CN101283279A

CN101283279A - 以cdca1-kntc2复合物为靶标的筛选和nsclc治疗方法

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Publication number: CN101283279A
Application number: CNA200680035270XA
Authority: CN
Inventors: 中村佑辅; 醍醐弥太郎; 中鹤修一
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2008-10-08
Also published as: US7943295B2; JP5150855B2; WO2007013480A3; US20110263012A1; EP1915622A2; WO2007013480A2; US20090215683A1; JP2009505633A

Abstract

本发明基于如下的观察，即CDCA1和KNTC2共激活以及它们的关连相互作用(cognate interaction)在肺癌发展中发挥重要作用，并且抑制该复合物的方法可用于治疗非小细胞肺癌。

Description

以CDCA1-KNTC2复合物为靶标的筛选和NSCLC治疗方法

本专利申请要求2005年7月29日提交的美国临时申请流水号60/703,704的权益，本文引用其全部内容作为参考。

发明领域

本发明涉及生物科学领域，更具体地涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及根据如下的发现治疗癌症，即CDCA1和KNTC2的共激活及其关连(cognate)相互作用在肺癌发展中发挥重要作用，并且抑制该复合物的方法能够用于治疗非小细胞肺癌。

发明背景

肺癌是世界上最常见的癌症之一，非小细胞肺癌(NSCLC)又是最为常见的形式，占总病例的接近80％(Greenlee RT.，et al.，CA Cancer J Clin.2001；51：15-36)。已经报道了与肺癌的发生和发展相关的许多遗传改变。然而迄今为止，其精确的分子机制仍然不清楚(Sozzi G.，Eur J Cancer.2001；37Suppl 7：S63-73)。在过去10年里，新开发的细胞毒剂，包括紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、吉西他滨(Gemcitabine)和长春瑞滨(vinorelbine)，为晚期NSCLC患者提供了多种治疗选择；然而，这些疗法与基于顺铂的疗法相比只能提供中等的存活效益(Schiller JH，et al.，N Engl J Med.2002；346：92-8；Kelly K，et al.，J Clin Oncol.2001；19：3210-8)。因此，人们热切期望有新的治疗策略。

用cDNA微阵列对成千上万个基因的表达水平进行系统分析是鉴定参与癌发生途径的未知分子的有效方法，并能够揭示用于开发新型疗法和诊断的候选靶分子。为了尝试分离用于诊断、治疗和/或预防NSCLC的潜在分子靶标，本发明人利用通过激光显微解剖纯化的肿瘤细胞群体，在含有23,040个基因的cDNA微阵列上对NSCLC细胞进行了全基因组表达模式分析(Kikuchi T，et al.，Oncogene.2003；22：2192-205；Suzuki C，et al.，Cancer Res.2003；63：7038-41；Kakiuchi S，et al.，Mol Cancer Res.2003；1：485-99；ZembutsuH，et al.，Int J Oncol.2003；23：29-39；Kakiuchi S，et al.，Hum Mol Genet.2004；13：3029-43)。为了检验代表性基因产物的生物学和临床病理学意义，本发明人还对临床肺癌材料进行了肿瘤组织微阵列分析(Ishikawa N，et al.，Clin Cancer Res.2004；10(24)：8363-70)。这种系统方法显示，细胞分裂关联1(CDCA1)和动粒(kinetocore)关联2(KNTC2)经常在原发NSCLC中共过度表达(另见WO2004/031413)。

细胞周期调节的改变是人类癌症的特征。CDCA1和KNTC2是参与纺锤体检查点信号传导的几种蛋白质的成员。特别地，动粒外板内的附接位点为染色体运动提供微管依赖性动力，并调节纺锤体检查点蛋白在动粒的组装。由Ndc80(Hec1)、Nuf2、Spc24和Spc25构成的Ndc80复合物对于中期染色体排列和后期染色体分离至关重要。Ndc80复合物首先在芽殖酵母中分离，并且已经在蠕虫、蛙、鸡和人类中鉴定了其同源物(Ciferri，C.et al.JBiol Chem.280，29088-95(2005).；McCleland，M.L et al.Genes Dev.17，101-114(2003).；Desai，A.et al.Genes Dev.17，2421-2435(2003).；DeLuca，J.G.et al.Curr Biol.13，2103-2109(2003).)。动粒外板内CDCA1-KNTC2复合物的附接位点为染色体运动提供微管依赖性动力，并调节纺锤体检查点蛋白在动粒的组装。已知缺失该复合物成员或有成员突变的酵母细胞会显示出动粒-微管附接丧失，但不会丧失动粒的全部结构(Wigge，P.A.et al.J Cell Biol.152，349-60(2001).)。当着丝粒丧失与纺锤体极体的连接时，酵母Nuf2也会在减数分裂前期从着丝粒消失，并且在染色体分离中发挥调节作用(Nabetani，A.et al.Chromosoma.110，322-334(2001).)。人CDCA1已鉴定为与已知细胞周期基因(包括CDC2、细胞周期蛋白、拓扑异构酶II和others21)共表达的基因成员，并且报道与有丝分裂HeLa细胞的着丝粒结合；这使人们预期，CDCA1是酵母Nuf2的功能性同源物(Wigge，P.A.et al.J Cell Biol.152，349-360(2001).)。

另一方面，使用酵母双杂交筛选，已经鉴定人KNTC2是与视网膜母细胞瘤蛋白(RB1)的C端相互作用的蛋白，并提示它是参与纺锤体检查点信号传导的数种蛋白质之一(Durfee，T.et al.Genes Dev.7，555-569(1993).；Chen，Y.et al.Mol.Cell.Biol.17，6049-6056(1997).)。这种涉及KNTC2的监视机制将MPS1激酶和MAD1/MAD2复合物募集到动粒，并通过检测未对准的染色体以及在实现适当的染色体双极附接之前致使前中期暂停，保证细胞分裂期间染色体的正确分离(Martin-Lluesma，S.et al.Science 297，2267-2270(2002))。

尽管有这些进展，但是到目前为止，还没有报道描述CDCA1-KNTC2复合物共激活在人癌症进展中的重要性以及作为治疗和预后靶标的潜力。

发明简述

通过分析非小细胞肺癌(NSCLC)基因组范围的基因表达模式，本发明人检测到细胞分裂关联1(cell divison associated CDCA1)的过度表达。本发明人进一步发现，CDCA1蛋白与一种也在肺癌中特异过度表达的蛋白质——动粒关联2(kinetocore associated 2，KNTC2)物理相互作用。Northern印迹分析显示，这两个基因在所检查的23种正常成人组织中只在睾丸中表达。在体外，用siRNA抑制CDCA1或KNTC2的表达，或者用显性负突变(dominantnegaive)CDCA1片段或由膜转导11聚精氨酸序列和CDCA1来源的19氨基酸肽(密码子398-416)构成的合成33氨基酸多肽抑制它们的结合，有效抑制了NSCLC细胞的生长。由于这里的数据证明，CDCA1和KNTC2属于癌-睾丸抗原(CTA)类，并且它们的同时上调是肺癌细胞生长/生存的经常而重要的特征，所以选择性抑制CDCA1或KNTC2的活性和/或抑制CDCA1-KNTC2复合物的形成似乎可是一种治疗多种肺癌的便利治疗策略。

因此，本发明提供了筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法。示例方法包括如下步骤：

(1)在测试化合物的存在下，使KNTC2多肽或其功能等价物与CDCA1多肽或其功能等价物接触；

(2)检测步骤(1)中多肽间的结合；和

(3)选择抑制多肽间结合的测试化合物。

CDCA1多肽的功能等价物可具有相应于KNTC2结合域的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：35的氨基酸序列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)。同样，KNTC2多肽的功能等价物可具有相应于CDCA1结合域的氨基酸序列。

本发明还提供了通过施用由上述本发明筛选方法获得的化合物治疗或预防受试者体内NSCLC的方法。

本发明进一步提供用于筛选治疗或预防NSCLC的化合物的试剂盒。该试剂盒优选地包括如下组分：

a：KNTC2多肽或其功能等价物，和

b：CDCA1多肽或其功能等价物。

本发明还提供治疗或预防受试者体内NSCLC的方法，其包括向所述受试者施用含有降低KNTC2基因表达的siRNA的siRNA组合物，其中该siRNA在有义链中具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。该siRNA优选地具有如下通式：

5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是相应于SEQ ID NO：9的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列；[A’]是与[A]互补的核糖核苷酸序列。

本发明的方法还为通过施用具有显性失活效应的CDCA1突变体或编码该突变体的多核苷酸来治疗或预防受试者中的NSCLC提供了条件。该CDCA1突变体可以具有包含KNTC2结合域的氨基酸序列，但排除其nuf2域。在优选实施方案中，该CDCA1突变体包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。该CDCA1突变体可以具有如下的通式：[R]-[D]，

其中[R]是膜转导物质，[D]是具有SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的多肽。膜转导物质可以从下组中选择：

聚精氨酸；

Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；

Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；

Buforin II/TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；

Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；

MAP(模型两亲肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；

K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；

Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；

Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；

朊病毒(Prion)/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ IDNO：44；

pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；

Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；

SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；

Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；和

HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49.

本发明提供由有义链和反义链构成的双链分子，其中该有义链是相应于KNTC2靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中该反义链是与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子在被引入到表达KNTC2基因的细胞中时抑制所述基因的表达。该双链分子可以包括由来自SEQ ID NO：31核苷酸序列的至少大约10个连续核苷酸构成的KNTC2靶序列。在优选实施方案中，该KNTC2靶序列包含来自SEQ ID NO：9核苷酸序列的大约19到大约25个连续核苷酸，或者完全由SEQ ID NO：9构成。

该双链分子可以是单一核糖核苷酸转录物，由通过单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链构成。该双链分子典型地是长度小于大约100个核苷酸、长度小于大约75个核苷酸、长度小于大约50个核苷酸或者长度小于大约25个核苷酸的寡核苷酸。该双链分子可以是长度为大约19到大约25个核苷酸之间的寡核苷酸。

本发明还提供一种载体，其编码如上所述的本发明的双链分子。该载体可以编码具有二级结构的转录物，其包括有义链和反义链。该转录物可以进一步包括连接有义链和反义链的单链核糖核苷酸序列。

本发明提供了一种包含由有义链核酸和反义链核酸的组合构成的多核苷酸的载体，其中该有义链核酸具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列，而该反义链核酸具有与该有义链互补的序列。

该多核苷酸可以具有通式：

5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是SEQ ID NO：9的核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核苷酸序列；而[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。

本发明提供了用于治疗或预防NSCLC的组合物，这种组合物包含药物有效量的针对KNTC2基因的siRNA。该siRNA可包括具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的有义链作为靶序列。

本发明进一步提供了用于治疗或预防NSCLC的组合物，这种组合物包含药物有效量的通过上述本发明的筛选方法选出的化合物作为活性成分，和药物可接受的载体。

本发明还提供了用于治疗或预防NSCLC的组合物，这种组合物包含药物有效量的本发明CDCA1突变体。

本发明提供了评估NSCLC预后的方法，其中该方法包括如下步骤：

(a)检测从待评估NSCLC预后的受试者采集的样品中CDCA1和KNTC2其中之一或二者的表达水平，和

(b)若检测到CDCA1和KNTC2其中之一或二者的表达水平提高，则表明预后不良。

上述方法可以包括检测CDCA1和KNTC2两者表达水平的步骤。该表达水平的检测可以通过如下方法中的任何一种：

(a)检测编码SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA的存在，

(b)检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质的存在，和

(c)检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质的生物活性。

本发明还提供了用于估计NSCLC预后的试剂盒，其中该试剂盒包括任何一种从下组选择的成分：

(a)用于检测编码SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA的试剂，

(b)用于检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质的试剂，和

(c)用于检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质的生物活性的试剂。

定义

除非另外特别指出，这里使用的文字“一个”、“一种”和“该”表示“至少一个”。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。而且，除非另外特别指出，术语“基因”、“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。

术语“有效”是指治疗使受试者体内NSCLC的大小、患病率或转移潜力降低。在进行预防治疗时，“有效”是指治疗延迟或阻止NSCLC的发生或者减轻NSCLC的临床症状。NSCLC的评估可以用标准临床规程进行。而且，治疗的有效性可结合任何已知的用于诊断或治疗NSCLC的方法加以确定。例如，NSCLC经常通过组织病理学或者通过鉴定症状异常，例如慢性咳嗽、声嘶、咳血、体重下降、食欲减退、气短、哮鸣、支气管炎或肺炎重复发作和胸痛来诊断。

附图简述

图1显示了CDCA1和KNTC2在肺肿瘤、细胞系和正常组织中的表达。图1A显示了CDCA1和KNTC2在16例NSCLC临床样品(T)和相应正常组织(N)中的表达，通过半定量RT-PCR检查。本发明人针对从临床肺癌样品的mRNA制得的每种单链cDNA制备了合适稀释物，以β-肌动蛋白(ACTB)的表达水平作为定量对照。图1B显示了通过半定量RT-PCR考察的CDCA1和KNTC2在NSCLC细胞系(1：A549，2：LC319，3：PC14，4：PC3，5：PC9，6：A427，7：NCI-H1373，8：EBC-1，9：LU61，10：NCI-H520，11：NCI-H1703，12：NCI-H2170，13：NCI-H226，14：RERF-LC-A1，15：SK-MES-1，16：NCI-H647，17：LX1，18：DMS114，19：DMS273，20：SBC-3，21：SBC-5，22：NCI-H1666，23：NCI-H781)中的表达。图1C显示了通过Northern印迹分析检测的CDCA1和KNTC2在正常人组织中的表达。

图2显示了CDCA1与KNTC2的相互作用以及由此所得的复合物的亚细胞定位。图2A鉴定KNTC2为CDCA1相互作用蛋白。IP免疫沉淀；IB免疫印迹。图2B显示了内源CDCA1(绿色)和内源KNTC2(红色)在LC319细胞中的共定位。图2C和2D通过免疫沉淀实验鉴定了CDCA1中结合KNTC2的区域。缺少CDCA1C端158个氨基酸的CDCA11-148和CDCA1149-306构建体未能保留任何可觉察的与LC319细胞中内源KNTC2相互作用的能力(C)。缺少CDCA1368-41位的49个氨基酸的CDCA1277-367和CDCA1319-367构建体不能与内源KNTC2相互作用，表明CDCA1 368-416位的49个氨基酸的肽可能是与内源KNTC2相互作用的最重要的区域(D)。

图3显示了CDCA1和KNTC2过度表达与更差的NSCLC后果的关联。图3A显示了在组织微阵列(X100)上用抗CDCA1(上图)和抗KNTC2(下图)多克隆抗体对来自手术切除SCC组织的代表性样品的免疫组织化学评价。图3B-E显示了根据组织微阵列上CDCA1与KNTC2表达的共表达(B)、CDCA1表达(C)、KNTC2表达(D)对肿瘤特异性生存时间的Kaplan-Meier分析结果。图3E，CDCA1和KNTC2的共过度表达与NSCLC患者不良预后的关联。282例NSCLC分成3组：组1为对CDCA1和KNTC2均有强烈阳性染色(62位患者)的病例，组2为对两种标记均为阴性染色(29位患者)的病例，组3为任何其他病例(191位患者，显示为其他)。

图4显示了针对CDCA1和KNTC2的siRNA对NSCLC细胞生长的抑制。图4A和4B，左上图，显示了通过半定量RT-PCR分析的A549细胞响应si-CDCA1、si-KNTC2或对照siRNA的基因敲低效果。图4A和4B，左下和右上图，显示了被特异siRNA或对照质粒(EGFP，乱序(Scramble)或萤光素酶)转染的LC319细胞集落形成和MTT测定结果。误差线代表一式三份测定的标准差。

图5显示了显性负突变CDCA1片段和肽对NSCLC细胞生长的抑制。图5A显示了在用CDCA11-464(全长)和CDCA1 200-464构建体共转染的LC319细胞中，通过免疫沉淀检测到的外源CDCA1与KNTC2复合物形成的降低(左上图；黑色箭头)。CDCA1 200-464片段与LC319细胞中内源KNTC2相互作用(左上图；白色箭头)。投入级分(Input fractions)(左第三图和下图)。通过免疫细胞化学检测到LC319细胞中CDCA1 200-464与内源KNTC2共定位(右图)。图5B，LC319细胞的MTT测定，检测了CDCA1200-464的显性失活效应。CDCA1 149-306用作对照。误差线代表一式三次实验的标准偏差。图5C显示了LC319细胞MTT测定的结果，检测到了11R-CDCA1 398-416肽转导对LC319细胞生长的抑制。误差线代表一式三次实验的标准偏差。

