CN101284876A

CN101284876A - 融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

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Publication number: CN101284876A
Application number: CNA2008100478408A
Authority: CN
Inventors: 徐进平; 孟小林; 王健; 鲁伟; 夏菡
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2008-05-28
Filing date: 2008-05-28
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2028-05-28
Also published as: CN101284876B

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白Penharpin及制备方法和用途，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白Penharpin的方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。融合蛋白Penharpin同时具有对虾肽Pen－2和激发子Harpin的活性，即具有抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质，如过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。融合蛋白Penharpin可以用于如细菌、真菌和病毒等微生物感染的植物病害的防治，对植物病害有良好的防治效果，并能诱生和提高植物的抗病能力、促进植物的生长、提高农作物产量。

Description

融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术、药物和植物病害防治领域，更具体地，本发明涉及对虾肽Pen-2(Penaeidin-2，以下简称Pen-2)与激发子Harpin的融合蛋白Penharpin，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白Penharpin的方法，以及含该融合蛋白Penharpin的药物组合物。本发明涉及的融合蛋白Penharpin同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性。融合蛋白Penharpin具有对虾肽Pen-2的抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有激发子Harpin诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质。该融合蛋白Penharpin在预防和治疗植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，以及在防治植物病害、诱生和提高植物的抗病能力、促进植物生长、提高农作物产量中的应用。

背景技术

对虾肽Penaeidins是从南美白对虾血浆和血细胞的酸性抽提物中分离的一类具有生物活性的肽类物质，分子大小为5.48-6.62kDa。Penaeidin家族是阳离子抗菌肽，COOH-端含有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，NH₂-端富含脯氨酸。Penaeidin前体N端具有保守性很强的信号肽，经加工获得成熟肽。Penaeidin成熟肽有翻译后修饰的特性，或者C端酰氨化，或者N端通过焦谷氨酸环化(Destoumieux D，Bulet P，Loew D，et al.1997.C.-J.Kanget al.2007)。

Penaeidins是一组具有生物活性的对虾抗菌肽，目前已分离并鉴定的Penaeidins分别为Pen-1、Pen-2、Pen-3、Pen-4和Pen-5等。Penaeidin在凡纳滨对虾和白滨对虾中都存在，它们可能分别执行不同的生物学功能。Penaeidin的转录水平很高，对虾能产生大量不同的Penaeidin。Penaeidin分子中有两个结构域，一个是富含甘氨酸和脯氨酸的N端结构域，另一个是含有6个保守半胱氨酸残基的C端。Penaeidin所含有的两个不同的结构域，行使着不同的功能，共同发挥作用，从而使抗菌肽具有多功能的特点。对虾肽Penaeidin-2(Pen-2)是从南美白对虾血淋巴中分离到的阳离子抗菌肽。天然的Pen-2具有50个氨基酸残基，分子量为5562Da。

Penaeidins同时具有抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的生物活性。Penaeidins通过多种抗菌模式发挥作用，对细菌起到快速杀死的作用，或者表现为抑制作用。Penaeidin的抗细菌活性主要是针对革兰氏阳性菌，并有种属特异性。Penaeidin能抑制许多细菌的生长，作用机制多种多样。有的Penaeidin缓慢杀死细菌，有的杀菌作用十分迅速。

Penaeidins具有抗真菌活性，通过抑制抱子萌发而起到杀死不同品系真菌的作用，而当Penaeidins的浓度较低时，则会抑制真菌的生长，并且导致其形态异常。对虾肽Pen-2同时具有抗细菌和真菌的活性。对虾肽Pen-2和Pen-3a对于许多丝状真菌具有抗菌活性，最小抑菌浓度(MIC)低于10μmol/L。

抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、水溶性好等优点，且抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。目前，随着抗生素残留，耐药菌株的不断出现。不少病原菌对抗生素产生很强的耐药性，而抗菌肽几乎不产生抗性。抗菌肽有着许多传统抗生素无法比拟的优点，它们具有广谱的生物学活性，抗菌能力强，杀菌迅速，种类多，可供选择范围广，靶菌株不易产生抗性突变，与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素等。同时，抗菌肽也是机体抵抗外源性感染的天然防御系统的重要组分之一，具有特异性与安全性。因此，研究能逐步替代抗生素的抗菌肽就显得极为重要，抗菌肽成为继青霉素等传统抗生素之后的一类重要新型抗菌药物。在医药领域中，德国和美国已有多种抗菌肽应用于临床治疗手术后重度真菌感染和重度肺炎症状的报道。在食品和化妆品领域中抗菌肽主要用作保藏剂和防腐剂，取得了较好的效果。抗菌肽在医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等方面将有着广阔的应用前景。

从来源上，激发子(elicitor)可分为生物激发子和非生物激发子两大类。生物激发子指来自病原菌、非病原菌、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的物质。激发子Harpin是革兰氏阴性(G-)植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子。植物过敏性反应(hypersensitive response，HR)，是植物在受到病原细菌侵染、发生不亲和反应时所产生的一种特有现象(Klement Z et al，1963)。过敏反应是植物自身具有的一种保护反应，类似于高等动物所具有的广谱抗病菌虫害的免疫反应。病原菌所产生的一些多糖、脂多糖、糖蛋白、脂肪酸、蛋白质以及多肽等激发子诱导植物过敏性反应。

病菌中参与过敏性反应的基因称为过敏性反应基因(hypersensitivereaction and pathogenicity；hrp)(Daniels M J et al，1993)。hrp基因一般成簇存在，hrp基因簇通常由多个转录单位组成。植物病原菌都有hrp基因簇，分子量为2000～4000，包括3～13个基因，它们既和致病相关，又与诱导寄主的过敏性反应相关(Willis DK，et al，1991)。1992年，Wei等首先从梨火疫病的病原细菌(Erwinia amylovora)中分离到一种约44kDa、能激发HR的蛋白质激发子Harpin(hrpN基因编码，常用Harpin Ea表示)，并将研究成果发表在《Science》上(Wei et al.，1992)。hrp基因簇中的各个基因协同作用，功能上相当于一个调控单元，它们既与致病性有关，又与诱导寄主的过敏性反应相关(Ezra D et al，2000；Leach J E，1996)。在基因组中，hrp基因往往是成串的，形成一个操纵子结构，能产生过敏反应的激发子Harpin的编码基因是其中的一个或几个(Beer SV，et al，1991)。

激发子Harpin既能诱导非寄主植物产生过敏反应，其本身又是寄主的一种致病因子(He SY，1993)。激发子Harpin通过与植物表面的受体结合、激活植物自身的防御功能，然后通过构型变化激活胞内有关酶的活性和蛋白质磷酸化，形成第二信使，信号得到放大，最终通过对特殊基因的调节而激发植物产生防卫反应(梁元存等，2001)。激发子Harpin激活植物防卫反应的途径主要有三种：(1)一种未知途径激活植物抗细菌反应；(2)水杨酸途径激活植物的抗细菌、真菌、病毒反应；(3)乙烯和茉莉酸途径激活抗真菌反应。

激发子Harpin具有调节离子通道、引起防卫反应和细胞死亡的功能。激发子Harpin能激发在细胞悬浮培养中活性氧的产生。已证明活性氧有三方面的抗病功能：(1)传递诱导防卫反应的互作信号；(2)修饰寄主的细胞壁以抵御病原菌的侵染；(3)直接抑制病原菌的侵入(He SY，1993)。

激发子Harpin能够直接应用于植物病害防治(直接喷洒使用或构建多功能生防微生物)，也能够应用于转基因植物，产生广谱的抗病特性。激发子Harpin可用于防治假单胞菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属等引起的细菌类疾病；镰孢属、疫霉属等引起的真菌类疾病；烟草花叶病毒和番茄花叶病毒等植物病毒类疾病。此外，激发子Harpin能抑制细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫对植物的侵染和侵害，是一种新型的抗菌抑菌剂，广泛应用于植物保护，特别是单子叶植物和双子叶植物，其中包括主要的农作物和经济作物、蔬菜等。

激发子Harpin具有促进生长和发育的功能，研究表明激发子Harpin能促进种子萌发和植物发育，提高作物的产量和质量，增大植株个体，利于植物的早熟和结实(Bonas U et al，1994；Laby et al，1997；傅华欣，1999；高正良，1999)。

激发子Harpin还可提高蔬菜、水果抗腐烂、霉变能力，延长贮藏时间。另外，激发子Harpin对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。

