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CN101415487A - 传感器应用中的位点选择性标记和模板分子印记聚合物 - Google Patents

传感器应用中的位点选择性标记和模板分子印记聚合物 Download PDF

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CN101415487A CNA2004800363298A CN200480036329A CN101415487A CN 101415487 A CN101415487 A CN 101415487A CN A2004800363298 A CNA2004800363298 A CN A2004800363298A CN 200480036329 A CN200480036329 A CN 200480036329A CN 101415487 A CN101415487 A CN 101415487A
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hydroxyl
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Research Foundation of the State University of New York
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Abstract

本发明提供用于检测分析物的分子印记聚合物(MIP)，形成MIP和用MIP检测分析物的方法。MIP包括使用分析物的模拟物形成的模板位点，以使报道分子化合物可选择地连接于模板位点，从而提供位点选择性标记和模板MIP。

Description

传感器应用中的位点选择性标记和模板分子印记聚合物
本申请要求2003年12月8日提交的美国临时申请60/527,661的优先权，该申请的内容被纳入本文作为参考。
本研究由授予号CHE-0078101和CHE-0315129的国家科学基金所资助。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明涉及通过采用选择性标记和模板分子印记聚合物(SSTT-MIP)检测分析物的领域。
发明背景
在美国，每年都要花费亿万美元用于化学物质的检测和定量。这些研究中的大多数在设备精良的实验室里进行，需要技术人员，大量昂贵试剂和长的分析时间。并且，对临床点护理测试或场地部署的要求使得小型集成分析平台成为必需。许多这种需要促进了化学传感器的发展[1]。类似地，不断增长的需要同时测定样品中的“所有”[2]推动了基于化学和生物化学传感器阵列方案[4-10]的人工“鼻”和“舌”的发展[3]。
目前，需要开发一种能克服现有方法缺点的新装置。同时定量样品中多种分析物的检测方法应较便宜且构建和操作较简单，准确、精确、可靠，提供足够的检测限，并且具有在分析物检测领域受欢迎的选择性优点。
已尝试的一种普通方法是使用“生物传感器”。在通用生物传感器中，固定化生物识别元件(例如抗体、适体、DNA寡核苷酸、酶、凝集素、信号蛋白、转运蛋白)用于选择性识别靶分析物，结合或转化(当分析物是底物时)事件产生与样品中分析物浓度有关的光、质量、热、或电化学反应。
虽然生物传感器的开发似乎简单，但开发分析用生物传感器存在许多基本问题。例如，传统方案依赖于鉴定可选择性识别靶分析物的适当生物识别元件。使用合适的检测/转导方法，固定化生物识别元件[11-13]，使生物识别元件保持其固有活性/亲和性和选择性。生物识别元件(传统设计中生物传感器的关键)应随时间保持稳定，靶分析物应能到达生物识别元件，分析物-生物识别元件相关/相互作用应可逆或至少在每次测定后容易解离/复原。上述缺点限制了生物传感器在分析物检测中的应用。
过去十年中，通过模板介导的功能单体的交联将特异性结合域引入合成聚合物中的研究吸引起了许多关注[15]。分子印记涉及将可聚合的功能单体围绕模板(伪-靶分析物或实际靶分析物)排列，然后聚合并除去模板。排列通常由以下方法实现：(i)非共价相互作用(例如，氢键、离子对相互作用)或(ii)可逆共价相互作用。除去模板后，这些分子印记聚合物(MIP)可识别并结合特异性化学物质(即模板或模板类似物)。
基于MIP的材料潜在的优点包括：可与生物识别元件相比的特异性；极端化学和物理条件下坚韧和稳定；能够设计缺乏合适生物识别元件的分析物的识别位点。开发了用于(非限制性例子)蛋白质、氨基酸衍生物、糖及其衍生物、维生素、核苷酸碱基、农药、药物和多环芳烃的MIP。然而，根据Lam[16]，基于MIP的生物模拟传感器的开发中的主要问题之一是信号转导。
有一些采用发光作为转导模态的基于MIP的传感器的报道。例如，Powell组[17a]通过使用氯化反-4-[p-(N，N-二甲基氨基)苯乙烯基(stryl)]-N-乙烯基苄基嘧啶鎓(荧光团)、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷、甲基丙烯酸2-羟基乙酯和引发剂2，2′-偶氮二异丁腈(AIBN)，形成cAMP-印记有机聚合物。在1毫摩尔cAMP的存在下，这种MIP显示20％的荧光变化，对cAMP的选择超过cGMP。Murray组[17b]通过使用Eu(R)3(NO3)3(R＝频哪醇基甲基膦酸酯或二乙烯基甲基苯甲酸酯)(荧光团)、苯乙烯和AIBN，制备索曼-印记有机聚合物。这种MIP能够检测低至每1×1015750份的索曼且有机磷农药的干扰最小。传感器响应时间为8分钟。Takeuchi组[17c]报道了基于荧光的MIP传感器，检测9-乙基腺嘌呤(9-EA)。