CN101426479B - 用于活性分子给药的稳定的纳米胶囊体系 - Google Patents

Abstract

本发明针对纳米胶囊体系，其特征为其在长时间内具有高稳定性。这些体系可用于高度亲脂的药理学或化妆品活性成分的控释。所述体系包含分散于水介质中的平均尺寸小于1μm的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊具有下述结构：该结构包含含有磷脂成分和一种或多种饱和的和/或不饱和C₁₂-C₂₄链脂肪酸或其衍生物的亲脂相；以及含有壳聚糖或其衍生物和聚环氧烷化合物的亲水相。

Description

用于活性分子给药的稳定的纳米胶囊体系

发明领域

本发明针对纳米胶囊体系，其特征为其在长时间内具有高稳定性。这些体系可用于药理学或化妆品活性成分的控释，特别是高度亲脂性的药理学或化妆品活性成分的控释。本发明尤其针对包含分散于水相的纳米胶囊的体系、包含该体系的化妆品与药物组合物，以及其制备方法。

发明背景

用于释放生物活性药剂的体系形成了持续发展的研究领域。在盖伦派医学领域公知的是，活性成分，特别是那些高亲脂性活性成分，经由局部途径(透皮或经粘膜)给药是特别不适宜的，这是由于其高亲脂性使得其实际上不可能穿过表皮脂质屏障。

由于这个原因，在过去的二十年中，已经开发出不同的体系以用于此类分子的释放，这些体系允许增加这些药物在应用后的生物利用度和经由表皮的吸收。在这些体系中，尤其引人关注的是诸如脂质体、微乳液、纳米微球和纳米颗粒的胶体体系的制备，该胶体体系由分散于水相的油相组成，其中油相中并入活性成分，水相中并入一种或几种表面活性剂。

因此，Calvo等人[J.Pharm.Pharmacol.，1996，48，1147-52]公开了用于通过眼部途径释放吲哚美辛的胶体体系，该体系由分散于包含泊洛沙姆作为表面活性剂的水相中的卵磷脂和聚-∈-己内酯的油相组成。

就其自身而言，专利申请EP760237涉及用于释放诸如环孢菌素的水不溶性物质的微乳液，其包含由甘油三酯、卵磷脂和表面活性剂组成的亲脂性分散相，以及含有丙二醇的水性亲水相。

专利申请WO97/22358公开了微乳液，其中将环孢菌素溶解于下述体系中：所述体系包含由生育酚或其衍生物组成的疏水相，诸如碳酸丙烯酯和聚乙二醇的一系列亲水性成分，以及表面活性剂。

然而，这类胶体体系的主要缺点是其带有负的净电荷，致使其与某些具有阳离子特性的生物成分(某些蛋白质、钠和钾离子)的接触造成表面电荷中和、体系破坏以及因此造成活性成分损失。另一方面，这些带负电的体系还会受生物膜的静电斥力作用，这是由于该生物膜也带有负电荷。

为了克服该局限，已经开展了重要的研究工作，以开发这样的胶体体系：其带有正的净电荷并且从而允许其经由具有阳离子特性的生物环境吸收和/或通过粘附于诸如粘膜和皮肤的生物膜而吸收。

专利申请WO96/37232涉及基于纳米乳液、纳米胶囊和纳米颗粒的体系，所述纳米颗粒由亲脂性内核组成并包被有壳聚糖，用于通过不同途径的活性成分给药。在水相中并入亲水性壳聚糖聚合物赋予所述体系以正的净电荷。在此之后，开发了并入该聚合物或其他可提供所需正电荷的聚合物的体系。

因此，Calvo等人[Colloid.Polym.Sci.，1997，275，46-53]公开了与本申请前一段落中所述相同的胶体体系，但还在水相中掺入泊洛沙姆作为表面活性剂，以释放以地西泮为模型的亲脂性分子。在同一领域中，E1-Shabouri的科学论文[Intern.J.Pharmac.，2002，249，101-8]公开了其中水相中除了壳聚糖以外，还使用羟基乙酸钠或明胶A的胶体体系，并分析了其用于环孢菌素释放的能力。

同样，Filipovic-Grcic的论文[J.Microencap.，2001，18(1)，3-12]涉及基于被壳聚糖包被的脂性核心的粘膜粘附体系，其中并入高分子量标记物(异硫氰酸-葡聚糖荧光素)，分析了所述体系在模拟胃液中作为壳聚糖的比例及其分子量的函数的稳定性。

然而，与此类体系在医药和化妆品领域中的应用相关的重要技术问题涉及其在贮存时和体内用药后的不稳定性。特别地，这些体系的组成在贮存期超过一个月或温度高于室温的情况下造成活性成分逐渐从亲脂相释放并移至水相，该活性成分在水相不可溶，导致其沉淀或形成结晶。

根据这些数据，特别有必要开发稳定的纳米胶囊体系，尤其是用于活性亲脂性成分释放的纳米胶囊体系，以及除了对这些分子具有结合的高容量并在适当的生物环境中释放之外，还具有明显提高的贮存和运输稳定性的纳米胶囊体，该稳定性是从工业适用性角度的关键表征。

另一个技术问题是这些体系的大部分在诸如高压灭菌和巴氏消毒的灭菌过程中都不稳定。这些过程涉及将所述体系在短时间内置于超过100℃的温度下。通常，这些强烈的物理条件会极大地改变不同成分的溶解性，并导致乳液或颗粒的破坏，并形成可能含有活性成分的油相。因此，高度期望发现用于具有亲脂性的活性成分或化妆品成分的控释的体系，其可以用于局部施药，并且甚至在进行灭菌时都稳定。