激发子Harpin本身不具有任何杀菌活性，对植物病原不具有直接的抑制或毒杀效果，不存在促进有害生物种群抗性发展的选择压力。但是，激发子Harpin可以激活植物产生一系列抗性反应。研究表明，激发子Harpin对野生动物(如鸟、鱼、蜜蜂、水蚤和藻类植物等)无害。因此，激发子Harpin作为抗菌抑菌剂具有不污染环境，对人畜安全，不产生抗药性等优点，在生产上具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种新的同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin两者生物活性的融合蛋白Penharpin。融合蛋白Penharpin具有对虾肽Pen-2的抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有激发子Harpin诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质。

本发明的另一目的是在于提供编码所述融合蛋白Penharpin的DNA，含有该DNA序列的载体，含有该载体的宿主细胞。

本发明的再一个目的是在于提供一种制备所述融合蛋白Penharpin的方法。

在本发明的第一个方面，提供了一种融合蛋白Penharpin，该蛋白包括：对虾肽Pen-2的氨基酸序列、激发子Harpin的氨基酸序列、以及位于对虾肽Pen-2的氨基酸序列与激发子Harpin的氨基酸序列之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。较佳的，所述的连接肽序列含4-15个氨基酸。更佳的，所述的融合蛋白包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二个方面，提供了一种分离的DNA分子，该DNA分子编码上述的融合蛋白Penharpin。较佳的，所述的DNA分子编码包括SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三个方面，提供了一种载体，该载体含有上述DNA分子。较佳的，所述的载体包括重组表达质粒pET-pen-hrp。

在本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述载体。较佳的，所述的宿主细胞包括重组基因工程菌株Escherichia coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，即E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，CCTCC No：M208071。该菌株含有上述重组表达质粒pET-pen-hrp。

在本发明的第五个方面，提供了一种产生上述融合蛋白Penharpin的方法，该方法包括以下步骤：培养上述宿主细胞，在能表达所述的融合蛋白Penharpin条件(其中包括诱导或非诱导条件)下，表达上述融合蛋白Penharpin，然后分离、纯化融合蛋白Penharpin。

在本发明的第六个方面，提供了一种药物组合物，该组合物包含有效剂量的上述融合蛋白Penharpin，以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。

在本发明的第七个方面，提供了上述药物组合物在预防或治疗植物病害中的应用。所述的融合蛋白Penharpin或药物组合物在防治植物病害中的应用。

本发明还涉及融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗细菌感染的药物中的应用。

本发明还涉及融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗真菌感染的药物中的应用。

本发明还涉及融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗病毒感染的药物中的应用。

本发明将对虾肽Pen-2基因和激发子Harpin基因融合、重构、表达，产生对虾肽Pen-2和激发子Harpin的融合蛋白Penharpin，该融合蛋白Penharpin同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性。融合蛋白Penharpin具有对虾肽Pen-2的抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有激发子Harpin诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质。融合蛋白Penharpin成为一种新型的药物，应用于预防和治疗植物的细菌、真菌和病毒病，在防治植物病害、诱生和提高植物的抗病能力、促进植物生长、提高农作物产量中发挥作用。

定义

如本文所用，术语“对虾肽Pen-2和激发子Harpin的融合蛋白”、“对虾肽Pen-2-激发子Harpin融合蛋白”、“对虾肽Pen-2与激发子Harpin的融合蛋白Penharpin”、“Pen-2-Harpin融合蛋白”、“融合蛋白Penharpin”、“Penharpin融合蛋白”等可互换使用，均指将对虾肽Pen-2氨基酸序列和激发子Harpin氨基酸序列融合、重构而成的蛋白。其中，两个氨基酸序列之间可以有或者没有连接肽序列。

如本文所用，术语融合蛋白Penharpin中“对虾肽Pen-2氨基酸序列”，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列。该序列与天然的或变异的对虾肽Pen-2具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然对虾肽Pen-2基本上相同的生物活性。优选的对虾肽Pen-2氨基酸序列是天然对虾肽Pen-2氨基酸序列。

如本文所用，术语融合蛋白中“激发子Harpin氨基酸序列”，指在所述融合蛋白Penharpin中的一部分氨基酸序列。该序列与天然的或变异的激发子Harpin具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与激发子Harpin基本上相同的生物活性。优选的激发子Harpin氨基酸序列是天然激发子Harpin氨基酸序列。

如本文所用，术语“连接肽”指位于对虾肽Pen-2氨基酸序列和激发子Harpin氨基酸序列之间、发挥连接作用的短肽。连接肽的长度为1-20个氨基酸，较佳的为4-15个氨基酸。技术人员可按照本领域的常规方法设计连接肽。

如本文所用，术语“对虾肽Pen-2和激发子Harpin的融合基因”、、“pen-hrp融合基因”、“pen-hrp”等可互换使用，均指将对虾肽Pen-2基因pen和激发子Harpin基因hrp融合、重构而成的融合基因。其中，两个基因序列之间可以有或者没有连接肽DNA序列。

如本文所用，编码融合蛋白Penharpin的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法分别获得编码对虾肽Pen-2和激发子Harpin的DNA序列，然后其进行拼接，构成本发明融合蛋白Penharpin的DNA序列。将该序列与合适的表达载体连接，然后转入合适的宿主细胞。培养上述宿主细胞，在能表达所述的融合蛋白Penharpin条件(其中包括诱导或非诱导条件)下，表达上述融合蛋白Penharpin，然后分离、纯化该融合蛋白Penharpin。

如本文所用，术语“载体”包括克隆载体、表达载体、病毒载体、质粒和粘粒等。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如原核系统表达载体和真核系统表达载体等。将编码本发明新融合蛋白Penharpin的核苷酸序列插入上述载体中，表达融合蛋白Penharpin。

本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括大肠杆菌和枯草杆菌等。真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞等。较佳的，该宿主细胞是大肠杆菌。

本发明中，含有上述载体的宿主细胞经过培养，可在合适的条件下表达上述融合蛋白Penharpin，然后分离、纯化融合蛋白Penharpin。

大肠杆菌表达系统具有以下优点：(1)蛋白质表达量高。基因工程蛋白的表达量最高可以达到菌体蛋白总量的30-50％。(2)可表达N端含有6个连续组氨酸的融合蛋白，该6个连续的组氨酸有利于蛋白质的分离和纯化。组氨酸在一般蛋白中为稀有氨基酸，引入连续的6个组氨酸具有很高的特异性。6个组氨酸尾与金属离子有很强的结合能力，而且对目的蛋白的结构和功能的影响很小，通常生物学活性可以得以保持，不经去除6个组氨酸尾可直接研究目的蛋白的生物学活性。(3)大肠杆菌表达系统是一种安全的表达系统，目前已经成功地采用大肠杆菌表达系统表达了多种医用的蛋白质，安全无毒，对人畜及环境无毒无害。(4)利于产业化生产。在所有基因工程表达系统中，大肠杆菌的生产成本是最低的，而且已经有成型的发酵设备和生产方法，有利于实现产业化生产。

在本发明的一个实施例中，将pen-hrp融合基因克隆入原核表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌Escherichia coli OrigamiB(DE3)pLysS，制备一种重组基因工程菌株Escherichia coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，即E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，CCTCC No：M208071。pET-32a(+)载体是一种表达量很高的载体，培养E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，在表达所述的融合蛋白Penharpin条件(其中包括诱导或非诱导条件)下，表达融合蛋白Penharpin，然后分离、纯化融合蛋白Penharpin。融合蛋白Penharpin约占菌体蛋白总量的28％以上，表达的融合蛋白Penharpin主要形成可溶性蛋白。

本发明的Penharpin融合蛋白具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的生物活性。在实施例中，Penharpin融合蛋白对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有不同程度的抗细菌活性，对多种细菌均有一定的抑杀作用。Penharpin融合蛋白对黑曲霉具有明显的抗菌活性。Penharpin融合蛋白可预防烟草花叶病毒(TMV)对烟草的侵染，并且Penharpin融合蛋白的对预防烟草花叶病毒(TMV)感染烟草的效果较激发子Harpin好。另外，Penharpin融合蛋白对TMV的感染有一定的治疗效果，病情指数较对照降低。Penharpin融合蛋白能引起烟草的过敏反应，并且将Penharpin融合蛋白和激发子harpin样品相比较，Penharpin融合蛋白处理组所引发的过敏反应较激发子Harpin处理组的反应程度强。Penharpin融合蛋白还能诱导烟草叶片中防御性物质过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。

在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效剂量的Penharpin融合蛋白，以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。

