CN101392233A - 表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌。该方法，是诱导表达具有颗粒状甲烷单加氧酶表达活性的工程菌，得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。该工程菌，是将可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组菌株。所述重组表达载体为含有单加氧酶的启动子及其下游连接的颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的可在宿主菌中表达的载体。本发明的工程菌可高效表达颗粒状甲烷单加氧酶，可用于沼气转化为甲醇，将丙烯氧化成1，2－环氧丙烷等的催化反应。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌。
背景技术
甲烷是重要的化工原料和化学能源，在人类的生产生活中扮演着重要的作用；同时也是造成温室效应最为重要的气体之一。有效、合理地利用甲烷，必将对全球能源利用、环境保护和循环经济产生重大的影响。由于甲烷是最稳定的烷烃化合物，C-H键能为104kcalmol-1，因此，甲烷直接转化其它高附加值化学品对于化学科学和工程都是一个很大的挑战。特别的，现有工艺通过氧化甲烷生成甲醇需要非常苛刻的反应条件，经过长期的工艺改进和催化剂改良，目前工业上从甲烷生产甲醇仍需255℃的温度和5～15MPa的压力。此外，这些工艺过程中所用的甲烷一般来自于天然气，但在自然界中分布广、密度低的沼气等甲烷资源由于其纯度较低，不能作为工业催化的原料。
自然界中的一类特殊微生物——甲烷氧化菌——可以在常温常压的情况下，依靠体内的甲烷单加氧酶无污染的实现甲烷到甲醇的专一性转化。甲烷单加氧酶不仅可以将甲烷转化成为甲醇，而且还可以催化其它一系列的单加氧反应，可以广泛地应用于生物转化及环境治理。如果能将甲烷单加氧酶进行表达，开发出一种细胞形态生物催化剂，那么在常温常压下就能将天然气转化为甲醇。这将大大降低甲醇的生产成本，是一种高度节能的、环境友好的甲醇生产工艺。同时，以可再生资源为原料通过厌氧甲烷发酵可以提供廉价的甲烷，是实现循环工业的极具潜力的一条途径。因此甲烷的资源化利用技术的研发具有重要的工业应用价值。
甲烷单加氧酶(EC.1.14.13.25，Methane Monooxygenase，简称MMO)分两种，一种是可溶性的甲烷单加氧酶(soluble methane monooxygenase，简称sMMO)，另一种是与细胞膜结合的颗粒状甲烷单加氧酶(particulate methane monooxygenase，简称(pMMO)。尽管sMMO和pMMO都能氧化甲烷生成甲醇，但二者还是存在很多的不同。sMMO存在于细胞质中，它底物范围广，许多的烃类化合物和芳香族化合物都能被氧化。与sMMO相比，pMMO的底物选择性相对较窄，只能氧化五碳以内的烷烃和烯烃，不能氧化芳香烃。但是pMMO却具有很多sMMO不具备的优势。pMMO存在于细胞膜上而不是细胞质中。该性质有利于底物与酶的接触和反应产物及时排出，意味着该酶催化的反应传质阻力更低，因而有利于在生物转化中应用。pMMO存在四级结构，由三个亚基组成(分别是23kDa的pmoC、27kDa的pmoA和45kDa的pmoB，Genbank31650 AF186586)，pMMO是α3β3γ3的三聚体结构，铜离子位于pmoB中。尽管在pMMO酶分子研究方面取得了一系列的进展，而且Methylococcus capsulatus(Bath)和Methylosinus trichosporium OB3b的pmo基因已经克隆测序，但pMMO的重组异源表达却进展甚微，至今在大肠菌及其他宿主细胞中没有表达成功。但pMMO的异源表达技术仍不成熟，既便有个别成功的例子，但重组菌的活性仅为原始菌的千分之一，不能得到高活性的表达。主要原因是pMMO的异源表达大都以大肠杆菌为宿主，得不到转化子，推测是pMMO的表达产物对大肠菌具有毒害作用。
尽管利用野生型甲烷氧化菌能够将甲烷转化甲醇，但是其在大规模的工业应用还存在一系列难以克服的技术问题。首先，甲烷氧化菌的培养比较困难，与其他工业应用的微生物相比增殖速度极慢，而且能够得到的细胞密度低。尽管通过添加特殊底物(氯甲烷、有机酸、维生素或甲醇等)能促进甲烷氧化菌生长，但其生长速度还是远远低于其它菌类。其次，利用野生甲烷氧化菌进行甲烷转化甲醇的过程中，甲醇的积累不易控制。在这些菌中都含有甲醇脱氢酶，因此甲醇会进一步地被氧化成为甲醛，进一步进入的细胞合成代谢。如果加入特殊的化学试剂，选择性地抑制甲醇脱氢酶的活性，这样虽然暂时促进甲醇的积累，但细胞的代谢途径却被中断，特别是阻止细胞的辅酶再生，严重影响细胞的代谢活性，进而阻止甲烷氧化反应。这主要是因为对于甲烷氧化菌而言，MMO氧化甲烷所需的NADH只能由甲醛进入相应的代谢途径后才能产生，因此如果将细胞控制在生产甲醇这一步的话，胞内原有的NADH被耗竭时，反应就停止了。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌。
本发明所提供的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌，是将可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组菌株。
所述重组表达载体为含有单加氧酶的启动子及其下游连接的颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的可在宿主菌中表达的载体。
所述单加氧酶基因的启动子为烷烃单加氧酶基因的启动子或颗粒状甲烷单加氧酶基因的启动子；所述烷烃单加氧酶基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为AJ302087的5′端第2008-2150位核苷酸序列，所述颗粒状甲烷单加氧酶基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为U31650 AF186586的5′端第34-499位核苷酸序列。
所述颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的的核苷酸序列为自GENBANK号为U31650 AF186586的5′端第500-3743位核苷酸序列。
所述宿主菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
所述重组表达载体的构建出发载体可为pCom10、酵母表达载体等，其中pCom10质粒可用于上述产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌，甲基扭曲杆菌等宿主中，而酵母表达载体可用于上述巴氏毕赤酵母或酿酒酵母中。