发明概述

本发明发现一种纳米胶囊体系，该体系包含亲脂性核心，其含有磷脂成分和含饱和的和/或不饱和的C₁₂-C₂₄链脂肪酸或其衍生物的油；以及包含壳聚糖和聚环氧烷的亲水相，该体系在水悬液中于正常的贮存条件下，在超过两年的时间内具有高度稳定性，这体现该体系的工业和商业可行性的关键方面。该体系还允许高度亲脂性分子的有效结合和随后的释放。

源于这些体系的额外优势是其经过高温灭菌步骤而保持结构和诸如颗粒尺寸和zeta电位的性质的能力。在例如必须灭菌的眼部应用时需要使用时，这个方面尤其相关。此外，使这些体系灭菌的可能性允许减少、在某些情况下消除最终制剂中防腐剂的使用。

因此，本发明的目的包含含有分散于水介质中的平均尺寸小于1μm的纳米胶囊的体系，所述纳米胶囊具有包含下列成分的结构：

a)亲脂相，其含有：

a.1)至少一种磷脂成分；以及

a.2)包含一种或多种饱和的和/或不饱和的C₁₂-C₂₄链脂肪酸或

其衍生物的油；

b)亲水相，其含有：

b.1)壳聚糖或其衍生物；以及

b.2)聚环氧烷化合物。

在本发明的一特定实施方案中，所述纳米胶囊体系在在所述纳米胶囊的亲脂相中还包含能够预防、缓解或治疗疾病的活性亲脂分子。在优选的实施方案中，所述活性亲脂分子是环孢菌素。

在另一特定实施方案中，所述纳米胶囊体系还包含吸附于所述纳米胶囊表面的具有亲水性的生物活性分子，所述分子选自肽、蛋白质、激素、抗原/变应原、抗体、肝素、DNA、RNA或寡核苷酸。

本发明的第二目的涉及包含前文定义的体系的药物组合物。

本发明的另一目的涉及包含前文定义的体系的化妆品组合物。在本发明的特定实施方案中，所述化妆品组合物还能够并入化妆品活性分子。

本发明的最后目的涉及制备前文定义的体系的方法，该方法包括：

a)通过将磷脂成分和油，以及任选的作为活性成分的亲脂性分子溶解于有机溶剂中而制备亲脂相；

b)通过将壳聚糖和聚环氧烷化合物溶解于水中而制备亲水相；

c)将两相均加热至40℃至60℃；

d)使亲脂相和亲水相混合，伴随纳米胶囊的自发形成；

e)有机溶剂的清除。

本发明的体系和组合物尤其适用于并入纳米胶囊亲脂相的亲脂性生物活性分子的给药。

发明的详细描述

本发明的体系包含分散于水介质的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊具有包含亲脂相和亲水相的结构，其中亲脂相中能够并入活性成分。

术语“纳米胶囊”应被理解为被亲水相包围的亲脂性的内核，所述亲水相包含“包封”所述内核的带正电荷的壳聚糖。纳米胶囊分散于水介质中，其中所述水介质可以包含额外量的溶解的壳聚糖和/或其他亲水性聚合物。纳米胶囊的不同亲脂性和亲水性成分之间造成的离子相互作用产生特征性的物理实体，其是独立的和可观察的，其平均尺寸小于1μm，即平均尺寸为1nm至999nm。

“平均尺寸”应被理解为纳米胶囊群体的平均直径，该纳米胶囊群体包含在水介质中一起运动的亲脂相和亲水相。这些体系的平均尺寸能够通过本领域技术人员已知的标准方法进行测量，这些方法描述于例如下文的实验部分。

本发明的体系的纳米微粒的特征是其具有小于1μm的平均尺寸，优选地其具有1nm至999nm的平均尺寸，优选其具有50nm至800nm的平均尺寸。胶囊的平均尺寸主要受以下因素的影响：磷脂成分的量(量越多，得到的尺寸越小)，壳聚糖的量和分子量(量或分子量增多，尺寸增加)，所用的油的密度以及制备过程的参数，例如混合过程中的搅拌速度和两相温度。

此外，由于壳聚糖的胺基团，所述纳米胶囊可以带有表面电荷(通过zeta电位测定)，其大小在+1mV到+70mV之间变化。

亲脂相

存在于纳米胶囊中的亲脂相包含至少一种磷脂成分以及由一种或多种饱和的和/或不饱和的C₁₂-C₂₄链脂肪酸或其衍生物组成的油。其功能是当在药理学和化妆品意义上具有活性的活性亲脂性成分存在时将其容纳，并随后在适当的生物环境中将其释放。

磷脂成分

本说明书中的磷脂成分应被理解为一类离子型脂质，其最简单的形式包含与两分子脂肪酸(1，2-二酰基甘油)和一个磷酸基团结合的甘油。通常，磷酸基团通过磷酸二酯键与另一组原子结合，该另一组原子通常含有氮，例如胆碱、丝氨酸或乙醇胺，并且很多时候带有电荷。其他磷脂衍生自氨基醇鞘氨醇或二氢鞘氨醇(鞘脂类)，并不必须来自甘油。得到的化合物由于脂肪酸链而具有亲脂性部分，并且由于磷酸基团和电荷而具有亲水性部分。