赋形剂可分为8类：(1)填充剂，如植物淀粉、乳糖、钙盐、碳酸氢钠、枸橼酸、右旋糖酐、蔗糖、醇、甘油、山梨糖醇、木糖醇、水和局部用制剂的矿物油(液体石蜡)、凡士林、石蜡、羊毛脂、蜂蜡、皂土、硅酸镁铝等。(2)涂层剂，如明胶、聚合物、紫胶、谷蛋白、胶浆等；(3)甜味剂，如蔗糖、乳糖、右旋糖酐、果糖、玉米糖浆、阿司巴甜、环己酸氨基磺酸盐等；(4)调味剂，如从苹果、樱桃、可可、柑橘、苏丹可可果、姜、甘草、薄荷等提取出的天然香料，以及来源被公认安全的人工香料等物质。(5)着色剂/染料，如偶氮和单偶氮染料、喹啉染料、三苯甲烷染料、黄嘌呤染料等。(6)缓冲剂，如磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐等和一些混悬、乳化和硬化化合物；(7)防腐剂，如山梨酸、硫柳汞、苯甲醇等；(8)推进剂，如压缩气体、碳氟化合物等。

因此，组合物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、纳米制剂等。

组合物可制成单元或多元剂型，各种剂型包含为了产生所期望的植物病害防治效果的预定量活性成分——Penharpin融合蛋白，以及合适的药剂学稀释剂或赋形剂或胶囊剂等。

该药物组合物在植物病害防治中，可根据植物病害具体情况采用有效剂量进行施药，这可以由生物防治人员确定。另外，本发明的Penharpin融合蛋白和药物组合物可与其它药物(如植病灵、多菌灵)联用，应用于植物病害的防治。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

在本发明的一个实施方案中，提供一种DNA片断的制备方法，该片段包含所述的编码Penharpin融合蛋白的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述的Penharpin融合蛋白具有的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码Penharpin融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种Penharpin融合蛋白，该蛋白为基因工程融合蛋白，其N的氨基酸是载体所编码的，N端氨基酸是：

MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA PILDEIADEY QGKLTVAKLN 60

IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL KEFLDANLAG SGSGHMHHHH 120

HHSSGLVPRG SGMKETAAAK FERQHMDSPD LGTDDDDKAM ADIGSEF 167

在本发明的一个实施方案中，所用pET-32a(+)质粒为Novagen公司产品，在pET-32a(+)质粒多克隆位点上游还带有His.Tag、S.Tag及肠激酶和凝血酶酶切位点，表达Penharpin融合蛋白，其分子质量约65kDa。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞——大肠杆菌，该宿主细胞包含编码本发明所述的Penharpin融合蛋白的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的Penharpin融合蛋白的DNA片断。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株，该菌株分类命名为Escherichia coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，即E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2008年5月13日，保藏编号：CCTCC No：M208071，该宿主细胞包含本发明所述的Penharpin融合蛋白的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)的构建方法。其步骤是：(1)南美白对虾Pen-2基因pen的扩增

上游引物PEN1：(SEQ ID No.3)

5′GTGAATTCTACAGGGGCGGTTACACA3′(下划线处为EcoR I位点)。

下游引物PEN2：(SEQ ID No.4)

5′GGTCTAGAAGAACCGCCAGATCCAGAGCCACCTCCTTTTACTAAGTGA3′(下划线处为Xba I位点)。

含Pen-2基因pen的质粒pGEM-T/Pen为模板，利用PCR仪扩增，获得230bp目的基因。

(2)重组质粒pGEM-T-pen的构建和鉴定

回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体(购于Promega公司)上，转化E.coli JM109(购于Promega公司)感受态细胞，涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司产品)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Promega公司产品)和100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定，DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T-pen。

(3)激发子Harpin基因hrp的扩增

上游引物HRP1：(SEQ ID No.5)

5’GGTCTAGAGGTGGCTCTGGATCTATGCGGGGTTCTCATCATCA 3’(下划线处为Xba I位点)。

下游引物HRP2：(SEQ ID No.6)

5’GGCTGCAGAAGCTTTCAGGCCACAGCCTGGTTAGTCTG 3’(下划线处为HindIII和PstI位点)。

含Harpin基因hrp的质粒pGEM-T-hrp为模板，利用PCR仪扩增，获得1281bp目的基因。

(4)重组质粒pGEM-T-hrp的构建和鉴定

回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司产品)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Promega公司产品)和100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定，DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T-hrp。

(5)重组质粒pGEM-T-pen-hrp的构建和鉴定

用Xba I、Pst I双酶切重组质粒pGEM-T-pen DNA，用胶回收试剂盒(Omega公司产品)回收、纯化目的3.2kb DNA片断。用Xba I、Pst I双酶切重组质粒pGEM-T-hrp DNA，用胶回收试剂盒回收、纯化目的1.2kb DNA片断。再将3.2kb DNA片断与1.2kb DNA片断连接，16℃连接15h后，产物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定。

(6)重组表达质粒pET-pen-hrp的构建和鉴定

用EcoR I、Hind III分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组质粒pGEM-T-pen-hrp DNA，分别用胶回收试剂盒回收、纯化目的DNA片断，再将1.4kb的pen-hrp DNA片断与pET-32a(+)DNA片断连接，16℃连接15h后，产物转化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)，34μg/mL氯霉素和15μg/mL卡那霉素的LB平板上，筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定，DNA测序分析鉴定重组质粒pET-pen-hrp。该菌株命名为大肠杆菌重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种利用大肠杆菌重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，表达Penharpin融合蛋白的方法。其步骤是：

(1)挑取单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)，34μg/mL氯霉素和15μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250r/min下振荡培养8-12h。4℃放置过夜。

(2)次日按4％接种量接入新鲜的含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)，34μg/mL氯霉素和15μg/mL卡那霉素2YT液体培养基中，在37℃下继续振荡培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG至终浓度为0.4mmoI/L，在37℃下诱导表达3-5h，4℃离心收集菌体。

(3)10％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种纯化Penharpin融合蛋白的方法。

(1)超声波破碎离心收集上清；

(2)采用His·Bind resin柱(Novagen公司产品)，按照Novagen公司操作手册纯化Penharpin融合蛋白；

(3)PBS缓冲液(pH7.3)透析处理纯化的Penharpin融合蛋白；

(4)10％SDS-PAGE电泳，激光扫描检测Penharpin融合蛋白纯度。

(5)采用Bradford assay法，测定纯化的Penharpin融合蛋白浓度。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

在本发明的一个实施方案中，检测了Penharpin融合蛋白抗细菌的生物活性。

采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。融合蛋白Penharpin具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抑菌活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Bibrio Parahemolyticus)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、大肠杆菌JM109(Escherichia coli JM109)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等有很好的抗菌活性。

在本发明的一个实施方案中，检测了Penharpin融合蛋白抗真菌的生物活性。

采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对真菌的活性。融合蛋白Penharpin对黑曲霉(Aspergillus niger)具有明显的抗菌活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL，对黑曲霉具有抑杀作用，抑杀率为47.7％。

在本发明的一个实施方案中，检测了Penharpin融合蛋白抗烟草花叶病毒感染的生物活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为2.0pmol/mL，融合蛋白Penharpin、激发子Harpin均可预防烟草花叶病毒(TMV)对烟草的侵染，并且融合蛋白Penharpin的对预防烟草花叶病毒(TMV)感染烟草的效果较激发子Harpin好。此外，融合蛋白Penharpin和激发子Harpin对TMV的感染也有一定的治疗效果，病情指数较对照降低，其相对防效分别为14.63％和13.93％，融合蛋白Penharpin的相对防效高于激发子Harpin。

在本发明的一个实施方案中，测定了Penharpin融合蛋白诱导烟草的过敏反应。

采用叶片穿刺法，测定融合蛋白Penharpin诱导烟草的过敏反应。融合蛋白Penharpin和激发子Harpin均能引起烟草的过敏反应，并且将融合蛋白Penharpin和激发子Harpin样品处理组相比较，融合蛋白Penharpin处理组所引发的过敏反应较激发子Harpin处理组的反应程度强，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)提取液样品处理组和PBS处理组均无反应。

在本发明的一个实施方案中，测定了融合蛋白Penharpin对防御性物质的诱导作用。

过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)都是植物防卫反应中起重要作用的酶，通过测定POD和SOD，确定融合蛋白Penharpin对烟草叶片中防御性物质POD和SOD的诱导作用。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为2.0pmol/mL。

烟草叶片POD活性在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第10h时达到峰值，约为初始值的1.8倍，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片POD的活性也在第10h达到峰值，约为初始值的1.5倍。PBS处理组的酶活无明显变化。融合蛋白Penharpin处理组与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的POD酶活在各个时间点均高于激发子Harpin处理组。