图6显示了CDCA1的显性负突变肽对NSCLC细胞生长的抑制。图6A显示了用11R-CDCA1398-416肽或乱序肽处理后LC319细胞的细胞周期分析结果。图6B显示了通过Western印迹分析检测的CDCA1和KNTC2蛋白在正常人肺成纤维细胞衍生的MRC5细胞中的表达，与3种肺癌细胞系比较(左图)。MTT测定显示11R-CDCA1398-416肽对几乎不表达CDCA1和KNTC2蛋白的MRC5细胞没有脱靶(off-target)效应(右图)。

图7显示了细胞透过性CDCA1肽对NSCLC细胞的体内生长抑制。

图7A显示了11R-CDCA1398-416肽对移植到裸鼠的A549细胞的生长抑制效果。对3只用11R-CDCA1398-416肽(0.15μmol/只/天)、乱序肽0.15μmol/只/天)或PBS(对照)处理的小鼠的平均肿瘤体积描点作图。动物每天肿瘤内注射每种肽，持续7周。来源于A549细胞的嫁接肿瘤的生长受到显性负突变细胞透过性11R-CDCA1398-416肽的显著抑制。图7B显示了移植到用11R-CDCA1398-416肽(0.15μmol/只/天)、乱序肽0.15μmol/只/天)或PBS(对照)处理7周的小鼠体内的肿瘤的肉眼外观。

详细说明

用于治疗或预防NSCLC的化合物的筛选

如上所述，本发明人揭示了在NSCLC细胞中，CDCA1与KNTC2相互作用。因此，本发明人提供了筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法。该方法包括如下步骤：

(a)在测试化合物的存在下，使KNTC2多肽或其功能等价物与CDCA1多肽或其功能等价物接触；

(b)检测步骤(1)中多肽间的相互作用；和

(c)选择抑制所述多肽结合的测试化合物。

在本发明的上下文中，CDCA1或KNTC2多肽的功能等价物是具有分别与CDCA1多肽(SEQ ID NO：34)或KNTC2多肽(SEQ ID NO：32)等价的生物活性的多肽。

用于制备与给定蛋白质功能等价的多肽的方法是本领域技术人员熟知的，包括在蛋白质中引入突变的已知方法。例如，本领域的技术人员可以通过定点诱变在CDCA1或KNTC2的任一个的氨基酸序列中引入合适的突变，来制备与CDCA1或KNTC2功能等价的多肽(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152：271-5(1995)；Zoller and Smith，Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al.，Nucleic Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer andFritz，Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA82：488-92(1985)；Kunkel TA，et al.，Methods Enzymol.1991；204：125-39.)。氨基酸突变也可以自然发生。本发明的多肽具有一个或多个氨基酸发生突变的CDCA1或KNTC2的氨基酸序列的多肽，只要所得的多肽分别与CDCA1或KNTC2在功能上等价。这类突变体中被突变的氨基酸数目一般为20个氨基酸或者更少，更典型地为10个氨基酸或者更少，优选地为5-6个氨基酸或者更少，更优选地为1-3个氨基酸。

已经知道，突变或修饰的蛋白质，也就是具有某个氨基酸序列通过替换、删除、插入和/或添加某一氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被修饰而得到的序列的蛋白质，保持原来的生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。

待突变的氨基酸残基优选地被突变成保守氨基酸侧链性质的不同氨基酸(该过程称作保守氨基酸取代)。氨基酸侧链性质的实例是疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)和共有如下功能基团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱基侧链(R，K，H)；和含芳香基侧链(H，F，Y，W)。注意，括号中的字母表示氨基酸的单字母编码。

向CDCA1或KNTC2的氨基酸序列添加了一个或多个氨基酸残基的多肽的实例是分别包含CDCA1或KNTC2的融合蛋白。因此，融合蛋白，也就是CDCA1或KNTC2与其他肽或蛋白质的融合物，也包含在本发明中。融合蛋白可以通过本领域技术人员熟知的技术制备，例如通过将编码CDCA1或KNTC2的DNA与编码其他肽或蛋白质的DNA连接，使它们读框一致，将该融合DNA插入到表达载体中，并在宿主中表达之。对于和本发明蛋白质融合的肽或蛋白质没有限制。

本领域已知的用于分离功能等价多肽的替代方法有，例如，使用杂交技术的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold SpringHarbor Lab.Press(1989))。本领域的技术人员能够容易地分离与CDCA1或KNTC2(也就是分别与SEQ ID NOs：34和32)高度同源的DNA，并从所分离的DNA分离与CDCA1或KNTC2功能等价的多肽。本发明的蛋白质包括由与编码CDCA1或KNTC2的DNA序列的全部或部分杂交的DNA编码的、与CDCA1或KNTC2功能等价的蛋白质。这些多肽包括相应于人源蛋白质的哺乳动物同源物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。在分离与来自动物的CDCA1或KNTC2编码DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用肺癌组织。

优选地，功能等价多肽的氨基酸序列与这里公开的天然CDCA1或KNTC2具有至少大约80％的同源性(也称作序列同一性)，更优选地有至少大约85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同源性。多肽的同源性可以按照“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)”中的算法加以确定。在其他实施方案中，功能等价多肽可以由在严紧条件下(如下文定义)与编码这种功能等价多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。

除杂交外，还可以使用基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，使用根据CDCA1或KNTC2的序列信息合成的引物分离编码与CDCA1或KNTC2功能等价的多肽的DNA。

本发明上下文中使用的CDCA1或KNTC2功能等价物在氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的存在与否或形式上可以有变化，这取决于用于产生它的细胞或宿主或者所用的纯化方法。无论如何，只要它是CDCA1或KNTC2多肽的功能等价物，它就落入本发明的范围。

在一些优选实施方案中，CDCA1多肽的功能等价物可以包括相应于KNTC2结合域的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：35的氨基酸序列(IQKIKLGIQQ LKDAAEREK)。类似地，KNTC2多肽的功能等价物可以包括相应于CDCA1结合域的氨基酸序列。

如上面讨论的，抑制CDCA1与KNTC2间的结合导致细胞增殖受到抑制。因此，抑制这种结合的化合物可以用作治疗或预防NSCLC的药物。可用于本发明筛选方法的CDCA1和KNTC2多肽可以是重组多肽或来源于自然界的蛋白质，或者还可以是其部分肽段，只要它保持全长蛋白质的结合能力即可。这种保持结合能力的部分肽段在这里称作“功能等价物”。在筛选方法中使用的CDCA1和KNTC2多肽可以是，例如，纯化多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式，或与其他多肽融合的融合蛋白。

作为筛选抑制CDCA1和KNTC2结合的化合物的方法，可以使用本领域技术人员熟知的许多方法。例如，筛选可以作为体外测定系统，例如细胞系统进行。更明确地，首先，将CDCA1或KNTC2与支持物结合，对它添加另一种蛋白质与测试化合物。接着温育该混合物，清洗，然后检测和/或测量与支持物结合的另一种蛋白质。

可用于结合蛋白质的支持物的实例包括，例如，不溶性多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；和合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon)；优选的是，可使用由上述材料制备的可商购的珠子(bead)和板(plate)(例如多孔板、生物传感器芯片等)。当使用珠子时，可以将它们填充到柱内。或者，磁珠的使用在本领域也是已知的，它使人们能够通过磁性容易地分离结合在珠子上的蛋白质。

蛋白质与支持物的结合可以根据常规方法进行，例如化学键合和物理吸附。或者，蛋白质可以通过特异识别该蛋白的抗体与支持物结合。而且，蛋白质与支持物的结合还可以通过抗生物素蛋白和生物素进行。

蛋白质间的结合优选地在缓冲液中进行，缓冲液的实例包括，但不仅限于，磷酸缓冲液和Tris缓冲液。然而，所选缓冲液不得抑制蛋白质间的结合。

在本发明的上下文中，利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以用作检测或定量结合蛋白质的方法。在使用这样的生物传感器时，只用微量的多肽且无需标记(例如BIAcore，Pharmacia)，蛋白质间的相互作用可以作为表面等离子体共振信号实时地被观察。因此，使用生物传感器例如BIAcore评估CDCA1与KNTC2的结合是可能的。

或者，可以对CDCA1或KNTC2进行标记，并且可利用结合蛋白的标记物来检测或测量结合蛋白。具体地，在对其中一个蛋白质进行预标记之后，使被标记的蛋白在测试化合物的存在下与另一种蛋白接触，清洗后，根据标记物对结合蛋白进行检测或测量。

在本方法中可用于标记蛋白质的标记物质包括但不仅限于放射性同位素(例如³H，¹⁴C，³²P，³³P，³⁵S，¹²⁵I，¹³¹I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖酶、β-葡萄糖苷酶)、荧光物质(例如荧光素异丙烯硫氰酸酯(FITC)、罗丹明)和生物素/抗生物素蛋白。当用放射性同位素标记蛋白质时，可以通过液体闪烁进行检测和测量。或者，用酶标记的蛋白质的检测或测量可以通过添加酶的底物并用吸光测定计检测底物的酶促变化，例如颜色产生。进一步，在使用荧光物质作为标记物时，可以用荧光光度计检测或测量结合蛋白。

而且，还可以用CDCA1或KNTC2的抗体检测或测量CDCA1与KNTC2的结合。例如，在使固定在支持物上的CDCA1多肽与测试化合物和KNTC2接触之后，温育和清洗混合物，然后可以用抗KNTC2的抗体进行检测或测量。或者，可以将KNTC2固定在支持物上，而使用抗CDCA1的抗体作为抗体。

当在本筛选中使用抗体时，优选地用一种如上所述的标记物质对抗体进行标记，并根据该标记物质进行检测或测量。或者，可以使用抗CDCA1或KNTC2的抗体作为第一抗体，进而用标记物质标记的第二抗体加以检测。而且，在本发明的筛选中与蛋白质结合的抗体可以用蛋白G或蛋白A柱加以检测或测量。

或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER双杂交系统”，“Mammalian MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”，“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参考文献“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。

在双杂交系统中，例如，CDCA1多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。结合CDCA1多肽的KNTC2多肽与VP16或GAL4转录激活区融合，并且在测试化合物的存在下也在酵母细胞中表达。或者，可以将KNTC2多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，将CDCA1多肽与VP16或GAL4转录激活区融合。当测试化合物不抑制CDCA1与KNTC2之间的结合时，两者的结合激活报道基因，使阳性克隆可检测。作为报道基因，除了HIS3基因之外，合适的实例包括，但不仅限于，Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

任何测试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物和天然化合物均可用于本发明筛选方法的内容。本发明的测试化合物还可以用本领域已知的大量组合文库方法中的任何一种获得，包括但不仅限于(1)生物学文库，(2)空间可寻址平行固相或溶液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库方法，(4)“一珠子一化合物”文库方法和(5)使用亲和色谱选择的合成文库方法。使用亲和色谱选择的生物学文库方法仅限于肽文库，而其他4种方法适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam，Anticancer Drug Des.12：145-67(1997))。用于分子文库合成的方法实例可在本领域中找到(DeWitt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909(1993)；Erb et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422-6(1994)；Zuckermannet al.，J.Med.Chem.37：2678-85(1994)；Cho et al.，Science 261：1303-5(1993)；Carell et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059(1994)；Carell et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061(1994)；Gallop et al.，J.Med.Chem.37：1233-51(1994))。化合物文库可存在于溶液(见Houghten，Bio/Techniques 13：412-21(1992))或珠子(Lam，Nature 354：82-4(1991))、芯片(Fodor，Nature 364：555-6(1993))、细菌(美国专利5,223,409)、孢子(美国专利5,571,698；5,403,484，和5,223,409)、质粒(Cull et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-9(1992))或噬菌体(Scott and Smith，Science 249：386-90(1990)；Devlin，Science 249：404-6(1990)；Cwirla et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-82(1990)；Felici，J.Mol.Biol.222：301-10(1991)；美国专利申请20020103360)。暴露于根据本发明筛选方法的细胞或蛋白质的测试化合物可以是单种化合物或化合物的组合。当在本发明的筛选方法中使用化合物组合时，多个化合物可以顺次或同时接触。

通过本发明筛选方法分离的化合物是可抑制CDCA1和KNTC2的活性、用于治疗或预防被归于细胞增生性疾病的疾病，例如NSCLC的药物的候选物。由本发明筛选方法获得的化合物中部分结构添加删除和/或替换而被改变的化合物，也包含在通过本发明筛选方法获得的化合物中。可有效抑制过度表达基因——即CDCA1和KNTC2基因——之表达的化合物视为具有临床效益，并可以进一步在动物模型或测试对象中测试其降低或防止癌细胞生长的能力。

本发明还可包括筛选与CDCA1或KNTC2多肽结合从而抑制其相互作用的蛋白质。为了达到这个目的，可以使用许多本领域技术人员熟知的方法。这种筛选可以用例如本领域熟知的方法通过例如免疫沉淀测定进行。本发明的蛋白质可以用标准程序重组产生。例如，可以通过将编码目的多肽的基因插入到外来基因表达载体，例如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8，在动物细胞中表达该基因。用于表达的启动子可以是通常使用的任何启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α启动子(Kim et al.，Gene 91：217-23(1990))，CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193(1991))，RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))，SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466-72(1988))，CMV立即早期启动子(Seed and Aruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946-58(1989))，HSV TK启动子等等。将基因引入动物细胞以表达外来基因可以根据任何常规的方法进行，例如电穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))，磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，MolCell Biol 4：1641-3(1984))，Lipofectin(脂质体转染试剂)法(Derijard B，Cell76：1025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran etal.，Science 259：230-4(1993))等等。多肽还可以表达成含有单克隆抗体识别位点(表位)的融合蛋白，其是通过将已显示特异性的单克隆抗体的表位引入到多肽的N或C端实现的。也可以使用商品化的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine 13：85-90(1995))。能够利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的载体是可商购的。

本文还提供了融合蛋白，其通过仅引入由几个到数十个氨基酸构成的小表位制备而得，而不会由于融合而改变原始多肽的性质。表位以及识别它们的单克隆抗体可以用作筛选与CDCA1或KNTC2多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))，所述表位例如多聚组氨酸(His-标签)、流感聚集物(influenza aggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人类单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等。

在免疫沉淀中，通过将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解产物中形成免疫复合物。免疫复合物由CDCA1或KNTC2多肽、具有该多肽结合亲和力的多肽和抗体构成。除了抗上述表位的抗体之外，免疫沉淀还能够用抗CDCA1或KNTC2多肽的抗体进行，这些抗体可以根据常规的方法制备，并可以是任何形式，例如单克隆或多克隆抗体，并且包括，例如，通过用多肽免疫动物如家兔获得的抗血清，全部类型的多克隆和单克隆抗体以及重组抗体(例如人源化抗体)。

具体地，抗CDCA1或KNTC2多肽的抗体可以用本领域熟知的技术制备。例如，用作抗原以获得抗体的CDCA1或KNTC2多肽可以来源于任何动物物种，但是优选地来源于哺乳动物，例如人、小鼠、家兔或大鼠，更优选地来源于人。用作抗原的多肽可以重组产生或者从天然来源分离。在本发明的上下文中，用作免疫抗原的多肽可以是CDCA1或KNTC2多肽的完整蛋白或者部分肽。

任何哺乳动物均可用抗原免疫；然而，优选地考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿目(Rodentia)，兔形目(Lagomorpha)或灵长类(Primates)动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠(hamster)。兔形目动物包括例如野兔(hares)、鼠兔(pikas)和家兔。灵长类动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。

用抗原免疫动物的方法在本领域是众所周知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体地，抗原可以在合适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮。如果希望，抗原悬浮液可以和适当量的标准辅助剂，例如弗氏完全佐剂，混合制成乳液，然后施予哺乳动物。优选地，随后每4-21天施用与适当量弗氏不完全佐剂混合的抗原数次。免疫还可以使用合适的载体。在上述免疫之后，用标准方法检查血清中期望抗体量的增加。

抗CDCA1或KNTC2多肽的多克隆抗体，可以通过从已检查血清中期望抗体增加的免疫哺乳动物采集血液，并通过任何常规方法从血液分离血清加以制备。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及从血清中分离的含有多克隆抗体的级分。免疫球蛋白G或M可以从只识别CDCA1或KNTC2多肽的组分中制备，例如使用与所述多肽偶联的亲和柱，进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。

为了制备单克隆抗体，从如上所述的用抗原免疫并检查到血清中期望抗体的水平增加的哺乳动物收集免疫细胞，用于细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选地从脾获得。其他优选用于和上述免疫细胞融合的亲本细胞包括，例如，哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选的是获得了利用药物选择融合细胞所需的性质的骨髓瘤细胞。

上述的免疫细胞和骨髓瘤细胞可以根据已知的方法进行融合，例如Milstein等的方法(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 73：3-46(1981))。

通过细胞融合获得的最终杂交瘤细胞可以通过在标准选择培养基，例如HAT培养基(含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基)上对它们进行培养加以选择。细胞培养典型地在HAT培养基上持续数天至数星期，这个时间足以使除了期望的杂交瘤细胞之外的其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释，筛选和克隆产生期望抗体的杂交瘤细胞。