该传感器基于模板9-EA，以及5，10，15-三(4-异丙基苯基)-20-(4-甲基丙烯酰羟苯基)卟啉锌(II)(荧光团)和甲基丙烯酸。在CH2Cl2中，这些聚合物的9-EA结合亲和性为7.5×105M-1，选择性超过腺嘌呤、4-氨基吡啶和2-氨基吡啶，在250微摩尔9-EA的存在下产生40％的荧光变化。Wang组[17d]报道了用于检测L-色氨酸的基于荧光的MIP传感器，采用丹磺酰化二甲基丙烯酸单体(荧光团)、乙二醇二甲基丙烯酸酯和AIBN。操作中，作者将流动淬灭剂4-硝基苯甲醛(4-NB)加入到MIP中淬灭丹磺酰发射。加入L-色氨酸时，一些4-NB释放/阻断接近丹磺酰残基，丹磺酰基荧光增加。加入10毫摩尔L-色氨酸时的荧光变化为45％。等量D-色氨酸、L-苯基丙氨酸和L-丙氨酸的存在所导致的荧光变化分别为32％、27％和<9％。Lam组[16]采用光诱导电子转移(PET)方案形成基于荧光的MIP，检测模板溶胶-凝胶衍生的干凝胶内的2，4-，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。在该研究中，作者使用2，4-D作为模板，共聚合了3-[N，N-双(9-蒽基甲基)氨基]]丙基三乙氧基硅烷(荧光团)与四乙氧基硅烷(TEOS)和苯基三甲氧基硅烷(PtrMES)。形成的MIP显示随pH的荧光变化(表观pKa接近7.2)，750微摩尔2，4-D的存在下，荧光降低15％。用相似浓度苯甲酸和醋酸的试验不引起明显干扰。
最近，Edmiston和同事[17e]报道了制备基于荧光的干凝胶MIP的方法，使用牺牲间隔物(SS)方案[18]，检测农药1，1-二(4-氯苯基)2，2，2-三氯乙烷(DDT)，其中，3-异氰酰丙基三乙氧基硅烷与4，4′-亚乙基双酚反应形成SS。然后，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)与荧光团4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD)反应(NBD与APTES胺、NBD-APTES结合)，制备荧光单体。然后，通过混合NBD-APTES、SS和双(三甲氧基甲硅烷基)苯，接着典型酸水解方案，形成印记干凝胶。一旦形成干凝胶，用稀LiAlH4裂解SS氨基甲酸酯键，在模板位点内形成胺残基，从干凝胶释放SS。传感器响应DDT(NBD荧光中3％的变化)，模板干凝胶对DDT的选择性超过潜在的干扰物(例如，蒽(A)，2，2-二(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烯(p，p-DDE)、1-(2-氯苯基)-1-(4-氯苯基)-2，2-二氯乙烷(o，p-DDD)、2，2-二(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烷(p，p-DDD)、二苯基甲烷(DPM)、4，4′-二溴二苯基(DBBP)、4，4′-二(氯甲基)-1，1′-二苯基(BCP))。DDT的检测限为每十亿分之一个数字水平。
然而，在所有对基于发光MIP传感器的研究中，尚未开发出能确保当出现分析物结合时，发光报道分子实际上立即接近分析物的方法。
发明概述
本发明提供一种形成基于位点选择性标记和模板的分子印记聚合物的可靠的化学传感器平台的方法。本发明方法中采用的SSTT-MIP方案提供了一种形成具有分析物特异性模板位点的MIP的方法，该位点也可结合报道分子。该方法中，分析物的检测比不提供这种定位的方法具有更高的效率。本发明与类似的MIP方法如Edmiston所述方法相比，具有改善的测量特征，例如信号/背景、信号/噪声比。
所述方法包括以下步骤。鉴定或形成分析物的模拟物，在这里称为牺牲间隔物分子模板(SSMT)。然后，促使未聚合的组分在SSMT的存在下发生聚合，形成具有可通过多种反应性基团结合SSMT的模板位点的聚合物平台，从而将SSMT掺入聚合物平台中。然后，将SSMT从聚合物平台中除去，在平台内形成一个或多个靶分析物及一个或多个报道分子的模板位点。选择SSMT，除去SSMT，在模板位点结合分析物和至少一个报道分子的反应性基团。除去SSMT后，模板位点与所结合的分析物接触，从而阻断除结合报道分子(即标记)基团外的所有反应性基团。然后，将该复合物与报道分子接触。除去分析物，所得聚合物平台是位点选择性标记和模板的分子印记聚合物(SSTT-MIP)。
本发明还提供分子印记聚合物平台，其中形成对特异性分析物的模板位点。在一个实施方式中，提供聚合物平台，其中，模板位点具有至少一个在该位点结合反应性基团的报道分子。在一个实施方式中，聚合物平台包括干凝胶或气凝胶。
本发明可用于开发检测多种分析物，包括那些已知的生物识别分子不能检测的分析物的传感器。
附图简要说明
图1是基于溶胶-凝胶衍生的干凝胶平台，生产位点选择性标记和模板的分子印记聚合物(SSTT-MIP)的典型反应方案。靶分析物是DDT。
图2是形成脱氧核苷选择性SSTT-MIP传感器单元的二元模板方案。
图3是设计(见图1)用于检测DTT的SSTT-MIP传感器的响应分布图。HBHE是1-羟基-2，2-二(4-羟苯基)乙烷；DDT的羟基化类似物。
图4是当与100ppb指定分子接触时，三种不同SSTT-MIP传感器各自对DDT模板的响应。这三种SSTT-MIP传感器来源于具有不同R’残基的不同前体(R’的非限制性例子参见插图和图1)。
发明详述
