CN101393212A - 一种呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其中所述酶标板的各孔包被有包被抗原，包被抗原由呋喃妥因的代谢物1－氨基乙内酰胺(AHD)与载体蛋白偶联制成；所述试剂包括：呋喃妥因的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、呋喃妥因系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。本发明的试剂盒具有灵敏度高、重复性好、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级，有望在畜牧养殖用水、饲料和动物源性食品(如奶样、动物组织样、尿样)的呋喃妥因残留检测中发挥重要作用。

Description

一种呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明属于药物残留分析和免疫技术领域，涉及硝基呋喃类的酶联免疫检测试剂盒，特别涉及一种呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

呋喃妥因属于硝基呋喃(Nitrofurans)类抗生素。硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药动力的特性，因价格较低且效果好，而被广泛应用，作为猪、禽类和水产促生长的添加剂。它主要用来治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疖疮、赤鳍病、溃疡病等，药效稳定，能抑制或杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌，并对某些原虫、真菌有一定作用。硝基呋喃类药物被动物服用之后，原药分子在动物体内迅速代谢，其在体内的稳定性不超过几小时，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，结合态可长期保持稳定，从而延缓原药在体内的清除速度。而普通的食品加工方法难以使蛋白结合态残留物大量降解，食用含有该残留物的肉制品会对人体产生一定的毒副作用。基于此原因，欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。2004年美国公布了禁止在进口动物源性食品中使用硝基呋喃类抗生素。我国也于2002颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。鉴于此，为了保障人民身体健康，保证进出口动物源性产品的质量，需要寻求一种快速灵敏方便的呋喃妥因残留的检测方法。

已经报道的检测呋喃妥因残留的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)和酶联免疫法。HPLC和LC-MS都有高灵敏度、高特异性的特点，但是它们需要昂贵笨重难以携带的仪器，大量的有机溶剂，繁琐的衍生化和费时的样品处理过程。ELISA分析与其它方法相比，优势在于灵敏度高，特异性强，仪器设备要求不高，测定成本低，方法快速、简便，试剂保存时间较长，自动化程度高，无放射性同位素污染，可现场操作且检测批量大。故研究呋喃妥因的酶联免疫检测试剂盒具有直接的经济效益和社会效益。

发明内容

针对现有检测技术的不足，本发明的目的是提供一种检测呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

本发明制备的呋喃妥因化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括：盒体，设在盒内的已包被抗原的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原为呋喃妥因的代谢物1-氨基乙内酰胺(AHD)与载体蛋白的偶联物。

所述试剂包括：呋喃妥因的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液，呋喃妥因标准液、发光液。

所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

所述浓缩磷酸盐缓冲液为：NaCl 80g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄.12H₂O₂29.0g，KCl 2.0g溶于1000mL蒸馏水中的水溶液。

所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的浓缩磷酸盐缓冲液。

所述包被抗原浓度优选为5μg/mL。

所述制备包被抗原偶联物使用的载体蛋白为分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。

所述包被抗原优选由呋喃妥因的代谢物1-氨基乙内酰胺(AHD)由戊二醛法与活化的卵清蛋白(cOVA)偶联制成；其涉及的反应方程式。

所述呋喃妥因的多克隆抗体工作浓度优选1:5000。所述呋喃妥因的多克隆抗体是由呋喃妥因的代谢物1-氨基乙内酰胺(AHD)与对醛基苯甲酸反应得到的衍生物1-(4-羧基苯亚甲基)-氨基乙内酰胺(CPAHD)与活化的牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到，其涉及的反应方程式为：

上述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒中：

所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度优选1:1000。

所述呋喃妥因标准液浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。

所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液(pH＝8.8)和体积比浓度为3/10000 H₂O₂的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。用对甲苯酚作为增强发光反应，其机理为自由基机理。

其中涉及的发光反应式为

本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒最低检测限可达0.01ng/ml，线性检测范围在0.1-10ng/ml，板内变异系数在20％以内，水样品中回收率在87％-113％之间。

本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒有着如下的特点：

(1)所制备的抗体对于呋喃妥因有着很高的特异性，可对水样品中呋喃妥因的残留进行专一的检测和评定

(2)样品前处理简单，无需衍生化和过柱净化

(3)结果灵敏度高，性能稳定。比传统的比色酶联免疫检测法，有着更高的灵敏度和更低的检测下限。

附图说明

图1为本发明呋喃妥因抗体的抑制率曲线。

图2为本发明呋喃妥因抗体的工作曲线。

具体实施方式

实施例11-氨基乙内酰胺(AHD)的衍生化，免疫原、包被抗原、及抗体的制备

(1)AHD的衍生化

将75mg(0.5mmol)3—羧基苯甲醛(CBA)溶于5mL甲醇中，得A液。将76mg AHD(0.5mmol)溶于15mL甲醇中，得B液。将A、B液混合，搅拌，于65℃回流，TLC跟踪，约18小时反应结束。旋转蒸干后加入约20mL乙醇洗涤抽滤。得到AHD的衍生物1-(4-羧基苯亚甲基)-氨基乙内酰胺(CPAHD)。