在本发明的体系中，磷脂成分优选磷酸甘油酯、鞘脂类、脑磷脂或其混合物。诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱或磷脂酸的磷酸甘油酯，是由脂肪酸、甘油、磷酸和醇(例如胆碱、丝氨酸、乙醇胺、甘油或肌醇)所形成的脂质。诸如鞘磷脂的鞘脂类由鞘氨醇、脂肪酸、磷酸以及醇或氨基醇形成。脑磷脂由甘油、磷酸、两种脂肪酸以及两种醇碱(胆碱和鞘氨醇)形成。

在本发明的一优选实施方案中，磷脂成分包含磷酸甘油酯。更优选地，其包含选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酸或其混合物的磷酸甘油酯。

在另一优选实施例中，磷脂成分是卵磷脂。优选使用商业上可获得的大豆卵磷脂，尽管也能够使用蛋黄卵磷脂。

卵磷脂是脂类化合物的复杂混合物，其中大部分是磷脂化合物，尤其是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱。通常，卵磷脂由其商品名和表示其组成中磷脂酰胆碱百分数的数字所表示。卵磷脂中磷脂酰胆碱的百分数在35％以及高至几乎100％之间变动，然而在本发明的卵磷脂中该百分数优选为35％至75％，优选为35％和55％。不推荐应用具有很高磷脂酰胆碱百分数(高于80％)的卵磷脂，因为其造成纳米胶囊悬液中游离油的存在。在这一点上，有几种可商购的卵磷脂，其特征是磷脂酰胆碱百分数不高于80％。因此，优选使用Epikuron135F、Epikuron145V、Epikuron170、Lipoid S30、Lipoid S45和Lipoid S75。

类似地，磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺的比例影响具有适当稳定性的纳米胶囊的形成。因此，已表明使用Epikuron135F提供最好的稳定性结果，其中组合物中磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺的比例大约为7/1，并且磷脂酰胆碱比例大于35％。

油

亲脂相中包含的油由一种或多种饱和的和/或不饱和的C₁₂-C₂₄链脂肪酸或其衍生物组成。所述脂肪酸的实例包括，但不限于，诸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、acacidic acid、camacilic acid、araquidic acid、山萮酸、二十四烷酸或二十六烷酸的饱和脂肪酸；诸如月桂烯酸、棕榈烯酸、油酸、11-十八碳烯酸、顺9-二十碳烯酸、鲸蜡烯酸或芥酸的单不饱和脂肪酸；诸如亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸、Stearidonic Acid、araquidonicacid、鰶鱼酸或二十二碳六烯酸的多不饱和脂肪酸。

类似地，能够使用这些脂肪酸的衍生物，这个定义应理解为是那些具有高度亲脂性，并且作为酸性基团与醇类或胺类反应的结果而产生的化合物，例如所述脂肪酸的酯或酰胺。同样地，脂肪酸衍生物的定义包括那些具有羟基、醚基或烷基作为烃链取代基的脂肪酸、其酯或其酰胺，例如脑酮酸、羟基神经酸、蓖麻油酸、结核硬脂酸或植烷酸；或那些烃链中具有环状结构的脂肪酸，例如乳杆菌酸或大风子油酸。

一般地说，能够使用任何蔬菜油，例如葵花籽油、玉米油、豆油、棉油、花生油、豆油、月见草油、橄榄油、椰子油、棕榈油、火麻仁油、甜杏仁油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、可可脂油、澳洲坚果油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油、葡萄籽油、芝麻油、霍霍巴油、榛果油，等等。

出人意料地，发现如果与本领域使用的其他油、例如商业上称为Migliol或Labrafac的油相比，在纳米胶囊的组成中并入这种类型的油与赋予体系长时间的高稳定性特别相关。特别地，使用在加速条件下模拟的测定已观察到本发明的体系于约37℃的温度下在5-6个月内稳定，这等同于在室温下正常贮存条件下的几乎两年。当此结果与诸如Migliol840和Labrafac Lipophile(由饱和的C₈-C₁₀链脂肪酸的二酯或甘油三酯的混合物组成)的其它类型的油的结果对比时，可看到所述体系的稳定性增加高至6倍。

在本发明的优选实施方案中，包含在亲脂相中的油是蓖麻油。所述的油通过蓖麻子冷榨获得，然而其是可商购的产品。其具有长链脂肪酸(C₁₆-C₁₈)的组成：2％(最大量)棕榈酸，2.5％(最大量)硬脂酸，2.5-6.0％油酸，2.5-7.0％亚油酸，1％(最大量)亚麻酸以及85-92％蓖麻油酸。

亲水相

亲水相包含壳聚糖或其衍生物和作为表面活性剂的聚环氧烷化合物，以及水。该相的功能可能是包被纳米胶囊，以及为其提供正电荷，使其能够经由阳离子性的生物环境吸收，或在其上吸附。

壳聚糖

壳聚糖是衍生自甲壳质(聚-N-乙酰基-D-葡糖胺)的天然来源的聚合物，其中N上乙酰基的重要部分已被水解反应除去。脱乙酰化程度优选高于40％，更优选高于60％。在一变体中为60-98％。因此其具有氨基多糖结构及阳离子性质。其包含具有通式(I)的单体单元的重复以及m个氨基集团被乙酰化的单元：

其中n为整数。n+m的和代表聚合度，即壳聚糖链中单体单元的数目。

用于得到本发明纳米胶囊的壳聚糖具有2至2000kDa的分子量，优选为2至500kDa，更优选为5至150kDa。可用的商业壳聚糖的实例为可由NovaMatrix，Drammen，Norway获得的UPG113、UP CL213及UP CL113。