本发明提供位点选择性标记和模板的分子印记聚合物(SSTT-MIP)。该SSTT-MIP具有战略上设置以提高分析物检测效率的报道分子。虽然不受理论的限制，认为报道分子(在这里称为报道分子的群聚区域)周围的直接微环境的物理化学性质(例如，介电常数、折光指数、动力学等)的改变导致报道分子的吸光度、激发和发射光谱、激发态发光寿命和/或发光极化的改变。结果，当报道分子和MIP模板位点共享一些或所有报道分子的群集区域时，可实现报道分子吸光度/发光性质(即分析信号)更大的变化。因此，当分析物分子与MIP模板位点结合，从而改变MIP模板位点的物理化学性质时，MIP模板位点的报道分子同时感应到结合。
在本发明的一个实施方式中，报道分子排他地存在于模板位点处，从而降低信号/噪声比和信号/背景比。在该实施方式中，聚合物骨架(即除模板位点以外)中存在极少或没有报道分子。
本发明还提供制备MIP的方法，其中，报道分子可选择性地安装于模板位点，以使在分析物的检测期间，报道分子的定位非常接近于分析物(即在报道分子群聚区域内)。
如本文所用，术语“分子印记聚合物”或“MIP”通常指具有多种分子大小的模板位点的凝胶或聚合模样结构，它们各自能够特异性结合分析物分子。模板位点与分析物分子的至少一部分的形状互补。而且，模板位点包含相互作用部分，位置与分析物上部分的空间排列相匹配。模板位点中的部分与分析物上的部分互补。通过互补，模板位点中的部分可与分析物上位置相应部分相互作用，形成键或其它吸引结合，例如，静电、共价、离子、疏水、氢键或其它相互作用。
如本领域技术人员所明白的那样，通常通过将分析物分子与一种或多种功能单体混合形成印记/单体复合物来形成MIP(其中，印记分子通过共价、离子、疏水、氢键或其它相互作用，与功能单体的互补部分相互作用或结合)。然后，单体/分析物复合物聚合形成交联的聚合物骨架。分析物分子再从功能单体解离/裂解，而从聚合物骨架上除去，以保留模板识别位点。模板位点的形状对分析物是特异的。分子大小空穴包含与分析物分子互补的部分，该空穴能选择性结合分析物。
与现有技术的MIP方法相比，在本发明方法中，鉴定和形成分析物的模拟物(在这里称为牺牲间隔物分子模板(SSMT))，然后将其掺入聚合物平台中。SSMT优选具有与靶分析物非常相似的结构。而且，选择SSMT，与聚合物平台形成键，数量超过结合的分析物形成的键的数量。SSMT应具有至少一个其它反应性基团，以在相对于指定分析物的其它位点能结合聚合物骨架。在一个实施方式中，将其与聚合物平台连接的SSMT上反应性基团的数目至少比相应分析物上反应性基团的数目多一个。在另一个实施方式中，SSMT与分析物的结构相同，除了连接聚合物平台的反应性基团的数目和同一性。参与SSMT-聚合物连接的基团可包含在SSMT中。这些SSMT聚合物连接最终在除去SSMT时被切除。
通常，分析物与相应的SSMT是结构类似的，不同之处通常在于SSMT上存在的其它官能团。然而，化学不同的分子形状可类似，因此，结构非常相似并非完全鉴定分析物与SSMT间的关系。而且，存在许多微小结构修饰，以形成针对给定分析物的可接受的SSMT。其它作用，如分子内氢键、离子相互作用、聚集、包封、二聚体，仍可形成对分析物分子显示结合优先性的SSTT-MIP。
除去SSMT，聚合物平台内形成模板位点(为简便起见在这里称为空穴)。各个模板位点暴露的反应性基团负责靶分析物识别。然而，由于上述其它反应性基团，当SSMT从空穴裂解时，空穴具有一个或多个超过结合分析物分子所需基团的反应性基团。多余的基团用于结合报道分子。一旦报道分子与模板位点结合，测定SSTT-MIP的吸收/发光，报道分子的UV、可见、IR吸收光/发光性质的变化(例如，吸收光谱、激发和发射光谱、激发态发光寿命和/或发光极化)表明，模板位点处分析物分子的存在。总的吸收/发光变化通常与样品中分析物分子的浓度呈比例。因此，可容易地构建分析物依赖性的校正曲线。
在一个实施方式中，就分析物DDT、合适的SSMT分子、化合物1而言，与其靶分析物相比，SSMT具有一个附加的官能团，如图1所示。化合物1是DTT的类似物，具有四个(EtO)3-Si-末端、含氨基甲酸酯的基团。相反，DDT具有三个含Cl-官能团，位置类似化合物1上上述基团的三个位置。通过可利用的醇盐官能团与化合物1结合的一个或多个功能单体进行聚合，形成MIP。聚合反应发生在SSMT周围，聚合物平台通过(EtO)3-Si氨基甲酸酯基团与SSMT相连接。然后，SSMT从聚合物平台裂解，得到具有模板位点的MIP，每个位点具有四个向内延伸的氨基。然后，MIP接触DDT，结合入模板位点，亲和性部分取决于聚合物的组成及其制备方案。DTT分子也可通过与模板位点中四个氨基中的三个相互作用而与模板位点结合(即DTT氢键上三个Cl中的每个与模板位点内的-NH2残基结合)。由于化合物1上“多余”的-OH，当采用上述步骤从模板空穴裂解时，在模板位点形成除需要结合分析物DTT以外的胺残基。因此，模板位点内存在未结合分析物DDT的单个游离胺残基。分析物DDT的存在也没有阻断游离胺残基。然后，模板位点内的此游离胺残基被报道分子如LissamineTM或罗丹明B磺酰氯位点选择性标记，使得报道分子的群聚区域与将结合分析物的模板位点大部分重叠。然后，从聚合平台洗涤分析物和任何未反应的发光探针，产生SSTT-MIP。利用羟基和氨基甲酸酯化学物质是说明性实施例；本领域技术人员将明白其它方案。优选使用不影响聚合平台完整性的化学物质，最优选氨基甲酸酯连接。
应理解，从SSTT-MIP解离后，SSMT可被修饰。例如，在图1的实施例中，当连接切断时，保留每个氨基甲酸酯连接的氮原子作为胺残基。修饰的SSMT分子在这里称为SSMT’(SSMT引物)。
本发明可使用聚合前形成的功能单体与SSMT之间的键在SSMT释放时发生解离/裂解的化学物质。例如，这种情况可发生在含羟基功能单体与含羧酸SSMT所形成的酯键中，在SSMT从由聚合功能单体形成的SSTT-MIP中释放时发生裂解。然而，优选用SSMT使整个连接切断(上述实施例中是氨基甲酸酯)(如图1所示)。在这种情况下，SSMT’的特征是失去的一部分键仍然与空穴连接，以结合分析物。
