1992；Fonseca，1994；Pugachev，1995；Colombage，1998；Kanesa，2000；Minke，2004)疫苗。但是，这些疫苗具有严重的缺点。例如，亚基疫苗是使用安全的，但难以大量生产；DNA疫苗免疫原性很弱，病毒载体疫苗在存在载体免疫性时缺乏效价。

因此，尽管人们非常关注黄病毒相关疾病和黄病毒持续扩散到新领域，对于这些感染仍然没有开发出抗病毒治疗剂，并且至今只生产出了非常有限量的批准疫苗。失活病毒疫苗(INVs)已被批准用于防止蜱传脑炎(TBEV)和日本脑炎(JEV)。然而，像其它失活病毒疫苗一样，这些疫苗具有低的有限的效价并且需要多次疫苗接种。尽管有这些缺陷，日本脑炎和蜱传脑炎INVs具有好的安全性记录的优点。唯一批准的针对黄病毒的活减毒疫苗(LAV)是广泛应用的基于黄热病病毒(YFV)17D株的活减毒疫苗，所述黄热病病毒17D株是通过黄热病病毒的野生型Asibi株在鸡胚组织中连续传代而发展出的。尽管这种活减毒疫苗被认为是非常安全和有效的，接种者中黄热病的例子还是有报导，包括最近在美国新兵招募中的出现的例子(Gerasimon，2005)。而且，这种疫苗不推荐用于婴儿、孕妇和免疫受损的个体中，因为有副反应，包括疫苗相关脑炎。

然而，黄病毒反向遗传学系统的发展已经引起了基于这些病毒的合理减毒的新型活减毒疫苗的生产和设计。这种新型的疫苗包括基于黄热病病毒17D的嵌合体，其中黄热病病毒prM-E-编码基因组片段盒已被源于异源黄病毒的prM-E-盒取代(Chambers，1999)。类似的基于嵌合病毒的方法应用于基于登革热和TBE的骨架(Pletnev，2002；Huang，2003)。在大多数例子中，嵌合黄病毒证实为高度减毒的表型并且能够引起有效的保护性免疫反应并且在病毒感染之后进行保护，所述病毒的结构蛋白被嵌合体表达(Monath，2002)。这些嵌合疫苗候选物的有效免疫接种没有显示出被预先存在的“载体”免疫性预防(Monath，2002)，其干扰基于其它病毒载体的重组病毒疫苗的效价。而且，尽管嵌合黄病毒可能提供了相当普遍的生产新疫苗的方法，仍然存在关于嵌合体自身可能至少在免疫受损个体中是致病性的考虑(Chambers，1999)，或存在可能会产生致病性嵌合体的考虑，因为在这些病毒的繁殖过程中已经检测到突变(Pugachev，2004)。

另一种在疫苗开发中有前途的方向是基于在黄病毒基因组中产生不可修复的缺失，其使得被免疫宿主中的生产性病毒复制效率更低或成为不可能事件。在后一个情形中，编码整个复制性机构但缺少例如C-编码区的病毒基因组可为体内免疫而被递送，其作为能够自我复制的体外合成的RNA(Kofler，2004；Aberle，2005)，或可能地，以在RNA聚合酶II启动子的控制下的DNA形式或作为体外合成的RNA，并且其能够自我复制(Kofler，2004；Aberle，2005)。用体外合成的缺陷性RNA基因组的直接免疫(其明确了在不存在完整病毒复制循环时SVPs的生产)，已被证明在产生保护性免疫性中是安全和有效的(Kofler，2004；Aberle，2005)。但是，因为合成、稳定性和递送的问题，在生产基于RNA的疫苗候选物时可能存在显著的障碍。

因而，现有技术对于可用于针对由属于黄病毒科的病毒感染引起的疾病的安全、有力和有效类型的疫苗是有缺陷的。本发明满足了本领域长期以来的需求和期望。

发明概述

在本发明的一个实施方式中，提供了黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒。所述复制缺陷假性感染性病毒包含：编码衣壳(C)蛋白的核苷酸序列中的缺失，所述缺失不破坏基因组环化所需要的RNA序列；prM/M的正常成熟所需要的prM蛋白的信号序列，或其组合，所述复制缺陷假性感染性病毒仅仅在表达黄病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突变C蛋白、突变prM、突变被膜蛋白或其组合的细胞中复制。

在本发明的另一相关实施方式中，提供了有效表达黄病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突变C蛋白、突变prM、突变被膜蛋白或其组合的细胞培养系统，使上述黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒能够在适当条件下繁殖。

在本发明的另一实施方式中，提供了生产上述黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒的方法。所述方法包括：产生黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含衣壳基因中的缺失，所述缺失不破坏基因组环化所需要的RNA序列，prM/M的正常成熟所需要的prM蛋白的信号序列，或其组合；产生表达黄病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突变C蛋白、突变prM、突变被膜蛋白或其组合的细胞系，所述细胞系提供高水平的黄病毒蛋白，所述蛋白为黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒的繁殖所需要；并且用黄病毒科的假性感染性病毒感染细胞系，从而生产黄病毒科复制缺陷假性感染性病毒。

在本发明的另一相关实施方式中，提供了药物组合物，其包含由本文描述的方法生产的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒。

在本发明的进一步相关的实施方式中，提供了保护受试者免受由暴露于黄病毒引起的感染的方法。所述方法包括给予受试者免疫有效量的由本文描述的方法生产的药物组合物，其在受试者中引起针对黄病毒的免疫反应，从而保护受试者免受感染。

附图简述

图1是在生产C或用于缺陷的反式互补的所有病毒结构蛋白的细胞中黄病毒PIV复制的图示。PIVs在正常细胞中体内或体外的复制导致不具有核壳的SVPs的释放。

图2A-2C显示表达YFV C以及YFV C、prM和E的细胞系可补助YF PIV复制。图2A是表达YFV和GFP的YF PIV基因组的图示。图2B是表达具有prM信号肽的Pac基因和YFV C(锚定的C；VEErep/C1/Pac)，或具有20a.a.的prM的锚定的C(VEErep/C2/Pac)，或所有YFV结构蛋白(VEErep/C-prM-E/Pac)的VEEV复制子的图示。图2C显示了YF PIV被用体外合成的PIV基因组转染的细胞系的释放。在显示的时间点替换培养基，测定PIVs滴度。箭头显示了细胞以1:5的比例更替继代接种的时间点。

图3A-3B显示了在包装细胞系上的YF PIV的生长曲线。用显示的每细胞感染单位MOIs的YF PIV感染包含VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac复制子的BHK-21细胞。在显示的时间时，培养基被替换并且确定释放的PIV的滴度。箭头显示了当细胞以1:5的比例更替继代接种时的时间点。图3A显示了在MOI10inf.u/细胞时的生长曲线并且图3B显示了在MOI0.1inf.u/细胞时的生长曲线。

图4A-4C显示了表达密码子优化的C基因的细胞生产的YF PIV。图4A显示了合成基因的核苷酸序列。引入的突变通过小写字母表示(SEQ ID NO：1)。图4B显示了在包装细胞系上的YF PIV的生长曲线。用显示的每细胞感染单位MOIs的YF PIV感染包含VEErep/C2/Pac、VEErep/C-prM-E/Pac、VEErep/C2opt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac复制子的BHK-21细胞。在显示的时间替换培养基并确定释放的PIV滴度。图4C显示了在37℃接种4天后YFV和YF PIV在包含VEErep/C2opt/Pac的细胞系中发展的噬菌斑。

图5A-5C显示了WN PIV在包装细胞中发展了弥漫性感染。图5A是WN PIV基因组和表达WNV结构基因的VEEV复制子的图示。图5B显示了接种70小时后WN PIV生产WNV抗原阳性细胞的集落(用NS1抗体-针对BHK(VEErep/C^*-E^*-Pac)细胞感染显示)。图5C显示了相同的WN PIV制剂针对Vero细胞单层感染仅仅生产单独感染细胞(在感染之后70小时用与图5B使用的相同黄芪胶染色方法显示)。

图6A-6C显示对于从用YF和WN PIVs感染的细胞释放的E蛋白的检测。在图6A中，用5inf.u/细胞MOI的YF PIV感染BHK-21细胞。释放的SVPs被收获并通过超速离心而纯化。样品通过SDSPAGE溶解，转移到滤器，通过D1-4G2MAB检测E蛋白。第一道，从未感染细胞收获的培养基；第二道，感染48小时后从用YF PIV感染的细胞中收获的培养基；第三道，感染72小时后从用YF PIVs感染的细胞中收获的培养基；第四道，YFV(2X10⁷PFU)。图6B中，用WN PIV感染vero细胞24小时，并且然后澄清培养液(在检测任何细胞裂解之前收集)的部分，通过SDS PAGE溶解，转移到滤器，并与E-特异性MAB反应(7H2；Bioreliance)。相同样品与多克隆血清的反应没有显示在这种制剂中的任何细胞相关非结构蛋白(结果未显示)，确认了E蛋白被活跃地分泌。第一道，WNV样品；第二道，从未感染细胞中收获的培养基；第三道，感染48小时后从用WN PIV感染的细胞中收获的培养基。在图6C中，western印迹显示了获自用YFV PIV RNA电穿孔的正常(非包装)BHK细胞的SVPs的蔗糖密度梯度中制备的部分的E蛋白成分。E蛋白反应的峰(在32％蔗糖时)相应于SVPs密度，并与这种事实一致，比在并行分析(42％)中运行的YFV迁移得更慢。