烟草叶片经过融合蛋白Penharpin喷施处理后，超氧化物歧化酶(SOD)的活性增加。SOD在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第6h时达到峰值，为初始值的1.5倍，然后逐渐回落，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片SOD的活性在第10h达到峰值，约为初始值的1.2倍。PBS处理组的酶活无明显的变化。与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的SOD酶活在较短时间内达到最大。

对虾肽Pen-2和激发子Harpin具有各自独特的生物学活性。对虾肽Pen-2对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒均具有明显的抗微生物感染活性。激发子Harpin能刺激植物产生自然的免疫机制，使得植物能抵抗一系列的细菌、真菌和病毒病害。激发子Harpin还具有促进植物生长和发育的功能。目前，激发子Harpin能够直接应用于植物病害防治(直接喷洒使用或构建多功能生防微生物)，也能够应用于转基因植物而具有广谱的抗病特性。但是，激发子Harpin在应用过程中，存在施药次数多、抗植物病害效果有待提高的问题。

至今为止，国内外未见对虾肽Pen-2在植物病害防治中应用的报道和文献。本发明所涉及的Penharpin融合蛋白同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性，在植物病害的防治中较单一的激发子Harpin的应用更有效，植物病害的防治效果更佳。同时，Penharpin融合蛋白的生产与对虾肽Pen-2、激发子Harpin的单独生产比较，降低了生产成本，也降低了植物病害防治的成本。

本发明的优点如下：

(1)采用基因工程技术，制备了Penharpin融合蛋白，Penharpin融合蛋白同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性，与单一的对虾肽Pen-2和激发子Harpin生物活性相比较，该融合蛋白具有更有效、广谱的生物活性。

(2)Penharpin融合蛋白的基因工程制备方法与其它方法如化学交联法相比，具有操作简单、表达量高、安全性高、成本低、有利于实现产业化生产。该方法的应用避免了化学交联法所存在的操作烦琐、交联效率低、产物不均一、蛋白质易失活、成本较高等缺陷。

(3)采用基因工程生产Penharpin融合蛋白，较单一生产对虾肽Pen-2和激发子Harpin，避免了重复劳动，降低了生产成本。

(4)在植物病害的防治应用中，Penharpin融合蛋白与单一的激发子Harpin的应用相比，对植物病害的防治效果更佳。

(5)在植物病害的防治应用中，Penharpin融合蛋白与激发子Harpin应用相比，减少了施药次数，降低了植物病害防治的成本。

Penharpin融合蛋白既具有对虾肽Pen-2的生物活性，又具有激发子Harpin的生物活性，是一种防治植物的病害、促进植物的生长、提高农作物产量的新型药物。

附图说明

本发明的上述和其它目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。

图1Pen-2基因pen的PCR扩增产物电泳图谱

Lane 1，LD2000 marker；lane 2，DNA fragments of pen were amplified by PCR.

图2重组质粒pGEM-T-pen的PCR和酶切鉴定图

Lane 1，LD2000 marker；lane 2，DNA fragments of pen were amplified by PCR；lane 3，recombinant pGEM-T-pen vector digested by EcoR I；lane 4，recombinant pGEM-T-pen vector digested by EcoR I/Xba I；lane 5，MarkerIII.

图3Harpin基因hrp的PCR扩增产物电泳图谱

Lane 1，Marker III；lane 2，DNA fragments of hrp were amplified by PCR.

图4重组质粒pGEM-T-hrp的PCR和酶切鉴定图

Lane 1，Marker III；lane 2，DNA fragments of hrp were amplified by PCR；lane 3，recombinant plasmid pGEM-T-hrp digested by Pst I；lane 4，recombinant plasmid pGEM-T-hrp digested by Pst I/Xba I.

图5重组质粒pGEMT-pen-hrp的PCR和酶切鉴定图

Lane 1，LD2000marker；lane 2，DNA fragments of pen were amplified by PCRwith PEN1 and PEN2；lane 3，DNA fragments of hrp were amplified by PCRwith HRP1 and HRP2；lane 4，DNA fragments of pen-hrp were amplified byPCR with PEN1 and HRP2；lane 5，recombinant plasmid pGEM-T-pen-hrpdigested by EcoR I；lane 6，recombinant plasmid pGEMT-pen-hrp digested byEcoR I/Hind III；lane 7，Marker III.

图6重组质粒pGEMT-pen-hrp的构建过程图

图7重组表达质粒pET-pen-hrp的PCR和酶切鉴定图

Lane 1，DL2000 marker；lane 2，DNA fragments of pen-hrp were amplifed byPCR with PEN 1and HRP2；Lane 3，recombinant pET-pen-hrp vector digestedby EcoR I/Hind III；lane 4，pET-pen-hrp vector digested by EcoR I；lane 5，Marker IV

图8重组表达质粒pET-pen-hrp的构建过程图

图910％SDS-PAGE检测融合蛋白Penharpin的表达

Lane 1，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)未诱导；lane 2，E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导前；lane 3，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a)诱导4h；lane 4，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导3h；lane 5，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导4h；lane 6，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导5h；lane 7，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导6h；lane 8，分子量标准；lane 9，纯化的融合蛋白Penharpin.

图10融合蛋白Penharpin在烟草叶片上诱导产生的过敏反应

1/6，Penharpin sample；2/5，harpin sample；3/4，PBS Buffer.

图11融合蛋白Penharpin诱导POD，POD活性测定

Time-course measurement of systemic activation of phenol peroxidase(POD)in tobacco leaves treated with protein Penharpin and Harpin.Control leaveswere treated with PBS.Plants were harvested at different time intervals afterthe beginning of treatment.

图12融合蛋白Penharpin诱导SOD，SOD活性测定

Time-course measurement of systemic activation of Superoxide dismutase(SOD)in tobacco leaves treated with protein Penharpin and Harpin.Controlleaves were treated with PBS.Plants were harvested at different time intervalsafter the beginning of treatment.

具体实施方式

通过结合下述具体实施例，阐明本发明。但是，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1南美白对虾Pen-2基因pen的扩增和克隆

1.扩增引物的设计和合成

为了使所表达的Pen-Harpin融合蛋白具有生物活性，具备正确的空间构象，设计对虾肽Pen-2和Harpin蛋白之间连接肽为“GGSGSGGSSRGGSGS”。

根据对虾肽Pen-2基因pen序列和连接肽“GGSGSGGSSRGGSGS”的核苷酸序列，设计一对引物PEN1和PEN2，PEN1和PEN2的核苷酸序列分别为：

上游引物PEN1：(SEQ ID No.3)

5′GTGAATTCTACAGGGGCGGTTACACA3′(下划线处为EcoR I位点)。

下游引物PEN2：(SEQ ID No.4)

引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。

2.目的基因pen的PCR扩增

以PEN 1和PEN2为引物，含Pen-2基因pen的质粒pGEM-T/Pen为模板，PCR扩增含有连接肽核苷酸序列的pen DNA片断，其5’端和3’端分别含有EcoR I和Xba I酶切位点。PCR反应体系：10×reaction buffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上游引物P1，1μL；20pmol下游引物P2，1μL；5U/μL Taq DNA聚合酶1μL；模板6μL；加无菌水至终体积为50μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，30s；53℃，45s；72℃30s(35个循环)；72℃，5min。

琼脂糖凝胶电泳结果如附图1所示。PCR扩增目的基因pen产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察，有一约为230bp DNA带，与目的基因pen结果相符。

3.南美白对虾pen基因的克隆

(1)目的基因pen片段的回收

采用DNA胶回收试剂盒(Omega公司产品)，按照Omega公司DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段。具体操作步骤如下：

①PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。

②在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。

③将融解的样品加入层析柱中，12000rpm离心1min，弃去液体。

④加300μL Binding Buffer，离心弃去液体。

⑤加750μL Washing Buffer，离心弃去液体。

⑥重复步骤(5)，1次。

⑦空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。

⑧将柱子放于1.5mL Eppendorf管，加入30μL Elution buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min，收集离心液，贮存于-20℃。

(2)目的基因pen片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T-pen

将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T载体，pGEM-T载体购自Promega公司。反应体系为：2×Ligation buffer，5.0μL；pGEM-T载体，0.5μL；PCR产物，4.0μL；T4DNA ligase，0.5μL；无加菌ddH2O至10μL。在冰上混合上述液体，16℃连接15h。

(3)质粒的转化

①感受态细胞的制备：采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。挑取单个E.coli JM109菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mL LB培养液中，37℃，220rpm振荡，待菌液OD值为0.6时，取1.5mL菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4,000rpm离心10min，弃上清。加入800μL冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4,000rpm离心10min，弃上清。加入100μL冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，4℃保存，7～10天内使用。