所述重组表达载体优选为将颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因插入到pCom10的NdeI和HindIII酶切位点之间或将所述单加氧酶基因的启动子及其下游连接的所述颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因插入到pCom10的EcoRI和HindIII酶切位点之间得到的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组载体。
本发明所提供的表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法，是诱导表达上述的工程菌，得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
所述方法中，所述诱导表达的方法为发酵至对数生长初期的权利要求1-6中任意一项所述的工程菌的发酵液中，加入0.05％(v/v)正辛烷，在15-20℃诱导培养得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
本发明通过生物信息学比对，选择与颗粒状甲烷单加氧酶同源性较高(大于30％)的单加氧酶，并利用其启动子作为调控颗粒状甲烷单加氧酶功能基因pmoCAB的启动子构建构建单加氧酶启动子—pmoCAB表达体系，同时选择适当的表达载体，构建得到可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体。本发明选择了具有较多膜蛋白氧化还原酶的菌作为宿主菌，并利用化学转化或电穿孔转化及原生质体融合等手段将表达载体转入宿主菌中构建了可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌，实验证明这些工程菌具有稳定、高效表达颗粒状甲烷单加氧酶的功能。
本发明的方法利用上述具有颗粒状甲烷单加氧酶表达活性的重组菌，彻底避开甲醇脱氢酶基因的影响，使甲烷氧化停留在甲醇这一步反应，克服了野生型甲烷氧化菌的缺陷，更易培养(能用含葡萄糖等普通碳源的培养基培养)。本发明还利用具有颗粒状甲烷单加氧酶活性的重组菌成功地解决了颗粒状甲烷单加氧酶的异源表达问题。所构建的基因工程重组菌能将天然气的烷烃液化成为相应的醇类，能将沼气转化为甲醇，能将丙烯氧化成1，2-环氧丙烷。本发明的工程菌可以用于环境中难降解化合物如石油中烃类化合物的羟化分解，因而可用于环境的生物治理。
附图说明
图1为pCompmo质粒构建图
图2为pCHP质粒构建图
图3为E.aerogenes pCompmo SDS-PAGE电泳图。
图4为含有pCHP质粒重组菌SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建及其颗粒状甲烷单加氧酶的表达
1、可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建
1)可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体(pCompmo)的构建
选择pCom10质粒(其核苷酸序列为自GENBANK Accession Number为AJ302087的第1-7675位核苷酸，可按照文献(Theo H.M.Smits，Plasmid，2001，46：16-24)描述的方法构建，清华大学)作为可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体的出发载体，一方面是其为广谱质粒，可以在不同的革兰氏阴性细菌复制；另一方面，该质粒启动子PalkB为烷烃单加氧酶启动子(自GENBANK Accession Number为AJ302087的5′端第2008-2150位核苷酸序列)，而烷烃单加氧酶与甲烷单加氧酶在结构与功能上有许多相似性。
可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体构建示意图如图1所示，具体方法如下所述：
以M.trichosporium OB3b的基因组DNA为模版，扩增pmoCAB功能基因(GENBANK Accession Number为U31650 AF186586的5′端第500-3743位核苷酸序列)，所用上下游引物分别为5’-CATATGAATTCAACAACAGAGACAACAG-3’ (带下划线的序列为NdeI的识别序列)和5’-AAGCTTCCAAACGCCGCATTCTATC-3’(带下划线的序列为HindIII的识别序列)，分别引入NdeI和HindIII酶切位点。PCR扩增反应条件如下：先94℃，预变性4分钟后进行30个循环的扩增反应；循环反应条件是：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟；30个循环结束后72℃补充延伸10分钟。扩增得到了预期的3.4kb的片段，经测序表明，扩增得到的片段具有自GENBANK Accession Number为U31650 AF186586的5’端第500-3743位核苷酸序列，即为pmoCAB功能基因片段。
将纯化后的PCR产物经限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切，将酶切得到的带有NdeI和HindIII粘性末端的pmoCAB功能基因片段插入pCom10的NdeI和HindIII酶识别位点之间，得到重组表达载体，将该重组表达载体进行酶切和测序验证，将验证表明含有启动子PalkB与其下游连接的上述PCR得到的pmoCAB的重组表达载体命名为pCompmo。
2)可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建
为了将pmoCAB基因在不同宿主中表达，选择了富含氧化还原酶的革兰氏阴性细菌作为宿主菌。利用电转化的方法将构建好的质粒pCompmo分别转入产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10204)或甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号8457)，将得到的重组工程菌株提取质粒测序验证，将验证表明含有质粒pCompmo的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)工程菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)工程菌、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)工程菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)工程菌， 甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)工程菌分别命名为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)pCompmo、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCompmo、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCompmo、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCompmo，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)pCompmo。