本发明方法可使用许多不同类型的聚合物系统。作为说明性实施例，可使用溶胶-凝胶衍生的干凝胶。然而，该方法也可容易地应用于其它基于气凝胶或天然或合成聚合物系统的MIP。然而，溶胶-凝胶衍生的干凝胶和气溶胶非常方便，因为干凝胶是纳米多孔材料，可通过选择前体和加工方法调节其物理化学性质和孔的大小，如参考文献19-28中所述。
通常，本发明方法所用聚合物应在聚合之前，使选择的SSMT可结合至少一些组成单体或与之化学相互作用。因此，例如，具有含末端(EtO)3-Si-基团的连接基团，例如图1所示(EtO)3-Si-氨基甲酸酯基团的SSMT，可用于含有聚合前体的聚合系统，该聚合前体通过与该基于醇盐的SSMT水解形成硅氧烷。可接受的聚合前体的非限制性例子是，如图所示，(EtO)3-Si-R’-Si-(EtO)3和(EtO)3-Si-R”基团。其它例子是本领域技术人员已知的(参见参考文献19-28)。
对于含多个反应位点的牺牲间隔物分子模板(SSMT)，可使用保护基阻断这些附加位点(保护)。保护基的例子是苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(t-BOC)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或苯基-SO2CI)。这种保护/脱保护是本领域技术人员已知的，如参考文献29所述。
通常，SSTT MIP方法尤其适合分析相对于制备的分析物具有一个或多个多余的官能团的SSMT类似物。
SSTT-MIP应能够缔合或结合分析物。例如，图1所示缔合是一个例子(氢键及疏水和π-π相互作用)。其它类型的缔合有疏水、氢键等，以及利用分析物和聚合物基平台的特定化学部分的相互作用的组合。
本发明报道分子可以是发光团或生色团。结合基团可与报道分子连接，或在一些情况下，报道分子已具有连接的结合基团。在SSTT-MIP的制备中，报道分子可通过结合基团直接与模板位点结合，或利用结合基团与发光团/生色团之间的连接部分间接结合。在一个实施方式中，报道分子是通过连接基团与结合基团相连接的发光团。结合基团可商业购买(例如购自Molecular Probes)。报道分子的非限制性例子包括发光团、连接部分和-SO2Cl结合基团，如图1和2具体所示。
发光团可为有机或无机类型。发光团的例子包括有机类如荧光素、BODIPY、罗丹明、有机金属复合物如三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)钌(II)([Ru(dpp)3]2+和发光纳米粒(即量子点)。量子点可具有元素硅(Si)、硫化镉(CdS)和硒化锌(ZnSe)。连接部分(这里也称为系链)可以是任何可能的天然或合成基团之一。用于在化学学科中相互隔开残基。连接部分的一般例子有亚甲基链、醚链、聚二甲基硅氧烷链、聚苯乙烯链、氨基酸链以及任何其它有机/无机低聚物。
可用于与模板位点上连接的特定类型基团形成键的结合基团的具体例子有：为标记胺残基，可使用异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、羧酸酯、四氟苯基酯、羰基叠氮化物、磺酰氯、芳基化试剂和醛；为标记巯基，可使用碘乙酰胺，马来酰亚胺、烷基卤、芳基化试剂和二硫化物；为标记醇残基，可使用二氯三嗪、N-甲基靛红酸酐、氨基苯基硼酸、酰叠氮制备的异氰酸酯和酰基腈；以及为标记羧酸，可使用肼、羟胺胺、碳二亚胺、酯化试剂、重氮烷、烷基卤和三氟甲磺酸酯。
优选连接部分不宜太长，以使从模板位点除去生色团/发光团时，对结合模板位点的分析物分子的生色团/发光团的影响小到检测不到。因此，报道分子的群聚区域和模板位点之间的一些重叠是合乎需要的。或者，报道分子可直接与疏水结合基团之一连接。
报道分子通常在UV、可见和/或IR中有发光光谱；然而，响应物理化学环境的不发光染料分子也可用作SSTT-MIP方案中的报道分子(例如，4-硝基苯胺和2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐(Reichardt染料30)、2，6-二氯-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐(Reichardt染料33)和N，N-二乙基-4-硝基苯胺)。生色团/发光团的吸收光和/或发射取决于局部环境的物理化学性质，报道分子周围局部物理化学性质在某种程度上可调节摩尔吸收、吸收光谱、发射量子产率、发射光谱、激发态寿命和/或发光极化(一种或所有)。分析物分子与模板位点的结合可调节物理化学性质中的这种变化，检测为报道分子的摩尔吸收、吸收光谱、发射量子产率、发射光谱、激发态寿命和/或发光极化的变化。合适的发光团的例子包括：丹磺酰基、荧光素、罗丹明、NBD和三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)钌(II)([Ru(dpp)3]2+。合适的生色团的例子包括：2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐(Reichardt染料30)、2，6-二氯-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐(Reichardt染料33)和N，N-二乙基-4-硝基苯胺。
下面是可用图1和2所示的本发明SSTT-MIP方法检测的分析物的例子。可能的分析物分子包括但不限于，药物、类固醇、前列腺素、糖苷、脱氧核糖核苷、脱氧核糖核苷酸等。可用本发明方法检测的分析物及其牺牲间隔物分子模板的非限制性例子如表1所示。
Figure A200480036329D00141
Figure A200480036329D00151