②质粒转化E.coli JM109感受态细胞：取上述连接产物10μL加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入390μL新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。取100μL菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司产品)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，，Promega公司产品)和Amp抗性的LB平板上，37℃培养过夜，观察结果，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR和酶切鉴定。

(4)重组质粒pGEM-T-pen的鉴定

随机挑取10个单克隆白斑，扩大培养后用质粒提取试剂盒(Qiagen公司产品)抽提质粒。以质粒pGEM-T-pen为模板，表明用引物PEN1、PEN2扩增出与预测结果相符的片断，目的基因pen已克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果见附图2。重组质粒pGEM-T-pen经EcoRI和Xba I双酶切，得到约3000bp和230bp的预期DNA片断，pGEM-T-pen经EcoRI单酶切，得到单一约3230bp的预期DNA片断。

(5)pen核苷酸序列测定

质粒pGEM-T-pen DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pGEM-T-pen质粒经全自动测序分析，pen基因核苷酸序列为：

tacaggggcg gttacacagg cccgataccc aggccaccac ccattggaag accaccgttc 60

agacctgttt gcaatgcatg ctacagactt tccgtctcag atgctcgcaa ttgctgcatc 120

aagttcggaa gctgttgtca cttagtaaaa gga 153

实施例2激发子Harpin基因hrp的扩增和克隆

1.扩增引物的设计和合成

根据激发子Harpin基因hrp序列和连接肽“GGSGSGGSSRGGSGS”的核苷酸序列，设计一对引物HRP1和HRPP2，HRP1和HRPP2的核苷酸序列分别为：

上游引物HRP1：(SEQ ID No.5)

下游引物HRP2：(SEQ ID No.6)

引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。

2.目的基因hrp的PCR扩增

以HRP1和HRPP2为引物，含激发子Harpin基因hrp的质粒pGEM-T-hrp为模板，PCR扩增含有连接肽核苷酸序列的hrp DNA片断，其5’端含有XbaI酶切位点。3’端含有HindIII和PstI酶切位点。PCR反应体系：10×reactionbuffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上游引物P1，1μL；20pmol下游引物P2，1μL；5U/μL Taq DNA聚合酶1μL；模板6μL；加无菌水至终体积为50μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，30s；53℃，45s；72℃30s(35个循环)；72℃，5min。

琼脂糖凝胶电泳结果如附图3所示。PCR扩增目的基因hrp产物经0.7％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察，有一约为1281bp DNA带，与目的基因hrp产物结果相符。

3.目的基因hrp的克隆

(1)目的基因hrp片段的回收

方法同实施例1。

(2)目的基因hrp片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T-hrp

(3)质粒的转化

方法同实施例1。

(4)重组质粒pGEM-T-hrp的鉴定

随机挑取10个单克隆白斑，扩大培养后用质粒提取试剂盒(Qiagen公司产品)抽提质粒。以质粒pGEM-T-hrp为模板，结果表明用引物HRP1、HRP2扩增出与预测结果相符的片断，目的基因已克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果见附图4。重组质粒pGEM-T-hrp经Xba I和Pst I双酶切，得到约3000bp和1281bp的预期DNA片断，pGEM-T-hrp经Pst I单酶切，得到单一约4281bp的预期DNA片断。

(5)hrp核苷酸序列测定

质粒pGEM-T-hrp DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pGEM-T-hrp质粒经全自动测序分析，hrp核苷酸序列为：

atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60

atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatccaa cccttatgca gagtctcagt 120

cttaacagca tgagttcgtt gcaaacctct gcatcattgt tccccgtgtc gctcaacagc 180

gatgtgagcg ccaacaccag cacttccagc aaagagctca aggctgtgat cgatcagctg 240

gttcaggcgc tgacccaaag tgggcagctc gatgaaacct caccgctcgg caaaatgctc 300

gccaaggcca tggctgcgga tggcaagtcg gctaacagca tcgatgacat cactgcatcg 360

ctcgacaagc tgatccacga aaagctcggc aacaatttcg gtgcctctgc cggcatcggc 420

gcgggtggcg gtggcggtgg cattggcggg gcgggttctg gttcgggtgt cggtggcggt 480

ctgagcagcg acgcgggtgc cgggcaatcc gatctgatga gccaggtcct gaacggcctc 540

ggcaaagccg tgctggacga tctgctgaca ccgagtggtg aaggcggaac aaccttttcc 600

agtgatgaca tgccgaccct ggaaaaagtc gcccggttca tggacgacaa caaggcccag 660

ttccctactc gggacggcgg ctcgtggatg aacgagctga aggaagacaa tggcctgtat 720

gcacaggaaa ccgctcagtt tcgttcggct ctcgacgtca ttggtcaaca gctcggccag 780

caacaaggtg atgccagtgg cgttaccagt ggcggcggtc tgggttcgcc cgtgagtgac 840

agctccctgg gtaatcctgc aatcgatgcc aacacaggtc ccgcggccaa tggcaatgcc 900

agcgtcgacg taggtcaact gatcggtcaa ctcatcgacc gtggtttgca gtcggtttcg 960

tcgggtggcg gtctgggtac accggtcgac aattccacgc agccgacagg tggcacgcca 1020

gcggctaacc cgacgggcaa cgtgtccaat caggacctgg gtcaactgct gaacggcttg 1080

ctgcaacgcg ggctggaagc gacgcttcag gatgctggca acaccggcgc cgacctgcaa 1140

tcgagcgctg cgcaagtggc agctcagctg atcaatgcgc tgttgcaagg caccaataac 1200

cagactaacc aggctgtggc ctga 1224

实施例3pen-hrp融合基因的合成和基因工程菌株

E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)的构建

1.重组质粒pGEM-T-pen-hrp的构建和鉴定

用XbaI、Pst I双酶切重组质粒pGEM-T-pen DNA，用胶回收试剂盒回收、纯化目的3.2kb DNA片断。用XbaI、Pst I双酶切重组质粒pGEM-T-hrpDNA，用胶回收试剂盒回收、纯化目的1.2kb DNA片断。再将3.2kb DNA片断与1.2kb DNA片断连接，16℃连接15h后，产物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养过夜。

随机挑取10个阳性克隆，经扩大培养后，用质粒提取试剂盒抽提质粒，采用PCR和Xba I、Pst I酶切鉴定重组质粒pGEM-T-pen-hrp。以质粒pGEM-T-pen-hrp为模板，用引物PEN1、PEN2、HRP1和HRP2扩增出与预测结果相符的片断，表明目的基因pen-hrp已按照分子设计要求克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果如附图5。重组质粒pGEM-T-pen-hrpDNA经EcoRI+HindIII双酶切，得到约3.0kb和1.4kb的二个DNA片断，pGEM-T-pen-hrp DNA经EcoRI单酶切，得到单一约4422bp的DNA片断。

重组质粒pGEM-T-pen-hrp的构建过程如附图6。

3.重组表达质粒pET-pen-hrp的构建和鉴定

用EcoR I、Hind III分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组质粒pGEM-T-pen-hrp DNA，分别用胶回收试剂盒回收、纯化目的DNA片断，再将1.4kb的pen-hrp DNA片断与pET-32a(+)DNA片断连接，16℃连接15h后，产物转化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)，34μg/mL氯霉素和15μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。

随机挑取10个阳性克隆，经扩大培养后，用质粒提取试剂盒抽提质粒，PCR和EcoR I、Hind III酶切鉴定pET-pen-hrp重组表达质粒。以质粒pET-pen-hrp为模板，用引物PEN1、PEN2、HRP1和HRP2扩增出与预测结果相符的片断，表明目的基因已克隆入pET-32a(+)载体中。PCR与酶切鉴定结果如附图7。重组质粒pET-pen-hrp DNA经EcoRI+HindIII双酶切，得到约5875bp和1422bp的二个DNA片断，pET-pen DNA经EcoRI单酶切，得到单一约7297bp的DNA片断。

重组表达质粒pET-pen-hrp的构建过程如附图8。

4.pen-hrp融合基因核苷酸序列测定

质粒pET-pen-hrp DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pET-pen-hrp质粒经全自动测序分析，结果表明6个His序列融合在pen基因前，pET-pen-hrp质粒在从5’到3’方向上依次含有pen基因、GGSGSGGSSRGGSGS连接肽编码序列和hrp基因，融合蛋白序列阅读框没有移码。

pen-hrp融合基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。其中，融合蛋白编码区为第1-1422位，pen编码区为1-153，hrp编码区为199-1422，GGSGSGGSSRGGSGS连接肽编码区为154-198。该融合基因所编码的融合蛋白Penharpin的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共473个氨基酸。

