CN101368953A - 一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即环丙沙星与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：环丙沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、环丙沙星标准液、浓缩洗涤液、发光液。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。可在动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中环丙沙星残留检测中发挥重要作用。

Description

一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

环丙沙星(CIP)为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果好，几乎对所有细菌的抗菌活性均较诺氟沙星及依诺沙星强2～4倍，环丙沙星被广泛应用于泌尿及呼吸道系统的感染。然而，它的过度使用也对生物及环境造成了严重的污染。因此，检测特别是快速、简单、灵敏检测环丙沙星变得越来越重要。

目前，检测环丙沙星的方法主要有：微生物法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)、液/质联用分析法(LC-MS/MS)。微生物法的缺陷是：费时而且缺乏特异性。薄层色谱法的缺陷是：操作过程复杂，时间长；操作人员需要经过专业培训；影响分析的干扰因素较多，结果重复性差。薄层色谱法、高效液相色谱法、色/质连用分析法、液/质联用分析法这些理化方法的缺陷是仪器设备昂贵，样品前处理复杂，费时，费力，不易普及，检测费用高。鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测环丙沙星的方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

本发明所述的环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即环丙沙星与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：环丙沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、环丙沙星标准液、浓缩洗涤液、发光液。

其中：所述包被抗原浓度为5μg/mL。

其中：所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。

其中：所述环丙沙星的多克隆抗体是由环丙沙星与载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物制备得到；所述环丙沙星的多克隆抗体的工作浓度优选1:8000。

其中：所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度优选1:1000。

其中：所述环丙沙星标准液浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL2ng/mL、5ng/mL。

其中：所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

其中：所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(体积比)H₂O₂的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

本发明的环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒使用时将标准品或样品和抗体混合后加入酶标板中，标准品或样品中的抗原和酶标板上的包被抗原一起竞争性的与溶液中的抗体结合，洗涤去除游离的抗原以及抗原抗体复合物，与酶标板上包被抗原结合的抗体再与酶标二抗结合，结合的酶标记物催化底物发光，加入发光液后用化学发光免疫分析仪测量发光值，根据底物被酶催化产生的发光强度进行定性或定量分析。

本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。

其中涉及的发光反应式为：

本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。可在动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中环丙沙星残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为本发明的包被抗原的紫外图谱。

图2为本发明环丙沙星抗体的抑制率曲线。

图3为本发明的工作曲线。

具体实施方式

实施例1、免疫原、包被抗原的及抗体的制备

(1)免疫原的合成

将环丙沙星与牛血清蛋白(BSA)采用EDC法进行偶联得到免疫原。具体包括以下步骤：

A，分别称取环丙沙星20.0mg(54.4μmol)，水溶性碳二亚胺(EDC)104.2mg(544μmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)31.3mg(272μmol)依次溶于5mL DMF中，避光、室温磁力搅拌反应24小时；

B，将123.3mg(1.8μmol)BSA(分子量范围为6.7KDa～6.8KDa)溶于10mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)(0.01M，pH7.4)中；

C，将“步骤A的产物”缓慢加入到“步骤B的产物”中，室温磁力搅拌反应3小时；反应完毕后，将反应液转移到半透膜中，在0-4℃用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得白色絮状固体即为免疫原(环丙沙星与牛血清蛋白的偶联物)，-20℃保存，备用。

(2)包被抗原的制备方法同免疫原，不同之处在于所用蛋白为卵清蛋白(OVA)。

(3)环丙沙星多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以环丙沙星与牛血清蛋白的偶联物为免疫原，首次免疫剂量为500ug/mL，首免时将免疫原溶于入等体积的生理盐水和弗氏完全佐剂制成乳化剂，颈背部多点注射，以后免疫取剂量减半的免疫原溶于等体积的生理盐水和弗氏不完全佐剂混合乳化，首免与二免间隔20天，以后每隔两周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7d以后心脏采血，离心得抗血清，得到多克隆抗体。

实施例2、CL-ELISA检测方法的建立

2.1 抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)