2、颗粒状甲烷单加氧酶的表达
将产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCompmo、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)pCompmo、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCompmo、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCompmo，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)pCompmo分别进行诱导表达；具体方法如下所述：
将上述工程菌下述基础培养基中培养至对数生长初期，然后分别在发酵液中，加入0.05％(v/v)正辛烷，在18℃诱导培养5小时得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
基础培养基：每升溶液中含有甘油1g，NaNH4HPO4·4H2O 3.5g，K2HPO4·3H2O7.5g，KH2PO4 3.7g，MgSO4·7H2O 0.246g，MT贮液1ml，去离子水定容至1L；其中MT贮液为每升溶液中含有FeSO4·7H2O 2.78g，MnCl2·4H2O 1.98g，CoSO4·7H2O 2.81g，CaCl2·2H2O 1.47g，CuCl2·2H2O 0.17g，ZnSO4·7H2O 0.29g，1mol·L-1HCl定容至1L。
将上述诱导培养5小时后得到的培养液，分别离心收集1ml培养液的菌体，用无菌水洗涤后，按照下述方法提取整细胞蛋白：
1)以0.5ml用冰预冷的50mmol/L Tris·Cl(PH 7.4)振荡沉淀的菌体使之复悬，用微量离心机于零度以12000g离心30秒回收菌体。再次吸出上清液，小心的吸净管壁上的液滴，尽可能是沉淀物不带有残留液体。
2)在步骤1)得到的沉淀中加入25ul水，振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来，立即加入25ul 2倍的SDS凝胶加样缓冲液(含有100mmol/L Tris·HCl(PH 6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，质量百分含量为4％的SDS(电泳级)，质量百分含量为0.2％的溴酚蓝，质量百分含量为20％的甘油的溶液)，继续振荡20秒钟。
3)将步骤2)得到的样品在沸水裕中放置5分钟，采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对样品进行剪切。
4)将步骤3)得到的剪切后的样品于室温仪12000g离心10分钟，将上清液移至另一个管中，弃沉淀物得到蛋白样品。
吸取上述得到的经剪切或超声处理的样品25u进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。然后用蛋白电泳图像分析软件计算表达的蛋白占总蛋白的量。分别以上述工程菌的野生型菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10204)或甲基扭曲杆菌(Methylobacteriumextorquens，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号8457)进行上述同样的诱导培养后按照上述提取整细胞蛋白后进行蛋白电泳为对照。
结果表明，上述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCompmo、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCompmo、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCompmo、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCompmo，甲基扭曲杆菌(Methylobacteriumextorquens)pCompmo均可表达pMMO蛋白，表达的pMMO蛋白均包括其pmoB、pmoA和pmoC亚基，表达量达总蛋白的5％以上。用美国GE Healthcare公司的ImageMaster VDS凝胶成像系统配套软件分析表明，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)pCompmo、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCompmo、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCompmo、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCompmo，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)pCompmo的pMMO蛋白表达量分别为0.8g/L发酵液、1.0g/L发酵液、0.7g/L发酵液、1.0g/L发酵液、0.5g/L发酵液。