还能够使用壳聚糖衍生物作为壳聚糖之外的选择，其被理解为壳聚糖中的一个或多个羟基基团和/或一个或多个氨基基团被修饰以提高壳聚糖的溶解性或增加其粘附性。这些衍生物包括乙酰化的、烷基化的或磺化的壳聚糖、硫醇化衍生物以及其它，如Roberts，Chitin Chemistry，Macmillan，1992，166中所述。优选地，当使用衍生物时，其选自O-烷基醚、O-酰基酯、三甲基壳聚糖、用聚乙二醇修饰的壳聚糖等。其它可能的衍生物为盐，如柠檬酸盐、硝酸盐、乳酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐等。在任何情况下，本领域技术人员了解如何鉴别能够在壳聚糖上进行而不影响最终制剂的稳定性和商业可行性的修饰。

聚环氧烷化合物

就其自身而言，聚环氧烷化合物应被理解为非离子性的合成亲水性聚合物，其结构中具有环氧烷单元，优选使用聚氧乙烯(PEO)或环氧乙烷-环氧丙烷(PEO-PPO)共聚物。在后者中，当使用PEO和PPO共聚物时，共聚物中PEO的比例可以在10％至80％重量比的范围内变动，其余部分(最高100％)为PPO。

这些聚合物以不同分子量上市，然而在本发明中优选使用分子量1000至25000的聚氧乙烯化衍生物。在优选实施方案中，所述聚氧乙烯化衍生物是三嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)，例如商品名为泊洛沙姆的共聚物。用例如普朗尼克F68(泊洛沙姆188)得到好的结果。

聚环氧烷化合物在体系中用作表面活性剂，其存在对于赋予所述体系稳定性是特别必要的。否则，纳米胶囊在其贮存过程中会聚集。因此，如果其不存在，在37℃下两周以后可观察到颗粒尺寸的增加。此外，由表I能够观察到，已有可能表明这种化合物的并入几乎不影响所形成的纳米胶囊的尺寸。

表I：泊洛沙姆的用量对纳米胶囊稳定性的影响

在本发明的变化形式中，所述体系具有一部分磷脂成分，优选相对于包括水在内的体系总重量的0.1％至10％的重量比，优选0.5％至5％，更优选1％至2.5％重量比。不推荐小于0.1％的磷脂成分比例，因为其会导致纳米胶囊悬浮液中存在游离的油；相反，比例高于10％能够导致颗粒与非包封体系的形成，因为带有正电荷的壳聚糖与带有负电荷的脂质成分相互作用。

另一方面，在本发明的另一变化形式中，体系中油的比例为相对于包括水在内的体系总重量的1％-20％重量比，优选2.5％至10％重量比。更少的量涉及能够被包封的活性成分的减少，而较大的量使得必须提高诸如磷脂成分的其他成分的比例以避免体系中游离油的存在。

在本发明的另一变化形式中，壳聚糖或其衍生物的比例优选为相对于包括水在内的体系总重量的0.05％至10％重量比，优选0.1％至2％，更优选0.25％至1％。比所述比例高的比例造成悬浮液粘度增加，这可能对某些应用有利，但却显著妨碍溶剂去除阶段和制剂浓度。

就其自身而言，聚环氧烷化合物的比例优选为0.05％至10％重量比，优选0.1％至5％重量比，更优选1％至2.5％。

在所有情况下，其余部分主要是纳米胶囊分散于其中的纯水。这并不意味着没有其他成分存在于纳米胶囊中(一种或多种亲脂性活性成分，化妆品成分等)、存在于纳米胶囊分散于其中的水介质中(稠化剂、防腐剂、香料等)或吸附于纳米胶囊上(亲水性活性成分、透明质酸等)。

在本发明体系的一变化形式中，纳米胶囊分散于水介质中，所述水介质还包含亲水性聚合物，该亲水性聚合物的作用是赋予体系粘性，很大程度地提高其密度。加入该成分是因为在某些情况下将纳米胶囊体系分散于本发明的水介质中导致以其应用的观点来看太稀薄，特别是在需要生产诸如凝胶、乳膏、软膏或香膏的半固体药物组合物或化妆品组合物时。在具有稠化性质的亲水性聚合物中，可以使用碳水化合物及衍生物、羧酸、诸如聚乙烯醇的聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮衍生物、壳聚糖或其衍生物、泊洛沙姆、聚乙二醇、透明质酸或其混合物，等等。

本发明的另一变化形式在形成纳米胶囊后根据水介质的不同性质和功能在水介质中加入透明质酸或其盐。一方面，其吸附在纳米胶囊上，改变其某些性质，如电荷。另一方面，已发现其能够增加与细胞膜和粘蛋白(存在于粘液中的蛋白)的相互作用。此外，根据用量，其能够保持溶解在水介质中并有助于调节体系的粘度。在任何情况下，已发现其不对体系的性质、尤其是体系尺寸和zeta电位的测量产生副作用，如表II所示。

表II.并入透明质酸后纳米胶囊的尺寸和zeta电位

本发明的体系的一个更令人感兴趣的应用是用于亲脂性分子的给药，特别是当其是药理学或化妆品活性化合物时。本发明中描述的体系具有在纳米胶囊内部缔合生物活性亲脂性分子的高能力。

因此，本发明的纳米胶囊体系还可在亲脂相中包含能够预防、缓解或治疗疾病的生物活性亲脂分子。

术语“生物活性亲脂分子”涉及任何用于处理、治疗、预防或诊断疾病或用于改善人和动物的生理和心理健康的具有亲脂性的物质。这些具有亲脂性的分子可包括蛋白质、肽、脂质、修饰的寡核苷酸(亲脂化的)、糖皮质激素、诸如维生素A、D、K和E的亲脂性维生素、抗真菌剂、抑菌剂、愈合剂、抗组胺剂、麻醉剂、止痒剂、抗生素、抗病毒剂、防腐剂、抗痤疮剂、褪色剂、抗皮质溢剂、免疫抑制剂、非甾体类抗炎药物(NSAIDs)和Capsilum来源的抗炎药物。