除了上述用抗原免疫非人类动物以制备杂交瘤细胞的方法之外，可以在体外用CDCA1或KNTC2多肽、表达这种多肽的细胞，或其裂解物免疫人淋巴细胞，例如被EB病毒感染的人淋巴细胞。然后，使被免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的人源骨髓瘤细胞例如U266融合，得到生产能够结合CDCA1或KNTC2多肽的期望人抗体的杂交瘤(特开昭(JP-A)63-17688号)。

随后可将所得杂交瘤移植到小鼠的腹腔内，并可提取腹水。所得单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换色谱或偶联有本发明任一靶蛋白(CDCA1或KNTC2多肽)的亲和柱加以纯化。抗体不仅能够用于本筛选方法，还可用于纯化和检测CDCA1或KNTC2多肽。它们可以进一步用作目标多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。此外，用作拮抗剂候选物的这类抗体可用于CDCA1或KNTC2多肽相关疾病包括下文中描述的NSCLC的抗体治疗。

这样获得的单克隆抗体还可以用基因工程技术重组制备(见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从免疫细胞——例如产生该抗体的杂交瘤细胞或免疫淋巴细胞——克隆编码抗体的DNA，将其插入到合适的载体内，并引入宿主细胞，制备重组抗体。这种重组抗体也可在本筛选的上下文中使用。

而且，在筛选等中使用的抗体可以是抗体的片段或修饰抗体，只要它能够结合CDCA1和KNTC2之一或两者即可。例如，抗体片段可以是Fab，F(ab’)₂，Fv，或单链Fv(scFv)，其中单链Fv中来自于H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具体地，抗体片段可以用酶(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理抗体而产生。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体内，并且在合适的宿主细胞中表达(见例如Co et al.，J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthunand Skerra，Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol121：652-63(1986)；Rousseaux et al.，Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Birdand Walker，Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。

抗体可以通过与各种分子例如聚乙二醇(PEG)偶联而加以修饰。修饰抗体可以通过抗体的化学修饰获得。这些修饰方法是本领域的常规方法。

或者，抗体可以作为来源于非人抗体的可变区与来源于人抗体的恒定区之间形成的嵌合抗体，或者作为由来源于非人抗体的互补性决定区(CDR)、来源于人抗体的框架区(FR)和恒定区构成人源化抗体而获得。这类抗体可以用已知的技术制备。

人源化可以用啮齿动物CDRs或CDR序列替换人抗体的相应序列(见例如Verhoeyen et al.，Science 239：1534-6(1988))来实施。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中实质上小于完整人可变域的部分被来自非人物种的相应序列所取代。也可以使用由人可变区以及人框架和恒定区构成的完全人抗体。这类抗体可以使用本领域已知的各种技术产生。例如，体外方法涉及使用展示于噬菌体上的人抗体片段重组文库(例如，Hoogenboom &Winter，J.Mol.Biol.227：381-8(1992))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白座位引入到内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物例如小鼠中来制备人抗体。这种方法在例如美国专利Nos.6,150,584，5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中有描述。

可将如上所得的抗体纯化到均质。例如，抗体的分离和纯化可根据用于一般蛋白质的分离和纯化方法。例如，可以适当选择和组合柱色谱法如亲和色谱、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等来分离和提纯抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow andDavid Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))；然而，本发明并不仅限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。使用的蛋白A柱的实例包括例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。

除亲和柱之外的色谱实例包括例如离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反相色谱、吸附色谱等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。色谱程序可以通过液相色谱，例如HPLC和FPLC来实施。

当抗体是小鼠IgG抗体时，可以用例如蛋白A sepharose或蛋白Gsepharose沉淀免疫复合物。如果CDCA1或KNTC2多肽被制备成具有表位例如GST的融合蛋白，则可以用特异结合这些表位的物质例如谷胱甘肽-Sepharose 4B，，按照与使用抗CDCA1或KNTC2多肽抗体相同的方式形成免疫复合物。

免疫沉淀可以遵循或根据例如文献中的方法进行(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。

免疫沉淀后的蛋白质通常用SDS-PAGE来分析，可以用合适浓度的凝胶根据蛋白质的分子量来分析结合的蛋白质。因为与CDCA1或KNTC2多肽结合的蛋白质难以用常规的染色方法例如考马斯蓝染色或银染色来检测，所以，通过在含有放射性同位素³⁵S-甲硫氨酸或³⁵S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质，然后检测该蛋白质，可以提高蛋白质检测的灵敏度。当蛋白的分子量已知时，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶直接纯化出靶蛋白，并可确定其序列。

与CDCA1或KNTC2多肽结合的化合物也可以用亲和色谱筛选。例如，可以将CDCA1或KNTC2多肽固定在亲和柱的载体上，并向柱上施加测试化合物。本文中的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。加载测试化合物之后，清洗柱，然后可制备与CDCA1或KNTC2多肽结合的化合物。

当测试化合物是蛋白质时，分析所得蛋白质的氨基酸序列，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针对cDNA文库进行筛选，从而获得编码该蛋白质的DNA。

利用表面等离子体共振现象的生物传感器也可用作检测或定量本发明结合化合物的手段。在使用这种生物传感器时，其只需用微量的多肽，并且无需标记(例如BIAcore，Pharmacia)，即可以根据表面等离子体共振信号实时地观察CDCA1或KNTC2多肽与测试化合物之间的相互作用。因此，有可能用生物传感器例如BIAcore来评估CDCA1或KNTC2多肽与测试化合物之间的结合。

当使固定化的CDCA1或KNTC2多肽暴露于合成化合物或天然物质库(natural substance banks)或随机噬菌体肽展示文库(random phage peptidedisplay library)时，筛选结合分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量来分离与CDCA1或KNTC2蛋白结合的蛋白质乃至化合物(包括激动剂和拮抗剂)的筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，是本领域技术人员公知的。

个体的基因组构成的差异可导致他们代谢各种药物的相对能力产生差异。在受试者体内被代谢后起抗NSCLC物质作用的化合物，可以通过诱导受试者细胞中的基因表达图式从癌性状态特征改变为非癌性状态的基因表达图式，来显示出自身的存在。因此，本文公开的差别表达的CDCA1或KNTC2基因，使得通过在来自选定受试者的测试细胞(或测试细胞群体)中测试候选化合物，选择特异性适合于受试者的假定治疗性或预防性NSCLC抑制剂成为可能。

为了鉴定适合于特殊受试者的抗NSCLC物质，使来源于受试者的测试细胞或测试细胞群体暴露于治疗剂，并确定CDCA1或KNTC2基因中一个或多个的表达。

测试细胞或测试细胞群体包含表达CDCA1或KNTC2基因的NSCLC细胞。优选地，测试细胞或测试细胞群体包括肺细胞。例如，可以在候选试剂的存在下温育测试细胞或测试细胞群体，测量测试细胞或测试细胞群体的基因表达图式，并与一种或多种参考模式，例如NSCLC参考表达模式或非NSCLC参考表达模式进行比较。

测试细胞或测试细胞群体中CDCA1或KNTC2的表达比含有NSCLC的参考细胞群体降低，表明所述物质治疗有效。

用于治疗或预防NSCLC的方法

本发明进一步提供了用于治疗、减轻或预防受试者NSCLC的方法。治疗化合物可以预防性或治疗性施加给患有NSCLC或者有风险(或者易于)发生NSCLC的受试者。这些受试者用标准临床方法或者通过检测CDCA1或KNTC2基因或多肽的异常表达水平或活性加以鉴定。预防性给药发生在该疾病显现出明显的临床症状之前，从而疾病或紊乱被阻止或其进展被延迟。

本发明方法包括降低一种或多种基因的基因产物的表达或功能，或者表达和功能，其中所述基因在NSCLC细胞中相比于与NSCLC源自相同组织类型的正常细胞表达异常增加。表达可以通过本领域已知的任何方法加以抑制。例如，可以用有效量的可降低受试者体内CDCA1或KNTC2基因量的化合物处理受试者。化合物的施用可以是系统的或者是局部的。这类治疗化合物包括降低NSCLC细胞中内源存在基因的表达水平的化合物(即下调CDCA1或KNTC2基因表达的化合物)。这类治疗化合物的施用对抗受试者NSCLC细胞中异常过度表达基因的效应，并预期可改善受试者的临床状况。这类化合物可以通过上述的本发明筛选方法获得。

或者，可通过向受试者施用抑制或拮抗过度表达基因表达的核酸来抑制CDCA1或KNTC2的表达。可以使用干扰过度表达基因表达的反义寡核苷酸、siRNA或核酶来抑制过度表达基因的表达。

如上文指出的，相应于CDCA1或KNTC2基因任一核苷酸序列的反义寡核苷酸可用于降低基因的表达水平。相应于在NSCLC中上调的CDCA1或KNTC2基因的反义寡核苷酸可用于治疗或预防NSCLC。针对这些基因的反义寡核苷酸可以如下起作用：这些基因编码的任一相应多肽，或相应的mRNA，从而抑制所述基因的转录或翻译，促进mRNA降解，和/或抑制CDCA1或KNTC2核苷酸所编码的蛋白质的表达，最终抑制这些蛋白的功能。这里使用的术语“反义寡核苷酸”包括与靶序列完全互补的核苷酸和具有一个或多个核苷酸错配的核苷酸，只要该反义寡核苷酸能够与该靶序列特异杂交即可。例如，本发明的反义寡核苷酸包括与CDCA1或KNTC2基因的任意核苷酸序列在至少15个连续核苷酸至全长序列的范围内有至少70％或者更高，优选地至少80％或者更高，更优选地至少90％或者更高，甚至更优选地至少95％或者更高的同源性(也称作序列同一性)的多核苷酸。可以使用本领域已知的算法确定同源性。而且，反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可以用作本发明中的反义寡核苷酸。这类修饰产物的实例包括膦酸低级烷基酯修饰(lower alkyl phosphonate modifications)，例如膦酸甲酯类型或膦酸乙酯类型，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰和氨基磷酸盐(phosphoroamidate)修饰。

本发明的siRNA分子还可以通过其与来自本文中公开基因的mRNA或cDNA特异性杂交的能力加以定义。在本发明上下文中，术语“杂交”和“特异杂交”可互换使用，表示两个核酸分子在“严紧杂交条件下”杂交的能力。短语“严紧杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，典型地在核酸的复杂混合物中，核酸分子将与其靶序列杂交而不与其他序列发生可检测的杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同的环境下会不同。越长的序列在越高的温度发生特异性杂交。在下列文献中可找到核酸杂交的详细指导：Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization withNucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays”(1993)。一般地，严紧条件选择比限定的离子强度pH下特定序列的热解链温度(T_m)低大约5-10℃。T_m是这样的温度(在限定的离子强度，pH和核浓度)，在该温度平衡状态时50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，因此在Tm时，50％的探针被占据)。严紧条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选地是背景杂交的10倍。严紧杂交条件的实例包括下列：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，42℃温育，或者5x SSC、1％SDS，65℃温育，在50℃0.2x SSC、和0.1％SDS中清洗。反义寡核苷酸及其衍生物通过下述方式作用于产生由CDCA1或KNTC2基因编码的蛋白质的细胞，其是通过与编码该蛋白质的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进mRNA的降解和抑制蛋白质的表达，从而导致蛋白质功能的抑制。

反义寡核苷酸及其衍生物可以通过与对于该衍生物无活性的适当基质材料掺混，制成外用制剂，例如搽剂或罨剂。

本发明的反义寡核苷酸抑制至少一种由CDCA1或KNTC2基因编码的蛋白质的表达，从而可用于抑制各自蛋白质的生物活性。

抑制过度表达基因一种或多种基因产物的多核苷酸还包括小干扰RNA(siRNA)，其由核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸的组合构成，其中所述核苷酸序列编码由CDCA1或KNTC2基因编码的过度表达蛋白质。术语“siRNA”指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。将siRNA引入细胞的标准技术，包括其中DNA是RNA转录模板的技术，可用于本发明的治疗或预防中。构建siRNA使得单个转录物同时具有靶基因的有义和互补反义序列，例如发夹。

使用该方法抑制CDCA1或KNTC2基因表达上调的细胞中的基因表达。siRNA与靶细胞中CDCA1或KNTC2基因的转录物结合，导致细胞产生的CDCA1或KNTC2蛋白减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，并可以和天然存在的转录物一样长。优选地，寡核苷酸的长度为大约75、大约50或大约25个核苷酸。更优选地，寡核苷酸的长度小于大约19-大约25个核苷酸。本发明使用的优选siRNA具有通式：

5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是相应于CDCA1或KNTC2基因的靶序列的核糖核苷酸序列；[B]是由大约3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列；[A’]是与[A]互补的核糖核苷酸序列。本文中，短语“CDCA1或KNTC2基因的靶序列”指在引入到NSCLC细胞系中时有效抑制细胞生存能力的序列。

优选的siRNA是降低KNTC2基因表达的siRNA，其中该siRNA在有义链中具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列。该siRNA具有通式：

5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是相应于SEQ ID NO：9的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列；和[A’]是与[A]互补的核糖核苷酸序列。

而且，siRNA的核苷酸序列可以用siRNA设计计算机程序加以设计，该程序可以从Ambion网站获得(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)。siRNA的核苷酸序列可以根据如下的方案由计算机程序选择：

选择siRNA靶点

1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等在Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro.Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)中不推荐针对5’和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75碱基之内)设计siRNA，因为这里可能富含调节蛋白质结合位点，因此针对这些区域设计的核酸内切酶和siRNA的复合物可能会干扰UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物的结合。

2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列有显著同源性的靶序列排除出考虑之外。可以使用BLAST(Altschul SF，et.al.，Nucleic Acids Res.1997；25：3389-402；J Mol Biol.1990；215：403-10.)进行同源性搜索，其可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion网站上，可以沿着待评估的基因的长度选择几个优选的靶序列。

可以利用转染表达本发明siRNA多核苷酸的载体抑制NSCLC细胞的生长。因此，本发明的另一个方面是提供由有义链和反义链构成的双链分子，该分子起CDCA1或KNTC2的siRNA的作用，还提供了编码该双链分子的载体。

本发明的双链分子包括有义链和反义链，其中有义链是相应于CDCA1或KNTC2靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中反义链是与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成双链分子，并且其中所述双链分子在被引入表达CDCA1或KNTC2基因的细胞中时，抑制所述基因的表达。

本发明的双链分子可以是：得自于其原始环境(若其是天然存在的分子，即为自然环境)的多核苷酸，从其自然状态发生物理或化学改变的多核苷酸，或者化学合成的多核苷酸。根据本发明，这类双链分子包括由DNA、RNA及其衍生物构成的分子。DNA适当地由碱基如A、T、C和G构成，在RNA中T被替换为U。

本发明的载体优选地包括与编码本双链分子的区域相邻，指导该分子在合适细胞内表达的调节序列。例如，通过将本发明双链分子的编码序列克隆到含有例如来自于小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或者人H1RNA启动子的载体中，可以使它们在细胞内转录。

或者，本载体可以这样制备：例如将靶序列克隆到表达载体内，使目标序列与载体的调节序列可操作连接从而允许其表达(DNA分子转录)(Lee，N.S.et al.，Nature Biotechnology 20：500-5(2002))。例如，具有靶序列之反义序列的RNA分子的转录可以由第一启动子(例如与克隆DNA的3’端连接的启动子序列)驱动，而具有靶序列之有义序列的RNA分子可以由第二启动子(例如与克隆DNA的5’端连接的启动子序列)驱动。表达的有义和反义链在体内相互杂交产生siRNA构建体，以沉默含有靶序列的基因。而且，可以使用两种构建体(载体)分别产生siRNA构建体的有义和反义链。

为了将载体引入到细胞内，可以使用转染增强剂。FuGENE6(Rochediagnostice)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)可用作转染增强剂。

抑制过度表达基因一种或多种基因产物的核酸还包括针对这些基因的核酶。在本发明的上下文中，核酶抑制过度表达CDCA1或KNTC2蛋白的表达，借此可用于抑制该蛋白质的生物活性。因此，由这种核酶构成的组合物可用于治疗或者预防NSCLC。

一般地，核酶分成大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯键的酶。在与大核酶反应后，反应位点由5’-磷酸和3’-羟基构成。大核酶进一步分成(1)I型内含子RNA，催化5’-剪接位点上鸟嘌呤核苷的转酯反应；(2)II型内含子RNA，催化通过套索结构进行的两步自剪接；和(3)核糖核酸酶的RNA组分，其通过水解在5’位点剪切tRNA前体。另一方面，小核酶与大核酶相比具有更小的尺寸(大约40bp)，它们切割RNA产生5’-羟基和2’-3’环磷酸。锤头型核酶(Koizumi et al.，FEBSLett.228：225(1988))和发夹型核酶(Buzayan，Nature 323：349(1986)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res.19：6751(1991))属于小核酶。设计和构建核酶的方法在本领域是已知的(见Koizumi et al.，FEBS Lett.228：225(1988)；Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.17：7059-71(1989)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res.19：6751-5(1991))，并且可以基于编码CDCA1或KNTC2蛋白的核苷酸序列的序列信息，根据常规核酶产生方法构建抑制过度表达NSC蛋白表达的核酶。