(2)免疫原的制备

混合酸酐法制备呋喃妥因及其代谢产物(AHD)免疫原CPAHD-cBSA步骤如下：

将18mg(300μmol)乙二胺(EDA)慢慢滴入冰冷的20mL(0.01M pH7.4)磷酸盐缓冲液PBS中，4℃搅拌，向该溶液中逐滴加入浓盐酸，调pH至7.4；称取牛血清白蛋白(BSA)1g(15μmol)和水溶性碳二亚胺(EDC)56mg(300μmol)加入上述EDA的溶液中，室温反应2小时。反应完毕后，取上清液于0—4℃透析。先后用0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)和蒸馏水透析五天，每6小时更换一次透析液。将透析后的溶液冻干，得白色絮状固体，-20℃保存待用。此为活化的牛血清白蛋白(cBSA)。

称取40mg(0.14mmol)CPAHD溶于10mL无水DMF(无水N-N二甲基甲酰胺)中搅拌溶解，加入51μL(0.2mmol)三正丁胺，冰浴反应10分钟，然后逐滴加入87μL(0.67mmol)氯甲酸异丁酯，室温反应1小时。称取80mg cBSA(1.2μmol)溶于10mL 50％DMF中，将活化好的CPAHD逐滴加入溶解了的cBSA中，于0—4℃反应4小时。反应结束，先后用PBS(0.01M pH7.4)缓冲液和蒸馏水透析5天，期间更换透析液，以便较好除去未反应的小分子。透析后，反应液冷冻干燥。得到免疫原CPAHD-cBSA。

(3)包被抗原的制备

称取117mg(2.6μmol)活化的卵清蛋白(cOVA)溶在10mL硼砂缓冲液(0.05MpH8.5)中，搅拌溶解。称取15.8mg(0.104mmol)AHD加入上述溶液中，然后量取0.2mL25％的戊二醛逐滴加入到上述溶液中于室温反应4小时。先后用PBS(0.01M pH 7.4)缓冲液和蒸馏水于0—4℃透析五天，每6小时更换一次透析液。将透析后的溶液冻干，得到固体粉末即为包被抗原。

(4)多克隆抗体的制备

合成的免疫原被用来免疫两只雄性新西兰大白兔。

首次免疫，用注射器对抽法将弗氏完全佐剂与免疫原按1：1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射0.5mg免疫原，进行背部皮下多点注射(5-10点)。首免两周后第一次加强免疫用弗氏不完全佐剂与同样量的抗原混合，进行第二次免疫，剂量、方法同首免。以后每隔两周加强免疫一次，剂量减半。第五次不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，注射七天后进行心脏采血。血液在4℃静置过夜，次日10000g/min离心15分钟，分离抗血清，得到多克隆抗体。

实施例2化学发光酶联免疫吸附检测法(CL-ELISA)的建立

2.1抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)

酶标板纵向用100μL/孔的，浓度梯度按80.0μg/mL、40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、和0.625μg/mL的包被抗原溶液包被，4℃放置过夜，用280μL/孔的洗涤液洗板三次，再用250μL/孔封闭液封闭，室温放置2.5小时，洗涤三次；横向加入100μL/孔，稀释梯度按1：100、1：200～～1：51200的抗体溶液，室温放置2小时，洗涤三次；加入100μL/孔的1：1000的辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，室温放置1小时，洗涤三次；加入100μL/孔的发光液，测定发光值。

以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。

2.2抗体灵敏度的测定(见图1)

经上述方阵法优选，申请人选择包被抗原浓度为5μg/mL，抗体浓度为1:5000，进行抗体的灵敏度的测定：

(1)包被过程：用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，将呋喃妥因的包被抗原配成5μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，280μL/孔，每次5分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。

(2)封闭过程：用250μL/孔的封闭液封闭上述已包被的酶标板，室温孵育2.5小时，洗涤。

(3)竞争过程：加稀释抗体(1:2500)50μL/孔与不同浓度的药物50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育2-4小时，洗涤。

(4)酶标过程：于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体(1:1000)100μL/孔，室温孵育1.5小时，洗涤。

(5)发光过程：于各反应孔中加入100μL/孔临时配制的发光液，立即用化学发光免疫分析仪检测。

(6)计算过程：检测结果以抑制率计算，

％抑制率＝％B/Bo，B是加入竞争者的发光值，Bo是没有竞争者的发光值。计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。以呋喃妥因的浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到抑制率曲线(图1)。

2.3工作曲线的建立(见图2)

(1)包被过程：用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，将呋喃妥因的包被抗原配成5μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，280μL/孔，每次5分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。

(2)封闭过程：用250μL/孔的封闭液封闭上述已包被的酶标板，室温孵育2.5小时，洗涤。

(3)竞争过程：加稀释抗体(1:2500)50μL/孔与浓度梯度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的呋喃妥因溶液50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育2-4小时，洗涤。