图7A-7F显示了用于黄热病(YF)和西尼罗河(WN)假性感染性病毒(PIV)生产的质粒的图示。图7A显示pYFPIV，图7B显示pWNPIV，图7C显示pVEErep/C1/Pac，图7D显示pVEErep/C2/Pac，图7E显示pVEErep/C3/Pac，图7F显示pVEErep/C^*-E^*-Pac。

图8A-8V显示本文使用的质粒的序列。图8A-8D显示pYFPIV的序列(SEQ ID NO：6)，图8E-8H显示pVEErep/C1/Pac的序列(SEQ IDNO：7)，图8I-8K显示pVEErep/C2/Pac的序列(SEQ ID NO：8)，图8L-8O显示pVEErep/C-prM-E/Pac的序列(SEQ ID NO：9)，图8P-8R显示pVEErep/C2opt/pac的序列(SEQ ID NO：10)，图8S-8V显示pVEErep/Copt-prM-E/Pac的序列(SEQ ID NO：11)。

图9显示用于反式(in trans)提供C的RepliVAX和VEE的重叠区域的图示。¹三十六种突变被插入VEErep/pac-Ubi-C^*以最小化与RepliVAX基因组编码的C片段的同源重组。²5’和3’CS序列在RepliVAX基因组中的位置。

图10显示了在第0代(从电穿孔开始)和第10代通过WNRepliVAX在C-表达细胞系{BHK(VEErep/Pac-Ubi-C^*)}中生产的感染性集落的并行(side by side)的比较，显示出更好生长的变体被容易地选择出。

图11显示在包含C-表达盒(VEErep/Pac-Ubi-C^*)的WHO-检定(certified)的Vero细胞中生产的RepliVAX PIV的滴定。尽管产生的PIV比在BHK细胞中生产的滴度稍低，Vero细胞使高滴度PIV的收获成倍增加，这对于BHK细胞是不可能的。

图12A-12B显示了环化突变体。图12A显示具有单碱基，匹配的CS突变的WNV/IRES-RLuc复制子的复制显示一些单碱基突变以WT水平复制。图的左边部分显示了在5′和3′CS序列之上的测试基因组。右边显示了利用Rluc报告基因检测的复制水平，以WT复制水平的百分比表示。下划线碱基表示突变的碱基。图12B显示源于通过组合m10和m13(图A)的具有匹配双碱基改变(m17)的WNV/IRES-RLuc复制子的复制，与以每种可能的模式组合WT和突变的CS的突变体，以及设计为产生非活性聚合酶(阴性对照)的突变体检测的复制水平相比较。图的左边部分显示了在5′和3′CS序列之上的测试基因组。右边显示了利用Rluc报告基因检测的复制水平，以WT复制水平百分比表示。下划线碱基表示突变的碱基。^*表示没有检测到复制。

发明详述

人们仅仅为少数由黄病毒引起的疾病生产了安全和有效的疫苗。已经用于生产针对YE、JE和TBEV的疫苗的经典的失活病毒疫苗(INV)和活减毒疫苗(LAV)方法仍然没有产生许可的产品以预防由其它黄病毒引起的疾病，特别是登革热和西尼罗河脑炎(WNE)。对于现有的LAVs(残余毒力和毒力逆转)和INV产品(由于抗原负荷和偶发抗原的反应原性)存在安全性考虑。另外，INVs通常需要多次接种。而且，对两种类型的疫苗都有生产上的考虑，包括需要避免在活减毒疫苗的繁殖过程中的毒力逆转，原因是生产对于失活病毒疫苗产品的强免疫反应需要的大量物质，和对繁殖用于生产INV产品的毒性病毒的高水平保存设施(high containment facilities)的需要。尽管存在对于新型黄病毒疫苗的有前途的候选物，它们的发展将需要克服这些问题。

本发明一般而言涉及属于黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒的构建和利用。在这点上，本发明描述了结合了失活疫苗的安全性和活减毒疫苗的效率和可规模化能力的新型复制缺陷黄病毒，其也被称为RepliVAX。本发明中也称为假性感染性病毒(PIVs)的这些黄病毒包含基因工程化的黄病毒基因组，其具有大部分衣壳-编码区域的缺失，从而防止该基因组在正常细胞系或接种了疫苗的动物中产生感染性子代。但是，这些假性感染性病毒可在表达C，或C-prM-E盒的细胞系中繁殖，其中它们高水平复制。因此，由于缺少C蛋白的反式互补，这些假性感染性黄病毒不能在正常动物中体内或体外发展出弥漫性感染，并且因此不能在动物中产生疾病。

与本领域已知的疫苗和生产这些疫苗的方法相反，本发明提供了假性感染性黄病毒的产业规模的生产系统，其将使得所述疫苗比失活疫苗更廉价地生产，同时比活减毒疫苗的利用更安全。通过提供新型重组疫苗达到这些目的，所述新型重组疫苗能够在被免疫动物和人中仅仅单轮复制，导致释放缺少遗传物质但是作为有效免疫原的亚病毒颗粒(SVPs)。

本发明已经证明假性感染性黄病毒可对于黄病毒(YFV)和西尼罗河病毒(WNV)生产。基于此，本发明预料本文描述的方法可广泛的应用于对抗其它黄病毒的疫苗的发展。而且，用所述假性感染性黄病毒的正常细胞系的感染产生缺少核壳和遗传物质的SVPs。本文描述的假性感染性黄病毒证明不能引起任何疾病，因而是安全的。另外，由于单轮复制和SVPs释放的能力，这些假性感染性黄病毒在小鼠中是免疫原性的，呈递病毒抗原。WN PIVs也保护小鼠免受WNV攻击之后的致死脑炎。

本文描述的PIVs可以允许在细胞培养物中高产量生产的方式生产，并且不能引起动物中的疾病。这些产品可递送给动物，在动物中它们的缺陷性复制过程预防了传播和疾病，但允许SVPs，黄病毒亚基免疫原的产生，所述黄病毒亚基免疫原已经显示对于引起针对由几种黄病毒导致的疾病的有效免疫反应是有效的。

本发明还证实了假性感染性黄病毒途径可应用于两种联系很远的蚊媒黄病毒。用于蜱媒黄病毒(Kofler，2004)的基于RNA的疫苗发展的类似技术的适用性显示了基于PIV的技术将适用于联系更远的黄病毒。另外，利用基于TBEV RNA的疫苗的工作显示了除了对于SVPs的抗体反应之外(类似于本文描述的)，具有复制活性的黄病毒基因组导入接种疫苗的宿主的细胞将也产生T细胞反应(Kofler，2004；Aberle，2005)。虽然T细胞反应在本文中没有测量，预测PIVs能够诱导模拟由病毒感染产生的T细胞反应。

虽然本文描述的PIV疫苗依赖于为TBEV制备的基于RNA的疫苗利用的相同黄病毒复制和SVP生产策略(Kofler，2004；Aberle，2005)，这些PIV疫苗不需要基因枪传递给动物，可在细胞培养物中容易地生长，并且可遭受与目前应用于商业上生产的YFV17D疫苗的相同类型的稳定化和储存(冻干)条件，因而提供了一种可规模化，可储存，并且可市场化的疫苗产品。对于WN RepliVAX的稳定性的初步研究已经显示了冻干制剂当在4℃下储存30天时没有显示出可检测的滴度损失。

为发展假性感染性黄病毒的有效反式互补(并且因此生产该病毒)所需要的高水平生长条件，本发明利用了表达来自VEEV复制子的高水平的C(或C-prM-E)的细胞。VEEV复制子比源于其它甲病毒属的复制子是较少引起细胞病变的，并且在脊椎动物和昆虫来源的一些细胞系中容易地建立起持久的复制。这种系统对于假性感染性黄病毒的生产看来是适合的，因为i)VEEV复制子在异源蛋白的合成，和在本发明中合成的C合成到黄病毒基因组去衣壳化所需要水平中是高效的。ii)VEEV复制子不会可检测地干扰黄病毒复制(Petrakova，2005)。而且，VEE复制子和YF PIV基因组可在BHK-21细胞中一起复制，而不导致CPE。iii)VEEV复制子可以高滴度包装成VEE病毒体，所述病毒体可被用于快速建立生产黄病毒结构蛋白的包装细胞系。

而且，C表达的前后对PIV生产的效果的监测显示表达锚定形式的C以及另外20a.a.的prM的包装细胞比单独表达锚定C的细胞产生更多的颗粒，暗示病毒体形成中处理事件的正确顺序的重要性。被包含prM的起始20个氨基酸的构建体增强的包装效率的基础是不清楚的，但是这种现象可通过两个邻近剪切位点(NS2B/NS3-和信号肽特异)(Yamshchikov和Compans，1994)的特定剪切顺序的需要和/或C蛋白产品在这两种不同的环境中的分配/稳定性的差异而解释。另外，观察到C与prM和E(VEErep/C-prM-E/Pac)的共表达仅仅导致相对于VEErep/C2/Pac的PIV产量的微小增加，所述VEErep/C2/Pac表达锚定C与prM片段。