或者，可以通过施用与基因产物结合或以其它方式抑制其功能的化合物，来抑制过度表达基因的一种或多种基因产物的功能。这种化合物的实例是与过度表达的一种或多种基因产物结合的抗体。

本发明涉及抗体的用途，特别是针对由上调基因CDCA1或KNTC2中任何一种编码的蛋白质的抗体或者这种抗体的片段的用途。如这里使用的，术语“抗体”指具有特异结构的免疫球蛋白分子，其特异性地与含有合成该抗体所用抗原的分子(即上调基因产物)，或者与其紧密相关的抗原相互作用(结合)。结合过度表达的CDCA1或KNTC2核苷酸的抗体可以是任何形式，例如单克隆或多克隆抗体，包括用多肽免疫动物例如家兔获得的抗血清、所有类型的多克隆和单克隆抗体、人抗体或通过基因重组产生的人源化抗体。而且，本发明治疗或预防NSCLC的方法中使用的抗体可以是抗体的片段或修饰抗体，只要其结合由标志基因(CDCA1或KNTC2基因)编码的一种或多种蛋白质即可。本治疗或预防NSCLC的方法中使用的抗体和抗体片段可以经过修饰，包括化学修饰抗体和嵌合抗体。这类抗体和抗体片段可以根据上述的方法获得(同上文)。

若所得抗体要施用给人体(抗体治疗)，优选地使用人抗体或人源化抗体，以降低免疫原性。例如，可以用抗原如CDCA1或KNTC2多肽、表达该多肽的细胞、或其裂解物对具有人抗体基因库的转基因动物进行免疫。然后从动物收集抗体产生细胞，与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，由它可以制备针对该多肽的人抗体(见WO92-03918，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。

或者，可以利用癌基因使产生抗体的免疫细胞，例如免疫淋巴细胞永生化，并将其用于制备单克隆抗体。本发明提供了使用针对过度表达CDCA1或KNTC2多肽的抗体治疗或预防NSCLC的方法。根据本方法，施用药物有效量的针对CDCA1或KNTC2多肽的抗体。针对过度表达CDCA1或KNTC2多肽的抗体的施用剂量足以降低CDCA1或KNTC2蛋白的活性。或者，可以使用结合肿瘤细胞特异性细胞表面标志的抗体作为药物递送工具。这样，例如，可以施用与细胞毒剂偶联的针对过度表达CDCA1或KNTC2多肽的抗体，施用的剂量足以损害肿瘤细胞。

此外，本文中公开的蛋白质的显性失活突变体可用于治疗或预防NSCLC。例如，本发明提供了通过施用具有显性失活效应的CDCA1突变体或编码这种突变体的多核苷酸治疗或预防受试者中NSCLC的方法。CDCA1突变体可包括含有KNTC2结合区的氨基酸序列，而不含有其nuf2域。CDCA1突变体可以具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列。

在一些优选实施方案中，CDCA1突变体与膜转导物质连接。若干肽序列转位进入活细胞的能力已经得到表征，并可用于本发明的这个目的。这类膜转导物质(典型地是肽)是根据它们内化后到达活细胞细胞质区室和/或细胞核区室的能力定义的。可作为转导物质来源的蛋白质的实例包括HIVTat转录激活子1、2、果蝇(Drosphila melanogaster)转录因子Antennapedia 3。此外，使用了具有转导活性的非天然肽。这些肽典型地是小肽，它们被转位测试的膜相互作用性质是已知的。K-成纤维细胞生长因子(FGF)分泌信号序列中的疏水区、毒液毒素mastoparan(transportan)13、和Buforin I14(一种两栖动物抗微生物肽)已显示可以用作转导物质。关于本发明有用的转导物质的综述见Joliot et al.Nature Crll Biology 6：189-196(2004)。

CDCA1突变体可具有通式：

[R]-[D]，

其中[R]是膜转导物质，[D]是具有SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的多肽。在通式中，[R]可以直接与[D]相连，或者通过接头(linker)与[D]间接相连。连接子可以使用具有多功能基团的肽或化合物。具体地讲，可以使用-GGG-氨基酸序列作用连接子。或者，膜转导物质和具有SEQ ID NO：35氨基酸序列的多肽可以结合在微颗粒(micro-particle)的表面。在本发明中，[R]可以和[D]的任意区域(arbitral region)连接。例如，[R]可以和[D]的N端或C端连接，或者构成[D]的氨基酸之侧链连接。而且，多个[R]分子也可以和一个[D]分子连接。在一些实施方案中，多个[R]分子可以和[D]的不同位点连接。在另一个实施方案中，[D]可以被连接在一起一些[R]的所修饰。

膜转导物质可以由下选择：

[聚精氨酸]；Matsushita，M.et al，J Neurosci.21，6000-6007(2003).

[Tat/RKKRRQRRR]SEQ ID NO：37；Frankel，A.et al，Cell 55，1189-93(1988).Green，M.&Loewenstein，P.M.Cell 55，1179-88(1988).

Penetratin[RQIKIWFQNRRMKWKK]SEQ ID NO：38；Derossi，D.et al，J.Biol.Chem.269，10444-50(1994).

Buforin II[TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK]SEQ ID NO：39；Park，C.B.et al.Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，8245-50(2000).

Transportan[GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL]SEQ ID NO：40；Pooga，M.et al.FASEB J.12，67-77(1998).

MAP(模型两亲肽)[KLALKLALKALKAALKLA]SEQ ID NO：41；Oehlke，J.et al.Biochim.Biophys.Acta.1414，127-39(1998).

K-FGF[AAVALLPAVLLALLAP]SEQ ID NO：42；Lin，Y.Z.et al.J.Biol.Chem.270，14255-14258(1995).

Ku70[VPMLK/SEQ ID NO：43；Sawada，M.et al.Nature Cell Biol.5，352-7(2003).

Ku70[PMLKE/SEQ ID NO：50；Sawada，M.et al.Nature Cell Biol.5，352-7(2003).

朊病毒(Prion)[MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP]SEQ IDNO：44；

Lundberg，P et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.299，85-90(2002).

pVEC[LLIILRRRIRKQAHAHSK]SEQ ID NO：45；Elmquist，A.et al.Exp.Cell Res.269，237-44(2001).

Pep-1[KETWWETWWTEWSQPKKKRKV]SEQ ID NO：46；Morris，M.C.et al.Nature Biotechnol.19，1173-76(2001).

SynB1[RGGRLSYSRRRF STSTGR]SEQ ID NO：47；Rousselle，C.et al.Mol.Pharmacol.57，679-86(2000).

Pep-7[SDLWEMMMVSLACQY]SEQ ID NO：48；Gao，C.et al.Bioorg.Med.Chem.10，4057-65(2002).

HN-1[TSPLNIHNGQKL]SEQ ID NO：49.Hong，F.D.&Clayman，G.L.Cancer Res.60，6551-6(2000).

在本发明中，构成聚精氨酸的精氨酸残基数目没有限制。在一些优选实施方案中，可以有5-20个连续的精氨酸残基。在优选实施方案中，聚精氨酸中精氨酸残基的数目是11(SEQ ID NO：36)。

如这里所用的，短语“CDCA1的显性失活片段”是指能够与KNTC2形成复合物(complexing)的CDCA1突变型。因此，显性失活片段是与全长CDCA1多肽在功能上不等价的片段。优选的显性失活片段是包含KNTC1结合区，而不含其nuf2域的显性失活片段。

用于治疗或预防NSCLC的药物组合物

本发明提供了用于治疗或预防NSCLC的组合物，其包括通过本发明筛选方法选择的、改变CDCA1或KNTC2基因的表达或活性的化合物。这种活性成分还可以是针对该基因的反义寡核苷酸、siRNA或核酶，或者反义寡核苷酸、siRNA或核酶的衍生物，例如表达载体，如上文所述。

当施用通过本方法的筛选方法分离的化合物作为人类和其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、羊、猪、牛、猴、狒狒或黑猩猩，的药物，治疗细胞增殖性疾病(例如非小细胞肺癌)时，分离的化合物可以直接施用或者用常规的药物制备方法制成一定剂型的制剂。本组合物的这类药物制剂包括适合于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)施用，阴道或非消化道(包括肌肉内、皮下和静脉内)或者通过吸入或吹入法施用的制剂。制剂可以任选地包装成离散的剂量单元。

适于口服施用的药物制剂包括：胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，它们各自含有一定量的活性成分。适合的制剂还包括粉末、颗粒、溶液、悬浮液和乳液。活性成分任选以大丸药糖剂(bolus electuary)或糊剂(paste)的形式施用。用于口服给药的片剂和胶囊剂可含有常规赋形剂诸如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或成型来制备，任选与一种或多种配方成分压缩或成型。压缩片剂可通过如下方法制备：将自由流动形式的活性成分，如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和/或分散剂混合，在适当的机器中进行压缩。成型片剂可通过如下方法制备：在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行成型。所述片剂可根据本领域公知的方法进行包衣(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式；或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜溶媒来构成。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂，乳化剂，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的缓释或控释。片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。

示例性的供非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与预期接受者的血液等张(isotonic)的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，包括但不限于悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以提供为单位剂量或多次剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注(continuous infusion)。可以从前述种类的无菌粉末、颗粒及片剂制备即配即用的注射溶液和悬浮液。

示例性的直肠施用制剂包括含有标准载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂(suppository)。用于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包括锭剂(lozenge)和软锭剂(pastille)，其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。对于活性成分的鼻内给药，可以使用液体喷雾剂、可分散粉末，或滴鼻剂(drops)的形式。滴鼻剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮剂。

吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurized pack)或其它便利的气溶胶喷雾递送装置方便地递送组合物。气溶胶包装可含有适宜的喷射剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门输送计量量(meteredamount)来确定剂量单位。

或者，对于通过吸入或吹入给药，组合物可以采用干粉组合物的形式，例如活性成分与合适粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以装入例如胶囊、药筒、胶或发泡包装(blister pack)中以单位剂量的形式提供，可以在吸入器或吹入器的帮助下从它们中施用粉末。

其他合适的制剂包括释放治疗剂的可植入装置和贴片。

如果期望，可调适上述制剂以提供活性成分的稳定释放。药物组合物还可以包含其他的活性成分，包括但不限于，抗微生物剂、免疫抑制剂和防腐剂。

应当理解，除了上文特别提到的成分之外，本发明的制剂还可以包括与该制剂类型有关的其他本领域常规物质；例如适合于口服给药的制剂可以包含增味剂。

优选的单位剂型含有如下文记载的有效量的活性成分或者其适当的部分。

对于前述的每种条件，组合物，例如多肽和有机化合物，可以按照大约0.1-大约250mg/kg/天的剂量口服或注射给药。成人的剂量范围一般为大约5mg-大约17.5g/天，优选地大约5mg-大约10g/天，最优选地大约100mg-大约3g/天。片剂或其它以分散单元提供的单位剂型可适宜地含有这样的量，该量在该剂量条件下为有效量，或者在多个该剂量条件下为有效量；例如，单位剂型含有约5mg-约500mg，通常为约100mg-约500mg的单位。

所用剂量将取决于多种因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切病症和严重程度。同时，给药途径也可随病症和严重程度而改变。

如上所述，本发明进一步提供了用于治疗或预防NSCLC的组合物，其含有抑制过度表达基因表达的活性成分。该活性成分可以通过与对于该衍生物无活性的适当基质材料掺混，制成外用制剂，例如搽剂或罨剂。

另外，如果需要，活性成分可以通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、防腐剂、止痛剂等配制成片剂、粉末、颗粒、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。其制备可以根据制备含核酸药物的常规方法。

优选地，反义寡核苷酸衍生物、siRNA衍生物或核酶衍生物通过直接施用到患病部位或者通过注射入血管从而达到患病部位而施加给患者。在组合物中还可以使用封固剂(mounting medium)，以提高耐久性和膜透过性。封固剂的实例包括脂质体、多聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染剂(lipofectin)及其衍生物。

这些组合物的剂量可以根据患者的状况加以调节，以期望的量使用。

例如，可以施用0.1-100mg/kg，优选地0.1-50mg/kg的剂量范围。

本发明的另一个实施方案是用于治疗或预防NSCLC的组合物，其由抗CDCA1或KNTC2多肽的抗体或可结合该多肽的抗体片段构成。

尽管剂量可以随症状而改变，在口服施用给普通成人(体重60kg)时，用于治疗或预防NSCLC的抗体或其片段的剂量实例是大约0.1mg-大约100mg/天，优选地大约1.0mg-大约50mg/天，更优选地大约1.0mg-大约20mg/天。

以注射形式向普通成人(体重60kg)非消化道给药时，尽管根据患者的状况、疾病症状和给药方法存在一些差异，方便的静脉内注射剂量为大约0.01mg-大约30mg/天，优选地大约0.1mg-大约20mg/天，更优选地大约0.1mg-大约10mg/天。同样，在其他动物的情况下，可能施用换算为60kg体重的剂量。

本文鉴定的差异表达的CDCA1或KNTC2基因还使得NSCLC治疗的过程的预后或监测成为可能。在本方法中，从正在进行NSCLC治疗的受试者提供测试生物样品。如果期望，在不同的时间点，例如在治疗之前、期间或之后，从受试者获得多个测试生物样品。然后确定样品中CDCA1或KNTC2基因的一个或多个的表达水平，并与没有经过治疗的具有已知NSCLC状态的参考样品进行比较。在本发明的一些优选实施方案中，可以同时检测CDCA1和KNTC2基因的表达水平。

如果参考样品不含NSCLC细胞，则测试生物样品与参考样品中CDCA1或KNTC2基因的表达水平相似表明治疗有效。然而，与参考样品相比，测试样品中CDCA1或KNTC2基因表达水平的差异表明临床结果或预后不良。在本发明的上下文中，从具有良好预后的患者获得的NSCLC细胞可以用作参考样品。例如，一般地，当患者在手术后能够生存超过5年时，患者具有良好的预后。更具体地讲，长生存期者(即良好预后)组和短生存期者(即不良预后)组分别包括平均5年肿瘤特异生存比例大于69％和小于45％的患者。因此，来自短生存期者的显示强烈染色的样品，可以用作不良预后的阳性对照。或者，除了来源于患者的样品，显示与来源于患者的样品相似的强烈染色的样品或肺癌细胞系也可以用作阳性对照。而且，在一些实施方案中，正常肺细胞、不表达CDCA1和KNTC2的肺癌细胞或其他细胞可以用作不良预后的阴性对照。

本发明还包括用于预测NSCLC预后的试剂盒，其中该试剂盒含有从下组选择的一种或多种组分：

(a)用于检测编码SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA之存在的试剂，

(b)用于检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质之存在的试剂，和

(c)用于检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质之生物活性的试剂。

在一些优选实施方案中，(a)用于检测编码SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA之存在的试剂可以是特异结合或识别CDCA1或KNTC2核酸的核酸，例如与CDCA1或KNTC2核酸互补的寡核苷酸序列。具体地，SEQ ID NO：34(CDCA1)和SEQ ID NO：32(KNTC2)的氨基酸序列由SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：31的核苷酸序列编码。因此，包含从SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：31所示核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸可以用作本方法优选的引物或探针。或者，在本发明中，(b)用于检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所述氨基酸序列的蛋白质之存在的试剂可以是结合CDCA1或KNTC2蛋白质的抗体。而且，(c)用于检测具有SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质之生物活性的试剂可用于本发明的试剂盒。检测试剂可以用试剂盒的形式包装在一起。上述试剂优选地封装在不同的容器内，例如核酸或抗体(与固体基质结合或者分别与用于将它们结合到基质的试剂包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)、和/或可检测标签。试剂盒还包含实施测定的说明书(例如书面、磁带、VCR、CD-ROM等)。试剂盒的测定样式可以是Northern杂交或者夹心式ELISA，两者在本领域是已知的。

例如，检测试剂可以固定在固体基质，例如多孔片条(strip)上，以形成至少一个NSCLC检测位点。多孔条带的测量或检测区可包括多个位点，每一个均含有核酸。测试片条还可以包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于不同于测试片条的片条上。对照位点可以包含不同量的固化核酸，即，在第一个检测位点的量较高，在随后位点的量较低。添加测试样品后，显示可检测信号的位点数目提供样品预后的定量指示。检测位点可以配置成任何适合于检测的形状，典型地成跨测试条带宽度的条形或点形。

下文提供实施例来说明本发明并帮助本领域普通技术人员制造和使用它。这些实施例决不意图构成对本发明的范围的限制。除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员共同理解的意思相同。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文公开的方法或材料相似或等价的方法或材料，下文描述了合适的方法和材料。这里引用的专利申请和公开的全部内容并入本文作为参考。