SSTT-MIP方案在制备用于检测和定量药物(例如，苯妥英、可待因、海洛因)、前列腺素(例如，A2、B2、Fla)、类固醇(睾酮，雌二醇、孕酮)和糖苷(甲基-D-吡喃葡糖苷、洋地黄毒苷、2-脱氧核糖)的传感器中尤其有效。然而，该方法也可用于制备检测多种分析物的传感器。
为检测脱氧核糖核苷酸，采用图2所示二元模板方案，形成SSTT-MIP。采用图1所示氨基甲酸酯形成化学方法制备碱基核糖牺牲间隔物(碱基-核糖-SSMT)。可选择碱基-核糖-SSMT上的碱基，以匹配靶分析物上的碱基，除了使用尿嘧啶(U)模板胸腺嘧啶(T)。需要时，可使用Fmoc保护/脱保护方法保护碱基上的胺位点，以防止形成脲。碱基-核糖-SSMT可与适当的第二碱基模板(碱基-2°-SSMT)和干凝胶的主要组分(即(EtO)3Si-R”-Si(EtO)3、Si(EtO)3和/或(EtO)4Si))混合(1:1)，形成模板干凝胶，除去牺牲间隔物，用生色团/发光团位点选择性标记模板位点。可选择碱基-2°-SSMT上的碱基以与靶分析物上的碱基互补(例如，A对T，G对C及反之亦然)。碱基-2°-SSMT可以两步制备。例如，可采用Leonard方法[30]制备9-(3-氯丙基)腺嘌呤、9-(3-氯丙基)鸟嘌呤、3-(3-氯丙基)胸腺嘧啶和3-(3-氯丙基)胞嘧啶。然后，衍生的碱基与3-巯基丙基-三乙氧基硅烷(MPTES)反应，形成碱基-2°-SSMT，如图2所示。
在本发明的一个实施方式中，每个靶分析物可设计和开发多种可调传感器。这里，同时进行SSTT-MIP库的筛选，以优化SSTT-MIP分析性能和SSTT-MIP的鉴别设置，其中，该设置内给定分析物的响应特征显示最大的多样性。在该(图3)的一个例子中，响应数据表明，SSTT-MIP可产生分析物相互间响应显著的差异。图4中的第二个例子表明，可简单地通过改变用于形成干凝胶的一个前体，从(EtO)3-Si-(CH2)2-Si-(OEt)3到(EtO)3-Si-苯基-Si-(OEt)3再到(EtO)3-Si-二苯基-Si-(OEt)3，以形成三种不同的干凝胶基SSTT-MIP，SSTT-MIP的响应显著改变。
通过协同使用多个传感器，可改善总体检测准确度、精密度和动态范围。通过使用多个可调传感器和冗余的检测方案，也可更容易地检测假阳性和假阴性。
离散SSTT-MIP基传感器元件的阵列可形成在光源面上，并用基于阵列的检测器检测。在光发射二极管(LED)面上传感器阵列的形成以及多种分析物的同时检测如美国专利6,492,182、6,582,966和6,589,438所述，其内容被纳入本文作为参考。各个SSTT-MIP基传感器元件可用作特定靶分析物的个体传感器。操作中，LED用作光源，同时激发LED面上所有SSTT-MIP传感器元件内的生色团/发光团，并且，阵列检测器(例如，电荷耦联装置(CCD)、互补的金属氧化物半导体(CMOS))检测来自所有SSTT-MIP基传感器元件的靶分析物依赖的吸收/发射。然后，各个SSTT-MIP基传感器元件的报道分子吸收/发光与样品中相应的靶分析物浓度相关联。
可用多种光电子检测器检测SSTT-MIP传感器阵列的吸收/发光。光子检测器的例子包括：光电二极管、光电倍增管、电荷耦联装置(CCD)或CMOS基摄像检测器。当检测装置是阵列检测器时，可同时评价传感器元件的整个SSTT-MIP阵列。
在另一个实施方式中，针孔式打印方法可用于开发同时测定多种分析物的传感器阵列。这就允许高速印记底物上可被外部光源(激光、灯)激发、或LED面上可直接整体激发/感应的多种传感器元件。
下面的实施例进一步描述了本发明，这些实施例是示例性的，而不是以任何方式限制本发明。
实施例1
本实施方式描述了制备选择性检测DDT靶分析物的SSTT-MIP(图1)。首先，合成牺牲间隔物分子模板(SSMT)。该实施例是两步过程。步骤1中，采用Cushman[31]所述合成方案，制备4，4’，4”-三羟基三苯基甲醇(HBHE)。步骤2中，完整的SSMT的形成是通过1当量4，4’，4”-三羟基三苯基甲醇与过量的3-异氰酰丙基三乙氧基硅烷(IPTES)在无水THF中反应，形成四氨基甲酸酯，(化合物1)SSMT。1H和13C NMR(500MHz)、IR和MS数据(未示出)都与化合物中所有四个氨基甲酸酯键的形成相一致。然后，1当量化合物1与100-500当量几种醇盐中的一种(见图1)反应，制备模板干凝胶。将该混合物搅拌几分钟到几小时。该溶胶在密封小瓶内水解后，将薄膜(500-800nm，表面光度测定法测定)旋转浇铸到融合的硅底物上，室温下24-48小时，黑暗中形成干凝胶。用50-200mM LiAlH4[17e]，再相继用THF、0.1M HCl和0.1M NH3连续冲洗，从模板干凝胶除去SSMT。为将报道分子装入模板位点，使模板干凝胶膜与10-200ppm DDT在THF中接触，用DTT填充模板位点。这就在每个模板位点内留下一个游离胺残基(图1)。然后，用微量移液器将报道分子引入THF溶液，室温下游离胺和报道分子中的结合基团(-SO2Cl)黑暗中反应5小时。然后，用新鲜THF冲洗干凝胶膜，以除去任何未反应的报道分子和DDT，形成SSTT-MIP。
实施例2