当检查VEEV复制子-编码C基因的密码子最优化以确定C基因序列的改变是否增加PIV的产量时，没有显示出在YFV PIV释放上与不表达密码子最优化的C基因的细胞有很大的差别。这种观察暗示了甚至利用没有最优化基因的VEEV复制子显示出产生饱和水平的C。这些结果与其它研究是一致的，所述其它研究证实了表达编码WNV C-E盒的VEEV复制子产生比在WNV感染细胞中监测到的更高的E水平。尽管最优化C基因的转表达不能提高YF PIV的产量，包含表达Copt的VEEV复制子的细胞当用YF PIV感染时发展了CPE并且产生了噬菌斑。这使得在Copt细胞中PIV的感染更类似于通过有复制能力的的病毒发展的感染。利用编码YFV Copt基因的VEEV复制子在假性感染性黄病毒生产中的用途的另外优点是安全水平，因为密码子的改变降低了与假性感染性黄病毒基因组的同源重组的机会。而且，Copt基因还可在其环化序列中被改变(本文为BHK(VEErep/C^*-E^*-Pac)细胞的WNV C编码区所述的)，以降低产生一种复制活性C-编码黄病毒的重组机会。到目前为止，本文描述的WN或YF PIV系统都没有产生可在细胞培养物或在高度易感染动物中检测的复制活性的黄病毒。另外，体内实验证实YF和WN PIVs都是安全的，并且甚至在用高剂量的PIVs i.c.接种3到4天龄小鼠之后不会导致任何疾病。然而，WN PIVs能够诱导高水平的中和抗体并且保护小鼠免受有复制能力的WNV的感染。

而且，丙型肝炎与AIDS归类为目前没有获得疫苗的致病性和致死性的主要感染性原因。在日本和韩国，HCV现在对肝细胞癌症的发展的作用超过了乙肝，肝细胞癌症是一种最普遍类型的癌症和一种归因于肝疾病的普遍死亡模式。这种方式在其它亚洲国家和其它发展中国家很可能变得越来越普遍，这归因于越来越流行的HCV以及对乙肝的有效免疫。在埃及和其它国家的一些社区中，丙肝感染的流行惊人的高，很可能至少部分归因于传统卫生保健实践和/或过去危险的西方技术的引入(例如在对血吸虫病的公共健康运动中病毒的以针为媒介的传播)。

在许多发展中国家，肝癌和硬化的比例很高，在输血过程中很少有有效的丙肝的控制。丙肝也是美国的主要公共健康问题，有大约4百万HCV携带者，许多由于肝病或肝癌的晚期面临着死亡的威胁。目前估计在美国每年有8000到10000个由于丙肝的死亡。在没有新的治疗剂或预防性方法的情况下，这一数字很可能在接下来的10-20年中增至三倍，潜在地超过由于AIDS的死亡数。

然而，没有预防这种感染的疫苗，由于可以理解的技术困难、大药厂对开发疫苗通常缺少兴趣，和主要基金机构的惯性，发展疫苗的努力(国内和国际)严重地受限。并且，由于有许多感染性疾病，面临归因于丙肝的严重肝疾病或死亡的很大风险的人是弱势的。

到目前为止，产生抗HCV感染的有效疫苗的努力是不成功的。然而，在最近几年内，HCV领域开始迅速发展，并且现在这种病毒在组织培养物中复制到相当高的滴度，到达10⁶inf.u/ml。在HCV基因组和其它黄病毒，如YF，JEV，TBE和其它的基因组之间有明显的相似。因此，设计复制缺陷黄病毒的策略可不仅应用于黄病毒属的成员，而且也可应用于肝病毒(Hepacivirus)属(其包括HCV)。HCV衣壳蛋白可通过在许多细胞系中的重组甲病毒复制子(基于SINV，VEEVEEEV和其它)生产，所述细胞系包括目前已知对于HCV感染易感的Huh-7和Huh-7.5细胞。复制缺陷HCV基因组，缺少衣壳基因，可被转染入衣壳生产细胞系并且将被包装成感染性含衣壳的颗粒。大规模生产需要的连续轮感染也可在这些细胞上进行。然而，在体内，在原初肝细胞中(以及可能其它细胞类型)，缺乏全衣壳基因或根本没有衣壳基因的HCV基因组将仅仅产生非结构病毒蛋白和糖蛋白E1和E2。这些蛋白将被呈递给免疫系统i)在蛋白酶体降解之后；ii)在细胞表面上和iii)以具有含E1和E2被膜的病毒样颗粒的形式。衣壳缺陷将使得病毒不能够扩散，并且因而限制被免疫接种感染的细胞。

概括而言，本发明证实了衣壳缺陷性假性感染性黄病毒i)可在表达衣壳或所有黄病毒结构基因的细胞系中产生一种弥漫性感染；ii)PIVs不能在正常细胞中产生弥漫性感染，iii)当PIVs感染正常细胞时，PIVs产生含SVPs的E蛋白；iv)PIVs在动物中显示了高水平的安全性；v)PIVs保护小鼠免受随后的黄病毒感染。总的来说，本发明证实了黄病毒PIVs可能是一种对于抗黄病毒感染和类似于黄病毒的病毒引起的感染的疫苗的发展安全，有力，并且有效的平台。

本发明涉及复制缺陷假性感染性黄病毒科，包含：在编码衣壳(C)蛋白的核苷酸序列中的缺失使得所述缺失不破坏基因组环化所需要的RNA序列，prM/M的正确成熟所需要的prM蛋白的信号序列，或其组合，所述黄病毒科仅仅在表达黄病毒科病毒的C蛋白或C，prM，被膜蛋白，突变C蛋白，突变prM，突变被膜蛋白或其重组体的细胞中复制。一般而言，黄病毒科包含属于黄病毒属、肝病毒属或瘟病毒属(Pestivirus)的病毒，或通过将其它病毒的prM-E盒与假性感染性黄病毒科的prM-E盒交换而产生的所述病毒的其它嵌合体。属于黄病毒属的病毒的例子不限于但可包括黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易(Saint Louis)脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷(Murray Valley)脑炎病毒。而且，属于肝病毒属的病毒的例子包括但不限于丙型肝炎病毒，并且属于瘟病毒属的病毒包括但不限于牛病毒性腹泻病毒(Bovine virus diarrhea)、猪瘟病毒(swine fevervirus)或猪霍乱病毒(hog cholera virus)。

在黄病毒的例子中，缺失的编码黄病毒C蛋白的核苷酸序列可编码氨基酸26到100或C蛋白的氨基酸26到100之内的氨基酸组合。所述组合可包括但不限于氨基酸26-93，31-100或31-93。本领域普通技术人员可利用相同的准则从属于黄病毒科的其它病毒或具有与这些病毒相同的基因结构的其它病毒删除C蛋白的核苷酸序列。通常并且可适用于所有这些病毒的是，缺失的基因被编码标记蛋白或抗原的基因取代。标记蛋白的例子可包括但不限于绿色荧光蛋白。

本发明还涉及表达黄病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突变C蛋白、突变prM、突变被膜蛋白或其组合的细胞培养系统，所述系统对于保证上述复制缺陷黄病毒科在适当条件下繁殖是有效的。为此目的，表达黄病毒科野生型或突变蛋白的细胞可利用基因工程化的源于病毒载体的复制子而产生。

一般而言，复制子中编码黄病毒科病毒的蛋白的基因被密码子最优化型的编码病毒蛋白的基因取代，使得所述取代降低细胞系编码基因与黄病毒科的假性感染性病毒的基因组重组的能力和/或提高黄病毒科假性感染性病毒的生产。

例如，所述复制子可表达包含在编码黄病毒科病毒的C蛋白的基因的至少36个核苷酸位点的突变的C蛋白。复制子可表达复制子中的C蛋白，所述C蛋白包含非天然环化序列使得环化序列的存在降低复制缺陷假性感染性病毒与天然病毒的生产性重组的机会。而且，复制子可表达蛋白，所述蛋白包含编码截短的C-prM连接的改变的核苷酸序列，在体内提高含prM/E的SVP的产量，或其组合，所述改变的序列的存在提高细胞培养物中复制缺陷假性感染性病毒的产量。

而且，通过利用体外合成的复制子RNAs转染，通过用设计为从细胞RNA-聚合酶II-特异性启动子合成功能性甲病毒复制子的质粒DNAs转染，或通过利用包装在甲病毒结构蛋白之内的甲病毒复制子感染，将表达黄病毒科蛋白的复制子引入细胞中。本文使用的病毒载体可以是甲病毒。所述甲病毒的代表性例子包括但不限于委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)(VEEV)，辛德毕斯病毒(Sindbis virus)，东方马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitisvirus)(EEEV)，西方马脑炎病毒(Western Equine Encephalitis virus)(WEEV)或罗斯河病毒(Ross River virus)。

本发明进一步涉及生产黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒的方法，包含：产生黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含衣壳基因中的缺失，prM/M的正确成熟所需要的prM蛋白的信号序列，或其组合，所述缺失不破坏基因组环化所需要的RNA序列；产生表达黄病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突变C蛋白、突变prM、突变被膜蛋白或其组合的细胞系，所述细胞系提供黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒繁殖所需要的高水平蛋白；和用黄病毒科的假性感染性病毒感染细胞系，因而产生黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒。关于病毒类型，衣壳基因缺失位点，产生表达黄病毒科的突变和野生型蛋白的细胞系的方法，复制子类型和复制子中的突变和编码复制子中黄病毒科突变和野生型蛋白的基因的修饰的所有其它方面都与上面讨论的相同。