实施例

提供如下的实施例用于举例，但并不限制要求保护的发明。

材料和方法

(a)肺癌细胞系和组织样品：下文规程中使用的人肺癌细胞系如下：肺腺癌(ADC)A427，A549，LC319，PC3，PC9，PC14，NCI-H23，NCI-H522和NCI-H1373；细支气管肺泡细胞癌(BAC)NCI-H1666和NCI-H1781；肺腺鳞癌(ASC)NCI-H226和NCI-H647；肺鳞状细胞癌(SCC)RERF-LC-AI，SK-MES-1，EBC-1，LC176，LU61，NCI-H520，NCI-H1703，和NCI-H2170；肺大细胞癌(LCC)LX1；和小细胞肺癌(SCLC)DMS114，DMS273，SBC-3和SBC-5。全部细胞在添加10％胎牛血清(FCS)的合适培养基中单层生长，保持在37℃、5％CO₂的湿润气氛中。人小气道上皮细胞(SAEC)生长在从Cambrex Bio Science公司(Walkersville，MD)购买的优化培养基(SAGM)中。如前所述从37位具有书面知情同意的患者获得原发性NSCLC样品，其中22例归类为ADC，14例归类为SCC，1例归类为ASC(Kikuchi T，et al.，Oncogene.2003；22(14)：2192-205)。另一组独立的16个原发性NSCLC，包括8例ADC和8例SCC，与相邻的正常肺组织样品一起从正在进行外科手术的患者获得。还从接受手术的患者获得了总共256例NSCLC和相邻正常肺组织，用于在组织微阵列上进行免疫染色及进一步统计分析。本研究和全部临床材料的使用均获得了各机构的伦理委员会(individual institutionalEthical Committee)的批准。

(b)半定量RT-PCR：用Trizol试剂(Life Technologies公司Gaithersburg，MD)根据制造商的规程从培养细胞和临床组织提取总RNA。将提取的RNA和正常人组织多聚(A)RNA用DNA酶I(Nippon Gene，Tokyo，Japan)处理，并用寡(dT)引物和SuperScript II反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)反转录。用下列合成的CDCA1特异性引物、KNTC2特异性引物或者作为内部对照的ACTB特异引物进行半定量RT-PCR实验：

CDCA 1，5’-GAGAAACTGAAGTCCCAGGAAAT-3’(SEQ ID NO：1)和5’-CTGATACTTCCATTCGCTTCAAC-3’(SEQ ID NO：2)；

KNTC2，5’-AAAAGAACCGAATCGTCTAGAGTC-3’(SEQ ID NO：29)和5’-CCGAGAGATCTTCTGACATGC-3’(SEQ ID NO：30)；

ACTB，5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO：3)和5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ ID NO：4)。

优化PCR反应的循环数，以确保产物强度在扩增的对数期内。

(c)Northern印迹分析：将人多组织印迹(blot)(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)与CDCA1或KNTC1的³²P标记PCR产物杂交。CDCA1和KNTC1的cDNA探针是用上述引物通过RT-PCR制备的。根据供应商的推荐进行预杂交、杂交和清洗。印迹(blot)用增感BAS屏(intensifying BASscreen)(BIO-RAD，Hercules，CA)在室温下放射自显影30个小时。

(d)抗体：为了获得抗CDCA1抗体，本发明人用pET28载体(Novagen，Madison，WI)制备了表达CDCA1部分片段(密码子15-338)的质粒，其中CDCA1部分片段在NH₂末端具有带His标签的表位。该重组肽在大肠杆菌、BL21codon-plus菌株(Stratagene，LaJolla，CA)中表达，并用TALON树脂(BDBioscience)根据供应商的规程加以纯化。从SDS-PAGE凝胶提取的蛋白质接种到兔体内；在亲和柱上根据标准方法纯化免疫血清。亲和纯化的兔多克隆抗CDCA1抗体用于western印迹、免疫沉淀和免疫染色。山羊抗KNTC2多克隆抗体从abcam公司(Cambridge，MA)购得。在western印迹上，本发明人利用内源表达或不内源表达CDCA1和KNTC2的NSCLC细胞系或者被CDCA1或KNTC2表达载体转染的细胞的裂解物证实了该抗体对CDCA1或KNTC2是特异性的。

(e)Western印迹：在下述裂解缓冲液中裂解细胞：50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、0.5％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS，加蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂合剂系列III；Calbiochem Darmstadt，Germany)。本发明人使用如前人记载(Ishikawa N，et al.，Clin Cancer Res.2004；10(24)：8363-70.)的ECL Western印迹分析系统(GE Healthcare/Amersham Biosciences Corp，Piscataway，NJ)。

(f)鉴定CDCA1关联蛋白：将来自肺癌细胞系LC319的细胞提取物与50μl蛋白A和G琼脂糖珠子在蛋白酶抑制剂的存在下、最终体积为2ml的免疫沉淀缓冲液(0.5％NP-40，50mM Tris-HCl，150mM NaCl)中，于4℃温育1小时，来加以预澄清。1,000rpm 4℃离心5min后，上清液在4℃与抗CDCA1多克隆抗体、抗KNTC2多克隆抗体、或者正常家兔IgG温育2小时。与50μl蛋白A和G琼脂糖珠子4℃温育1小时后，通过5,000rpm离心2min从每个样品收集珠子，用1ml免疫沉淀缓冲液清洗6次，清洗后的珠子重新悬浮在50μl Laemmli样品缓冲液中，煮沸5min，之后在5-10％SDS PAGE凝胶(BIO RAD)上分离蛋白质。电泳后，对凝胶银染色。将特异地出现在与抗CDCA1多克隆抗体温育的提取物中的蛋白条带切出，用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS；AXIMA-CFR plus，SHIMADZU BIOTECH，Kyoto，Japan)进行分析。为了确认CDCA1与KNTC2之间的相互作用，本发明人进行了免疫沉淀实验。为了获得pCAGGSn3Fc-CDCA1，本发明人将整个编码序列克隆到pCAGGSn3Fc-CDCA1质粒载体的合适位点中。用ABI Prism 3700DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)利用T3、T7或合成寡核苷酸引物根据制造商的说明确定每个cDNA克隆的核苷酸序列。将来自被pCAGGSn3Fc-CDCA1转染的LC319细胞的提取物分别用KNTC2多克隆抗体(Abcom，Inc.)和正常兔IgG免疫沉淀。用抗FLAG M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich Co.)进行了免疫印迹。

(g)鉴定CDCA1中的KNTC2结合区：将CDCA1的11个缺失构建体(CDCA1 200-464，CDCA1 149-464，CDCA1 1-348，CDCA1 1-148，CDCA1149-306，CDCA1 306-464，CDCA1 319-464，CDCA1 277-416，CDCA1277-367，CDCA1 319-416，和CDCA1 319-367)克隆到C端FLAG标签pCAGGS载体的合适位点中。用表达CDCA1之11个缺失构建体的质粒转染肺癌细胞系LC319，将该细胞的提取物在蛋白酶抑制剂的存在下与100μl蛋白G-琼脂糖珠子在最终体积为2ml的免疫沉淀缓冲液(0.5％NP-40，50mM Tris-HCl，150mM NaCl)中4℃温育1小时，来加以预澄清。4℃1,000rpm离心5min后，将上清液在4℃与抗FLAG M2琼脂糖一起温育2小时。通过5,000rpm离心2min从每个样品收集珠子，并用1ml免疫沉淀缓冲液清洗6次之后，将清洗后的珠子重新悬浮在50μl Laemmli样品缓冲液中，煮沸5min，然后在10％SDS PAGE凝胶上分离蛋白质。分别用KNTC2多克隆抗体(Abcom，Inc.)和抗FLAG M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich Co.)进行免疫印迹。

(h)免疫细胞化学：将培养的细胞用PBS(-)清洗2次，在4％甲醛溶液中室温固定60min，并通过用含有0.1％Triton X-100的PBS(-)处理1.5分钟使其可透过。用含3％BSA的PBS(-)覆盖细胞60分钟，以便在第一抗体反应之前封闭非特异结合。然后，将细胞与抗人CDCA1或KNTC2蛋白的抗体温育。用与Alexa488偶联的山羊抗兔第二抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)和与Alexa594偶联的驴抗山羊第二抗体(Molecular Probes)对免疫复合物进行染色，用激光共聚焦显微镜(TCS SP2AOBS：Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)进行观察。

(i)免疫组织化学和组织微阵列分析：肿瘤组织微阵列用福尔马林固定的NSCLC根据先前的公开进行构建(Ishikawa N，et al.，Clin Cancer Res.2004；10(24)：8363-70)。用于采样的组织区域根据与载玻片上相应HE染色切片的目测对齐来加以选择。用组织微阵列点样器(Beecher Instruments，Sun Prairie，WI)将从供体肿瘤块获得的3、4或5个组织核(直径0.6mm；高3-4mm)放置在接收石蜡块内。从每个病例钻取正常组织核。使用所得微阵列块的5μm切片进行免疫组织化学分析。CDCA1和KNTC2的阳性度由3位独立的研究者在事先不知道临床随访数据的情况下半定量地进行评估，每位研究者按照不存在(评分为0)、微弱(1+)或强阳性(2+)记录染色强度。只有当所有研究均确定其为强阳性(2+)时，肺癌才评分为强阳性(2+)。为了研究临床材料中CDCA1/KNTC2蛋白的存在，本发明人用ENVISION+Kit/HRP(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)对组织切片进行染色。在封闭内源过氧化物酶和蛋白质之后，添加亲和纯化的抗CDCA1抗体或抗KNTC2抗体，并将每个切片与作为第二抗体的HRP-标记的抗兔或抗山羊IgG温育。添加底物-色原，用苏木精复染。

(j)统计分析：本发明人尝试将临床病理变量，例如年龄、性别和病理TNM阶段，与通过组织微阵列分析确定的CDCA1和/或KNTC2蛋白的表达水平相互关联起来。从手术时起，到NSCLC相关的死亡时或到最后随访观察止，计算肿瘤特异的生存曲线。对每个相关变量和CDCA1/KNTC2的表达计算Kaplan-Meier曲线；用log-rank时序检验分析(log-rank test)患者亚群之间的生存时间差异。用Cox风险比例-危险回归模型进行单变量和多变量分析，确定临床病理变量与癌症相关死亡率之间的关联。首先，本发明人分析了死亡与可能的预后因素包括年龄、性别、pT分类和pN分类的关联，一次考虑一个因素。其次，采用总是强迫CDCA1/KNTC2表达以及任意或全部满足进入水平即p值小于0.05的变量进入模型的向后(逐步)程序进行多变量Cox分析。该模型不断加入因素时，独立因素没有超过P＜0.05的出口水平。

(k)RNA干扰测定：本发明人先前建立了基于载体的RNA干扰(RNAi)系统psiHlBX3.0，其设计用于在哺乳动物内合成siRNA(Shimokawa T，et al.，Cancer Res.2003；63(19)：6116-20)。通过将表1中的双链寡核苷酸克隆进入psiHlBX载体的BbsI位点制备针对CDCA1(si-CDCA1)和KNTC2(si-KNTC2)的siRNA表达载体。将10μg siRNA表达载体用30μlLipofectamine 2000(Invitrogen)转染进入NSCLC细胞系A549和LC319。转染的细胞在合适浓度遗传霉素(G418)的存在下培养7天，通过Giemsa染色计数集落数目，并且在处理7天后通过MTT测定评估细胞的生存力；简而言之，向每个培养皿添加浓度为1/10体积的细胞计数试剂盒-8(cell countingkit-8)溶液(DOJINDO，Kumamoto，Japan)，将培养板在37℃继续温育4小时。用Microplate Reader 550(BIO-RAD)测量490nm吸光度，以630nm作为参比。为了证实CDCA1或KNTC2mRNA表达的抑制，用如下的合成CDCA1特异引物和KNTC2特异引物根据标准规程进行半定量RT-PCR实验。用于RNAi的合成寡核苷酸的靶序列如下：(EGFP：增强绿色荧光蛋白(GFP)基因，维多利亚多管水母(Aequorea victoria)GFP突变体)，5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ ID NO：5)；对照2(乱序：编码5S和16SrRNA的叶绿体小眼虫(Euglena gracilis)基因)，5’-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3’(SEQ ID NO：6)；对照3(萤光素酶：北美萤火虫(Photinus pyralis)萤光素酶基因)，5’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3’(SEQ ID NO：7)；siRNA-CDCA1-#2，5’-AAGATGCTGCTGAAAGGGAGA-3’(SEQ ID NO：8)；siRNA-KNTC2-#1，5’-GCTGGATGATCTTTACCAA-3’(SEQID NO：9)。

表1：

插入siRNA表达载体的特异性双链寡核苷酸序列和各siRNA的靶序列

基因		核苷酸序列	SEQ ID NO：
基因		核苷酸序列	SEQ ID NO：	EGFP	插入	TCCCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC	14
EGFP	插入	AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC	15	EGFP	插入	TCCCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC	14
EGFP	插入	AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC	15	EGFP	发夹	GAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC	16
SCR	插入	TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC	17	EGFP	发夹	GAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC	16
SCR	插入	TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC	17	SCR	插入	AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC	18
SCR	发夹	GCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC	19	SCR	插入	AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC	18
SCR	发夹	GCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC	19	LUC	插入	TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG	20
LUC	插入	AAAACGTACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAATCGAAGTATTCCGCGTACG	21	LUC	插入	TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG	20
LUC	插入	AAAACGTACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAATCGAAGTATTCCGCGTACG	21	LUC	发夹	CGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG	22
CDCA1	插入	TCCCAAGATGCTGCTGAAAGGGAGATTCAAGAGATCTCCCTTTCAGCAGCATCTT	23	LUC	发夹	CGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG	22
CDCA1	插入	TCCCAAGATGCTGCTGAAAGGGAGATTCAAGAGATCTCCCTTTCAGCAGCATCTT	23	CDCA1	插入	AAAAAAGATGCTGCTGAAAGGGAGATCTCTTGAATCTCCCTTTCAGCAGCATCTT	24
CDCA1	发夹	AAGATGCTGCTGAAAGGGAGATTCAAGAGATCTCCCTTTCAGCAGCATCTT	25	CDCA1	插入	AAAAAAGATGCTGCTGAAAGGGAGATCTCTTGAATCTCCCTTTCAGCAGCATCTT	24
CDCA1	发夹	AAGATGCTGCTGAAAGGGAGATTCAAGAGATCTCCCTTTCAGCAGCATCTT	25	KNTC2	插入	TCCCGCTGGATGATCTTTACCAATTCAAGAGATTGGTAAAGATCATCCAGC	26
KNTC2	插入	AAAAGCTGGATGATCTTTACCAATCTCTTGAATTGGTAAAGATCATCCAGC	27	KNTC2	插入	TCCCGCTGGATGATCTTTACCAATTCAAGAGATTGGTAAAGATCATCCAGC	26
KNTC2	插入	AAAAGCTGGATGATCTTTACCAATCTCTTGAATTGGTAAAGATCATCCAGC	27	KNTC2	发夹	GCTGGATGATCTTTACCAATTCAAGAGATTGGTAAAGATCATCCAGC	28

(1)合成显性失活肽：来源于CDCA1之KNTC2结合域的显性失活20或19氨基酸序列在其N端与膜转导性11聚精氨酸序列(11R)共价连接。合成了4种显性失活肽：11R-CDCA1368-387，

RRRRRRRRRRR-GGG-QYKRTVIEDCNKVQEKRGAV(SEQ ID NO：10)；11R-CDCA1378-397，

RRRRRRRRRRR-GGG-NKVQEKRGAVYERVTTINQE(SEQ ID NO：11)，11R-CDCA1 388-407，RRRRRRRRRRR-GGG-YERVTTINQEIQKIKLGIQQ(SEQ ID NO：12)；11R-CDCA1398-416

RRRRRRRRRRR-GGG-IQKIKLGIQQLKDAAEREK(SEQ ID NO：13)。用制备型反相HPLC对肽进行纯化，且纯度＞95％。

(m)11R-肽对肺癌细胞生长的效果：LC319和A546以及源自正常人肺成纤维细胞的MRC5细胞与浓度为5μM，10μM，和20μM的11R-肽温育7天。培养基每隔一天更换一次，使每种肽处于合适的浓度，并在处理后7天通过MTT测定评估细胞的生存能力；简而言之，向每个培养皿添加浓度为1/10体积的细胞计数试剂盒-8溶液(DOJINDO，Kumamoto，Japan)，培养板在37℃继续温育4小时。然后用Microplate Reader 550(BIO-RAD)测量490nm吸光度，以630nm作为参比。如前所述地进行流式细胞术分析(Suzuki，C.et al.Cancer Res.65，11314-11325(2005).)。