在优选实施方案中，所述生物活性亲脂分子为环孢菌素。

在另一优选实施方案中，所述生物活性亲脂分子为糖皮质激素，例如氢化可的松、泼尼松、氟替卡松、泼尼松龙、曲安西龙、曲安奈德、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、二丙酸倍氯米松。

在优选的变化形式中，所述糖皮质激素是戊酸倍他米松。

纳米胶囊中包封的活性成分的比例可以是相对于包括水在内的体系总重量最高5％的重量比；更大的量会降低体系的稳定性，并且需要加入更多量的磷脂成分以包封所有活性成分。然而，在每一情况下适当的比例依赖于待包封的活性成分。

在包封作为活性成分的环孢菌素的具体情况下，其在所述体系中的比例优选为0.01％至5％重量比，更优选为0.1％至2％重量比。

当并入戊酸倍他米松时，该成分包括在体系中的百分比优选为0.01％至3％，更优选为0.05％至0.5％。

在本发明的另一方面，包含纳米胶囊的体系还能够用于不具有高度亲脂性的活性成分的给药。在这种情况下，它们被包封在纳米胶囊中，但吸附在后者表面。该变化形式可用于制备用于亲水性生物活性分子给药的稳定体系，所述亲水性生物活性分子例如肽、蛋白质、激素(胰岛素、LRH、LD等)、根据目标是产生免疫反应还是耐受的抗原/变应源(钛类毒素、白喉毒素等)、抗体、肝素(低分子量的和未分馏的)、DNA、RNA和寡核苷酸，等等。

本发明的第二目的涉及包含上文所定义的纳米胶囊体系的药物组合物。

药物组合物的实例包括用于口服、含服、舌下、局部、眼、鼻或阴道给药的任何液体组合物(即纳米胶囊的悬浮液或分散液)，或用于局部、眼、鼻或阴道给药的任何凝胶、乳膏、软膏或香膏形式的组合物。

在优选的方面，所述制剂经粘膜给药。纳米胶囊的正表面电荷通过其与带负电的粘膜和上皮细胞表面的相互作用为药物提供在粘膜表面上的更好吸附。

在另一优选方面，所述制剂经皮内或透皮给药，应被理解为透过皮肤或在皮肤上给药。该给药形式特别相关，因为本发明的体系不仅有助于药物经透皮途径吸收和渗透，而且有助于体系在皮肤表面的粘着和随后活性成分的控释(“贮存”型)。

由于其在皮肤上给药或透过皮肤给药中的良好性能，以及由于其长期稳定性，本发明的纳米胶囊体系还非常适于化妆品应用。

因此，本发明的另一目的为包含前面定义的纳米胶囊体系的化妆品组合物。这些化妆品组合物包括任何液体组合物(纳米胶囊的悬浮液或分散液)或包含本发明体系并以凝胶、乳膏、软膏或香膏形式存在的用于局部给药的任何组合物。所述组合物的特征在于，即使当其不缔合任何的化妆品活性分子时，其也具有软化、保护和修复性质。

在本发明的一变化形式中，所述化妆品组合物也可以并入亲脂性活性分子，尽管其不具有任何治疗效果，但其具有作为化妆品的性质。可被并入纳米胶囊的活性分子包括软化剂、防腐剂、香味物质、抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、祛屑剂、褪色剂、抗皮脂溢剂、染料、晒黑霜、紫外光吸收剂、酶、香味物质，等等。

药物和化妆品组合物还可包含pH控制剂，例如避免组合物的pH降至低于5的缓冲剂；抑制磷脂成分和油氧化的抗氧化剂；以及避免制剂中重要结构性改变的防腐剂。因此，在一变化形式中，在亲脂相中使用柠檬酸盐缓冲剂，其具有控制pH和同时作为抗氧化剂的双重功能；并在亲水相使用对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。

根据其结构，这些附加成分可以存在于含有纳米胶囊的相中，或者存在于其中分散有纳米胶囊的水介质中，或者完全或部分地吸附在纳米胶囊上。本领域技术人员能够确定使用何种附加成分，以及其是否必要，它们中有很多常用于药物和化妆品组合物中。

本发明的最后一个目的涉及制备上文所定义的包含纳米胶囊的本发明体系的方法。一方面，所述步骤包含通过将磷脂成分和油溶解于有机溶剂中以制备亲脂相。任选的亲脂性药物或化妆品活性成分的并入是通过将其与磷脂成分和油一起溶解于亲脂相中而进行，而不考虑成分加入溶液的次序。

有机溶剂的选择在很大程度上取决于并入的活性成分。尽管优选使用药物可接受的有机溶剂，例如乙醇和异丙醇，在某些情况下，比如当希望包封环孢菌素时，会选用丙酮，因为如下表所示，与环孢菌素具有高亲和力的溶剂，如乙醇或异丙醇，在随后水相与亲脂相混合的过程中会导致活性成分扩散至水相。

表III.环孢菌素的量与有机溶剂类型对纳米胶囊形成的影响

优选使用有机溶剂的最小可能量，因其在剩下的步骤中必须被进一步全部或部分去除。

在具体实施方案中，将有机溶剂加入至0.005％至0.015％重量比的磷脂成分、约0.025％重量比的油以及0.0025％至0.005％重量比的活性成分中，所有的百分数均相对于有机溶剂的总重量而测定。