本发明还涉及包含通过上述方法生产的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒的药物组合物。本发明进一步涉及保护受试者免受由于暴露于黄病毒科导致的感染的方法，包含给予受试者免疫有效量的本文所述的药物组合物，所述组合物在受试者中引起抗黄病毒科的免疫反应，因而保护受试者免受感染。所述组合物可通过腹膜内、皮内、皮下、肌肉内、口服或鼻内途径给药。而且，受益于所述组合物的使用的受试者可以是人，或动物。

如本文所用的，术语“一种(a或an)”可表示一种或多种。如本文在权利要求所用的，当与“包含”联用时，“一种”可表示一种或多于一种。如本文所用的，“另一种”或“其它”可表示至少第二或更多种与其相同或不同的要求的成分或组分。如本文所用的，术语“黄病毒科”包括黄病毒、肝病毒、瘟病毒属。属于黄病毒属的病毒的例子包括但不限于黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒，类似的，属于肝病毒属的病毒的例子包括但不限于丙型肝炎病毒，并且属于瘟病毒属的例子包括但不限于牛病毒性腹泻病毒(Bovine virusdiarrhea)、猪瘟病毒(swine fever virus)或猪霍乱病毒(hog choleravirus)。

而且，尽管本发明公开了属于黄病毒属的复制缺陷假性感染性黄病毒科病毒的构建和用途，本领域普通技术人员可利用相同的准则构建包含属于黄病毒科的其它病毒的嵌合体，或通过置换黄病毒科或其它类似病毒之内的病毒的prM-E盒构建嵌合体。

包含本文讨论的属于黄病毒科的假性感染性病毒的药物组合物可彼此或与其它药物组合物同时或序贯给药。所述组合物共给药的效果是为了保护个体免受由所述病毒引起的感染和其它疫苗可治疗的疾病。本文所述的组合物，其它药物组合物，或其组合可通过本领域的任何标准方法全身或局部独立给药，例如，皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、皮内、肌肉内、局部、经肠、经直肠、经鼻、向颊地、经阴道或通过吸入喷雾，通过药泵或包含在透皮贴剂(patch)或植入片中。本文所述的组合物的剂量制剂可包含适于本给药方法的传统的无毒，生理或药学可接受的载体或媒介，这对于本领域普通技术人员来说是公知的。

本文所述的组合物，其它药物组合物，或其组合，可独立给药一次或多次，以获得，维持或提高治疗剂效果。确定剂量或确定组合物中的每种或两种的适当剂量是包含单个给药剂量还是多个给药剂量是在本领域技术人员的知识范围之内的。适当的剂量依赖于受试者的健康，对个体免受黄病毒感染的保护，给药途径和利用的制剂。

下述实施例是为了解释本发明的不同实施方式而给出，不意味着以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地理解到本发明非常适于实现目的并获得提到的结果和优点，以及本发明固有的目的，结果和优点。本领域技术人员可以想到包含在如权利要求范围所限定的本发明的精神之内的改变和其它用途。

实施例1

细胞培养

BHK-21细胞由Paul Olivo(Washington University，St.Louis，Mo)提供。它们在37℃下保持在补充了10％胎牛血清(FBS)和维生素的α极限必需培养基(aMEM)中。WHO-核定的Vero细胞，最初为用于人疫苗生产而制备，由NIH的Dr.Steve Whitehead提供。Vero细胞保持在包含6％FBS的MEM中。

实施例2

质粒构建

对于所有的质粒构建体使用标准重组DNA技术。使用的质粒的图示显示于图7A-7F。图和序列显示于图8A-8F。在别处已经描述了包含YFV17D株基因组的感染性cDNA的亲本低拷贝量的质粒pACNR/FLYF-17Dx(Bredenbeek et al.，2003)，所述质粒由Dr.CharlesM.Rice提供(Rockefeller University，New York，N.Y.)。pYFPIV包含有缺陷的YFV基因组(YF PIV)，其中编码YF衣壳基因的氨基酸26-93的片段被源于pEGFP-N1(Clontech)的密码子最优化的GFP基因取代。WN PIV基因组(pWNPIV)源于Texas2002感染性cDNA(Rossiet al.，2005)，通过融合C的密码子30与C的密码子101(见图5A)。质粒pVEErep/C1/Pac，pVEErep/C2/Pac和pVEErep/C-prM-E/Pac(图2A)编码双亚基因组VEEV复制子，其中第一亚基因组启动子驱动RNAs的转录，所述RNAs包含VEEV26S RNA的5’UTR，后面分别紧接着对应于YFV基因组的nt119-481，119-541和119-2452的序列。第二亚基因组启动子驱动嘌呤霉素乙酰转移酶(Pac)基因的表达，其产品使细胞产生对由嘌呤霉素(Pur)引起的翻译阻滞的抗性。表达与Pac基因融合的WNV的C-prM-E盒(源于Sindbis病毒复制子(Scholle et al.，2004))的非细胞致病性VEEV复制子(命名为pVEErep/C^*-E^*-Pac)从VEE非细胞致病性复制子中(Petrakova et al.，2005)产生；E-编码序列与Pac基因通过连接体融合，所述连接体由NS1的起始9密码子和NS2B的最后25密码子，紧接着与直接融合于FMDV2A的NS3的2密码子组成(见图5A)。编码YFV17D衣壳的密码子和prM的起始20氨基酸的最优化序列利用别处描述的密码子频率数据设计(Haas et al.，1996)。这种基因通过PCR从重叠人工寡核苷酸中合成。扩增的片段在克隆入表达盒VEErep/C2opt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac之前被测序。后一个复制子具有与pVEErep/C2/Pac和pVEErep/C-prM-E/Pac基本上相同的设计，但包含图4A所示的密码子最优化的序列。

另外，还产生了表达JEV prM-E的嵌合WN-RepliVAX。这通过取代编码WNV基因组的A RepliVAX中的JEV的Nakayama株的prM和E基因而构建。基因交换是通过将截短的WNV C蛋白的最后密码子与JEV的prM编码序列的起始密码子(Nakayama株)直接融合而获得。相同的融合策略应用于盒的3’末端，JEV E蛋白的最后密码子与WNV的NS1的起始密码子直接融合。这些融合被引入编码结合了T7启动子和核酶的全WN RepliVAX cDNA的BAC质粒，并且从这种BAC DNA回收的RNA被引入BHK(VEErep/Pac-Ubi-C^*)细胞。产生的RepliVAX(命名为JE RepliVAX)在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C^*)上形成弥漫性感染性集落(foci)。对于WN RepliVAX，形成于这种细胞系上的集落比通过完全感染性WNV-JEV嵌合体产生的小。JERepliVAX生长到比WN RepliVAX低大约10倍的滴度，获得在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C^*)中超过10⁶U/ml的滴度。如所期望的，JERepliVAX与JE-特异性Mabs反应，并且期望类似的嵌合黄病毒，JERepliVAX将诱导高水平的JEV-中和抗体，并产生抗JE保护。

实施例3

RNA转录

质粒通过在CsCl梯度中离心而纯化。在转录反应之前，质粒通过XhoI(用于pYFPIV)或MhuI(用于VEE复制子和VEE辅助编码质粒)或SwaI(用于pWNPIV)线性化。RNAs在帽子类似物的存在下通过SP6或T7RNA聚合酶合成。转录物的产量和完整性在非变性条件下通过凝胶电泳而分析。转录反应的等分试样用于电穿孔而不用另外纯化。

实施例4

RNA转染和PIV复制分析

BHK-21细胞的电穿孔在前述条件下进行(Liljestrom et al.，1991)。为建立包装的细胞培养物，VEEV复制子电穿孔24小时后将Pur加入到培养基中达到10g/ml。体外合成的YF PIV基因组的转染在5天后进行，那时含复制子细胞重新开始有效生长。在图示时间点通过用含Pur的相同培养基替换培养基而收获样品。在许多实验中，PIV分泌细胞在到达汇合时分裂。

VEEV复制子通过体外合成的复制子和2辅助RNAs(Volkova etal.，2006)的共电穿孔入BHK-21细胞而包装入VEEV感染性病毒颗粒。含复制子病毒颗粒在转染后24小时收获，用于感染原初BHK-21细胞，紧接着Pur选择。在WN PIV的例子中，体外合成的PIV RNA转染入含表达WN C、prM和E和Pac的VEErep/C^*-E^*-Pac复制子的BHK细胞[BHK(VEErep/C^*-E^*-PAC)细胞]。VEErep/C^*-E^*-PAC基因组的THE方案示于图5A。收获的PIVs利用标准方法在这些细胞上传代(Rossi et al.，2005)。

实施例5

测量YF PIV的滴度

为测量释放的YF PIV的滴度，BHK-21细胞以5x10⁵细胞/孔接种入六孔Costar皿。四小时后，用不同稀释的包装病毒子感染细胞，37℃下在5％CO₂培养箱中培育1小时之后，用补充了10％FBS的2ml MEM覆盖它们。感染的细胞数量通过在倒置UV显微镜下计数GFP-阳性细胞而评价。来自接种量的感染细胞分数通过计数限定区域的显微镜视野中荧光-产生细胞而确定。平均5个不同视野的计数，重新计算对应于每系列稀释的滴度。在后一个实验中，滴度也通过单层BHK-21细胞上的噬菌斑测定而测量，所述BHK-21细胞携带VEErep/Copt-prM-E/Pac复制子，所述测量利用前述条件(Lemm et al.，1990)，除了细胞为了噬菌斑发展在琼脂糖下培育5天，然后用2.5％的甲醛固定并用结晶紫染色。