(n)小鼠模型：动物实验根据实验动物照看和使用的机构和国家指导方针进行，并获得机构动物使用委员会的批准。将1×10⁶个A549细胞皮下植入到6周龄BALB/c雄性裸鼠(nu/nu)的右肩。注射2周后，将带有肿瘤(平均体积30mm³)的小鼠随机分为3组，并用11R-CDCAl398-416肽(0.15μmol/只/天)、乱序(0.15μmol/只/天)或PBS(对照)肿瘤内给药7周。每天使用卡钳测量肿瘤的体积，并将数据代入公式(体积＝0.52×[宽度]²×[长度])计算球状体的体积。

结果

(a)CDCA1和KNTC2基因共激活：利用代表23,040个基因的cDNA微阵列筛选在大部分NSCLC中高度反式激活的元件，鉴定出CDCA1(登录号NO.hCT1957725(Celera)SEQ ID NO：33，34)为良好的候选物。该基因在绝大部分被检NSCLC病例中显示3倍或者更高的表达。随后，在另外16个NSCLC病例中的10例(8例ADC中的4例，8例SCC中的6例)中用半定量RT-PCR实验确认了其反式激活(图1A)。在所检查的全部23个NSCLC和SCLC细胞系中均观察到CDCA1上调，而在来源于正常支气管上皮的SAEC细胞中几乎不能检测到转录物(图1B)。在12个肺癌细胞系中，使用抗CDCA1抗体在western印迹上确认了CDCA1的内源表达(数据未显示)。用CDCA1cDNA作为探针进行的Northern印迹分析鉴定了一个2.4kb转录物；只在睾丸中观察到大量存在，表明CDCA1是典型的癌-睾丸抗原(图1C)。

(b)鉴定KNTC2是与CDCA1相互作用的蛋白质：为了阐释CDCA1在肺癌细胞中的功能，本发明人首先寻找可以和CDCA1相互作用的蛋白质。提取LC319细胞的裂解物，用抗CDCA1抗体免疫沉淀。蛋白复合物用SilverQuest(Invitrogen)在SDS-PAGE凝胶上染色。提取出现于被抗CDCA1免疫沉淀的细胞裂解物中但不出现于用正常兔IgG免疫沉淀的细胞裂解物中的75kDa条带，通过MALDI-TOF质谱确定其肽序列。该程序鉴定KNTC2(GenBank登陆号NO.NM 006101，SEQ ID NO：31，32)是CDCA1相互作用蛋白的候选物。外源CDCA1和内源KNTC2的关连(cognate)相互作用免疫沉淀实验确认(图2A)。

为了确定内源CDCA1和KNTC2在肺癌细胞中的亚细胞定位，用兔多克隆抗CDCA1和山羊多克隆抗KNTC2抗体进行免疫细胞化学分析；检测到两种蛋白质在G1/S期主要共定位于中心体和细胞核，在G2/M期共定位于中心体和着丝粒(图2B)。

随后对原发NSCLC组织和肺癌细胞系进行重新检查，通过半定量RT-PCR实验发现，在16例NSCLC临床样品的9例中(8例ADC中的3例，8例SCC中的6例)，以及在全部23个肺癌细胞系中KNTC2表达提高(图1A，B)。相对于ACTB基因更高的CDCA1和KNTC2基因mRNA表达图式在临床样品中是显著相关的(χ²-检验P＜0.001)。这两个基因还在几乎所有被检的肺癌细胞系中共激活(χ²-检验P＜0.001)。用KNTC2cDNA作为探针的Northern印迹鉴定了一个只在睾丸大量存在的2.5-kb转录物，表明KNTC2属于癌-睾丸抗原范畴(图1C)。KNTC2在肺癌和正常组织中的表达分布图式与CDCA1非常相似。

(c)鉴定CDCA1的KNTC2结合区域：为了确定CDCA1中与KNTC2相互作用所需的具体域，将6种具有COOH(C)端FLAG-序列的CDCA1缺失构建体(CDCA1 200-464，CDCA1 149-464，CDCA1 1-348，CDCA1 1-148，CDCA1 149-306，和CDCA1 306-464)其中之一转染进入LC319细胞。使用单克隆抗Flag抗体的免疫沉淀表明，缺失C端158个氨基酸的CDCA1 1-148和CDCA1 149-306构建体不能与内源KNTC2相互作用(图2C)。为了进一步确定CDCA1的最小KNTC2结合域，将额外的5种具有C端FLAG序列的CDCA1缺失构建体(CDCA1 319-464，CDCA1 277-416，CDCA1 277-367，CDCA1 319-416，和CDCA1 319-367)其中之一转染进入LC319细胞。使用单克隆抗Flag抗体的免疫沉淀表明，缺失CDCA1 368-416中49个氨基酸的CDCA1 277-367和CDCA1 319-367构建体不能与内源KNTC2相互作用(图2D)。

(d)CDCA1和KNTC2过度表达与不良预后的关联：使用从256例NSCLC制备的组织微阵列，用亲和纯化的抗CDCA1和KNTC2多克隆抗体进行免疫组织化学分析，分别在225(88％)和225(88％)例中见到阳性染色。其中，对于CDCA1染色，138例ADC肿瘤中的117例(85％)为阳性；80例中的72例是SCC(90％)；21例中的19例是LCC(90％)，全部10例BAC(100％)和全部7例ASC(100％)呈阳性，而对于KNTC2染色，138例ADC肿瘤中的117例为阳性(85％)；80例中的75例为SCC(94％)；21例中的20例为LCC(95％)，全部10例BAC(100％)和全部7例ASC(100％)呈阳性。所有这些肿瘤均是手术切除的NSCLC，在任何相邻的正常肺组织中未观察到染色(图3A)。在这些肿瘤中，CDCA1蛋白的表达图式与KNTC2蛋白表达显著一致(χ²-检验P＜0.001)，证实了RT-PCR和Western印迹的结果。CDCA1/KNTC2的表达图式被归类为无/微弱(打分0～1+)或强(打分2+)。具有同时表现CDCA1和KNTC2强烈阳性的肿瘤的病例很可能具有更差的预后(Log rank时序检验P＝0.146；图3B)。在该CDCA1/KNTC2免疫染色实验中长期和短期生存者的定义如下：

长期生存者：属于平均5年生存比例至少为69％的患者组的患者，和短期生存者：属于平均5年生存比例不超过45％的患者组的患者。

而且，使用从282例石蜡包埋NSCLC制备的组织微阵列，用亲和纯化的抗CDCA1和抗KNTC2多克隆抗体进行免疫组织化学分析。

CDCA1/KNTC2的表达图式被归类为无/微弱(打分0～1+)或强(打分2+)。所检查的282例NSCLC中，95例(33.7％)显示强烈CDCA1染色(打分2+)，113例(40.1％)中可见微弱染色(打分1+)，74例(26.2％)中没有观察到染色(打分0)。对于KNTC2，在112例(39.7％)中观察到强烈染色(打分2+)，122例(43.3％)中可见微弱染色(打分1+)，48例(17％)中没有观察到染色(打分0)。所有这些肿瘤均是手术切割NSCLC病例，在其任何相邻正常肺组织中未观察到染色(图1c)。282例肿瘤中有189例对CDCA1和KNTC2同时阳性(打分为1+～2+)，有29例对两种蛋白均为阴性。282例肿瘤中有19例只对CDCA1阳性，有45例只对KNTC2阳性。在这些肿瘤中CDCA1蛋白的表达图式与KNTC2蛋白的表达显著一致(χ²-检验P＜0.0001)，进一步确证了RT-PCR和Western印迹的结果，提示CDCA1和KNTC2可能具有共同的转录调节因子。CDCA1在NSCLC中的强烈表达与pT因素状态显著相关(χ²＝5.473，P＝0.019)，并与肿瘤特异性5年生存显著相关(Log-rank时序检验P＝0.0233)(图3C)。KNTC2在NSCLC中的强烈表达与pT因素状态显著相关(χ²＝11.664，P＝0.0006)，并与5年生存能力显著相关(时序检验P＝0.0384)(图3D)。肿瘤既不表达CDCA1也不表达KNTC2的NSCLC患者可获得最佳的生存效益，而两个标记均为强阳性的患者肿瘤特异生存时间最短(Log rank时序检验P＝0.0250；图3E)。利用单变量分析，本发明人发现淋巴结状态(N0对N1，N2：P＜0.0001；计分检验)、肿瘤大小(T1对T2，T3，T4：P＜0.001；计分检验)和高CDCA1/KNTC2表达(P分别为0.0233，0.0384；计分检验)是NSCLC患者不良预后的重要相关特征。

(e)通过针对CDCA1和KNTC2的特异siRNA抑制NSCLC细胞生长：

为了评估CDCA1和KNTC2是否对于肺癌细胞生长或生存至关重要，构建质粒表达针对CDCA 1(si-CDCA1)或KNTC2(si-KNTC2)的siRNA，用针对EGFP、萤光素酶和乱序的siRNA作为对照。将任一质粒(si-CDCA1-#2或si-KNTC2#1)转染进入A549或LC319细胞，与对照相比，显著抑制了内源CDCA1或KNTC2蛋白的表达，导致MTT(非配对t检验分别为P＝0.0008和0.0005)和集落形成测定(A549的代表性数据如图4A，B所示)测得的细胞生存能力和集落数目明显降低。

(f)CDCA1的显性失活肽对NSCLC细胞生长的抑制：为了调查CDCA1-KNTC2相互作用在功能上对于肺癌细胞生长或生存的重要性，考察了一种CDCA1缺失片段(CDCA1200-464；见图2C)抑制CDCA1与KNTC2之间直接相互作用的显性负作用，该缺失片段缺少CDCA1的N端部分，但与其他缺失突变体相比显示与内源KNTC2有最强的亲和性。由于用抗CDCA1/KNTC2抗体免疫沉淀的内源CDCA1条带与IgG重链条带重叠，难以检测内源CDCA1和KNTC2的相互作用。因此，为了证实CDCA1和KNTC2之间的直接相互作用受到CDCA1 200-464构建体的抑制，将两个质粒组合：CDCA1 1-464(全长)和CDCA1 200-464；或CDCA1 1-464(全长)和不能与内源KNTC2相互作用的CDCA1 149-306(对照)(图5A，左二上图)，共转染进入LC319细胞。用抗KNTC2多克隆抗体进行免疫沉淀只检测到CDCA1 1-464(全长)或CDCA1 200-464与内源KNTC2的相互作用(图5A；左上图；黑白箭头)。进一步证实，CDCA1 200-464的过度表达降低外源CDCA1(CDCA11-464；全长)与内源KNTC2间复合物的形成(图5A；左上图；黑箭头)。CDCA1200-464与内源KNTC2在LC319细胞中共定位还通过免疫细胞化学得到了证实(图5A；右图)。接着，将编码CDCA1200-464的质粒转染进入LC319细胞，检测该构建体的显性失活效应。如预期的，转染CDCA1 200-464的显性失活片段导致MTT测定测得的细胞生存能力显著降低(非配对t检验P＝0.0026，CDCA1 200-464对CDCA1 149-306；图5B)。

如图2D所示，CDCA1 368-416的49氨基酸肽被认为是与内源KNTC2相互作用最重要的区域。为了开发能够在体内抑制CDCA1-KNTC2复合物形成的生物活性细胞透过性化合物，合成了4种氨基酸多肽，它们覆盖CDCA1 368-416的KNTC2结合域，且其N端与膜转导11聚精氨酸序列(11R)共价连接。为了检验这些聚精氨酸连接肽对肺癌细胞生长/生存能力的效果，分别用4种CDCA1衍生肽之一处理LC319细胞。通过MTT测定得知，11R-CDCA1 398-416的转染导致细胞生存能力显著且呈剂量依赖地降低(图5C；非配对t检验P＝0.001或0.0021)。11R-CDCA1398-416处理72小时以后，数个细胞进入细胞周期并被阻止于有丝分裂期，显示圆形细胞学形态，与siRNA抑制CDCA1或KNTC2的效果非常相似(数据未显示)。对比地，未处理细胞与用非有效肽处理的细胞之间在细胞形态学上没有差异，它们均显示正常的间期细胞呈伸展形、有丝分裂细胞呈圆形的分布。为了阐明11R-CDCA1398-416肽抑制肿瘤的机制，对用这些肽处理的肿瘤细胞进行流式细胞术分析，发现细胞引起G2/M阻断，处理72小时后亚G1级分(sub-G1fraction)显著增加(图6A)。11R-CDCA1398-416对正常肺成纤维细胞衍生的MRC5细胞的细胞生存力没有影响，其中MR5细胞的CDCA1和KNTC2表达水平几乎不能检测到(图6B)。这些数据表明，可转导11R-CDCA1398-416肽能够抑制CDCA1和KNTC2功能复合物的形成，而且对不表达这些蛋白的正常人类细胞没有毒性作用。

(g)显性失活肽对NSCLC细胞的体内生长抑制：为了进一步研究CDCA1的显性失活肽的体内抑制肿瘤效果，将A549细胞皮下植入6周龄BALB/c小鼠的右肩，并通过肿瘤内注射11R-CDCA1398-416肽(0.15μmol/只/天)、乱序肽(0.15μmol/只/天)或PBS(对照)处理小鼠7周。三个处理组中体重或食物摄入没有差异(数据未显示)。肿瘤生长受到11R-CDCA1398-416肽的显著抑制，但不被乱序肽或PBS抑制(图7A，B)。这些数据表明，CDCA1的显性失活肽在体外和体内对癌细胞具有生长抑制效果，并且抑制CDCA1-KNTC2相互作用可能是开发新型抗癌药物的潜力靶标。

讨论

尽管迄今为止已经报道了许多用于肺癌治疗的分子靶标，但是在临床环境下显示抗癌生物活性且有害副作用极小的物质几乎没有。因此，本发明人以开发用于肺癌治疗新型小化合物为目的尝试了鉴定上调基因。策略如下：1)通过用eDNA微阵列系统进行全基因组筛选，鉴定NSCLC中的上调基因，2)通过多组织Northern印迹核实候选基因在正常器官中最小限度表达，3)通过组织微阵列在数百个NSCLC组织样品中确认过高表达和与临床病理学因素的相互关联，和4)用siRNA核实靶基因对于肺癌细胞生存或生长至关重要。通过这种系统的方法，鉴定了两种新型癌-睾丸抗原，CDCA1和KNTC2，在大部分临床NSCLC样品和细胞系中共同过高表达。此外，发现由这些基因的产物形成的复合物对于NSCLC细胞的生长和进展不可或缺。

有人指出CDCA1和KNTC2参与有丝分裂的调节(Ciferri，C.et al.J BiolChem.280，29088-95(2005).)。在人类肿瘤细胞中，大部分有丝分裂调节蛋白的与其正常的对应物相比异常表达，其中一些已知起癌基因的作用(Nicholas，K.and Stephen，T.Nat Rev Cancer.4，927-36(2004).)。其中一个亚类还被预期为用于开发新型抗癌剂的可能靶分子来源。例如，高度保守的极光激酶(aurora kinase)就是其中一个有丝分裂关键调节物家族(Doggrell，S.A.ExpertOpin Investig Drugs.13，1199-201(2004).)。事实上，最近有几种极光激酶抑制剂包括ZM447439、Hesperadin和VX-680被描述为抗癌药物(Doggrell，S.A.Expert Opin Investig Drugs.13，1199-201(2004)；Harrington，E.A.et al.NatMed.10，262-7(2004).)。在本研究中，本发明人通过组织微阵列分析发现，显示CDCA1/KNTC2大量表达的NSCLC患者具有较短的肿瘤特异生存期，因此提示CDCA1和KNTC2一道在肺癌进展中发挥重要作用。