另一方面，通过将壳聚糖和聚环氧烷化合物溶于水而制备亲水相。在一优选实施方案中，将0.0005％至0.002％重量比的壳聚糖和0.001％和0.005％重量比的聚环氧烷化合物溶于水，所有的百分数均相对于水的总重量而测定。

随后，将两相均加热至40℃至60℃的温度，优选至50℃，然后将其混合。这是出乎意料的，因为并不期望在该温度范围形成纳米胶囊和稳定体系。已经有可能观察到如果在高于该最大值加热，所得到的制剂会因为在悬浮液中存在游离的油而不适用。相反，如果在40℃以下加热，则观察到亲脂性成分开始凝固。能够通过在有机相中加入水相，或在水相中加入有机相而进行该混合阶段，因为加入次序不影响体系性质。两相一经混合，纳米胶囊就通过溶剂替换过程而自发形成，其中当一相并入另一相时，有机溶剂扩散至水相，形成由磷脂成分、油和任选的活性成分组成的脂质小滴。任选的活性成分的特征为其是高度负电性的，造成壳聚糖在其周围迅速定位，这是通过由该聚合物的正电荷而引起的离子相互作用，这也使得体系的表面电荷也为正性。

一旦纳米胶囊形成，则通过本领域技术人员已知的任何方法去除所用的有机溶剂。去除有机溶剂是因为不建议其在药物制剂中存在。

随后，纳米胶囊体系制备中一典型的步骤是将其浓缩以提高组分浓度。本发明中观察到能够将初始体积出乎意料地浓缩至比纳米胶囊制剂体积低17倍，低于这个体积体系会开始失去稳定性。

去除有机溶剂或浓缩阶段之后，能够加入上文所述的附加药剂(稠化剂、透明质酸或其盐、防腐剂等)。

如果将体系用于非亲脂性生物活性分子的给药，其可在纳米胶囊形成之后或去除有机溶剂之后加入。

此外，已出乎意料地观察到分散于本发明的水相中的纳米胶囊体系可以进行高温灭菌过程而不影响其稳定性。所述过程包括，例如，高压灭菌过程、间歇灭菌、HTST(高温短时间)和UHT(超高温)。这些过程是本领域技术人员已知的，其进行的目的在于能够将本发明的体系用于诸如眼部途径应用情况下的需要灭菌的应用中。类似地，源自该特征的另一优势是允许显著降低针对其他给药途径在商业制剂的生产中防腐剂的使用。

通常用于高温灭菌的条件可导致纳米胶囊的溶解并因此造成活性成分的释放。然而，已有可能观察到本发明的纳米胶囊在灭菌过程之后保持其尺寸和表面电荷，并且未观察到体系中出现活性成分的晶体。这表明没有所述的活性成分从纳米胶囊中释放至水相。

作为附加的特征，经历灭菌过程的体系在长时间内也保持稳定是非常重要的，如本发明所附的实施例中所示，已经在加速测试中证实其在37℃下至少4个月的稳定性，这等同于正常条件下超过一年，因而证实这些体系在工业上和商业上的可行性。

下文描述了一些示例性的实施例，其显示本发明的特征和优点，然而，所述实施例不应被解释为对权利要求所定义的本发明目的的限制。实施例

作为下文详述的实施例的通用方法，从尺寸、zeta电位(或表面电荷)、包封效率以及环孢菌素A结晶存在的角度，对纳米胶囊进行表征。在Heidolph炉(Titramax1000)中进行纳米胶囊的稳定性研究，在Presoclave75(Selecta)中进行高压过程。

使用光子相关光谱法(PCS；Zeta Sizer，Nano series，Nano-ZS，MalvernInstruments，UK)进行粒度分布测定，以获得纳米微粒群体的平均尺寸。

使用激光多普勒测速法(LDA；Zeta Sizer，Nano series，Nano-ZS，Malvern Instruments，UK)测量Zeta电位。将样品稀释于超纯水中以测定电泳迁移率。

视觉评估自壳聚糖纳米胶囊中的环孢菌素A和戊酸倍他米松的释放，观察是否在水相中形成结晶，并用HPLC对环孢菌素浓度进行定量(外相中最大溶解度为16μg/ml)，或根据包封的活性成分，对戊酸倍他米松进行定量(外相中最大溶解度为5μg/ml)的浓度。这样，如果外相中定量的量等于活性成分的最大溶解度，则推测存在结晶的形成，尽管其不可见。

实施例中所用的壳聚糖(Protasan UP C1113)来自NovaMatrix-FMCBiopolymer，环孢菌素A来自LC Laboratories，戊酸倍他米松来自Guinama，蓖麻油来自Galindo，磷脂酰胆碱来自Degussa(Epikuron135F)，泊洛沙姆188来自BASF公司，丙酮来自Vorquímica(Analema)，以及所用的其余产品来自Sigma Aldrich，蔗糖，葡萄糖和甘露醇。

实施例1

带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊在37℃的悬浮液中的稳定性研究

如下所述制备带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊：

a)用250mg卵磷脂，0.5ml蓖麻油，50mg或100mg环孢菌素A和25ml丙酮制备油相。

b)用50mg壳聚糖，125mg泊洛沙姆188和100ml蒸馏水制备水相。

c)将油相和水相均加热至50℃，然后将有机相加入至水相，纳米胶囊自发形成。

随后，通过在真空中加热(37℃)去除丙酮，随后浓缩剩余的体积直至保留10mL水。

所制备的纳米胶囊具有：小于1微米的纳米尺寸，更具体地，200nm至700nm；正的zeta电位(+10mV至+70mV)；几乎100％的环孢菌素A包封效率(在活性化合物的降解与提取后直接定量，以及在外水相的量化后间接定量得到此数据)。