本实施例描述了如实施例1所述制备的SSMT-MIP的应用。图3总结了一系列设计用于检测DDT的干凝胶基SSTT-MIP膜的响应分布。这些具体实验的检测器是光电倍增管。在这些具体的SSTT-MIP中，使用联苯基作为R’残基(见图1)。当将DDT加入到SSTT-MIP中时，随着DDT的加入荧光降低(淬灭)。作为SSTT-MIP对DDT选择性的初步试验，THF中的这些SSTT-MIP膜与过量的苯基-SO2Cl反应，形成具有任何游离胺的磺酰胺。然后，再测定苯基-SO2Cl处理的SSTT-MIP膜的响应。在试验DDT浓度范围内未发现明显的响应。该结果提示，不存在DDT时苯基-SO2Cl到达SSTT-MIP中的模板位点，并与SSTT-MIP内可大DDT模板位点中一个或多个游离胺残基形成磺酰胺。在第二个试验中，将HBHE引入DDT模板的SSTT-MIP中。HBHE，一种羟基化DDT类似物，可容易地被SSTT-MIP识别；然而，观察到的响应分布与DDT响应相比完全不同。该结果表明，SSTT-MIP可能具有分析物相关响应分布。而且，当用苯基-SO2Cl处理这些SSTT-MIP膜时，HBHE无响应(结果未示出)。然而，当先用含80ppb HBHE的THF溶液处理，再加入250ppb DDT(等待15分钟)处理DDT模板的SSTT-MIP时，HBHE的存在使发光先增加125±3％，加入DDT发光又降低9±2％。该结果提示，DDT能够置换一些HBHE。类似地，用60ppb DDT，再加入85ppb HBHE处理DDT模板的SSTT-MIP时，DDT的存在使发光降低，而一旦加入HBHE，发光增加122±4％。该结果提示，HBHE能够置换一些DDT。总之，这些结果表明，SSTT-MIP方案可用于制备具有分析物选择性的基于发光的传感器。
实施例3
本实施例阐述一些SSTT-MIP操作原则。记录有或没有DDT或HBHE时，SSTT-MIP膜(浸渍在THF中)的稳态发光各向异性和多频率调相示踪(相当于时间分辨发光强度衰减)。结果总结在表2中。
表2：DDT响应性SSTT-MIP的恢复的稳态发光各向异性和激发态发光寿命
 
样品 ΔF(％)a r τ(ns)/w(ns)b
SSTT-MIP 0 0.10±0.01 2.6±0.06/1.2±0.2
SSTT-MIP+DDT -27 0.36±0.01 2.6±0.1/0.1±0.1
SSTT-MIP+HBHE +120 0.35±0.01 3.4±0.03/0.1±0.1
(a)来自图1(100ppb分析物)。(b)以单峰的Lorentzian寿命分布报道的激发态发光寿命，其中τ是平均激发态寿命，w是半峰全宽。
上表说明了几个重要特点。第一，LissamineTM罗丹明B(LRB)残基的发光各向异性对没有分析物的SSTT-MIP比有分析物的SSTT-MIP要小得多。第二，有分析物的SSTT-MIP的强度衰减动力学清晰分布，表明没有分析物的情况下，发光团(即LRB)SSTT-MIP模板位点内分布的微环境/群聚区域。第三，当将DDT加入到SSTT-MIP中时，平均LRB寿命不变。第四，当将HBHE加入到SSTT-MIP中时，平均LRB寿命增加。最后，SSTT-MIP中分析物的存在可使寿命变为单一指数。这些结果一起表明：没有分析物的SSTT-MIP模板位点内的发光报道基团相对可移动，并遇到广泛分布的微环境/群聚区域。在DDT的存在下，DDT分子阻碍了模板位点内发光团的运动，DDT迫使发光团进入更离散的微环境或限制到达其它微环境，并且，DDT以静电方式淬灭发光团荧光(平均寿命不变)。在HBHE的存在下，HBHE分子阻碍了发光团的运动，HBHE迫使发光团进入更离散的微环境，HBHE保护发光团以免淬灭和/或增加局部微环境刚性，以增加平均寿命。
图3内的插图显示，150ppb DDT重复处理的DDT模板的SSTT-MIP传感器膜的响应分布。通过注射150ppb DDT，在流动的TFH流中进行连续流动试验。这些550±150nm厚SSTT-MIP膜的响应时间(达到90％最大信号变化的时间)数量级为20s，4％内响应是可逆的(20个循环)。
图4总结了DDT各自模板的三种不同的SSTT-MIP传感器膜的一系列响应试验。这三种SSTT-MIP膜之间唯一的差异是用于形成最终干凝胶的前体((EtO)3-Si-(CH2)2-Si-(OEt)3、(EtO)3-Si-苯基-Si-(OEt)3或(EtO)3-Si-二苯基-Si-(OEt)3)的选择。研究这些数据，显示几个有意思的特点。第一，这些SSTT-MIP传感器对DDT的选择性超过许多结构类似的分析物。第二，R’基团的选择(图1)可用于调节总的传感器选择性。具体地说，随着R’大小的降低，总的DDT选择性增加。这些结果表明，形成基于SSTT-MIP传感器元件的阵列的方案(其中，可对给定分析物设计各个传感器元件)，以及传感器元件对设计的所述分析物的集体响应。这样，可设计多种传感器来检测相同的分析物；自检的冗余方案。
实施例4
本实施方式描述了SSMT-MIP检测另两种分析物，即可待因和洋地黄毒苷(分别是吗啡和地高辛，用于形成SSMT)。表3显示了对于一对用于检测可待因和洋地黄毒苷设计的SSTT-MIP-基传感器，变量如干凝胶组成、连接部分长度和发光团同一性的影响。
表3：干凝胶组成、报道分子、系链化学性质和长度对分析物检测限的影响。
 
分析物 干凝胶a 报道分子 对b 连接部分c 检测限
可待因 d 丹磺酰基 NH2/SO2Cl D 25nM
d 丹磺酰基 NH2/SO2Cl C3 90nM
d 丹磺酰基 NH2/SO2Cl C6 700nM
d NBD NH2/SO2Cl D 1.2μM
e NBD NH2/SO2Cl D 1.2nM
洋地黄毒苷 d 丹磺酰基 NH2/SO2Cl D 100μM
f 丹磺酰基 NH2/SO2Cl D 1.7nM
g 丹磺酰基 NH2/SO2Cl D 1.9nM
h NBD NH2/SO2Cl D 78nM
a)干凝胶的摩尔组成。
b)模板位点/功能结合基团内的官能团。
c)D-结合基团直接连接发光团，C3-结合基团与发光团间的丙基间隔物，C6-结合基团与发光团间的己基间隔物。
d)45摩尔％四乙基正硅烷(TEOS)、5摩尔％辛基三甲氧基硅烷(OTS)和50摩尔％二(2-羟基-乙基)氨基丙基三乙氧基硅烷(HAPTS)。
e)85摩尔％TEOS、5摩尔％OTS和10摩尔％HAPTS。