上述所构建的含有质粒pET-pen-hrp的菌株为E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，菌种保藏号CCTCCM208071。

实施例4基因工程融合蛋白Penharpin的表达

挑取用甘油保存的菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，接种于含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mLkanamycin(sulfate)的LB液体培养基中，37℃，250r/min下振荡培养8-12h。次日按4％接种量接入新鲜含100μg/mL Ampicillin，34μg/mLchloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液体培养基中，37℃培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG(终浓度为0.4mM)，37℃下诱导表达，诱导后3h，4h，5h，6h分别取样，离心沉淀，去上清，加入300μLPBS(PH6.9)缓冲液，超声波破碎，12,000g离心10min，上清加入5×SDS-PAGE样品缓冲液，参照《分子克隆》进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250染色检测分析表达结果。结果如附图9所示。10％SDS-PAGE电泳结果表明在IPTG诱导后基因工程菌株能够表达融合蛋白Penharpin，表达产物分子量与预期相符，约为65kDa。

实施例5融合蛋白Penharpin的纯化

(1)挑取用甘油保存的菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，接种于含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液体培养基中，37℃，250r/min下振荡培养8-12h。次日按4％接种量接入新鲜含100μg/mL Ampicillin，34g/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液体培养基中，37℃培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG(终浓度为0.4mM)，37℃下诱导表达，诱导表达4h后，5000g离心收集菌体。

(2)重悬于Binding Buffer pH7.920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L NaCl中，4℃，进行超声波破碎菌处理(处30min，每次10s，间隔30s)。12,000g离心20min两次，收集上清，上清即为Penharpin融合蛋白的提取液。

(3)Ni⁺⁺柱层析样品处理：Penharpin融合蛋白的提取液经0.45μm的滤膜过滤，用1×Binding Buffer定容至100ml Ni⁺⁺柱层析样品。用10床1×Binding Buffer，20床无菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer(5mMNiSO4)，结合Ni⁺⁺；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床后，备用(1床即是柱内介质的体积)。样品经蠕动泵以循环方式通过Ni⁺⁺柱，使带有6×His的蛋白样品流动相充分与Ni⁺⁺柱中的Ni⁺⁺相结合，过夜后从Ni⁺⁺柱出口收集未与Ni⁺⁺结合的样品(穿漏液)。分别采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni++柱结合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer(1M咪唑+0.5MNaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗脱与Ni++柱结合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。Ni++柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗样柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(100mM EDTA+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗柱子。通过SDS-PAGE检验目的蛋白在洗脱液中的分布，参照《分子克隆》进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250染色检测分析表达结果。结果如附图9所示。纯化样品经10％SDS-PAGE检测，有约为65kDa的单一条带。

实施例6融合蛋白Penharpin纯化样品中蛋白质含量的确定

将15mL经Ni⁺⁺柱洗脱、收集的融合蛋白Penharpin纯化样品装入经处理的透析袋中，放入盛有1000mL PBS缓冲液(PH6.9)烧杯中透析、过夜。以上操作均在4℃进行。用Bradford法确定融合蛋白Penharpin含量，用mg/mL标定。

Bradford法具体操作如下：

(1)将0、1、2、3、4、5、6μL 1mg/ml牛血清白蛋白(B SA)标准溶液依次加入酶标微孔板中，用PBS补足50μL。

(2)向每孔中加入200μL Bradford试剂工作液(0.1％考马斯亮蓝G250，5％乙醇，8.5％磷酸)。振荡、混匀后，室温放置2分钟。

(3)用酶标仪测B SA蛋白各浓度的OD570值(λ＝570nm)。以BSA蛋白质浓度为横坐标，以BSA蛋白各浓度的OD570值为纵坐标制作标准曲线。

(4)用同样方法测定样品的OD570值，用标准曲线中确定样品的浓度。

实施例7融合蛋白Penharpin抗细菌的生物活性

采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。实验菌种包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Bibrio Parahemolyticus)、大肠杆菌JM109(Escherichia coli JM109)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)(中国典型培养物保藏中心提供)。培养细菌至对数生长期，测OD₆₀₀，将菌浓度调整到2-7×10⁵CFU/ml。用无菌微量加样器向无菌96孔微孔板中加入待测样品50μL，用肉汤培养基倍比稀释，再向各孔中加入50μL菌液，混匀，37℃培养12h。同时设阳性(氨苄青霉素，Amp)对照组、空白对照组。各孔分别加入5mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液10μL，继续培养4h。向各孔中加入90μL DMSO，混匀并使蓝色晶体充分溶解于DMSO中，测量OD₅₇₀。细菌存活率按下列公式计算。

细菌存活率＝(A₅₇₀样品处理/A₅₇₀空白处理)×100％。

融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌的活性测定结果见表1。细菌存活率表明融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有不同程度的抗细菌活性，对多种细菌均有一定的抑杀作用。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL，对金黄色葡萄球菌的抑杀率为22.8％、短小芽孢杆菌的抑杀率为40.4％、苏云金芽孢杆菌的抑杀率为31.2％、枯草芽孢杆菌的抑杀率为47.4％、溶藻弧菌的抑杀率为23.4％、副溶血弧菌的抑杀率为28.4％、大肠杆菌JM109的抑杀率为56.3％、铜绿假单胞菌的抑杀率为38.5％、鼠伤寒沙门氏菌的抑杀率为43.8％。

表1融合蛋白Penharpin抗细菌活性测定

实施例8融合蛋白Penharpin抗真菌的生物活性

采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对真菌的活性。实验菌种——黑曲霉(Aspergillus niger)(中国典型培养物保藏中心提供)。28℃培养黑曲霉7天至长出孢子。用无菌水冲洗培养基表面，获得孢子悬液，将孢子浓度调整到2-7×10⁵spores/mL。用无菌微量加样器向无菌96孔微孔板中加入待测样品50μL，用查氏培养基(查氏培养基200mL：NaNO₃ 0.4g，K₂HPO₄ 0.2g，KCl 0.1g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.004g，蔗糖6g)倍比稀释，再向各孔中加入50μL孢子悬液，混匀，28℃培养18h。同时设阳性(两性霉素，AmB)对照组、空白对照组。各孔分别加入5mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液10μL，继续培养4h。向各孔中加入90μL DMSO，混匀并使蓝色晶体充分溶解于DMSO中，测量OD₅₇₀。真菌存活率按下列公式计算。

真菌存活率＝(A₅₇₀样品处理/A₅₇₀空白处理)×100％。

融合蛋白Penharpin对黑曲霉的活性测定结果见表2。黑曲霉菌存活率表明融合蛋白Penharpin对黑曲霉具有明显的抗菌活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL，对黑曲霉具有抑杀作用，抑杀率为47.7％。

表2融合蛋白Penharpin抗真菌活性测定

实施例9融合蛋白Penharpin抗烟草花叶病毒感染的生物活性

1.烟草花叶病毒(TMV)样品的制备

取适量感染烟草花叶病毒(TMV)的烟草叶片，剪碎。将剪碎的叶片放入研钵中，加入少量的石英砂和0.2M PBS，在冰浴中彻底研磨。将研磨好的叶片组织离心，4℃4000rpm离心30min。取上清即为病毒粗提液。配置20％的蔗糖溶液。将20％蔗糖溶液加至离心管底层，将粗提纯的病毒悬浮液加在最上层。20,000g离心60min，弃上清液，取沉淀。沉淀充分悬浮于0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)中，12,000rpm离心20min，取上清液。将20％蔗糖溶液加至离心管底层，上清液加在最上层。20,000g离心60min，弃上清液，取沉淀。沉淀充分悬浮于0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)中，12,000rpm离心20min，取上清液。上清液20,000g离60min，取沉淀。沉淀悬浮于适量0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)中，即为纯化的TMV病毒样品。在透射电镜下观察所获得的烟草花叶病毒(TMV)。

2.融合蛋白Penharpin对烟草花叶病毒(TMV)感染的预防作用

取长势一致的盆栽烟草植株，随机分为三组(A、B、C)，每组9个样本。A、B、C各组分别涂抹PBS、2pmol/mL激发子Harpin样品和2pmol/mL融合蛋白Penharpin样品。涂抹各样品5天后，以常规摩擦接种法接种TMV。接种后观察记录样本的发病情况。