(4)酶标过程：于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体(1:1000)100μL/孔，室温孵育1.5小时，洗涤。

(5)发光过程：于各反应孔中加入100μL/孔临时配制的发光液，立即用化学发光免疫分析仪检测。

(6)计算过程：检测结果以抑制率计算，

％抑制率＝％B/Bo，B是加入竞争者的发光值，Bo是没有竞争者的发光值。计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。以呋喃妥因的浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到工作曲线(图2)。

实施例3、本发明的检测呋喃妥因的化学发光酶联免疫试剂盒的组装

(1)检测呋喃妥因的化学发光酶联免疫试剂盒的组成

a、包被有包被抗原(AHD与载体蛋白的偶联物)的固相载体(乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板)；

b、呋喃妥因抗体工作液(体积比浓度为1:5000)；

c、呋喃妥因标准溶液6瓶，浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL；

d、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(工作浓度为1:1000)；

e浓缩磷酸盐缓冲溶液：为每升含NaCl 80g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄.12H₂O₂ 29.0g，KCl2.0g的水溶液。

f浓缩洗涤液：为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L的浓缩磷酸盐缓冲液。

g、发光液：0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+体积比浓度为3/10000的H₂O₂。

(2)酶标板的制备

将包被抗原溶于包被液中，配成5μg/mL的溶液，酶标板的每孔加入100μL，4℃孵育过夜，倾去包被液，每孔加入280μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后加入250μL/孔的封闭液，37℃孵育2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封在4℃下保存。

实施例4、本发明的呋喃妥因的酶联免疫试剂盒的测定程序

4.1试剂盒使用的注意事项

1)使用之前将所有试剂温度升至室温，使用后立刻将所有试剂放回冰箱，4℃下保存。

2)在使用过程中务必不能让微孔干燥。

3)按照推荐的洗板顺序操作。

4)使用中避免光线直射。

4.2试剂的准备

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。

3)发光液：0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(体积比)H₂O₂。

4.3样品前处理

(1)水样将水样经过0.45um的滤膜抽滤，然后加入体积比浓度为0.05的吐温-20。得到待测样品。

(2)牛奶将牛奶样品在4℃、10000转/分钟离心15分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。

(3)尿样将尿样品在4℃，10000转/分钟离心15分钟，去掉沉淀，将剩余的猪尿用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。

(4)动物组织取样品与4mL 0.1M的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20min，然后10000转/分钟离心15min，取上清液用10M NaOH调pH至9.5±0.5，旋涡振荡5min，然后10000转/分钟离心15min。取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000转/分钟离心10min，分出有机相，水相再用异丁醇(每次10mL)萃取两次，三次萃取的有机相合并在一起，50-60℃水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成1:10的溶液，得到待测样品。

4.4检测步骤

1)加样：向酶标板中加入50μL/孔的呋喃妥因系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入呋喃妥因抗体工作液50μL/孔，室温(25℃)恒温孵育2.5h；

2)洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；

3)加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h；

4)洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；

5)加发光液：每孔加入发光液100μL；

6)检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。

4.5结果判断

以所测得的标准品发光值，除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(B/B0)，以抑制率为纵坐标，呋喃妥因浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

％抑制率＝％标准品发光值(或样品)/0标准品发光值。

实施例5 试剂盒特异性的试验

判定试剂盒特异性的指标是交叉率，将呋喃妥因，呋喃他酮，呋喃西林，呋喃妥因，AHD，NPAHD，CPAHD配成浓度梯度，用试剂盒测定各药物的IC₅₀值，每个药物4个复孔，结果列于下表：

实施例6 试剂盒精密度和准确度试验

取0.1，0.5，1，5，10ppb的呋喃妥因标样，添加到水样品中，来检测呋喃妥因回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。

根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。

结果见下表。

从上述测定结果看，变异系数低于19％，回收率在87-113％之间。表明本试剂盒的回收率比较吻合理论值，有着可靠的准确度；而且变异系数较小，重复性好。

Claims (10)

1、一种呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由呋喃妥因的代谢物1-氨基乙内酰胺与载体蛋白偶联制成；所述试剂包括：呋喃妥因的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、呋喃妥因标准液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。

2、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

3、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗原浓度为5μg/mL。

4、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。

5、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述呋喃妥因的多克隆抗体是由呋喃妥因的代谢物1-氨基乙内酰胺与对醛基苯甲酸反应得到的衍生物1-(4-羧基苯亚甲基)-氨基乙内酰胺与活化的牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述呋喃妥因的多克隆抗体的工作浓度为1:5000。

6、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度为1:1000。

7、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述呋喃妥因标准液浓度分别为为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。

8、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩磷酸盐缓冲液为每升含NaCl 80g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄.12H ₂O₂29.0g，KCl 2.0g的水溶液。

9、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L的浓缩磷酸盐缓冲液。

10、根据权利要求1所述呋喃妥因的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述发光液是0.01M鲁米诺与pH＝8.8、0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比浓度为3/10000H₂O₂的混合液。

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