其中，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCompmo表达蛋白电泳图如图3所示，图3中，M1为24～97kD分子量的标准蛋白marker，M2为16～115kD分子量的标准蛋白marker，E为用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCompmo整细胞蛋白上样的条带，Control为用野生菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)整细胞蛋白上样的条带。工程菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCompmo与野生菌产气肠杆菌相比，在36kD～53kD处、24kD～36kD和24kD处均有明显条带，分子量大小约为45kD、27kD和24kD。而pMMO的三个亚基大小分别为23kD(pmoC)、27kD(pmoA)和45kD(pmoB)。图3中箭头所指三处为pMMO的亚基，从上至下分别为pmoB、pmoA和pmoC。SDS-PAGE电泳说明编码pmoCAB的mRNA可以在基因工程宿主产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)中进行翻译。蛋白电泳图像分析软件分析表明，从整细胞蛋白的电泳中可以发现工程菌表达pMMO的量为菌体总蛋白的5％以上。
实施例2、可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建及其颗粒状甲烷单加氧酶的表达
1、可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建
1)可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体(pCHP)的构建
可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体(pCHP)的构建流程示意图如图2所示。以M.trichosporium OB3b的基因组DNA为模版，扩增pmo功能全基因簇(AF186586)，所用上下游引物分别为5’-AGTAGAATTCATTGAGAAGTGAGCAGCCT-3’(带下划线的序列为EcoRI的识别序列)和5’-ATACAAAGCTTTGAAGATAATGCTGCCGA-3’(带下划线的序列为HindIII的识别序列)，分别引入EcoRI和HindIII酶切位点。PCR扩增反应条件如下：先94℃，预变性4分钟后进行30个循环的扩增反应；循环反应条件是：94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸4分钟；30个循环结束后72℃补充延伸10分钟。得到了预期的4.4kb的片段，经测序表明，扩增得到的片段具有自GENBANK Accession Number为U31650 AF186586的5′端第34bp-4474bp位核苷酸序列，即为pmo全基因簇，其中自GENBANK AccessionNumber为U31650 AF186586的5′端第34-499位核苷酸序列为启动子序列。将纯化后的PCR产物经限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，将酶切得到的带有NdeI和HindIII粘性末端的pmoCAB功能基因片段与插入pCom10的EcoRI和HindIII酶识别位点之间，得到重组表达载体，将该重组表达载体进行酶切和测序验证，将验证表明含有上述PCR得到的片段的重组表达载体命名为pCHP。
2)可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建
为了将pmoCAB基因在不同宿主中表达，选择了富含氧化还原酶的革兰氏阴性细菌作为宿主菌。利用电转化的方法将构建好的质粒pCHP分别转入产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10204)和甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号8457)中，将得到的重组工程菌株提取质粒测序验证，将验证表明含有质粒pCHP的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)分别命名为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCHP、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCHP、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCHP、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)pCHP，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)pCHP。
2、颗粒状甲烷单加氧酶的表达
将产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCHP、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)pCHP、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCHP、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCHP，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)pCHP分别进行诱导表达；具体方法如下所述：
将上述工程菌下述基础培养基中培养至对数生长初期，然后分别在发酵液中，加入0.05％(v/v)正辛烷，在20℃诱导培养5小时得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
基础培养基：每升溶液中含有甘油1g(或1g葡萄糖)，NaNH4HPO4·4H2O 3.5g，K2HPO4·3H2O 7.5g，KH2PO43.7g，MgSO4·7H2O 0.246g，MT贮液1ml，去离子水定容至1L；固体培养基中加入15g琼脂粉；其中MT贮液为每升溶液中含有FeSO4·7H2O2.78g，MnCl2·4H2O 1.98g，CoSO4·7H2O 2.81g，CaCl2·2H2O 1.47g，CuCl2·2H2O 0.17g，ZnSO4·7H2O 0.29g，1mol·L-1 HCl定容至1L。
将上述诱导培养5小时后得到的培养液，分别离心收集细胞，用无菌水洗涤后，对整细胞蛋白(按照实施例1的步骤2所述的提取整细胞蛋白的方法提取得到)然后分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检验。然后用蛋白电泳图像分析软件计算表达的蛋白占总蛋白的量。分别以上述工程菌的野生型菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10204)或甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号8457)进行上述同样的诱导培养后进行蛋白电泳为对照。