实施例6

YF PIVs的传代

包装的细胞系通过体外合成的VEEV复制子RNAs的转染或通过用包装入VEEV结构蛋白的相同复制子以10inf.u/细胞的感染复数(MOI)感染细胞而建立。Pur选择之后，用YF PIV以不同MOIs感染它们。在图示时间点通过替换培养基收获样品。

实施例7

YF SVP生产的分析

BHK-21细胞以每100-mm皿2x10⁶的浓度接种。在37℃下培育4小时之后，用YF PIV以10inf.u/细胞的MOI感染细胞，并且然后在补充了10％FBS的10ml的MEM中培育24小时。然后培养基被每24小时替换的10ml无血清培养基VP-SF(Invitrogen)替换以分析SVP释放。收集的VP-SF样品通过低速离心而澄清(5,000r.p.m，10分钟，4℃)，并且然后通过超速离心浓缩，所述超速离心通过2ml的10％蔗糖，制备于PBS上，在SW-41转子上以39,000r.p.m在4℃进行6小时。粒状沉淀材料溶解于用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缺少b-巯基乙醇(为了保持与D1-4G2MAB的结合)的加载的缓冲液中，并进一步通过Western印迹分析。蛋白转移之后，用D1-4G2MAB和购自Santa Cruz Biotechology的辣根过氧化物酶(HRP)-连接驴抗小鼠二级抗体处理硝化纤维素膜。利用Western印迹Luminol试剂(Santa CruzBiotechnology)根据制造者的建议检测HRP。为获得阳性对照样品，如对于SVPs所述的那样将YFV(2x10⁸PFU)通过10％蔗糖垫进行超速离心。

对于YFV SVPs的蔗糖密度梯度分析，BHK-21细胞用体外合成的YF PIV基因组RNA进行电穿孔。转染后24小时时，完全MEM被VP-SF培养基替代，其在24小时后收获。在此时间时，超过95％的细胞是GFP-阳性的并且不显示任何CPE的征兆。收获的样品通过低速离心澄清(5000rpm，10分钟，4℃)，并且然后通过在SW-28转子在25,000rpm，4℃下进行过夜离心而浓缩。得到的粒状沉淀悬浮于TN缓冲液中(10nm Tris HCl(pH7.5)，100mM NaCl，0.1％BSA)并且进一步的分析如所述的进行(Schalich et al.，1996)。

简要地，0.5ml样品被加载到不连续的蔗糖梯度中(1.5ml50％，1.5ml35％和1.5ml10％的制备于PBS缓冲液中的蔗糖)。离心在Optima MAX Ultracentrifuge(Beckman)中在SW-55转子中以45,000rpm在4℃下进行1小时。粒状沉淀溶解于用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缺少b-巯基乙醇(为了保持与D1-4G2MAB的结合)的加载的缓冲液中，并进一步通过Western印迹分析。蛋白转移之后，用D1-4G2MAB和购自Santa Cruz Biotechology的辣根过氧化物酶(HRP)-连接驴抗小鼠二级抗体处理硝化纤维素膜。利用Western印迹Luminol试剂(Santa Cruz Biotechnology)根据制造者的建议检测5HRP。用YFV(2X10⁸PFU)进行并行的(side by side)梯度分析，进行如上述用于YFV-PIV源的SVPs相同的程序。

实施例8

WN PIV的分析

WN PIV的滴度通过用病毒的系列稀释感染Vero细胞单层而确定，并且然后24小时后固定，用特异于WNV的多克隆超免疫小鼠腹水液进行免疫组织化学染色，如前面所描述的一样进行(Rossi et al.，2005)。感染的细胞被计数并用于确定滴度。为评价WN PIV用于在Vero细胞，或BHK(VEErep/C^*-E^*-PAC)细胞上形成集落的能力，单层用WN PIV稀释液感染，用半固体黄芪胶覆盖层覆盖，在37℃下培育，并且然后固定并用特异于WNV NS1的MAB染色(E.Konishi，Kobe，Japan提供)，如上面所描述的一样进行。

实施例9

PIV安全研究

通过将不同剂量的病毒(回收自亲本感染性cDNAs的YFV17D或WNV TX02)或PIV通过颅骨内(i.c.)途径(20ml体积)接种入3-到4-天龄小鼠(outbred Swiss Webster，Harlan)或通过腹膜内(i.p.)途径(100ml体积)接种入4-5周龄雌性小鼠(outbred Swiss Webster，Harlan)建立PIV安全。监测14天小鼠疾病和死亡的征兆，垂死并且表现为不能存活到接下来的一天的动物被人道地处死，并记录为接下来的一天“死亡”。

实施例10

WN PIV效价和效率研究

用上述WN PIV接种的选择的动物被处以安乐死，在接种后21天流血。血清从动物中收获，合并，并利用上述方法测试它们降低在Vero细胞单层上WNV集落形成的能力。剩余的动物用1,000inf.u(通过在Vero细胞上集落形成测试而确定)接种，对应于WNV的NY99株的大约100LD₅₀(Xiao et al.，2001)，并且动物然后如上所述另外观察14天。

实施例11

YFV C-和YFV C-prM-E-表达盒都可补助YFV PIV的复制

补助黄病毒基因组中C缺失缺陷的一般策略显示于图1。它是基于缺少C基因的基因组的发展，和在表达C(或所有病毒结构蛋白)的细胞中但不在正常细胞中的这些假性感染性病毒基因组(PIV基因组)的繁殖。后者细胞中的复制，不产生PIV基因组中缺陷的反式互补需要的病毒结构蛋白，导致包含关键保护性免疫原E但缺少包含C和病毒遗传物质的核壳的SVPs的释放。

重组YFC基因组(YF PIV基因组)被工程化以包含GFP代替C的氨基酸26-93，与剩下的多肽框内克隆(图2A)。GFP的表达提供了在实验中确定含基因组PIVs滴度的方便的方法。C-编码序列从这种PIV基因组的缺失期望可破坏C形成功能性核壳的能力，但不期望影响功能性形式的prM和E的产生。因而，表达这种基因组的细胞，其产生GFP荧光，不能释放感染性病毒。然而，感染性子代期望可从表达高水平的C的“包装”细胞中产生。

为了用于有效PIV生产的细胞系的快速开发，利用了基于委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)(VEEV)基因组的表达系统(复制子)(Petrakova et al.，2005)。VEEV复制子比源于其它甲病毒的复制子致细胞病变性更小，并且在脊椎动物和昆虫起源的一些细胞系中容易地建立持久的复制。表达盒被设计为双亚基因组结构(图2B)，其中一种亚基因组启动子驱动Pac的表达，提供消除不包含Pac表达VEEV复制子的转染培养物中的细胞的有效方法。第二亚基因组启动子驱动编码YFV结构蛋白的亚基因组RNA的转录。为鉴定最有效的包装盒，VEEV复制子编码i)具有prM信号肽的YFVC，也已知为锚定的C(Lindenbach and Rice，2001)，(VEErep/C1/Pac)，或ii)具有prM的信号肽和20氨基酸的C(VEErep/C2/Pac)，或iii)所有YFV结构蛋白(VEErep/C-prM-E/Pac)。该设计的基本原理是在C-编码盒中保持信号肽，其期望对于将C靶向到正确的细胞区室是关键的。

体外合成的VEEV复制子RNAs转染到BHK-21细胞中，并且在接下来的4-5天内在含Pur培养基中选择Pur^R稳定细胞系。在转染后起始的2-3天中，源于VEEV的RNAs的复制导致生长阻滞，然后，如先前所描述的(Petrakova et al.，2005)，复制变得效率更低并且细胞重新开始生长。产生的Pur^R培养物用体外合成的YF PIV RNAs转染，并且在转染后不同的时间点，释放的包含GFP-表达基因组的感染性颗粒的滴度被确定(图2C)。令人惊讶的是，BHK-21细胞中两种不同的复制RNAs(YFV-和VEEV-特异性)的存在不产生致细胞病变效应(CPE)，并且保持对Pur的抗性和高水平GFP的表达，显示出VEEV复制子和YF PIV RNA的复制。如图2C所示，表达这两种标记物基因的培养物能够生长并需要更替继代接种(以每4天1:5的比例)以防止培养物到达汇合。图2的实验证实了所有的三种VEEV复制子能够供应为形成感染性PIVs的充分水平的YFV C；在没有VEEV复制子的情况下从用YF PIV RNA转染的原初BHK-21细胞中没有释放感染性颗粒(数据未显示)。然而，表达这些包装盒的细胞生产PIV的能力是不同的。表达YFV C后面紧接着prM信号肽的构建体(锚定的C；VEErep/C1/Pac)证实了与表达更长蛋白序列的盒相比较最低水平的YF PIV RNA包装。C1构建体的更低包装效率的基础是不清楚的，但这种现象可能通过在两个相邻剪切位点的特定顺序的剪切的需要(NS2B/NS3和信号肽酶)(Yamshchikov和Compans，1994)，和/或在这两种不同的背景中产生的C蛋白的分配/稳定性的不同，而解释。因而，这些实验之后，从所有进一步实验中清除VEErep/C1/Pac。VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac复制子都包装了YF PIV到类似滴度，达到超过10⁷inf.u/ml。而且，PIV颗粒的释放持续到实验结束，每24小时的时期内每种细胞释放～20感染性YF PIV。相同的细胞可能也释放缺少核壳和基因组的包含prM/E的SVPs，但这种可能性没有进一步研究。