f)47摩尔％TEOS、33摩尔％3，3，3-三氟丙基三甲氧基硅烷(TFP-TMOS)和20摩尔％OTS。
g)25摩尔％TEOS、40摩尔％(五氟苯基)-丙基三甲氧基硅烷(PFP-TMOS)和35摩尔％TFP-TMOS。
h)50摩尔％TEOS、10摩尔％PFP-TMOS、10摩尔％TFP-TMOS、20摩尔％OTS和10摩尔％TFP-TMOS。
虽然本说明书阐述了具体实施方式，本领域技术人员应理解，不背离本发明的范围，本领域技术人员可进行常规改进。
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Claims (32)

1.一种用于检测分析物存在的分子印记聚合物，其包含：
至少一个能够选择性结合所述分析物的模板位点，所述模板位点具有暴露的反应性基团，其中，暴露的反应性基团的数目超过选择性结合分析物所需的暴露的反应性基团的数目。
2.如权利要求1所述的分子印记聚合物，还含有在不是分析物选择性结合于模板位点所需的模板位点、与暴露的反应性基团结合的报道分子。
3.如权利要求1所述的分子印记聚合物，其特征在于，模板位点暴露的反应性基团的数目比选择性结合分析物所需的反应性基团的数目多一个。
4.如权利要求1所述的分子印记聚合物，还包含与所述一个或多个暴露的反应性基团结合的分析物分子。
5.如权利要求1所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述分析物选自：药物、前列腺素、类固醇、糖苷、脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷酸。
6.如权利要求1所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述报道分子包含发光团或生色团、连接基团和结合基团。
7.如权利要求6所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述发光团选自：丹磺酰基、荧光素、BODIPY、罗丹明、三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)钌(II)([Ru(dpp)3]2+和量子点。
8.如权利要求6所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述生色团选自：4-硝基苯胺；2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐(Reichardt染料30)；2，6-二氯-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐；和N，N-二乙基-4-硝基苯胺。
9.如权利要求6所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述连接基团是亚甲基链、醚链、聚二甲基硅氧烷链、聚苯乙烯链或氨基酸链。
10.如权利要求6所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述结合基团选自：异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、羧酸酯、四氟苯基酯、羰基叠氮化物、磺酰氯、芳基化试剂、醛、碘乙酰胺、马来酰亚胺、烷基卤、二硫化物、二氯三嗪、N-甲基靛红酸酐、氨基苯基硼酸、从酰叠氮制备的异氰酸酯、酰基腈、肼、羟胺胺、碳二亚胺、酯化试剂、重氮烷、烷基卤和三氟甲磺酸酯。
11.如权利要求5所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述药物选自：苯妥英、可待因、海洛因、可卡因、Δ9-THC、四环素、吗啡；SSMT分别选自：5-(对-羟苯基)或-5-苯基乙内酰脲、吗啡、3-乙酰吗啡、对-羟基可卡因、8-α-羟基-Δ9-THC、土霉素和纳布啡。
12.如权利要求5所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述前列腺素选自：前列腺素A2、前列腺素B2、前列腺素E1、前列腺素E2、前列腺素F1a、前列腺素F2a、前列腺素F2a；SSMT分别选自：19(R)-羟基前列腺素A2、19(R)-羟基前列腺素B2、19(R)-羟基前列腺素E1、19(R)-羟基前列腺素E2、19(R)-羟基前列腺素F1a、19(R)-羟基前列腺素F2a和19(R)-羟基前列腺素F2a。
13.如权利要求5所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述类固醇选自：睾酮、雌二醇、孕酮、胆固醇；SSMT分别选自：4-羟基睾酮、4-羟基雌二醇、17-α-羟基孕酮和22(r)-羟基胆固醇。
14.如权利要求5所述的分子印记聚合物，其特征在于，所述糖苷选自：甲基α-D-吡喃葡糖苷、甲基β-D-吡喃葡糖苷、洋地黄毒苷、2-脱氧核糖；SSMT分别选自：α-D-吡喃葡糖、β-D-吡喃葡糖、地高辛和核糖。
15.一种制备用于特异性检测分析物的位点选择性标记的分子印记聚合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将未聚合的聚合物组分与一种或多种牺牲间隔物分子模板(SSMT)分子混合，其中，所述SSMT分子比分析物至少多一个反应性基团；
b)使未聚合组分聚合，从而在聚合物中形成模板位点，其中，每个模板位点通过多种键与SSMT分子结合；
c)从模板位点释放SSMT，从而形成具有多个暴露的反应性基团的模板位点，使得每个模板位点处暴露的反应性基团的数目大于分析物分子上反应性基团的数目；