烟草对烟草花叶病毒(TMV)感染按下述标准分级别：

(1)0级：无任何症状

(2)1级：明脉或心叶有轻微花叶

(3)3级：心叶及中部叶片花叶

(4)5级：心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形，皱缩或植株轻度矮化

(5)7级：重花叶，多数叶片畸形，皱缩或植株明显矮化

(6)9级：重花叶，畸形，植株明显矮化甚至死亡

烟草对烟草花叶病毒(TMV)感染的发病率、病情指数、相对防效分别按下列公式计算。

发病率(％)＝(各处理样本发病数/各处理总样本数)×100

病情指数＝∑(病级数×病样本数)/(最高病级×各处理总样本数)×100

相对防效(％)＝[(对照平均病情指数一处理平均病情指数)/对照平均病情指数]×100

融合蛋白Penharpin对烟草花叶病毒(TMV)感染的预防作用试验结果见表3。涂抹融合蛋白Penharpin、激发子Harpin 5d后，再接种TMV，则烟草植株的病情指数和发病率均较PBS对照有较大幅度的减少，相对防效分别为76.6％和38.7％，发病率分别减少了70％和33.3％。结果表明融合蛋白Penharpin、激发子Harpin均可预防烟草花叶病毒(TMV)对烟草的侵染，并且融合蛋白Penharpin的对预防烟草花叶病毒(TMV)感染烟草的效果较激发子Harpin好。

表3融合蛋白Penharpin对烟草花叶病毒感染的预防作用测定

3.融合蛋白Penharpin对烟草感染烟草花叶病毒(TMV)的治疗作用

取长势一致的盆栽烟草植株，随机分为三组(A、B、C)，每组9个样本。等量接种TMV。接种5d后，A、B、C各组分别涂抹PB S、2pmol/mL激发子Harpin样品和2pmo1/mL融合蛋白Penharpin样品。接种后观察并记录发病情况。TMV感染分级别标准、发病率，病情指数和相对防效的计算方法同上述2。

融合蛋白Penharpin对感染烟草花叶病毒(TMV)的烟草的治疗作用试验结果见表4。试验结果表明，融合蛋白Penharpin和激发子Harpin对TMV的感染均有一定的治疗效果，病情指数较对照降低，其相对防效分别为14.6％和14.0％，融合蛋白Penharpin对治疗感染TMV的烟草的相对防效略高于激发子Harpin。

表4融合蛋白Penharpin对烟草感染烟草花叶病毒的治疗作用测定

实施例10融合蛋白Penharpin诱导烟草的过敏反应测定

采用叶片穿刺法测定融合蛋白Penharpin诱导烟草的过敏反应。不锈钢毫针用酒精棉球擦拭，并在酒精灯上灼烧，待冷却后在烟叶叶面穿刺小孔，将处理好的样品20μl，分别点加在上述小孔上，控制水渍斑直径为2cm，标明各孔处理。采用重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)经诱导表达，制备融合蛋白Penharpin的提取液样品。以E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-hrp)经诱导表达，制备激发子Harpin提取液样品。设E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)经诱导表达所制备的提取液样品，以及PBS(5mmol/L，pH6.5)为对照。穿刺处分别点上述融合蛋白Penharpin的提取液样品、激发子Harpin提取液样品、E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)提取液样品和PBS样品。将烟草置20℃-25℃温室培养，分别于12h、24h、36h和48h后观察叶片反应及反应程度。

12h后，融合蛋白Penharpin和激发子Harpin样品穿刺点样的孔周围出现萎缩，24h后出现塌陷，36h后出现枯斑，而对照PBS无此现象。融合蛋白Penharpin在烟草叶片上诱导产生的过敏反应结果见图10。试验结果表明融合蛋白Penharpin和激发子Harpin均能引起烟草的过敏反应。将融合蛋白Penharpin和激发子Harpin样品处理组相比较，融合蛋白Penharpin处理组所引发的过敏反应较激发子Harpin处理组的反应程度强，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)提取液样品处理组和PBS处理组均无反应。

实施例11融合蛋白Penharpin对防御性物质的诱导作用

过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)都是植物防卫反应中起重要作用的酶，通过测定POD和SOD，确定融合蛋白Penharpin对烟草叶片中防御性物质POD和SOD的诱导作用。

1.样品处理

取三株健康的烟草，并分别涂抹三组样品：A，PBS缓冲液；B，2pmol/mL激发子Harpin样品；C，2pmol/mL融合蛋白Penharpin。在涂抹后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h，采集烟叶叶片样品，称重，置于EP管中，-20℃保存备用。

2.过氧化物酶(POD)活性的测定

参照Hydo方法进行(Hydo H et al.1971)。向样品EP管中加入100μl50mM pH6.8 PBS研磨。4℃，12000rpm离心5min，上清即为酶粗提液。反应体系为：15μl酶粗提液，300μl 0.3％H2O2，285μl 0.2％愈创木酚，300μl0.1M pH6.8 PBS。所设对照不加酶，加pH6.8 PBS。25℃水浴10min，反应后立即冰浴，加300μl 20％三氯乙酸终止反应。测OD450，并记录。

烟草叶片经过融合蛋白Penharpin涂抹处理后，过氧化物酶(POD)活性增加。过氧化物酶(POD)活性测定结果见图11。烟草叶片POD活性在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第10h时达到峰值，约为初始值的1.8倍，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片POD的活性也在第10h达到峰值，约为初始值的1.5倍。PBS处理组的酶活无明显变化。融合蛋白Penharpin处理组与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的POD酶活在各个时间点均高于激发子Harpin处理组。

3.超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

采用NBT(氯化硝基氮兰四唑)光还原反应法，测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性。向样品EP管中加入100μl 50mM pH7.8 PBS缓冲液研磨。4℃ 12000rpm离心5min。上清即为酶粗提液。反应体系为：10μl酶粗提液；60μl 220mM甲硫氨酸；60μl 1.25mM NBT；60μl 0.33mM核黄素；810μl pH7.8 PBS。所设对照不加酶，加pH7.8 PBS缓冲液。25℃，4000lux光照下反应20min，反应后立即黑暗终止反应。测OD570，并记录。

烟草叶片经过融合蛋白Penharpin涂抹处理后，超氧化物歧化酶(SOD)的活性增加。融合蛋白Penharpin诱导SOD，SOD活性测定结果见图12。SOD在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第6h时达到峰值，为初始值的1.5倍，然后逐渐回落，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片SOD的活性在第10h达到峰值，约为初始值的1.2倍。PBS处理组的酶活无明显的变化。与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的SOD酶活在较短时间内达到最大。

SEQUENCE LISTING

(1)一般信息：

(i)发明名称：融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

(ii)序列数目：6

(2)SEQ ID No.1的信息：

<110>武汉大学

<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

<130>融合蛋白Penharpin核苷酸序列

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1422

<212>DNA

<213>重组DNA

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1422)

<223>

<220>

<221>pen gene

<222>(1)..(153)

<223>

<220>

<221>linker DNA

<222>(154)..(198)

<223>

<220>

<221>hrp gene

<222>(199)..(1422)

<223>

<400>1

tac agg ggc ggt tac aca ggc ccg ata ccc agg cca cca ccc att gga 48

Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly

1 5 10 15

aga cca ccg ttc aga cct gtt tgc aat gca tgc tac aga ctt tcc gtc 96

Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val

20 25 30

tca gat gct cgc aat tgc tgc atc aag ttc gga agc tgt tgt cac tta 144

Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys Phe Gly Ser Cys Cys His Leu

35 40 45

gta aaa gga ggt ggc tct gga tct ggc ggt tct tct aga ggt ggc tct 192

Val Lys Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ser Arg Gly Gly Ser

50 55 60

gga tct atg cgg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc 240

Gly Ser Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser

65 70 75 80

atg act ggt gga cag caa atg ggt cgg gat ctg tac gac gat gac gat 288

Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp

85 90 95

aag gat cca acc ctt atg cag agt ctc agt ctt aac agc atg agt tcg 336

Lys Asp Pro Thr Leu Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Met Ser Ser