实施例12

具有缺陷基因组的YF PIVs可大规模生产

PIV作为疫苗候选物的最终用途依赖于以需要的规模生产这些颗粒的能力，例如，为商业化生产。对用于疫苗制备的基于RNA的反式互补系统(VEEV复制子)的依赖需要进一步的标准化，因为存在在克隆入RNA病毒基因组的异源基因中突变累积的可能性。低传代细胞系的利用，是克服这种限制的一种方法。替代地，可通过将复制子重复转染入初始细胞，或通过生产包装的VEEV复制子然后感染初始细胞而最小化VEErep基因组中的突变累积。包装的VEE复制子的利用被认为是建立包装细胞系的一种简单和有效的方法。

为有效生产PIVs，利用一种允许在先前包装的VEEV复制子中生产甲病毒复制子表达细胞培养物的技术。简短地，VEEV复制子利用先前描述的二辅助系统(Volkova et al.，2006)包装为VEEV感染性病毒体，包装为包含到达10⁹inf.u/ml滴度的制剂。用这些颗粒感染和在Pur存在下选择的BHK-21细胞可用于在3-5天内获得YFV结构蛋白编码细胞培养物。建立之后，含VEErep/C2/Pac-和VEErep/C-prM-E/Pac-包含细胞系用先前产生的YF PIVs样品以高(10inf.u/细胞)和低(0.1infu/细胞)MOIs感染。在所有例子中，缺陷YFVs生产性地复制(见图3)并且感染单层中所有细胞，产生高滴度的PIVs。因而，通过用包装的VEEV复制子感染细胞建立包装的细胞系，然后用PIVs感染，看来是一种用于大规模生产基因组中缺失C序列的PIVs的简单和有效的系统。

实施例13

利用表达密码子最优化形式的YFC C基因的VEE复制子的YF PIVs

在利用包装系统支持缺陷病毒的复制中的另一可能的问题是在缺陷病毒基因组和编码反式互补基因的RNAs之间的重组。所述重组可能导致感染性病毒的产生。在本文描述的实验中，利用噬菌斑测试不再检测到感染性YFV，但有必要排除掉病毒可在这些细胞中形成的可能性。

另外，许多节肢动物传播病毒编码的蛋白期望发展为利用两种非常不同的宿主的翻译机制。因而，它们的密码子使用不期望为对于每种宿主中的表达是最佳的。因此，表达盒中C-编码序列被修饰以达到两个目标：i)提高C生产的产量和ii)降低YF PIV基因组和VEE复制子的C-编码亚基因组RNA之间的同源重组的可能性。利用在最有效翻译的哺乳动物基因中发现的密码子频率合成YFV C(图4A)。这些沉默的突变也破坏了黄病毒基因组复制需要的环化序列，因而，降低了YF PIV基因组和VEEV复制子的YFV C-编码RNA之间的重组事件中产生有复制能力的YFV的可能性。

Copt基因利用与VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac相同的策略克隆入VEErep构建体，VEErep/Copt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac，并且反式互补Pur^R细胞系通过RNA转染或通过用包装的RNAs感染细胞而建立。用体外合成的PIV基因组RNA转染这些细胞有效产生了PIV，其类似于用表达VEEV复制子的细胞选择的那些，所述VEEV复制子表达非最优化YFV C基因(图4B)。然而，表达密码子最优化的C的细胞证明是有用的试剂，因为当用YF PIV感染并用含具有低密度FBS的培养基的琼脂糖覆盖时，它们能够发展CPE并清楚地形成可见的噬菌斑(图4C)。因而，尽管YFVC基因的密码子最优化没有改变PIV从这些细胞中的生产，表达密码子最优化的YFV C的细胞代表了一种对于评价YF PIVs非常有用的系统，特别是不表达荧光标记物的那些。在另外的测试中，在用噬菌斑形成测试和GFP-焦点测试中确定的相同样品的滴度之间观察到非常好的相关性。

YF PIV形成的噬菌斑比YFV的噬菌斑小，显示了结构蛋白最可能以顺式功能(cis function)在病毒颗粒形成中更有效地生产。获得形成噬菌斑的能力的原因尚不清楚。然而，预测YFV C具有一定水平的细胞毒性，因为包含表达密码子最优化形式的蛋白的VEEV复制子的细胞系证实了比编码天然C基因的复制子的相应物具有更低的生长率。因而，YF PIV基因组复制可能导致足以引起CPE的细胞内环境的另外改变。

实施例14

可为其它黄病毒产生PIVs

为证明可容易地为其它黄病毒产生PIVs，将上述策略应用于WNV。为达到这一点，生产了一种具有35-氨基酸长的C蛋白的WNPIV基因组(图5A)。为包装这种WN PIV基因组，利用通过用非细胞致病性VEEV复制子转染BHK细胞而产生的包装细胞系，所述非细胞致病性VEEV复制子表达WNV C/prM/E和Pac[BHK(VEErep/C^*-E^*-Pac)]。为最小化在这种细胞系中复制的WN PIV基因组与VEErep RNA-编码C蛋白之间的重组可导致产生感染性WNV的可能性，在VEEV复制子中的WNV C-编码基因被修饰以包含在WNV环化区域中的群生(clustered)沉默突变。

收获自用合成的WN PIV基因组转染的BHK(VEErep/C^*-E^*-Pac)细胞的培养基能够生产包装细胞中的抗原-阳性集落(图5B)，显示感染性WN PIV已经被生产。然而，对于用相同样品的Vero细胞单层的感染仅仅检测到抗原-阳性细胞(图5C)。1x10⁸inf.u/ml的滴度的WN PIV在包装细胞上被生产，并且如期望的，WN PIV可在这种细胞系上反复传递(passed)。因而，利用一种已建立的细胞系，可利用与上面对于YFV描述的相同的补助系统容易地获得高滴度储量的WN PIV。令人感兴趣的，在WNV包装细胞系和WN PIV的例子中，观察到病毒产量在感染后期达到稳定水平，同时出现CPE(结果未显示)，然而，共复制YF PIV基因组和VEEV复制子的细胞持续生产PIV许多天(图2).

实施例15

用YF或WN PIVs感染的细胞生产SVPs

为证实用PIVs感染的细胞生产SVPs，BHK-21细胞用体外合成的YF PIV RNA转染或用在C-表达细胞中产生的YF PIVs感染。从BHK-21细胞中释放的颗粒通过超速离心而纯化，并且通过利用特异于E，D1-4G2的小鼠单克隆抗体的western印迹而分析(Gentry et al.，1982)。RNA-转染和PIV-感染的细胞产生可从培养基中成粒状沉淀的E蛋白(图6A)，显示其可以微粒形式存在。由于这些细胞不显示任何CPE，并且样品在超速离心之前以低速离心而被澄清，在粒状沉淀部分中检测的E蛋白不可能代表细胞碎片。类似的，western印迹分析证实用WN PIV感染的Vero细胞产生细胞外形式的E(在CEP的任何征兆发展之前)，其与通过WNV-感染Vero细胞生产的在大小上是不能区别的(图6B)。

为进一步评价PIV-感染细胞释放的E蛋白的物理性质，从仅包含复制PIV基因组的细胞中收集的培养基根据已公开的数据进行蔗糖密度梯度分析(Schalich et al.，1996)。SVPs在具有2％蔗糖组分中被发现(图6C)。在同样的实验中，YFV病毒体证实了高密度，并且在具有42％蔗糖组分中被检测到。以WNV SVPs期望大小迁移的E蛋白-包含颗粒也在WNV PIVs感染的培养物中被检测。E在PIV-感染细胞的培养基中的存在与通过仅表达缺少功能性C基因的prM/E或TBEVRNA疫苗的SVPs的生产是一致的。

实施例16

PIV在动物中的安全性，效价，和效率

WN和YF PIVs的安全性通过i.c.接种数胎的(litters of)3到4天龄的小鼠而建立。这些研究显示接种了WT YFV或WNV的小鼠被快速杀死，并且这些病毒在这些动物中展现了大约1PFU的50％致死剂量(LD₅₀)(表1)。然而，以2x10⁶inf.u剂量接种到乳鼠的WN和YF PIVs没有杀死任何小鼠(表1)。安全性进一步通过用野生型(wt)病毒和WN PIVs i.p.接种成体小鼠而证明。这些研究显示了WN PIVs在成体小鼠中是完全安全的(表2)。而且，wt WNV杀死了显著一部分的成体小鼠，LD₅₀小于1PFU，3x10⁶inf.u的剂量的WN PIV不能导致任何死亡(表2)。然而，最令人感兴趣的是如下发现：WNPIVs是非常有力的免疫原(利用接种30,000inf.u检测NEUT滴度)，并且免疫接种了3x104，3x10⁵，或3x10⁶inf.u的100％的动物获得抗WNV的NY99株的100LD₅₀攻击的保护(表2)。

表1：在乳鼠中的PIVs的安全性。

^a接种制剂，在具有10％FBS的培养基中稀释。^b通过i.c.途径以20ml/动物的体积递送。^c接种后14天的存活(存活/死亡)。^d来自死于感染的动物的平均存活时间(标准偏差)。^e不适用。