对那些纳米胶囊进行稳定性研究，在研究过程中将其于37℃贮存6个月，每隔一个月测量颗粒尺寸、zeta电位以及水相中存在的环孢菌素。由于环孢菌素不溶于水，在不稳定的情况下有沉淀的倾向并引起可见结晶的出现。

表IV：

贮存于37℃的带有环孢菌素A(1％)的壳聚糖纳米胶囊的表征(平均值±SD)。

如表IV所示，带有1％环孢菌素的纳米胶囊保持小于1微米的直径与正的zeta电位，并且在37℃下至少稳定两个月。

表V：

贮存于37℃的带有环孢菌素A(0.5％)的壳聚糖纳米胶囊的表征(平均值±SD)。

由表V可见，并入环孢菌素A(0.5％)的壳聚糖纳米胶囊在37℃下至少稳定5个月，保持小于1μm的直径，正性zeta电位，并且无环孢菌素A晶体形成，表明分子保持在纳米胶囊的油内核中。该体系在尺寸和电位方面至少稳定6个月(本研究的最长时间)。

实施例2

带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊对于高压灭菌的稳定性研究

根据实施例1中所述的方法制备带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊，然后将一份进行高压灭菌过程(120℃，20分钟)。本研究的主要目的在于评估纳米胶囊的尺寸和电位在高压灭菌过程中是否被改变。

表VI：

高压灭菌过程之后带有环孢菌素A(1％)的壳聚糖纳米胶囊的表征(平均值±SD)。

由表VI可见，经过高压灭菌过程之后，纳米胶囊保持其尺寸和表面电荷。此外，经过高压灭菌过程之后未出现环孢菌素A结晶，显示活性分子从纳米胶囊中无显著释放至水相。

实施例3

高压灭菌的带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊在37℃的悬浮液中的稳定 性研究

根据实施例1中所述的方法制备带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊，然后根据实施例2中所述的方法高压灭菌，并在37℃下贮存5个月。为评估该体系的稳定性，每隔1个月测量颗粒尺寸、zeta电位以及环孢菌素晶体在水相中的存在。

表VII：

高压灭菌并贮存于37℃下的带有环孢菌素A的壳聚糖纳米胶囊的表征(平均值±SD)。

包被有壳聚糖并经高压灭菌的带有环孢菌素A的纳米胶囊在37℃至少稳定4个月(表VII)。

实施例4

带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊的制备

如下所述用戊酸倍他米松制备壳聚糖纳米胶囊：

a)用250mg卵磷脂，0.5ml蓖麻油，100mg戊酸倍他米松和25ml丙酮制备油相。

b)用50mg壳聚糖，125mg泊洛沙姆188和100ml蒸馏水制备水相。

c)将油相和水相均加热至50℃，然后将有机相加入至水相，纳米胶囊自发形成。

通过加热(37℃)和真空，将所得乳液浓缩(去除有机溶剂)至终体积10ml。

所制备的纳米胶囊具有：小于1微米的纳米尺寸，并且更具体地，200nm至600nm；正的zeta电位(+25mV至+60mV)；99.9％的戊酸倍他米松包封效率(在外水相的量化后间接定量得到此数据)。更具体地，纳米胶囊的理化表征和包封效率描述于表VIII。

表VIII：

带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊的理化表征和包封效率(平均值±SD)。

实施例5

带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊在室温悬浮液中的稳定性研究

对根据实施例4中的描述所制备的纳米胶囊进行稳定性研究，其中将它们于室温贮藏6个月，测量尺寸、zeta电位以及戊酸倍他米松在水相中的存在。如表IX所示，它们保持纳米尺寸，正的zeta电位，并且戊酸倍他米松保留在纳米胶囊的脂质内核中。

表IX：

贮存于室温的带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊的表征(平均值±SD)。

实施例6

带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊在37℃悬浮液中的稳定性研究

对根据实施例4中的描述所制备的纳米胶囊进行稳定性研究，其中将它们于37℃下贮存6个月，测量颗粒尺寸、zeta电位以及戊酸倍他米松在水相中的存在。如表X所示，带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊是稳定的。

表X：

贮存于37℃的带有戊酸倍他米松的壳聚糖纳米胶囊的表征(平均值±SD)。

Claims (41)

1.一种纳米胶囊体系，其包含分散于水介质中的平均尺寸小于1μm的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊具有包含下列成分的结构：