纵向用每种包被抗原按40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL的系列稀释度包被酶标板，100μL/孔，0-4℃放置过夜，用洗涤液洗板三次，每次拍干；250μL/孔封闭液封闭，室温放置3小时，洗板三次，每次拍干；加入100μL/孔一系列稀释的抗体(1:100至1:1024000)，室温放置2小时，洗板三次，每次拍干；加入100μL/孔的1：1000的辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，室温放置1小时，洗板三次，每次拍干；加入100μL/孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。

2.2 抗体灵敏度的测定

根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1:8000，包被抗原浓度为5μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：

1)包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液将环丙沙星的包被抗原配成5μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300μL/孔，每次5分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。

2)封闭：用封闭液封闭上述已包被的酶标板，250μL/孔，室温孵育2-4小时，然后洗涤。

3)加样：加稀释抗体(1:4000)50μL/孔与不同浓度的药物50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温2-4小时，然后洗涤。

4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体(1:1000)100μL/孔，1.5小时，洗涤。

5)发光：于各反应孔中加入临时配制的发光液100μL/孔，立即用化学发光免疫分析仪检测。

6)检测结果以抑制率计算：％抑制率＝％B/Bo，B是不同浓度的药物作为竞争者的发光值，Bo是不加药的发光值。计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。

实施例3、检测环丙沙星的化学发光酶联免疫试剂盒

(1)检测环丙沙星的化学发光酶联免疫试剂盒的组成

a、包被有包被抗原(环丙沙星与载体蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；

b、环丙沙星标准溶液6瓶，浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL；

c、环丙沙星抗体工作液(工作浓度为1:8000)；

d、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(工作浓度为1:1000)；

e、浓缩磷酸盐缓冲溶液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄. 12H₂O₂ 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL，pH7.5；

f、浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄.12H₂O₂29.0g，KCl 2.0g，tween-200.5mL加双蒸水至1000mL；

g、发光液：0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(体积比)H₂O₂。

(2)酶标板的制备

用包被液将包被抗原稀释成5μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育1h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例4、检测环丙沙星的化学发光酶联免疫试剂盒的应用

4.1 试剂的配制

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。

3)发光液：0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(体积比)H₂O₂。

4.2 样品前处理

(1)牛奶首先将购买的纯牛奶样品在4℃、10000转/分钟条件下，离心15分钟，去掉脂肪层；将脱脂的牛奶用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。

(2)猪尿样将猪尿样品在4℃，10000g离心15分钟，去掉沉淀，将剩余的猪尿用洗涤液稀释成1：10。得到待测样品。

(3)动物组织取样品与4mL0.1M的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20min，然后10000g离心15min，取上清液用10M NaOH调pH至9.5±0.5，旋涡振荡5min，然后10000g离心15min。取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000g离心10min，分出有机相，水相再用异丁醇(每次10mL)萃取两次，三次萃取的有机相合并在一起，50-60℃水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成1：10的溶液，得到待测样品。

4.3 检测步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入环丙沙星系列标准浓度溶液或样品溶液50μL，然后加入环丙沙星抗体工作液50μL，室温(25℃)恒温孵育2.5h；

2)洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次，拍干；

3)加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1h；

4)倾出孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次，拍干；

5)加发光液：每孔加入发光液100μL；

6)检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。

4.4 结果判断

所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以100，以抑制率为纵坐标，环丙沙星浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

％抑制率＝％标准品发光值(或样品)/0标准品发光值。

实施例5试剂盒精密度和准确度试验

取0.1，0.2，0.5，1，2，5ppb的环丙沙星标样，添加到牛奶样品中，来检测环丙沙星回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表。

从上述测定结果看，变异系数低于21％，回收率在70-112％之间。表明本试剂盒有很好的重复性和准确度。

Claims (9)

1.一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即环丙沙星与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：环丙沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、环丙沙星标准液、浓缩洗涤液、发光液。

2.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗原浓度为5μg/mL。

3.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。

4.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述环丙沙星的多克隆抗体是由环丙沙星与载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物制备得到；其中所述环丙沙星的多克隆抗体的工作浓度为1:8000。

5.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度为1:1000。

6.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述环丙沙星标准液浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL2ng/mL、5ng/mL。

7.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比为3/10000H₂O₂的混合液。

9.根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述三(羟甲基)氨基甲烷溶液的pH＝8.8。

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