d)使分析物分子与具有多个暴露的反应性基团的模板位点结合，其中，每个模板位点处至少一个暴露的反应性基团是游离的；
e)使报道分子与所述游离暴露的反应性基团结合；
f)释放分析物分子，从而提供位点选择性标记的分子印记聚合物，以特异性检测试验样品中分析物的存在。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述聚合物是干凝胶或气凝胶。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述SSMT分子上至少多于一个反应性基团包含羟基。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述未聚合的组分与多于一种类型的SSMT分子混合，各种类型的SSMT模拟相同的分析物，从而形成对相同分析物具有不同检测限的模板位点的位点选择性标记的分子印记聚合物。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，除去步骤a)中用于形成模板位点的SSMT，不保留化学残基。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤c)中，从所述模板位点释放SSMT，模板位点上不保留化学残基。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述残基是氨基。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述报道分子包括发光团或生色团、连接基团和结合基团。
23.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述报道分子是选自以下的发光团：丹磺酰基、荧光素、BODIPY、罗丹明、三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)钌(II)([Ru(dpp)3]2+和量子点。
24.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述报道分子是选自以下的生色团：4-硝基苯胺；2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐(Reichardt染料30)；2，6-二氯-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶并)酚盐；和N，N-二乙基-4-硝基苯胺。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述连接基团选自：亚甲基链、醚链、聚二甲基硅氧烷链、聚苯乙烯链和氨基酸链。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述结合基团选自：异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、羧酸酯、四氟苯基酯、羰基叠氮化物、磺酰氯、芳基化试剂、醛、碘乙酰胺、马来酰亚胺、烷基卤、二硫化物、二氯三嗪、N-甲基靛红酸酐、氨基苯基硼酸、从酰叠氮制备的异氰酸酯、酰基腈、肼、羟胺胺、碳二亚胺、酯化试剂、重氮烷、烷基卤和三氟甲磺酸酯。
27.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述分析物是选自以下的化合物：药物、前列腺素、类固醇、糖苷、脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷酸。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述药物选自：苯妥英、可待因、海洛因、可卡因、Δ9-THC、四环素、吗啡；SSMT分别选自：5-(对-羟苯基)或-5-苯基乙内酰脲、吗啡、3-乙酰吗啡、对-羟基可卡因、8-α-羟基-Δ9-THC、土霉素和纳布啡。
28.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述前列腺素选自：前列腺素A2、前列腺素B2、前列腺素E1、前列腺素E2、前列腺素F1a、前列腺素F2a、前列腺素F2a；SSMT分别选自：19(R)-羟基前列腺素A2、19(R)-羟基前列腺素B2、19(R)-羟基前列腺素E1、19(R)-羟基前列腺素E2、19(R)-羟基前列腺素F1a、19(R)-羟基前列腺素F2a和19(R)-羟基前列腺素F2a。
29.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述类固醇选自：睾酮、雌二醇、孕酮、胆固醇；SSMT分别选自：4-羟基睾酮、4-羟基雌二醇、17-α-羟基孕酮和22(r)-羟基胆固醇。
30.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述糖苷选自：甲基α-D-吡喃葡糖苷、甲基β-D-吡喃葡糖苷、洋地黄毒苷、2-脱氧核糖；SSMT分别选自：α-D-吡喃葡糖、β-D-吡喃葡糖、地高辛和核糖。
31.一种检测试验样品中分析物存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使试验样品与具有至少一个对分析物特异的模板位点的位点选择性标记的分子印记聚合物相接触，其中，所述模板位点具有至少一个与其结合的报道分子；
b)检测由于接触试验样品造成的报道分子发射的变化；
其中，报道分子发射的变化表明试验样品中分析物的存在。
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