结果表明，上述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCHP、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCHP、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCHP、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCHP在上述两种培养基的诱导培养后，均可表达pMMO蛋白，表达的pMMO蛋白均包括其pmoB、pmoA和pmoC亚基，表达量达总蛋白的5％以上。用美国GE Healthcare公司的ImageMaster VDS凝胶成像系统配套软件分析表明，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCHP、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCHP、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCHP、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)pCHP的用添加葡萄糖的培养基诱导培养时pMMO蛋白表达量为分别0.4g/L发酵液、0.3g/L发酵液、0.4g/L发酵液、0.5g/L发酵液、0.4g/L发酵液；用添加甘油的培养基诱导培养时pMMO蛋白表达量为分别为0.7g/L发酵液、0.8g/L发酵液、0.7g/L发酵液、0.6g/L发酵液、0.7g/L发酵液。
部分菌株蛋白电泳如图4所示，其中，泳道M为标准蛋白marker，分子量如图所示；泳道1-3分别为阴性对照产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)在甘油培养基中的培养后蛋白电泳情况；泳道1’-3’分别为重组菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)pCHP、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCHP和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)pCHP在甘油培养基中培养后的蛋白电泳情况；泳道4-5分别为阴性对照产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)在添加葡萄糖的培养基中的培养后蛋白电泳情况；泳道4’-5’分别为重组菌产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)pCHP和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)pCHP在葡萄糖培养基中的情况。工程菌与野生型菌株相比，在24kDa附近明显多一条带，而这条带大小与pmoC相同(蛋白电泳采用整细胞全蛋白上样，pmoA、pmoB可能由于其它蛋白条带的影响在电泳图中条带差别不明显)，可以说明pMMO在三株重组菌中都得到转译，形成了三个亚基pmoC、pmoA和pmoB。蛋白电泳图像分析软件，从整细胞蛋白的电泳中可以发现工程菌表达pMMO的量为菌体总蛋白的5％以上。
Claims (8)
1、表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌，是将表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到的表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组菌株。
2、根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述重组表达载体为含有单加氧酶的启动子及其下游连接的颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的可在宿主菌中表达的载体。
3、根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述单加氧酶基因的启动子为烷烃单加氧酶基因的启动子或颗粒状甲烷单加氧酶基因的启动子；所述烷烃单加氧酶基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为AJ302087的5′端第2008—2150位核苷酸序列，所述颗粒状甲烷单加氧酶基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为U31650 AF186586的5′端第34—499位核苷酸序列。
4、根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的核苷酸序列为自GENBANK号为U31650 AF186586的5′端第500bp—3743bp位核苷酸序列。
5、根据权利要求1-4中任意一项所述的工程菌，其特征在于：所述工程宿主菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
6、根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述重组表达载体是将颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因插入到pCom10的NdeI和HindIII酶切位点之间或将所述单加氧酶基因的启动子及其下游连接的所述述颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因插入到pCom10的EcoRI和HindIII酶切位点之间得到的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组载体，所述pCom10的核苷酸序列为自GENBANK Accession Number为AJ302087的第1-7675位核苷酸。
7、一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法，是诱导表达权利要求1—6中任意一项所述的工程菌，得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述诱导表达的方法为发酵至对数生长期的权利要求1—6中任意一项所述的工程菌的发酵液中，加入体积百分含量为0.05％的正辛烷，在15-20℃诱导培养5小时得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
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