表2：在成体小鼠中PIV的安全性，效价和效率。

^a接种制剂，在具有10％FBS的培养基中稀释。^b通过i.p.途径以100ml/动物的体积递送。^c接种后14天的存活(存活/死亡)。^d来自死于感染的动物的平均存活时间(标准偏差)。^e在接种后21天收集自2个动物的汇集血清的NEUT滴度(显示的滴度是最高稀释度，产生WNV集落形成80％的降低)。^f抗100LD₅₀的WNV的NY99株的攻击的保护被攻击后14天的存活所证实；来自稀释接种组的单个存活者从第8-14天显示了疾病的征兆(驼背，皱毛，和不适)。PIV接种动物在14天的攻击后观察期中没有显示任何疾病的征兆。^g不适用。^h来自未免疫小鼠血清的NEUT滴度与来自WN PIV-接种小鼠的血清被并行地测试。

实施例17

进一步修饰以提高PIVs/RepliVAX的产量和安全性

本发明证实了RepliVAX的反复传代不产生重组，但是具有增强的生长的变体被选择：WNV RepliVAX在编码WNV C蛋白的细胞系上反复传代。通过将WNV C基因的一种拷贝与Pac基因融合，其由一种非细胞致病性VEErep亚基因组启动子(Petrakova et al.，2005)驱动，而生产C蛋白。在获得的构建体中(VEErep/Pac-Ubi-C^*)，泛素(Ubi)基因被插入到C基因之前，并且C后面紧接着终止密码子。在本背景中，可生产Pac-Ubi融合蛋白连同成熟C蛋白(缺少疏水性锚；见图9)。在VEErep中的C基因(表示为“C^*”)通过插入36个突变被进一步修饰，所述36个突变切除CS信号，将GUCAAUAUGCU(SEQ IDNO：2)的11碱基区域转变为GUgAAcAUGuU(SEQ ID NO：3)同时保持C编码能力。这种大量的突变显著降低了同源重组的可能性，并且，如果不发生基因组之间的重组，复制活性基因组的生产不能发生，因为产生的RNA将具有不匹配的CSs，这防止了复制(图9)。

为测试生产性重组的不可能性，从表达VEErep/Pac-Ubi-C^*{BHK(VEErep/Pac-Ubi-C^*)}的BHK细胞产生了一种克隆细胞系，并且这种细胞系被用于传代WN RepliVAX10次(在每个例子中以0.01的MOI感染)，并且产生的RepliVAX已经详细描述。为确定10-(p10)代群体是否包含任何活病毒，用p10WN RepliVAX以0.1，1，和10的复数感染Vero细胞单层，并且广泛清洗以去除细胞外RepliVAX。这些单层在24小时后重新清洗，并且然后在2天后收获。当用WNV的高敏感多克隆抗体染色时来自这些培养物的上清液传递到新鲜Vero细胞培养物上不能显示出任何免疫阳性细胞，显示出RepliVAX没有与包装的细胞系编码的C蛋白生产性重组。

令人感兴趣的是，当p10WN RepliVAX与p0RepliVAX在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C^*)细胞系上比较时，p10RepliVAX产生了感染的多态集落，许多比p0RepliVAX产生的大得多(图10)。而且，p10RepliVAX与p0RepliVAX相比在早期时间点复制高10倍，终点滴度为两倍。

获自产生自用p10RepliVAX感染的Vero细胞的cDNA的PCR产品的分析证实没有包含全长C编码区的产品。然而，跨越这些区域的产品的C-prM连接产的序列分析显示在传代过程中发生了两种突变。如从在包装细胞上的p10RepliVAX生产的集落的异源性质所期望的(图10)，两种突变都表示为具有初始RepliVAX序列的混合物。一种突变，其表现为存在于这些序列反应中一半核酸群体之上(在两个方向的测序)，由在RepliVAX基因组的信号肽剪切位点(S(c)VGA|VTLS(SEQ ID NO：4)之前的P4位点的AGC>uGC(S>C)突变组成。第二种突变，其仅仅存在于大约30％的扩增序列中(也在两个方向完成的反应中)，由在NS2B/NS3剪切位点(QKKR|GGK(m)T)(SEQ ID NO：5)之后的位点P3中的AAG>AuG(K>M)组成。尽管这些突变在缺失了SL5的位点中，它们不改变预测的RNA结构。更好生长的RepliVAX的快速选择(仅仅10个生长循环)是非常令人兴奋的，因为它显示出更好生长变体的选择是一种改进RepliVAX的有力的方法。这些突变的位点不是不期望的，因为已知NS2B/NS3对(versus)信号肽剪切的改变效率可影响黄病毒颗粒产量和感染性(Keelapang et al.，2004；Lee et al.，2000；Lobigs and Lee，2004；Yamschikov et al.，1997)。持续研究了甚至更好生长的变体的选择，并且为插入第二代RepliVAX构建体这两种突变被靶向，以确认它们分别(或一起)提高RepliVAX产量和抗原生产的能力。然而，本文表示的数据显示在这些传代条件下：1)没有发生重组，2)阳性选择可用于生产改善的RepliVAXs。

JE RepliVAX的盲目传代类似地产生了具有在基因组相同区域突变的更好生长的变体。对于生产更好生长的变体盲目传代RepliVAX产品的能力是本发明的关键特征，和相对于传统LAV的一种清楚的优点，所述传统LAV中由于考虑到更好生长变体可能已经丧失了它们在人中的减毒性，更好生长变体的生产通常是复杂的。

而且，突变的改善的C-表达盒(VEErep/Pac-Ubi-C^*)，其已经显示为稳定的并证实了当用于BHK细胞系(对于人疫苗生产没有批准)中时不会重组，当引入Vero细胞(一种已经接受的用于人疫苗生产的细胞系)中时也已经显示出对于PIV繁殖是稳定并有用的。特别的，对应于VEE复制子的RNAs已利用与应用于BHK细胞相同的方法从合格种引入Vero细胞。RNA引入Vero细胞之后，细胞维持在含嘌呤霉素的无血清培养基中(一种对于疫苗生产重要的问题)，并且这些细胞显示出对于PIV繁殖是有用的。在这些繁殖条件下，这些细胞显示出生产比类似来源的BHK细胞稍低的PIV滴度，但VEErep/Pac-Ubi-C^*-Vero细胞在这些培养条件下进行得更好，允许多重收获。图11显示了为在无血清条件下的多重收获可获得PIV从这些细胞的生产。

总之，表达C(特别是包含prM的信号序列，或该区加上prM和E基因的部分的C盒)的细胞系中PIVs的繁殖理论上可与PIV基因组重组，产生可导致疾病的活病毒，增加疫苗生产方法的风险。为克服这一问题，本发明证实了用于WN PIV繁殖的细胞系可利用C蛋白生产，所述C蛋白正好终止于NS2B/NS3剪切位点，使在PIV基因组该区域的重组机会最小化，提供了相对于其它繁殖方法的优点，在所述其它方法中，细胞系编码RNAs，所述RNAs编码与PIV共享的C的锚部分(也已知为prM的信号肽)。

为进一步增强这种C-表达盒的安全性，本发明证实了用于制备补助PIV基因组的VEErep-编码C的盒的部分(也就是由于病毒复制需要的潜在的RNA元件，编码生产复制性PIV基因组所需要的氨基酸序列的最初30密码子，)可被特异性突变以生产与PIV基因组在36核苷酸位点不同的盒(不改变蛋白产品地引入)，产生显著降低与PIV基因组的重组可能性的C基因(图9)。而且，这种突变的C基因被产生以具有在环化信号(CS)中的三种突变，其必须与PIV基因组的3’UTR中的CS互补以允许病毒复制，提供了防止重组的进一步的安全性特征(图9)。最后，通过将泛素基因利用到来自得到的多聚蛋白的完整C产品(替代的自我剪切序列例如FMDV的自身-蛋白酶2A，或其它相关序列可容易地替代泛素)将这种C基因插入到VEE复制子，在可选择标记物基因(pac)之后。这种单独-多聚蛋白盒的产生提供了生产遗传上更稳定的VEE复制子的优点，降低了在繁殖细胞系中的重组机会，消除了C-表达盒，并降低了PIV产量。得到的构建体(VEErep/Pac-Ubi-C^*，图9)被引入BHK细胞，并且利用已经建立的方法将细胞用于生产表达VEE复制子的克隆细胞系(Fayzulin et al.，Virology2006)。

从单个细胞克隆18次传代之后检查克隆细胞系，发现没有任何C盒的遗传缺失的证据(通过RT-PCR)，也没有发现在C-表达盒中有任何可检测的突变。最重要的是，这种细胞系显示出以41的传代水平繁殖WNV PIV的类似能力。最后，在细胞系上10次传代之后，没有观察到重组生产的能够在不表达C盒的细胞(也就是WT Vero细胞)上生产性复制的PIV-重组体的证据，也没有观察到通过RT PCR将C-编码序列引入到PIV基因组的证据。