100 105 110

ttg caa acc tct gca tca ttg ttc ccc gtg tcg ctc aac agc gat gtg 384

Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser Leu Asn Ser Asp Val

115 120 125

agc gcc aac acc agc act tcc agc aaa gag ctc aag gct gtg atc gat 432

Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu Lys Ala Val Ile Asp

130 135 140

cag ctg gtt cag gcg ctg acc caa agt ggg cag ctc gat gaa acc tca 480

Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser

145 150 155 160

ccg ctc ggc aaa atg ctc gcc aag gcc atg gct gcg gat ggc aag tcg 528

Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala Ala Asp Gly Lys Ser

165 170 175

gct aac agc atc gat gac atc act gca tcg ctc gac aag ctg atc cac 576

Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu Asp Lys Leu Ile His

180 185 190

gaa aag ctc ggc aac aat ttc ggt gcc tct gcc ggc atc ggc gcg ggt 624

Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly

195 200 205

ggc ggt ggc ggt ggc att ggc ggg gcg ggt tct ggt tcg ggt gtc ggt 672

Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Gly

210 215 220

ggc ggt ctg agc agc gac gcg ggt gcc ggg caa tcc gat ctg atg agc 720

Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln Ser Asp Leu Met Ser

225 230 235 240

cag gtc ctg aac ggc ctc ggc aaa gcc gtg ctg gac gat ctg ctg aca 768

Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu Asp Asp Leu Leu Thr

245 250 255

ccg agt ggt gaa ggc gga aca acc ttt tcc agt gat gac atg ccg acc 816

Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser Asp Asp Met Pro Thr

260 265 270

ctg gaa aaa gtc gcc cgg ttc atg gac gac aac aag gcc cag ttc cct 864

Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn Lys Ala Gln Phe Pro

275 280 285

act cgg gac ggc ggc tcg tgg atg aac gag ctg aag gaa gac aat ggc 912

Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp Met Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Gly

290 295 300

ctg tat gca cag gaa acc gct cag ttt cgt tcg gct ctc gac gtc att 960

Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser Ala Leu Asp Val Ile

305 310 315 320

ggt caa cag ctc ggc cag caa caa ggt gat gcc agt ggc gtt acc agt 1008

Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala Ser Gly Val Thr Ser

325 330 335

ggc ggc ggt ctg ggt tcg ccc gtg agt gac agc tcc ctg ggt aat cct 1056

Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser Ser Leu Gly Asn Pro

340 345 350

gca atc gat gcc aac aca ggt ccc gcg gcc aat ggc aat gcc agc gtc 1104

Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Ala Ala Asn Gly Asn Ala Ser Val

355 360 365

gac gta ggt caa ctg atc ggt caa ctc atc gac cgt ggt ttg cag tcg 1152

Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly Gln Leu Ile Asp Arg Gly Leu Gln Ser

370 375 380

gtt tcg tcg ggt ggc ggt ctg ggt aca ccg gtc gac aat tcc acg cag 1200

Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val Asp Asn Ser Thr Gln

385 390 395 400

ccg aca ggt ggc acg cca gcg gct aac ccg acg ggc aac gtg tcc aat 1248

Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala Ala Asn Pro Thr Gly Asn Val Ser Asn

405 410 415

cag gac ctg ggt caa ctg ctg aac ggc ttg ctg caa cgc ggg ctg gaa 1296

Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu Gln Arg Gly Leu Glu

420 425 430

gcg acg ctt cag gat gct ggc aac acc ggc gcc gac ctg caa tcg agc 1344

Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala Asp Leu Gln Ser Ser

435 440 445

gct gcg caa gtg gca gct cag ctg atc aat gcg ctg ttg caa ggc acc 1392

Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ala Leu Leu Gln Gly Thr

450 455 460

aat aac cag act aac cag gct gtg gcc tga 1422

Asn Asn G1n Thr Asn Gln Ala Val Ala

465 470

<210>2

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Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly

1 5 10 15

Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val

20 25 30

Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys Phe Gly Ser Cys Cys His Leu

35 40 45

Val Lys Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ser Arg Gly Gly Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser Leu Asn Ser Asp Val

115 120 125

Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu Lys Ala Val Ile Asp

130 135 140

Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser

145 150 155 160

Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala Ala Asp Gly Lys Ser

165 170 175

Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu Asp Lys Leu Ile His

180 185 190

Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly

195 200 205

Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Gly

210 215 220

Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln Ser Asp Leu Met Ser

225 230 235 240

Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu Asp Asp Leu Leu Thr

245 250 255

Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser Asp Asp Met Pro Thr

260 265 270

Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn Lys Ala Gln Phe Pro

275 280 285

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Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser Ala Leu Asp Val Ile

305 310 315 320

Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala Ser Gly Val Thr Ser

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Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser Ser Leu Gly Asn Pro

340 345 350

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370 375 380

Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val Asp Asn Ser Thr Gln

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Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu Gln Arg Gly Leu Glu

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Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala Asp Leu Gln Ser Ser

435 440 445

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(3)SEQ ID No.2的信息：

<110>武汉大学

<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

<130>融合蛋白Penharpin氨基酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>473

<212>PRT

<213>多肽

<220>

<221>Penharpin PEPTIDE

<222>(1)..(473)

<223>

<220>

<221>Pen-2PEPTIDE

<222>(1)..(51)

<223>

<220>

<221>linker PEPTIDE

<222>(52)..(66)

<223>

<220>

<221>Harpin PEPTIDE

<222>(67)..(473)

<223>

<400>1

Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly

1 5 10 15

Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val

20 25 30

Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys Phe Gly Ser Cys Cys His Leu

35 40 45

Val Lys Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ser Arg Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser

65 70 75 80

Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp

85 90 95

Lys Asp Pro Thr Leu Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Met Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser Leu Asn Ser Asp Val

115 120 125

Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu Lys Ala Val Ile Asp

130 135 140

Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser

145 150 155 160

Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala Ala Asp Gly Lys Ser

165 170 175

Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu Asp Lys Leu Ile His

180 185 190

Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly

195 200 205

Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Gly

210 215 220

Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln Ser Asp Leu Met Ser

225 230 235 240

Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu Asp Asp Leu Leu Thr

245 250 255

Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser Asp Asp Met Pro Thr

260 265 270

Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn Lys Ala Gln Phe Pro

275 280 285

Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp Met Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Gly

290 295 300

Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser Ala Leu Asp Val Ile

305 310 315 320

Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala Ser Gly Val Thr Ser

325 330 335

Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser Ser Leu Gly Asn Pro

340 345 350

Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Ala Ala Asn Gly Asn Ala Ser Val

355 360 365

Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly Gln Leu Ile Asp Arg Gly Leu Gln Ser

370 375 380

Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val Asp Asn Ser Thr Gln

385 390 395 400

Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala Ala Asn Pro Thr Gly Asn Val Ser Asn

405 410 415

Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu Gln Arg Gly Leu Glu

420 425 430

Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala Asp Leu Gln Ser Ser

435 440 445

Ala Ala Gin Val Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ala Leu Leu Gln Gly Thr

450 455 460

Ash Ash Gln Thr Asn Gln Ala Val Ala

465 470

(4)SEQ ID No.3的信息：

<110>武汉大学

<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

<130>引物PEN1核苷酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>1

gtgaattcta caggggcggt tacaca 26

(5)SEQ ID No.4的信息：

<110>武汉大学

<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

<130>引物PEN2核苷酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>1

ggtctagaag aaccgccaga tccagagcca cctcctttta ctaagtga 48

(6)SEQ ID No.5的信息：

<110>武汉大学

<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

<130>引物HRP1核苷酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>43

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>1

ggtctagagg tggctctgga tctatgcggg gttctcatca tca 43

(7)SEQ ID No.6的信息：

<110>武汉大学

<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途

<130>引物HRP2核苷酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>38

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>1

ggctgcagaa gctttcaggc cacagcctgg ttagtctg 38

Claims

1.一种融合蛋白Penharpin，其特征在于，该蛋白具有对虾肽Pen-2的氨基酸序列、激发子Harpin的氨基酸序列、以及位于对虾肽Pen-2的氨基酸序列与激发子Harpin的氨基酸序列之间的连接肽序列。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述的连接肽序列由1-20个氨基酸构成。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白Penharpin，其特征在于：所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种分离的DNA分子，其特征在于：该DNA分子编码权利要求1所述的融合蛋白Penharpin。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

6.一种载体，其特征在于包含权利要求4所述的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于包括重组表达质粒载体pET-pen-hrp。

8.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求6所述的载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于包括一种重组基因工程菌株Escherichia coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，CCTCC No：M208071。

10.一种产生权利要求1所述的融合蛋白Penharpin的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

培养权利要求8所述的宿主细胞，在能表达所述的融合蛋白条件，其中包括诱导或非诱导条件下，表达所述的融合蛋白Penharpin，然后分离、纯化该融合蛋白Penharpin。

11.一种药物组合物，其特征在于该组合物包含有效剂量的权利要求1所述的融合蛋白Penharpin。

12.权利要求1所述的融合蛋白Penharpin或权利要求11所述的药物组合物在防治植物病害中的应用。

13.一种融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗细菌感染的药物中的应用。

14.一种融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗真菌感染的药物中的应用。

15.一种融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗病毒感染的药物中的应用。