对于新分子靶标，人们预期其估计的各种影响最小，同时具有强大的抗癌生物活性。CDCA1和KNTC2均已知是细胞周期调节物，利用我们的MTN筛选，本发明人证明，这两种蛋白质属于癌-睾丸抗原。本发明人还证明，CDCA1和KNTC2在NSCLC中同时过高表达。从256或282例NSCLC制备的组织微阵列上免疫组织化学分析显示，对两种蛋白均显强阳性染色的NSCLC的患者很可能显示更短的肿瘤特异性生存时间，提示CDCA1与KNTC2一起对于肺癌进展具有关键作用。而且，抑制内源CDCA1或KNTC2降低了它们的表达，并抑制了A549和LC319细胞的生长。此外，本发明人首次证明，这些结合被CDCA1蛋白的显性失活形式以及由膜转导聚精氨酸序列和CDCA1衍生的19氨基酸肽(密码子398-416)构成的合成33氨基酸多肽阻断，继而肺癌细胞的生长被有效抑制。最近，几个研究组报道，抑制分子间相互作用导致复合物功能丧失。例如，将一种细胞透过性短肽与来源于JNK相互作用蛋白1(JIP-1)之JNK结合域的20氨基酸序列共价连接，可改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，并改善糖耐量(Kaneto H，et al.，NatMed.2004；10：1128-32)。此外，一种细胞透过肽(SN50)阻断NF-[κ]B在外来刺激物激活后的转位(Lin YZ，et al.，J Biol Chem.1995；270：14255-8)。阻断NF-[κ]B可保护[β]细胞免于IL-1[β]诱导的细胞凋亡(Stephens LA，et al.，JAutoimmun.1997；10：293-8)。类似的方法已成功用于阻断活化性蛋白1(AP-1)、活化T细胞的一种核因子(NFAT)和一种信号转导及转录激活因子(STAT)1的细胞核移入(Torgerson TR，et al.，J Immunol.1998；161：6084-92；Bonny C，et al.，Diabetes.2001；50：77-82)。所有这些表明，将大蛋白质转化为小化合物更容易成功。选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞没有或者只有极小毒性作用在癌症患者治疗中是最理想的。Chen等报道，一些细胞膜透过性肽诱导癌细胞以比未转染细胞相对更高的水平经历细胞凋亡，这些肽含有抑制底物被细胞周期蛋白A(CCNA)/细胞周期依赖的激酶2(CDK2)或细胞周期蛋白E(CCNE)/CDK2磷酸化的基序(Chen，Y.N.et al.Proc Natl AcadSci U S A.96，4325-9(1999).)。也有报道称，阻断p53-MDM2相互作用的抗MDM2肽在玻璃体内注射后可诱发p53快速积累，激活细胞凋亡诱发基因，优先杀伤成视网膜母细胞瘤细胞，并且只有极小的视网膜损伤(Harbour，J.W.et al.Arch.Ophthalmol.2，1341-6(2002).)。我们使用特异性靶向癌细胞的细胞透过性肽的结果提示，抑制CDCA1-KNTC2复合物为开发作为抗肿瘤药剂的新型拮抗剂提供了理论依据。

总之，本发明人发现，CDCA1-KNTC2癌-睾丸抗原复合物在癌细胞生长和/或生存中发挥特殊的功能作用。我们的数据显示了设计新的抗癌肽以及特异靶向CDCA1和KNTC2和/或其复合物活性的小化合物，作为治疗肺癌患者的治疗策略的可行性。

应当理解，这里描述的实施例和实施方案只是出于举例说明的目的，本领域的技术人员可以想到它的各种修改或改变，并且这些修改或改变也包含在本申请的精神和以及由附加权利要求限定的本发明范围内。这里引用的全部出版物、专利和专利申请的全部内容并入本文作为参考。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)

<120>以CDCA1-KNTC2复合物为靶标的筛选和NSCLC治疗方法

<130>ONC-A0515P

<150>US 60/703,704

<151>2005-07-29

<160>50

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>1

gagaaactga agtcccagga aat 23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>2

ctgatacttc cattcgcttc aac 23

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>3

gaggtgatag cattgctttc g 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>4

caagtcagtg tacaggtaag c 21

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>5

gaagcagcac gacttcttc 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>6

gcgcgctttg taggattcg 19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>7

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<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>8

aagatgctgc tgaaagggag a 21

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA靶序列

<400>9

gctggatgat ctttaccaa 19

<210>10

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>用于显性失活构建体的人工合成肽序列

<400>10

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gln Tyr

1 5 10 15

Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg Gly

20 25 30

Ala Val

<210>11

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>用于显性失活构建体的人工合成肽序列

<400>11

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg G]y Gly Gly Asn Lys

1 5 10 15

Val Gln Glu Lys Arg Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn

20 25 30

Gln Glu

<210>12

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>用于显性失活构建体的人工合成肽序列

<400>12

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Tyr Glu

1 5 10 15

Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys Ile Lys Leu Gly Ile

20 25 30

Gln Gln

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>用于显性失活构建体的人工合成肽序列

<400>13

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ile Gln

1 5 10 15

Lys Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu

20 25 30

Lys

<210>14

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>14

tcccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>15

aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51

<210>16

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的发夹结构

<400>16

gaagcagcac gacttcttct tcaagagaga agaagtcgtg ctgcttc 47

<210>17

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>17

tcccgcgcgc tttgtaggat tcgttcaaga gacgaatcct acaaagcgcg c 51

<210>18

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>18

aaaagcgcgc tttgtaggat tcgtctcttg aacgaatcct acaaagcgcg c 51

<210>19

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的发夹结构

<400>19

gcgcgctttg taggattcgt tcaagagacg aatcctacaa agcgcgc 47

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>20

tccccgtacg cggaatactt cgattcaaga gatcgaagta ttccgcgtac g 51

<210>21

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建s iRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>21

aaaacgtacg cggaatactt cgatctcttg aatcgaagta ttccgcgtac g 51

<210>22

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的发夹结构

<400>22

cgtacgcgga atacttcgat tcaagagatc gaagtattcc gcgtacg 47

<210>23

<211>55

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>23

tcccaagatg ctgctgaaag ggagattcaa gagatctccc tttcagcagc atctt 55

<210>24

<211>55

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>24

aaaaaagatg ctgctgaaag ggagatctct tgaatctccc tttcagcagc atctt 55

<210>25

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA发夹设计

<400>25

aagatgctgc tgaaagggag attcaagaga tctccctttc agcagcatct t 51

<210>26

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>26

tcccgctgga tgatctttac caattcaaga gattggtaaa gatcatccag c 51

<210>27

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸

<400>27

aaaagctgga tgatctttac caatctcttg aattggtaaa gatcatccag c 51

<210>28

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA发夹设计

<400>28

gctggatgat ctttaccaat tcaagagatt ggtaaagatc atccagc 47

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>29

aaaagaaccg aatcgtctag agtc 24

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>30

ccgagagatc ttctgacatg c 21

<210>31

<211>2150

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(105)..(2033)

<400>31

ctcgagccac gaaggccccg ctgtcctgtc tagcagatac ttgcacggtt tacagaaatt 60

cggtccctgg gtcgtgtcag gaaactggaa aaaaggtcat aagc atg aag cgc agt 116

Met Lys Arg Ser

1

tca gtt tcc agc ggt ggt gct ggc cgc ctc tcc atg cag gag tta aga 164

Ser Val Ser Ser Gly Gly Ala Gly Arg Leu Ser Met Gln Glu Leu Arg

5 10 15 20

tcc cag gat gta aat aaa caa ggc ctc tat acc cct caa acc aaa gag 212

Ser Gln Asp Val Asn Lys Gln Gly Leu Tyr Thr Pro Gln Thr Lys Glu

25 30 35

aaa cca acc ttt gga aag ttg agt ata aac aaa ccg aca tct gaa aga 260

Lys Pro Thr Phe Gly Lys Leu Ser Ile Asn Lys Pro Thr Ser Glu Arg

40 45 50

aaa gtc tcg cta ttt ggc aaa aga act agt gga cat gga tcc cgg aat 308

Lys Val Ser Leu Phe Gly Lys Arg Thr Ser Gly His Gly Ser Arg Asn

55 60 65

agt caa ctt ggt ata ttt tcc agt tct gag aaa atc aag gac ccg aga 356

Ser Gln Leu Gly Ile Phe Ser Ser Ser Glu Lys Ile Lys Asp Pro Arg

70 75 80

cca ctt aat gac aaa gca ttc att cag cag tgt att cga caa ctc tgt 404

Pro Leu Asn Asp Lys Ala Phe Ile Gln Gln Cys Ile Arg Gln Leu Cys

85 90 95 100

gag ttt ctt aca gaa aat ggt tat gca cat aat gtg tcc atg aaa tct 452

Glu Phe Leu Thr Glu Asn Gly Tyr Ala His Asn Val Ser Met Lys Ser

105 110 115

cta caa gct ccc tct gtt aaa gac ttc ctg aag atc ttc aca ttt ctt 500

Leu Gln Ala Pro Ser Val Lys Asp Phe Leu Lys Ile Phe Thr Phe Leu

120 125 130

tat ggc ttc ctg tgc ccc tca tac gaa ctt cct gac aca aag ttt gaa 548

Tyr Gly Phe Leu Cys Pro Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Thr Lys Phe Glu

135 140 145

gaa gag gtt cca aga atc ttt aaa gac ctt ggg tat cct ttt gca cta 596

Glu Glu Val Pro Arg Ile Phe Lys Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Ala Leu

150 155 160

tcc aaa agc tcc atg tac aca gtg ggg gct cct cat aca tgg cct cac 644

Ser Lys Ser Ser Met Tyr Thr Val Gly Ala Pro His Thr Trp Pro His

165 170 175 180

att gtg gca gcc tta gtt tgg cta ata gac tgc atc aag ata cat act 692

Ile Val Ala Ala Leu Val Trp Leu Ile Asp Cys Ile Lys Ile His Thr

185 190 195

gcc atg aaa gaa agc tca cct tta ttt gat gat ggg cag cct tgg gga 740

Ala Met Lys Glu Ser Ser Pro Leu Phe Asp Asp Gly Gln Pro Trp Gly

200 205 210

gaa gaa act gaa gat gga att atg cat aat aag ttg ttt ttg gac tac 788

Glu Glu Thr Glu Asp Gly Ile Met His Asn Lys Leu Phe Leu Asp Tyr

215 220 225

acc ata aaa tgc tat gag agt ttt atg agt ggt gcc gac agc ttt gat 836

Thr Ile Lys Cys Tyr Glu Ser Phe Met Ser Gly Ala Asp Ser Phe Asp

230 235 240

gag atg aat gca gag ctg cag tca aaa ctg aag gat tta ttt aat gtg 884

Glu Met Asn Ala Glu Leu Gln Ser Lys Leu Lys Asp Leu Phe Asn Val

245 250 255 260

gat gct ttt aag ctg gaa tca tta gaa gca aaa aac aga gca ttg aat 932

Asp Ala Phe Lys Leu Glu Ser Leu Glu Ala Lys Asn Arg Ala Leu Asn

265 270 275

gaa cag att gca aga ttg gaa caa gaa aga gaa aaa gaa ccg aat cgt 980

Glu Gln Ile Ala Arg Leu Glu Gln Glu Arg Glu Lys Glu Pro Asn Arg

280 285 290

cta gag tcg ttg aga aaa ctg aag gct tcc tta caa gga gat gtt caa 1028

Leu Glu Ser Leu Arg Lys Leu Lys Ala Ser Leu Gln Gly Asp Val Gln

295 300 305

aag tat cag gca tac atg agc aat ttg gag tct cat tca gcc att ctt 1076

Lys Tyr Gln Ala Tyr Met Ser Asn Leu Glu Ser His Ser Ala Ile Leu

310 315 320

gac cag aaa tta aat ggt ctc aat gag gaa att gct aga gta gaa cta 1124

Asp Gln Lys Leu Asn Gly Leu Asn Glu Glu Ile Ala Arg Val Glu Leu

325 330 335 340

gaa tgt gaa aca ata aaa cag gag aac act cga cta cag aat atc att 1172

Glu Cys Glu Thr Ile Lys Gln Glu Asn Thr Arg Leu Gln Asn Ile Ile

345 350 355

gac aac cag aag tac tca gtt gca gac att gag cga ata aat cat gaa 1220

Asp Asn Gln Lys Tyr Ser Val Ala Asp Ile Glu Arg Ile Asn His Glu

360 365 370

aga aat gaa ttg cag cag act att aat aaa tta acc aag gac ctg gaa 1268

Arg Asn Glu Leu Gln Gln Thr Ile Asn Lys Leu Thr Lys Asp Leu Glu

375 380 385

gct gaa caa cag aag ttg tgg aat gag gag tta aaa tat gcc aga ggc 1316

Ala Glu Gln Gln Lys Leu Trp Asn Glu Glu Leu Lys Tyr Ala Arg Gly

390 395 400

aaa gaa gcg att gaa aca caa tta gca gag tat cac aaa ttg gct aga 1364

Lys Glu Ala Ile Glu Thr Gln Leu Ala Glu Tyr His Lys Leu Ala Arg

405 410 415 420

aaa tta aaa ctt att cct aaa ggt gct gag aat tcc aaa ggt tat gac 1412

Lys Leu Lys Leu Ile Pro Lys Gly Ala Glu Asn Ser Lys Gly Tyr Asp

425 430 435

ttt gaa att aag ttt aat ccc gag gct ggt gcc aac tgc ctt gtc aaa 1460

Phe Glu Ile Lys Phe Asn Pro Glu Ala Gly Ala Asn Cys Leu Val Lys

440 445 450

tac agg gct caa gtt tat gta cct ctt aag gaa ctc ctg aat gaa act 1508

Tyr Arg Ala Gln Val Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu Leu Asn Glu Thr

455 460 465

gaa gaa gaa att aat aaa gcc cta aat aaa aaa atg ggt ttg gag gat 1556

Glu Glu Glu Ile Asn Lys Ala Leu Asn Lys Lys Met Gly Leu Glu Asp

470 475 480

act tta gaa caa ttg aat gca atg ata aca gaa agc aag aga agt gtg 1604

Thr Leu Glu Gln Leu Asn Ala Met Ile Thr Glu Ser Lys Arg Ser Val

485 490 495 500

aga act ctg aaa gaa gaa gtt caa aag ctg gat gat ctt tac caa caa 1652

Arg Thr Leu Lys Glu Glu Val Gln Lys Leu Asp Asp Leu Tyr Gln Gln

505 510 515

aaa att aag gaa gca gag gaa gag gat gaa aaa tgt gcc agt gag ctt 1700

Lys Ile Lys Glu Ala Glu Glu Glu Asp Glu Lys Cys Ala Ser Glu Leu

520 525 530

gag tcc ttg gag aaa cac aag cac ctg cta gaa agt act gtt aac cag 1748

Glu Ser Leu Glu Lys His Lys His Leu Leu Glu Ser Thr Val Asn Gln

535 540 545

ggg ctc agt gaa gct atg aat gaa tta gat gct gtt cag cgg gaa tac 1796

Gly Leu Ser Glu Ala Met Asn Glu Leu Asp Ala Val Gln Arg Glu Tyr

550 555 560

caa cta gtt gtg caa acc acg act gaa gaa aga cga aaa gtg gga aat 1844

Gln Leu Val Val Gln Thr Thr Thr Glu Glu Arg Arg Lys Val Gly Asn

565 570 575 580

aac ttg caa cgt ctg tta gag atg gtt gct aca cat gtt ggg tct gta 1892

Asn Leu Gln Arg Leu Leu Glu Met Val Ala Thr His Val Gly Ser Val

585 590 595

gag aaa cat ctt gag gag cag att gct aaa gtt gat aga gaa tat gaa 1940

Glu Lys His Leu Glu Glu Gln Ile Ala Lys Val Asp Arg Glu Tyr Glu

600 605 610

gaa tgc atg tca gaa gat ctc tcg gaa aat att aaa gag att aga gat 1988

Glu Cys Met Ser Glu Asp Leu Ser Glu Asn Ile Lys Glu Ile Arg Asp

615 620 625

aag tat gag aag aaa gct act cta att aag tct tct gaa gaa tga 2033

Lys Tyr Glu Lys Lys Ala Thr Leu Ile Lys Ser Ser Glu Glu

630 635 640

agataaaatg ttgatcatgt atatatatcc atagtgaata aaattgtctc agtaaaaaaa 2093

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2150

<210>32

<211>642

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>32

Met Lys Arg Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Ala Gly Arg Leu Ser Met

1 5 10 15

Gln Glu Leu Arg Ser Gln Asp Val Asn Lys Gln Gly Leu Tyr Thr Pro

20 25 30

Gln Thr Lys Glu Lys Pro Thr Phe Gly Lys Leu Ser Ile Asn Lys Pro

35 40 45

Thr Ser Glu Arg Lys Val Ser Leu Phe Gly Lys Arg Thr Ser Gly His

50 55 60

Gly Ser Arg Asn Ser Gln Leu Gly lle Phe Ser Ser Ser Glu Lys Ile

65 70 75 80

Lys Asp Pro Arg Pro Leu Asn Asp Lys Ala Phe Ile Gln Gln Cys Ile

85 90 95

Arg Gln Leu Cys Glu Phe Leu Thr Glu Asn Gly Tyr Ala His Asn Val

100 105 110

Ser Met Lys Ser Leu Gln Ala Pro Ser Val Lys Asp Phe Leu Lys Ile

115 120 125

Phe Thr Phe Leu Tyr Gly Phe Leu Cys Pro Ser Tyr Glu Leu Pro Asp

130 135 140

Thr Lys Phe Glu Glu Glu Val Pro Arg Ile Phe Lys Asp Leu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Phe Ala Leu Ser Lys Ser Ser Met Tyr Thr Val Gly Ala Pro His