a.亲脂相，其含有：

a.1)0.1％至10％重量比的卵磷脂，其中卵磷脂含有的磷脂酰胆碱的比例为35％-80％重量比；以及

a.2)1％至20％重量比的油，所述油包含一种或多种饱和的和/或不饱和的C₁₂-C₂₄链脂肪酸；

b.亲水相，其含有：

b.1)0.05％至10％重量比的壳聚糖；以及

b.2)0.05％至10％重量比的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物；

其中纳米胶囊体系中组分a.1)、a.2)、b.1)和b.2)的各组分的重量比是相对于包括水在内的纳米胶囊体系的总重量。

2.如权利要求1所述的体系，其中所述卵磷脂是大豆卵磷脂。

3.如权利要求1所述的体系，其中所述卵磷脂含有磷脂酰胆碱的比例为35％至75％重量比。

4.如权利要求3所述的体系，其中所述卵磷脂含有磷脂酰胆碱的比例为35％至55％重量比。

5.如权利要求1所述的体系，其中所述油包含蓖麻油。

6.如权利要求1所述的体系，其中所述环氧乙烷-环氧丙烷共聚物是泊洛沙姆。

7.如权利要求6所述的体系，其中所述环氧乙烷-环氧丙烷共聚物是泊洛沙姆188。

8.如权利要求1所述的体系，其中所述体系中卵磷脂的比例为相对于包括水在内的总重量的0.5％至5％。

9.如权利要求8所述的体系，其中所述体系中卵磷脂的比例为相对于包括水在内的总重量的1％至2.5％。

10.如权利要求1所述的体系，其中所述体系中油的比例为相对于包括水在内的总重量的2.5％至10％。

11.如权利要求10所述的体系，其中所述体系中油的比例为相对于包括水在内的总重量的4.5％至5.5％。

12.如权利要求1所述的体系，其中所述体系中壳聚糖的比例为相对于包括水在内的总重量的0.1％至2％。

13.如权利要求12所述的体系，其中所述体系中壳聚糖的比例为相对于包括水在内的总重量的0.25％至1％。

14.如权利要求1所述的体系，其中所述体系中环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的比例为相对于包括水在内的总重量的0.1％至5％。

15.如权利要求14所述的体系，其中所述体系中环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的比例为相对于包括水在内的总重量的1％至2.5％。

16.如权利要求1所述的体系，其中所述水介质还包含粘性的亲水性聚合物。

17.如权利要求16所述的体系，其中所述粘性的聚合物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、泊洛沙姆类、聚乙二醇或其混合物。

18.如权利要求1所述的体系，其还包含透明质酸或其任何盐。

19.如权利要求1所述的体系，其中所述纳米胶囊具有1至999纳米的平均尺寸。

20.如权利要求19所述的体系，其中所述纳米胶囊具有50至800纳米的平均尺寸。

21.如权利要求19所述的体系，其中所述纳米胶囊具有200至700纳米的平均尺寸。

22.如权利要求1所述的体系，其中所述纳米胶囊带有正的表面电荷。

23.如权利要求22所述的体系，其中所述正的表面电荷由+1mV至+70mV的zeta电位表示。

24.如权利要求1所述的体系，其在所述纳米胶囊的亲脂相中还包含生物活性亲脂分子。

25.如权利要求24所述的体系，其中所述生物活性亲脂分子选自蛋白质、肽、脂质、亲脂化的寡核苷酸、糖皮质激素、亲脂性维生素、抗真菌剂、抑菌剂、愈合剂、抗组胺剂、麻醉剂、止痒剂、抗生素、抗病毒剂、防腐剂、抗痤疮剂、褪色剂、抗皮质溢剂、免疫抑制剂、非甾体类抗炎药(NSAIDs)和Capsilum来源的抗炎药物。

26.如权利要求25所述的体系，其中所述亲脂性维生素选自维生素A、D、K和E。

27.如权利要求24所述的体系，其中所述纳米胶囊中所述生物活性亲脂分子的比例为相对于包括水在内的所述体系总重量的最高5％的重量比。

28.如权利要求24所述的体系，其中所述亲脂性分子是环孢菌素。

29.如权利要求28所述的体系，其中所述纳米胶囊中环孢菌素的比例为相对于包括水在内的所述体系的总重量的0.01％至2％重量比。

30.如权利要求24所述的体系，其中所述亲脂性分子是氢化可的松、泼尼松、氟替卡松、泼尼松龙、曲安西龙、曲安奈德、地塞米松、倍他米松、戊酸倍他米松、倍氯米松或二丙酸倍氯米松。

31.如权利要求30所述的体系，其中所述亲脂性分子是戊酸倍他米松。

32.如权利要求1或24所述的体系，其还包含吸附于所述纳米胶囊表面的具有亲水性的生物活性分子，所述具有亲水性的生物活性分子选自肽、蛋白质、激素、抗原/变应原、肝素、DNA、RNA或寡核苷酸。

33.如权利要求32所述的体系，其中所述蛋白质是抗体。

34.药物组合物，其包含如权利要求1至33中任一权利要求所定义的体系。

35.如权利要求34所述的组合物，用于口服、含服、舌下、眼、鼻或阴道给药。

36.如权利要求34所述的组合物，用于局部给药。

37.化妆品组合物，其包含如权利要求1至23中任一权利要求所定义的体系。

38.如权利要求37所述的组合物，其包含化妆品可接受的亲脂性分子，所述化妆品可接受的亲脂性分子选自软化剂、防腐剂、抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、祛屑剂、褪色剂、抗皮脂溢剂、染料、晒黑霜、紫外光吸收剂、酶或香味物质。

39.如权利要求34至36中任一权利要求所述的组合物，其还包含pH控制剂、抗氧化剂或防腐剂。

40.如权利要求38所述的组合物，其还包含pH控制剂。

41.制备如权利要求1至33中任一权利要求所述的体系的方法，其包含：

a.通过将卵磷脂和油以及任选的作为活性成分的亲脂性分子溶解于有机溶剂中而制备亲脂相，其中卵磷脂含有的磷脂酰胆碱的比例为35％-80％重量比；

b.通过将壳聚糖和环氧乙烷-环氧丙烷共聚物溶解于水中而制备亲水相；

c.将两相均加热至40℃至60℃；

d.通过搅拌使所述亲脂相和所述亲水相混合，伴随纳米胶囊的自发形成；

e.去除所述有机溶剂。