而且，为处理PIV可能与疫苗中的黄病毒在免疫时重组产生新的有毒的黄病毒的考虑，本发明证实了具有“非天然”存在于所有已知的天然循环黄病毒中的环化信号(CS)的WNV基因组可被产生，复制到高水平。在一些实验室中产生了在所有黄病毒基因组的5’和3’末端发现的两种CS必须是100％互补以提供生产性病毒复制的证据(Khromykh et al.J.Virol.，2001；Lo et al.，J.Virol.，2003；Alvarez et al.，Virol.，2003)。这些研究还证实了非天然CSs可生产复制性基因组，只要CS是100％互补。然而这些研究者报告了具有非天然CS序列的所有基因组具有复制缺陷。通过WNV基因组中的CS系统性分析，特别是测试仔细选择的单个碱基交换产生高水平复制的能力，鉴定了允许高水平的基因组复制的单碱基交换，和后来的双碱基交换(图12A)。图12B证实了具有两个碱基取代的WNV基因组的高水平复制是可能的，并且具有错配CS序列的故意生产的基因组(也就是WT和2-碱基突变体)不具有复制活性。这种突变，和其它类似的突变，可因此被利用以生产具有很好安全性能的PIV，因为产生自CS-修饰PIV疫苗和在接受免疫接种的人群的区域传播的病毒之间的单点遗传重组的任何重组病毒将不具有复制活性，并因而不能导致疾病。

实施例18

表达WNV C基因的BHK细胞维持它们的表型多代

对源于用VEErep/Pac-Ubi-C^*转染的BHK细胞的WNV C-表达克隆细胞系的研究已经证实了由于几种原因的其在产生RepliVAX中长期稳定性和实用性。首先，这些细胞对于RepliVAX的反复传代是有用的。第二，在两种不同的代水平时(单个细胞克隆后8&24代)对于细胞的并行(side by side)集落形成测试显示不能区别的WNRepliVAX滴度和集落大小。最后，对在24代水平的这些细胞的C-编码盒的序列的直接分析显示相对于原初VEErep序列没有改变。将这些数据拿到一起显示了含有C-表达VEEreps的细胞应该对于在目前接受的用于生产人疫苗的主细胞种子批模式(master cell seed lotformat)的应用是足够稳定的。而且，VEEreps已被用于人的实验中的事实使得很可能VEErep-细胞技术在Vero细胞中的应用在规章审批过程中不会遇到任何意想不到的障碍。

实施例19

WNV VLPs的淋巴组织靶向

如上所示，WNV VLPs与RepliVAX类似，除了代替了黄病毒prM/E蛋白之外，它们可编码报道基因，或它们可简单地包含不具有报道基因的黄病毒复制子。VLPs可在表达所有三种WNV结构蛋白的包装细胞中容易地生产，并且已经以高滴度被生产(Fayzulin et al.，2006)。当10⁷U的VLP被接种入小鼠时，接种24小时后这些动物在血清中产生了1,000到5,000U/ml的I型干扰素(IFN)。通过ip和皮下足垫注射(fp)产生了IFN响应。而且，fp接种b-半乳糖苷酶-表达VLPs24小时后切割的腿弯部淋巴结包含大量b-半乳糖苷酶-阳性细胞，显示VLPs，其以不可区别于RepliVAX的方式进入细胞，是靶向于重要的淋巴器官的。这种结果与通过VLP-注射引发的高水平IFN是一致的，并且暗示了类似的靶向是RepliVAX的高效价和高效率的原因。

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任何在本说明书中提到的专利或公开文献对于本发明所述领域的普通技术人员是提示性的。而且，这些专利和公开文献在此引入作为参考，如同每份公开文献特定并单独引入作为参考所提示的那样。

Claims

1.黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其包含：

在编码衣壳(C)蛋白的核苷酸序列中的缺失，其中所述缺失编码所述C蛋白的氨基酸26到100或所述C蛋白的氨基酸26到93或31到100，并且所述缺失不破坏基因组环化所需要的RNA序列或prM/M的正确成熟所需要的prM蛋白的信号序列。

2.权利要求1的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中所述病毒是黄病毒、肝病毒或瘟病毒，或通过将其它病毒的prM-E盒与假性感染性病毒的prM-E盒交换而产生的所述病毒的其它嵌合体。

3.权利要求2的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中所述黄病毒是黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、日本脑炎病毒或墨累谷脑炎病毒。

4.权利要求3的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中缺失的编码所述黄病毒的C蛋白的核苷酸序列编码氨基酸26到100。

5.权利要求2的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中所述肝病毒是丙型肝炎病毒。

6.权利要求2的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中所述瘟病毒是牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒或猪霍乱病毒。

7.权利要求1的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中所述缺失的基因被编码标记蛋白或抗原的基因取代。

8.权利要求7的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，其中标记蛋白是绿色荧光蛋白。

9.表达黄病毒科病毒的C蛋白的细胞群体，其中所述表达对于使权利要求1的复制缺陷的病毒能够在适当条件下繁殖是有效的，并且编码C蛋白的核酸序列是密码子最优化的，使得所述密码子优化降低细胞系编码的C蛋白与黄病毒科假性感染性病毒基因组重组的能力和/或提高黄病毒科假性感染性病毒的生产，并且其中所述编码C蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：1。

10.权利要求9的细胞群体，其中利用源于病毒载体的基因工程化复制子产生表达病毒的野生型或突变蛋白的细胞。

11.权利要求10的细胞群体，其中所述复制子表达C蛋白，所述C蛋白包含在编码属于黄病毒科的病毒的C蛋白的基因的至少36个核苷酸位点的突变。

12.权利要求10的细胞群体，其中所述复制子表达复制子中的C蛋白，所述复制子包含非天然环化序列，使得所述环化序列的存在降低复制缺陷假性感染性病毒与天然病毒的生产性重组的机会。

13.权利要求10的细胞群体，其中所述复制子表达蛋白，所述复制子包含编码截短的C-prM连接的改变的核苷酸序列，使得所述改变的序列的存在提高细胞培养中复制缺陷假性感染性病毒的产量，体内提高包含prM/E的SVP产量，或其组合。

14.权利要求10的细胞群体，其中通过用体外合成的复制子RNAs转染，通过用设计为从细胞RNA-聚合酶II-特异性启动子合成功能性甲病毒复制子的质粒DNAs转染，或通过用包装在甲病毒结构蛋白内部的甲病毒复制子感染，将表达黄病毒科病毒的野生型或突变蛋白的复制子引入细胞中。

15.权利要求10的细胞群体，其中病毒载体是甲病毒。

16.权利要求15的细胞群体，其中甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德毕斯病毒、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)或罗斯河病毒。

17.生产黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒的方法，其包括：

产生黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含在衣壳基因中的缺失，其中所述缺失编码所述C蛋白的氨基酸26到100或所述C蛋白的氨基酸26到93或31到100，并且所述缺失不破坏基因组环化所需要的RNA序列或prM/M的正确成熟所需的prM蛋白信号序列；

产生表达黄病毒科病毒的衣壳蛋白的细胞系，其中所述细胞系提供黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒繁殖所需的高水平的衣壳蛋白，并且所述细胞系中编码衣壳蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：1；和

用黄病毒科的假性感染性病毒感染细胞系，从而产生黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒。

18.权利要求17的方法，其中所述病毒是黄病毒、肝病毒或瘟病毒或通过将其它病毒的prM-E盒与假性感染性病毒的prM-E盒交换而产生的所述病毒的其它嵌合体。

19.权利要求18的方法，其中所述黄病毒是黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、日本脑炎病毒或墨累谷脑炎病毒。

20.权利要求19的方法，其中缺失的编码所述黄病毒的C蛋白的核苷酸序列编码氨基酸26到100。

21.权利要求18的方法，其中所述肝病毒是丙型肝炎病毒。

22.权利要求18的方法，其中所述瘟病毒是牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒或猪霍乱病毒。

23.权利要求17的方法，其中利用源于病毒载体的基因工程化复制子产生表达病毒的野生型或突变蛋白的细胞。

24.权利要求23的方法，其中编码复制子中黄病毒科病毒突变蛋白的基因被编码所述病毒的蛋白的密码子最优化形式的基因取代，使得所述取代降低细胞系编码基因与假性感染性黄病毒科基因组重组的能力和/或提高假性感染性黄病毒的生产。

25.权利要求24的方法，其中所述复制子表达C蛋白，所述复制子包含在编码属于黄病毒科的病毒的C蛋白的基因的至少36个核苷酸位点中的突变。

26.权利要求24的方法，其中复制子表达复制子中的C蛋白，所述复制子包含非天然环化序列使得所述环化序列的存在降低复制缺陷假性感染性病毒与天然病毒的生产性重组的机会。

27.权利要求23的方法，其中通过用体外合成的复制子RNAs转染，通过用设计为从细胞RNA-聚合酶II-特异性启动子合成功能性甲病毒复制子的质粒DNAs转染，或通过用包装在甲病毒结构蛋白内部的甲病毒复制子感染，将表达黄病毒科病毒的野生型或突变蛋白的复制子引入细胞中。

28.权利要求23的方法，其中病毒载体是甲病毒。

29.权利要求28的方法，其中甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德毕斯病毒、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)或罗斯河病毒。

30.药物组合物，其包含通过权利要求17所述方法生产的黄病毒科的复制缺陷假性感染性病毒。

31.权利要求30的药物组合物在制备用于保护受试者免受暴露于黄病毒导致的感染的药物中的用途，其中所述组合物在受试者中产生针对黄病毒的免疫反应，从而保护受试者免受感染。

32.权利要求31的用途，其中所述药物通过腹膜内、皮内、皮下、肌肉内、口服或鼻内途径施用。

33.权利要求31的用途，其中所述受试者是人或动物。