165 170 175

Thr Trp Pro His Ile Val Ala Ala Leu Val Trp Leu Ile Asp Cys Ile

180 185 190

Lys Ile His Thr Ala Met Lys Glu Ser Ser Pro Leu Phe Asp Asp Gly

195 200 205

Gln Pro Trp Gly Glu Glu Thr Glu Asp Gly Ile Met His Asn Lys Leu

210 215 220

Phe Leu Asp Tyr Thr Ile Lys Cys Tyr Glu Ser Phe Met Ser Gly Ala

225 230 235 240

Asp Ser Phe Asp Glu Met Asn Ala Glu Leu Gln Ser Lys Leu Lys Asp

245 250 255

Leu Phe Asn Val Asp Ala Phe Lys Leu Glu Ser Leu Glu Ala Lys Asn

260 265 270

Arg Ala Leu Asn Glu Gln Ile Ala Arg Leu Glu Gln Glu Arg Glu Lys

275 280 285

Glu Pro Asn Arg Leu Glu Ser Leu Arg Lys Leu Lys Ala Ser Leu Gln

290 295 300

Gly Asp Val Gln Lys Tyr Gln Ala Tyr Met Ser Asn Leu Glu Ser His

305 310 315 320

Ser Ala Ile Leu Asp Gln Lys Leu Asn Gly Leu Asn Glu Glu Ile Ala

325 330 335

Arg Val Glu Leu Glu Cys Glu Thr Ile Lys Gln Glu Asn Thr Arg Leu

340 345 350

Gln Asn Ile Ile Asp Asn Gln Lys Tyr Ser Val Ala Asp Ile Glu Arg

355 360 365

Ile Asn His Glu Arg Asn Glu Leu Gln Gln Thr Ile Asn Lys Leu Thr

370 375 380

Lys Asp Leu Glu Ala Glu Gln Gln Lys Leu Trp Asn Glu Glu Leu Lys

385 390 395 400

Tyr Ala Arg Gly Lys Glu Ala Ile Glu Thr Gln Leu Ala Glu Tyr His

405 410 415

Lys Leu Ala Arg Lys Leu Lys Leu Ile Pro Lys Gly Ala Glu Asn Ser

420 425 430

Lys Gly Tyr Asp Phe Glu Ile Lys Phe Asn Pro Glu Ala Gly Ala Asn

435 440 445

Cys Leu Val Lys Tyr Arg Ala Gln Val Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu

450 455 460

Leu Asn Glu Thr Glu Glu Glu Ile Asn Lys Ala Leu Asn Lys Lys Met

465 470 475 480

Gly Leu Glu Asp Thr Leu Glu Gln Leu Asn Ala Met Ile Thr Glu Ser

485 490 495

Lys Arg Ser Val Arg Thr Leu Lys Glu Glu Val Gln Lys Leu Asp Asp

500 505 510

Leu Tyr Gln Gln Lys Ile Lys Glu Ala Glu Glu Glu Asp Glu Lys Cys

515 520 525

Ala Ser Glu Leu Glu Ser Leu Glu Lys His Lys His Leu Leu Glu Ser

530 535 540

Thr Val Asn Gln Gly Leu Ser Glu Ala Met Asn Glu Leu Asp Ala Val

545 550 555 560

Gln Arg Glu Tyr Gln Leu Val Val Gln Thr Thr Thr Glu Glu Arg Arg

565 570 575

Lys Val Gly Asn Asn Leu Gln Arg Leu Leu Glu Met Val Ala Thr His

580 585 590

Val Gly Ser Val Glu Lys His Leu Glu Glu Gln Ile Ala Lys Val Asp

595 600 605

Arg Glu Tyr Glu Glu Cys Met Ser Glu Asp Leu Ser Glu Asn Ile Lys

610 615 620

Glu Ile Arg Asp Lys Tyr Glu Lys Lys Ala Thr Leu Ile Lys Ser Ser

625 630 635 640

Glu Glu

<210>33

<211>2067

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(386)..(1777)

<400>33

tggcggaatg gggcgggact tccagtagga ggcggcaagt ttgaaaagtg atgacggttg 60

acgtttgctg atttttgact ttgcttgtag ctgctccccg aactcgccgt cttcctgtcg 120

gcggccggca ctgtaggagc tcaaactatg tagttggaaa gtgtcttcat ctctcgttaa 180

tgaataaatt gtaactgaaa ttgtacttcg aaagaatgat agaatttgga tattggagga 240

ggttccaaaa ggaaatactg gaagtttggg aaagttagga gactaacttg gagcagaaat 300

ttcattcaat tattaaaggg tttagaagcc tagcagaaaa atttgaattt gatgtggtgg 360

gtaagattaa caggaaactt ccaag atg gaa act ttg tct ttc ccc aga tat 412

Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr

1 5

aat gta gct gag att gtg att cat att cgc aat aag atc tta aca gga 460

Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly

10 15 20 25

gct gat ggt aaa aac ctc acc aag aat gat ctt tat cea aat cca aag 508

Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys

30 35 40

cct gaa gtc ttg cac atg atc tac atg aga gcc tta caa ara gta tat 556

Pro Glu Val Leu His Met Ile Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr

45 50 55

gga att cga ctg gaa cat ttt tac atg atg cca gtg aac tct gaa gtc 604

Gly Ile Arg Leu Glu His Phe Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val

60 65 70

atg tat cca cat tta atg gaa ggc ttc tta cca ttc agc aat tta gtt 652

Met Tyr Pro His Leu Met Glu Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val

75 80 85

act cat ctg gac tca ttt ttg cct atc tgc cgg gtg aat gac ttt gag 700

Thr His Leu Asp Ser Phe Leu Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu

90 95 100 105

act gct gat att cta tgt cca aaa gca aaa cgg aca agt cgg ttt tta 748

Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pr0Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu

110 115 120

agt ggc att atc aac ttt att cac ttc aga gaa gca tgc cgt gaa acg 796

Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr

125 130 135

tat atg gaa ttt ctt tgg caa tat aaa tcc tct gcg gac aaa atg caa 844

Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln

140 145 150

cag tta aac gcc gca cac cag gag gca tta atg aaa ctg gag aga ctt 892

Gln Leu Asn Ala Ala His Gln Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu

155 160 165

gat tct gtt cca gtt gaa gag caa gaa gag ttc aag cag ctt tca gat 940

Asp Ser Val Pro Val Glu Glu Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp

170 175 180 185

gga att cag gag cta caa caa tca cta aat cag gat ttt cat caa aaa 988

Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys

190 195 200

acg ata gtg ctg caa gag gga aat tcc caa aag aag tca aat att tca 1036

Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser

205 210 215

gag aaa acc aag cgt ttg aat gaa cta aaa ttg ttg gtg gtt tct ttg 1084

Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn Glu Leu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu

220 225 230

aaa gaa ata caa gag agt ttg aaa aca aaa att gtg gat tct cca gag 1132

Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu

235 240 245

aag tta aag aat tat aaa gaa aaa atg aaa gat acg gtc cag aag ctt 1180

Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu

250 255 260 265

aaa aat gcc aga caa gaa gtg gtg gag aaa tat gaa atc tat gga gac 1228

Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp

270 275 280

tca gtt gac tgc ctg cct tca tgt cag ttg gaa gtg cag tta tat caa 1276

Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln

285 290 295

aag aaa ata cag gac ctt tca gat aat agg gaa aaa tta gcc agt atc 1324

Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile

300 305 310

tta aag gag agc ctg aac ttg gag gac caa att gag agt gat gag tca 1372

Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser

315 320 325

gaa ctg aag aaa ttg aag act gaa gaa aat tcg ttc aaa aga ctg atg 1420

Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met

330 335 340 345

att gtg aag aag gaa aaa ctt gcc aca gca caa ttc aaa ata aat aag 1468

Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys

350 355 360

aag cat gaa gat gtt aag caa tac aaa cgc aca gta att gag gat tgc 1516

Lys His Glu Asp Val Lys Gln Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys

365 370 375

aat aaa gtt caa gaa aaa aga ggt gct gtc tat gaa cga gta acc aca 1564

Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr

380 385 390

att aat caa gaa atc caa aaa att aaa ctt gga att caa caa cta aaa 1612

Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys

395 400 405

gat gct gct gaa agg gag aaa ctg aag tcc cag gaa ata ttt cta aac 1660

Asp Ala Ala Glu Arg G]u Lys Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn

410 415 420 425

ttg aaa act gct ttg gag aaa tac cac gac ggt att gaa aag gca gca 1708

Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala

430 435 440

gag gac tcc tat gct aag ata gat gag aag aca gct gaa ctg aag agg 1756

Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg

445 450 455

aag atg ttc aaa atg tca acc tgattaacaa aattacatgt ctttttgtaa 1807

Lys Met Phe Lys Met Set Thr

460

atggcttgcc atcttttaat tttctattta gaaagaaaag ttgaagcgaa tggaagtatc 1867

agaagtacca aataatgttg gcttcatcag tttttataca ctctcataag tagttaataa 1927

gatgaattta atgtaggctt ttattaattt ataattaaaa taacttgtgc agctattcat 1987

gtctctactc tgccccttgt tgtaaatagt ttgagtaaaa caaaactagt tacctttgaa 2047

atatatatat ttttttctgt 2067

<210>34

<211>464

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>34

Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile

1 5 10 15

His lle Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr

20 25 30

Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile

35 40 45

Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe

50 55 60

Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu

65 70 75 80

Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu

85 90 95

Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro

100 105 110

Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile

115 120 125

His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln

130 135 140

Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln

145 150 155 160

Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu

165 170 175

Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln

180 185 190

Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly

195 200 205

Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn

210 215 220

Glu Leu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu

225 230 235 240

Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu

245 250 255

Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val

260 265 270

Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser

275 280 285

Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser

290 295 300

Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu

305 310 315 320

Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr

325 330 335

Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu

340 345 350

Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln

355 360 365

Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg

370 375 380

Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys

385 390 395 400

Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys

405 410 415

Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys

420 425 430

Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile

435 440 445

Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr

450 455 460

<210>35

<211>19

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>CDCA1-KNTC2结合区域肽序列

<400>35

Ile Gln Lys Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu

1 5 10 15

Arg Glu Lys

<210>36

<211>11

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的11聚体多聚精氨酸序列

<400>36

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210>37

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Tat序列

<400>37

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210>38

<211>16

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Penetratin序列

<400>38

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210>39

<211>21

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Buforin II序列

<400>39

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

151015

Arg Leu Leu Arg Lys

20

<210>40

<211>27

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Transportan序列

<400>40

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210>41

<211>18

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的MAP(模型两亲性肽)序列

<400>41

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ala

<210>42

<211>16

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的K-FGF序列

<400>42

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

1 5 10 15

<210>43

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Ku70序列

<400>43

Val Pro Met Leu Lys

1 5

<210>44

<211>28

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的朊病毒(Prion)序列

<400>44

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp

1 5 10 15

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro

20 25

<210>45

<211>18

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的pVEC序列

<400>45

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

151015

Ser Lys

<210>46

<211>21

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Pep-1序列

<400>46

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210>47

<211>18

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的SynB1序列

<400>47

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gly Arg

<210>48

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Pep-7序列

<400>48

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr

1 5 10 15

<210>49

<21l>12

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的HN-1序列

<400>49

Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu

1 5 10

<210>50

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的Ku70 PMLKE序列

<400>50

Pro Met Leu Lys Glu

1 5

Claims

1. 筛选用于治疗或预防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：

(b)检测步骤(1)中多肽间的相互作用；和

(c)选择抑制所述KNTC2与CDAC1多肽之间结合的测试化合物。

2. 权利要求1的方法，其中CDCA1多肽的功能等价物包含KNTC2结合域的氨基酸序列。

3. 权利要求2的方法，其中CDCA1多肽的功能等价物包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)。

4. 权利要求1的方法，其中KNTC2多肽的功能等价物包含CDCA1结合域的氨基酸序列。

5. 用于筛选治疗或预防NSCLC的化合物的试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：

(a)KNTC2多肽或其功能等价物，和

(b)CDCA1多肽或其功能等价物。

6. 用于治疗或预防受试者体内NSCLC的方法，包括向所述受试者施用siRNA组合物，该组合物包含降低KNTC2基因表达的siRNA，其中该siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

7. 权利要求6的方法，其中该siRNA具有通式：

5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

8. 治疗或预防受试者体内NSCLC的方法，所述方法包括施用通过权利要求1的方法获得的化合物的步骤。

9. 治疗或预防受试者体内NSCLC的方法，所述方法包括施用具有显性失活效应的CDCA1突变体或编码所述突变体的多核苷酸的步骤。

10. 权利要求9的方法，其中所述CDCA1突变体含有包括KNTC2结合区的氨基酸序列，且不包含其nuf2域。

11. 权利要求9的方法，其中所述CDCA1突变体包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。

12. 权利要求11的方法，其中所述CDCA1突变体具有通式：[R]-[D]，

其中[R]是膜转导物质，[D]是包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的多肽。

13. 权利要求12的方法，其中所述膜转导物质从下组中选择：

聚精氨酸；

Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；

Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；

Buforin II/TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；

Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；

MAP(模型两亲肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；

K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；

Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；

Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；

朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；

pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：4 5；

Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；

SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；

Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；和

HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49.

14. 一种由SEQ ID NO：35所示氨基酸序列构成的多肽。

15. 一种多肽，具有通式：[R]-[D]，

16. 一种包括有义链和反义链的双链分子，其中该有义链包含相应于KNTC2靶序列的核糖核苷酸序列，反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，而且其中所述有义链和反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且所述双链分子当被引入到表达KNTC2基因的细胞中时抑制所述基因的表达。

17. 权利要求16的双链分子，其中所述KNTC2靶序列包含来自SEQ IDNO：31所示核苷酸序列的至少大约10个连续核苷酸。

18. 权利要求17的双链分子，其中所述KNTC2靶序列包含来自SEQ IDNO：9所示核苷酸序列的大约19-大约25个连续核苷酸。

19.权利要求18的双链分子，其中所述KNTC2靶序列由SEQ ID NO：9构成。

20. 权利要求16的双链分子，其中所述双链分子是单一核糖核苷酸转录物，包括通过单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链。

21. 权利要求16的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约100个核苷酸的寡核苷酸。

22. 权利要求21的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约75个核苷酸的寡核苷酸。

23. 权利要求22的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约50个核苷酸的寡核苷酸。

24. 权利要求23的双链分子，其中该双链分子是长度小于大约25个核苷酸的寡核苷酸。

25. 权利要求24的双链分子，其中该双链分子是长度为大约19-大约25个核苷酸的寡核苷酸。

26. 一种载体，其编码权利要求16的双链分子。

27. 权利要求26的载体，其中该载体编码具有二级结构的转录物，该转录物包括有义链和反义链。

28. 权利要求27的载体，其中该转录物进一步包括连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。

29. 一种载体，其包括多核苷酸，该多核苷酸包括有义链核酸和反义链核酸的组合，其中所述有义链核酸包括由SEQ ID NO：9构成的核苷酸序列，而所述反义链核酸由与所述有义链互补的序列构成。

30. 根据权利要求29的载体，其中所述多核苷酸具有通式：

5’-[A]-[B]-[A’]-3’，

其中[A]是SEQ ID NO：9的核苷酸序列；[B]是由3-23个核苷酸构成的核苷酸序列；[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。

31. 用于治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包含药物有效量的针对KNTC2基因的siRNA。

32. 权利要求31的组合物，其中所述siRNA包括含有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的有义链作为靶序列。

33. 用于治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包含药物有效量的通过权利要求1的方法选出的化合物作为活性成分，和药物可接受的载体。

34. 用于治疗或预防NSCLC的组合物，所述组合物包含药物有效量的具有显性失活效应的CDCA1突变体或者编码所述突变体的多核苷酸作为活性成分，和药物可接受的载体。

35. 权利要求34的组合物，其中该CDCA1突变体包括含有KNTC2结合区的氨基酸序列，但不包含其nuf2域。

36. 权利要求35的组合物，其中该CDCA1突变体包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。

37. 权利要求35的组合物，其中该CDCA1突变体具有通式：

[R]-[D]，

38. 权利要求37的组合物，其中该膜转导物质从下组中选择：

聚精氨酸；

Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；

Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；

Buforin II/TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；

Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；

MAP(模型两亲肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；

K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；

Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；

Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；

朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；

pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；

Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；

SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；

Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；和

HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49.

39. 一种评价NSCLC预后的方法，其中该方法包括如下步骤：

(a)检测从待评价NSCLC预后的受试者收集的样品中CDCA1和KNTC2其中之一或两者的表达水平，和

(b)若检测到CDCA1和KNTC2其中之一或两者的表达水平提高，则表明预后不良。

40. 权利要求39的方法，其中该方法包括检测CDCA1和KNTC2两者的表达水平的步骤。

41. 权利要求39的方法，其中表达水平是通过从下组选择的任何一种方法检测的：

(b)检测包含SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质的存在，和

(c)检测包含SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质的生物活性。

42. 用于评价NSCLC预后的试剂盒，其中该试剂盒包含从下组选择的任何一种成分：

(b)用于检测包含SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质之存在的试剂，和

(c)用于检测包含SEQ ID NO：34(CDCA1)或SEQ ID NO：32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白质之生物活性的试剂。